CN103834736A - 转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的pcr检测引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测引物、检测方法及试剂盒。所述检测方法包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行扩增；（3）如果仅扩增出一条401bp片段，为纯合转基因水稻科丰2号；如果同时扩增出401bp和541bp的两条片段，为杂合转基因水稻科丰2号；如果只扩增出一条541bp片段，为非转基因水稻。本发明检测方法能够准确检测出转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态，为转基因水稻科丰2号成分检测标准物质研制奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因植物外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，尤其涉及转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，属于转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态的检测领域。
背景技术
标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是依法开展转基因生物安全监管的重要物质基础。转基因成分检测标准物质研制对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。
此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，也有利于缩短育种进程。
目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体构建特征的构建特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。迄今未止，国内外目前还没有针对转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的检测方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供检测转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物；
本发明的目的之二是提供转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测方法；
本发明的目的之三是提供转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了用于检测转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示。
根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因，本发明通过Hi-TAIL PCR获得外源插入SCK基因的5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，所获得的含有SCK基因的外源插入载体及其两侧5’端和3’端侧翼水稻序列的连接区的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明进一步根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列设计出一套能够准确检测转基因抗虫水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示。
本发明的目的之二是提供一种转基因抗虫水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测方法，该方法包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以提取的DNA为模板，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）如果仅扩增出一条401bp片段，为纯合转基因水稻科丰2号；如果扩增出401bp和541bp的两条片段，为杂合转基因水稻科丰2号；如果只扩增出一条541bp片段，为非转基因水稻。
其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。
本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，5×Go Taq缓冲液5.0μL，0.025U Go Taq DNA聚合酶0.5μL，10mmol/L dNTP2.0μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ ID No.3所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ IDNo.4所示的引物0.5μL，25ng/μL DNA模板2μL，余量为双蒸水。
所述的PCR扩增条件优选为：94℃变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。
本发明进一步的目的是提供一种转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒，包括：5×Go Taq缓冲液，Go Taq DNA聚合酶，dNTP，一套PCR检测引物和双蒸水；其中，所述PCR检测引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明检测方法能够准确的检测出转基因水稻科丰2号外源基因插入的纯合/杂合状态，为转基因抗虫水稻科丰2号成分检测标准物质研制以及转基因作物遗传育种奠定了基础。
附图说明
图1Hi-TAIL PCR扩增结果；M：1Kb plus Marker1：下游第二轮PCR产物2：下游第三轮PCR产物；3：上游第二轮PCR产物4：上游第三轮产物。
图2上下游测序拼接结果（2614bp）。
图3从已知序列的两端设计Hi-TAIL PCR的嵌套引物。
图4Hi-TAIL PCR扩增结果；M：1Kb plus Marker1、上游第二轮PCR产物；2、上游第三轮产物；注：下游引物无条带。
图5上下游测序拼接结果。
图6M：1Kb plus Marker1:空白对照；2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图7长片段验证获得的整合结构；①、②、③、④、⑤分别代表：从所示意的位置设计长片段引物进行扩增。
图81号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker；1:空白对照，2：明恢86阴性对照，3：科丰2号。
图92号引物扩增结果：M：100bp Marker；1:空白对照；2：明恢86阴性对照，3：科丰2号。
图103号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照；2：明恢86阴性对照，3：科丰2号。
图114号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照，2：明恢86阴性对照3：科丰2号。
图125号引物扩增结果：M：1Kb plus Marker，1:空白对照2：明恢86阴性对照，3：科丰2号。
图13本发明PCR检测方法扩增科丰2号鉴定外源基因纯合的结果；M：100bp Marker；1：空白对照；2：明恢86，3-16：不同植株的科丰2号，17：明恢86和科丰2号DNA等体积混合物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1转基因水稻科丰2号品系中外源插入的SCK基因的侧翼序列的获得
转基因水稻科丰2号品系外源插入目的基因为SCK基因，共415bp，其碱基序列为SEQ ID No.5所示。通过Hi-TAIL PCR获得整合结构（外源插入基因侧翼序列）。
1、第一步：在目的基因SCK上设计Hi-TAIL PCR的嵌套引物
①下游引物：
Sck-sp1 CTTTCTCATCATCTTCATCCCTGGACTTG
Sck-sp2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGATTTGCAAGCCGAGTGACACGAATT
Sck-sp3 TTGATTTAGTGCAGATGCATGAATCGC
上游引物：
Sck-Ap1 GCACCATCTTCTTTGCTCTCTTTCTCTGT
Sck-Ap2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCTTTCGTTTTAAAGGTGTGTGTGCTGGTAC
Sck-Ap3TGATGACTCAAGCGATGAACCTTCTGAG
随机引物：
AD1-1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA
AD1-2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT
AD1-3 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA
AD1-4 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNAGGT
AD-C ACGATGGACTCCAGAG
②PCR结果见图1。
③上下游测序拼接结果（2614bp）见图2。
2、第二步：从已知序列的两端设Hi-TAIL PCR的嵌套引物
图3为嵌套引物设计的示意图。
①下游引物：
OSP-SP1 AGATTAAAATAGCTTTCCCCCGTTGTAGC
OSP-SP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAAAGTGCTATCCACGATCCATAGCAAG
OSP-SP3 CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
上游引物：
hptII-AP1 GCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATC
hptII-AP2 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAG
hptII-AP3 CGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCG
随机引物：同上。
②PCR结果见图4。
③上下游测序拼接结果（3840bp）见图5。
3.第三步：根据5’端获得的水稻序列，得到3’端水稻序列。然后，在水稻启动子上设上游引物，水稻3’端序列上设下游引物，通过长片段扩增得到3’端侧翼序列。
①下游引物：OSJ-3'-AP：CGCTTTGACCTAAGTTTGCACGGAC
上游引物：OSP-SP：CAATAGTCTCCACACCCCCCCACTATC
②PCR结果见图6。
③测序拼接结果（5423bp）见图7。
4、全部测序结果：全部的连接区序列（外源插入载体（含有SCK基因）和两侧的水稻侧翼序列的连接区）为SEQ ID No.1所示。
5、长片段验证获得的整合结构
按照图7中①、②、③、④、⑤分别代表所示意的位置设计长片段引物进行扩增，预期大小分别为：1.4Kb、1176bp、817bp、2.3kb、4443bp；扩增结果分别见图8、图9、图10、图11、图12。
实验例2转基因抗虫水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测方法的建立
1、引物设计及序列
该转化体外源整合结构位于水稻基因组1号染色体上，其中，1-613bp为5’端水稻基因组序列；614-4931bp为外源整合结构；4932-5423bp为3’端水稻基因组序列。引物OSJ-3’-R位于3’端水稻基因组上；引物OSJ-5’-F位于5’端水稻基因组上；引物35SPolyA-F位于外源整合结构35SPolyA序列上。
引物序列
OSJ-3’-R：TATAGTGAGAATCATTCATCAGCGC（SEQ ID No.2）
OSJ-5’-F：GGGCAATCAAGGATATATTGAGAC（SEQ ID No.3）
35SPolyA-F：TCGCTCATGTGTTGAGCATATAAG（SEQ ID No.4）
表1连接区序列（SEQ ID No.1）各元件名称及位置
2、复合PCR扩增反应体系：
反应体系：5×Go Taq缓冲液5.0μL，0.025U Go Taq DNA聚合酶0.5μL，10mmol/L dNTP2.0_μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ ID No.3所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ ID No.4所示的引物0.5μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去离子水补至25μL。
PCR扩增程序：94℃变性5min；（94℃30s，58℃30s，72℃30s）35个循环；72℃延伸7min。
3、结果判定
纯合转基因水稻科丰2号中仅能扩增出一条401bp的片段；杂合转基因水稻科丰2号同时扩增出两条片段，一条为401bp，另一条为541bp；而非转基因水稻中只能扩增出一条541bp片段。
实验例3转基因抗虫水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测的应用实验
一、植物材料
1、不同植株的转基因抗虫水稻科丰2号；
2、非转基因水稻：明恢86；
以上实验材料由中科院遗传与发育生物学研究所及中国农业科学院生物技术研究所提供。
二、实验方法
（一）、植物基因组DNA的提取与检测
1植物材料DNA提取
1.1CTAB提取缓冲液的配制
600mL水中加入81.7g NaCl和20g CTAB，充分溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH7.5）溶液100mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶液100mL,最后用HCl或NaOH溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL。高温高压（103.4kPa/121℃）条件下灭菌20min后使用。
1.2提取方法
a.100mg样品，充分研磨成粉末后转移至2ml离心管中；
b.1ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合。
c.65℃水浴40min，期间颠倒混匀数次；
d.12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酚、氯仿-异戊醇（24：1），充分混合；
e.12000r/min离心10min。转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），充分混合；
f.12000r/min离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20℃放置2小时或更长时间；
g.12000r/min离心10min；
h.弃上清，加入500μL，70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000r/min离心10min；
i.弃上清，将离心管倒立于吸水纸吸干，并使乙醇充分挥发，干燥DNA；
g.加100μl水溶解DNA；
k.用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。
2DNA检测
取3ul提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。
（二）、PCR检测体系及反应程序的建立
按照实验例2所述的PCR检测体系及反应程序进行；每组实验进行3次重复。
三、实验结果
实验结果如图13所示；不同植株的科丰2号仅能扩增出一条401bp的片段；明恢86和科丰2号DNA等体积混合物扩增出两条片段，一条为401bp，另一条为541bp；非转基因水稻明恢86只能扩增出一条541bp片段（琼脂糖凝胶浓度为2%，EB中染色30min）。
Claims (5)
1.用于检测转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测引物，其特征在于：其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4所示。
2.一种转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以提取的DNA为模板，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）如果仅扩增出一条401bp片段，则待检测的样品为纯合转基因水稻科丰2号；如果扩增出401bp和541bp的两条片段，待检测的样品为杂合转基因水稻科丰2号；如果只扩增出一条541bp片段，待检测的样品为非转基因水稻。
3.按照权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系按照以下方式建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，5×Go Taq缓冲液5.0μL，0.025U Go Taq DNA聚合酶0.5μL，10mmol/L dNTP2.0μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ ID No.3所示的引物0.75μL，10μmol/L SEQ ID No.4所示的引物0.5μL，25ng/μLDNA模板2μL，余量为双蒸水。
4.按照权利要求2所述的PCR检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：94℃变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。
5.一种转基因水稻科丰2号外源基因纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒，包括：5×Go Taq缓冲液，Go Taq DNA聚合酶，dNTP，PCR检测引物和双蒸水；其特征在于：所述PCR检测引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
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