CN103014136A

CN103014136A - 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法

Info

Publication number: CN103014136A
Application number: CN201110282854XA
Authority: CN
Inventors: 金芜军; 宛煜嵩; 张秀杰; 苗朝华; 于晓芹
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: CN103014136B

Abstract

本发明提供了一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法，其是以5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′为引物，进行长距离聚合酶链式扩增，以纯合外源基因KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp)，以杂合外源基因KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp)，以非转基因水稻基因组DNA为模板能扩增出一条短片段(240bp)，从而可以快速准确地鉴定出纯合型转基因抗虫水稻KMD1，为后续的转基因作物遗传育种奠定基础。

Description

基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，具体地说，涉及一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法。

背景技术

标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是开展转基因生物安全监管的基准物。开发转基因成分检测标准物质对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围，主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。

目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体的特征建立特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。国内外目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)外源基因纯合/杂合状态检测方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1(KMD1)的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测转基因抗虫水稻KMD1的特异性引物，其包括：正向引物5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和反向引物5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′。该引物对是基于KMD1外源基因的旁侧序列而设计的引物，利用该对引物进行长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR，LD-PCR)，以纯合KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp)，以杂合KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp)，以非转基因水稻基因组DNA为模板只能扩增出一条短片段(240bp)。

本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型KMD1的方法，包括步骤：1)提取植物基因组；2)以步骤1)的基因组为模板，利用上述特异性引物进行PCR检测。

PCR反应条件优选为：94℃ 1min；98℃ 10s，66℃ 10min，30个循环；72℃ 10min。

PCR反应体系优选为：

本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检测纯合型转基因抗虫水稻KMD1中的应用。

本发明首次基于外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)的外源基因纯合的鉴定方法，可用于转基因检测用标准物质候选物的筛选鉴定。此外，在转基因作物遗传育种过程中，需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，有利于缩短育种进程。

附图说明

图1为本发明通过LD-PCR在水稻中的扩增结果；其中，M：1kbplus DNA ladder；1：空白对照；2：非转基因水稻明恢63；3：外源基因纯合的KMD1；4：外源基因杂合的KMD1。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品，转基因抗虫水稻KMD1和非转基因水稻明恢63可市售获得。

实施例

利用引物，其中正向引物为LA-KMD1F：5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′，反向引物为LA-KMD1R：5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′进行LD-PCR扩增鉴定KMD1的外源基因纯合状态。

1.实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫水稻KMD1，非转基因水稻明恢63。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，Takara LA Taq，10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)，dNTP Mixture(2.5mM)购自Takara Biotechnology，1kb Plus DNAMarker购自TransGen Biothech。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京生工生物技术有限公司合成。

1.3实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪MM400(Retsch)；

PCR扩增仪：AB Applied Biosystems veriti 96 well Thermal Cycler(AB)；

核酸电泳仪：DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)；

DNA电泳分析系统：GeneSnap凝胶成像分析系统；

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。

2.实验方法

2.1水稻基因组DNA的提取

水稻单粒种植，取幼嫩叶片作为DNA提取材料，依照TianGenPlant Genomic DNA Kit(购自天根生化科技(北京)有限公司，目录号：DP320；包括缓冲液LP1、LP2、LP3、洗脱缓冲液TE及吸附柱CB3)的操作手册，进行水稻总DNA的提取。

a.称取水稻新鲜叶片100mg，单株分别标记，剪刀剪碎装入2ml离心管中，放入液氮中预冷，用低温混合球磨仪充分破碎。加入400μl缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，涡旋振荡1min，室温放置10min。

b.加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡1min。12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。

c.加入1.5倍体积的缓冲液LP3，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。将所得的溶液或者絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。

d.向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12,000离心30s，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。重复此步骤如下：向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000离心30s，弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。14,000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

e.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl去离子双蒸水(pH7.0-8.5)，室温放置2-5min，12,000离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.2DNA浓度和纯度测定

使用NaNoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至100ng/μl。

2.3长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR，LD-PCR)

根据获得的3’侧翼序列和5’侧翼序列，从两端设计引物用于扩增出全长。其中正向引物LA-KMD1F在5’插入区的水稻序列，反向引物LA-KMD1R在3’插入区的水稻序列，引物序列见表1。

表1

引物	序列
		LA-KMD1F	5’-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3’
LA-KMD1R	5’-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3’

LD-PCR扩增体系为：总体系25μl，Takara LA Taq 1.25U，10×LAPCR Buffer II(Mg²⁺Plus)2.5μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，引物各1μl(10μM)，水稻DNA 2μl(100ng/μl)，剩余用ddH₂O补足。

LD-PCR扩增程序：94℃ 1min；98℃ 10s，66℃ 10min，30个循环；72℃ 10min。

3.实验结果

根据转基因水稻KMD1 5’和3’两端侧翼序列设计的正向引物和反向引物，通过LD-PCR在非转基因水稻明恢63、纯合转基因水稻KMD1、杂合转基因水稻KMD1 DNA中进行扩增，能够快速准确地鉴定出KMD1中纯合体和杂合体。其中在纯合转基因水稻KMD1中仅能扩增出一条8884bp的片段；杂合转基因水稻KMD1扩增出两条片段，一条为8884bp，一条为240bp；而非转基因水稻中只能扩增出一条240bp片段。扩增结果如图1所示，其中琼脂糖凝胶浓度为1％，EB中染色20min。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测转基因抗虫水稻克螟稻1的特异性引物，其特征在于，包括：

正向引物：5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和

反向引物：5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′。

2.一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取植物基因组；

2)以步骤1)的基因组为模板，利用权利要求1的特异性引物进行PCR检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94℃ 1min；98℃ 10s，66℃ 10min，30个循环；72℃ 10min。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：

5.含有权利要求1所述特异性引物的检测试剂盒。

6.权利要求5所述的试剂盒在检测纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1中的应用。