JP2017018114A - 形質遺伝子移入のためのトウモロコシにおける褐色中肋−3遺伝子特異的マーカーの使用 - Google Patents
形質遺伝子移入のためのトウモロコシにおける褐色中肋−3遺伝子特異的マーカーの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2010年5月12日に出願された「USE OF BROWN MIDRIB-3 GENE SPECIFI
C MARKERS IN MAIZE FOR TRAIT INTROGRESSION」についての米国特許仮出願第61/33
4,073号の出願日の恩恵を主張するものである。
接合状態を決定するための方法を提供する。さらに、本開示の方法は、BMR含有植物系
統についての育種プロセスの向上に有用である。
普遍的成分である。リグニンポリマーは、反芻動物における繊維消化を低下させ、リグニ
ン化の程度は、粗飼料作物可消化率に反比例し得る。Cherney et al. (1991) Adv. Agron
. 46: 157-98。褐色中肋(BMR)突然変異を有するトウモロコシは、有意に低減された
リグニン含有率、改変されたリグニン組成及び改善された可消化率に関連づけられる、葉
の中肋の赤褐色着色を呈示する。少なくとも4つの独立したBMR突然変異が、トウモロ
コシにおいて同定されている。Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7: 1435-6。これらの
突然変異は、「bm1、bm2、bm3、及びbm4」と呼ばれており、すべて、対照ト
ウモロコシと比較したときに減少されたリグニン含有率を呈示する。bm3突然変異は、
コーヒー酸O−メチルトランスフェラーゼ(COMT、例えば、GenBankアクセッ
ション番号M73235)遺伝子内の挿入(bm3−1)、欠失(bm3−2)、及び挿
入/欠失(bm3−3)を含む。Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7; Vigno
ls et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16。
アデノシルメチオニン(S−adenylsylmethionine)を利用してコー
ヒー酸のメチル基を転移させ、その結果、フェルラ酸が生産される。そのフェルラ酸から
最終的にコニフェリルアルコール及びシナピルアルコールが生成される。遊離ラジカルの
存在下でのコニフェリルアルコールとフェルラ酸アルコールとシナピルアルコールのこの
組み合わせが、リグニン生産をもたらす。bm3突然変異は、特性決定されており、遺伝
子不活性化によってコーヒー酸のメチル基転移を阻害すると考えられている。Guillet-Cl
aude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110:126-35; Piquemal et al. (2002) Plant
Physiology 130:1-11; He et al. (2003) Crop Sci. 43:2240-51; Morrow et al. (1997)
Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16。しかし、bm
3遺伝子座での特定の植物の接合状態を特異的に検出及び試験するための迅速な方法は、
開発されていない。
ロコシ品種(例えば、bm3突然変異体)のハイスループットPCRベース分子特性決定
方法を本明細書に開示する。bm3突然変異体及び野生型COMT対立遺伝子の存在又は
不在を決定することによる、植物組織サンプル、及び従って該サンプルを調製した植物の
接合状態の決定方法を開示する。従って、bm3遺伝子座における接合状態ステータスを
特異的に検出及び試験する、エンドポイント加水分解プローブPCRベース接合状態アッ
セイ(これを本明細書ではTaqMan(登録商標)アッセイとして言及する)を提供す
る。アッセイであって、bm3突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生
型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスを同じアッセイにおいて利用する
ものであるアッセイを開示する。
添付の配列表に載っている核酸配列は、37 C.F.R.§1.822において定義
されているとおりの、ヌクレオチド塩基についての標準的文字略記を用いて示されている
。各核酸配列の一方の鎖しか示されていないが、表示されている鎖へ任意の参照によりそ
の相補鎖が含まれると解される。添付の配列表において:
配列番号:1は、トウモロコシCOMT部分遺伝子を増幅するために使用したフォワー
ドプライマー配列(BM35_F):TACTCTACTGGCTGCGGCTAGCを
示す。
配列番号:2は、トウモロコシCOMT部分遺伝子を増幅するために使用したリバース
プライマー配列(BM35_R):TAACCTTGATTGTTATTACTCGCA
CATGGを示す。
配列番号:3は、トウモロコシCOMT部分遺伝子をシークエンスするために使用した
COMT遺伝子からオリゴヌクレオチド配列(BM1234R):ATCAGCATCA
GCCAGGCAGGを示す。
配列番号:4は、突然変異体bm3対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプ
ライマー配列(BM3_F):AAAAAGAACGAGGTTGCAAAAGATAを
示す。
配列番号:5は、突然変異体bm3対立遺伝子を同定するために使用したリバースプラ
イマー配列(BM3_R):TTAGAATCCACGACATGCAAGAGを示す。
配列番号:6は、5’末端にFMA及び3’末端にMGBNFQを有する突然変異体b
m3対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列(BM3_Probe):FAM
−ACAAACCAAAGGATGTCG−MGBNFQを示す。
配列番号:7は、野生型COMT対立遺伝子を同定するために使用したフォワードプラ
イマー配列(COMT_F):CGCACTCGACGACGATGACを示す。
配列番号:8は、野生型COMT対立遺伝子を同定するために使用したリバースプライ
マー配列(COMT_R):CACGCTGCTCAAGAACTGCTAを示す。
配列番号:9は、5’末端にVIC及び3’末端にMGBNFQを有する野生型COM
T対立遺伝子を同定するために使用したプローブ配列(COMT_Probe):VIC
−CATTTTCCGGCAGCGC−MGBNFQを示す。
配列番号:10は、bm3ヌクレオチド配列を示す。
配列番号:11は、部分COMTヌクレオチド配列を示す。
BMR含有植物系統についての育種プロセスを大いに向上させることができるbm3ト
ウモロコシ品種のハイスループットPCRベース分子特性決定方法を本明細書に開示する
。特定の実施形態において、該方法は、単離されたゲノムDNAのサンプルをトウモロコ
シ植物から得る工程、該単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列
番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの
核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることが
できるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子と接触させる工程、及び該トウ
モロコシ植物からの単離されたゲノムDNA中のbm3突然変異の接合状態を決定する工
程を含む。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハ
イブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高
ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオ
チド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、10ヌクレオチドと35ヌクレオチドの間
の長さである。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10
にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は
、配列番号:10の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95%同一であ
る。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、配列番号
:11の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95%同一である。一部の
実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズする
ことができるヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイ
ブリダイズすることができない。一定の実施形態において、配列番号:10又は配列番号
:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸
分子は、配列番号:1〜9からなる群より選択される。
施形態において、該方法は、トウモロコシ植物からのゲノムDNAを、高ストリンジェン
シー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができる核酸分子に暴露する工程
を含むことができる。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号
:10にハイブリダイズすることができる核酸分子は、配列番号:4、配列番号:5、及
び配列番号:6からなる群より選択することができる。
形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法をさらに開示する。一部の実施
形態において、該方法は、COMT遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と戻
し交配する工程、該交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムDNAのサン
プルを得る工程、単離されたゲノムDNAの該サンプルを、高ストリンジェンシー条件下
で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも
1つの核酸分子と接触させる工程、及び単離されたゲノムDNAのサンプルを得た植物を
繁殖させることにより、COMT遺伝子における突然変異を含む交配種から、高ストリン
ジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
を含む少なくとも1つの核酸分子に高ストリンジェンシーで結合する後代を選択する工程
、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が該遺伝子組換え
植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程を含むこと
ができる。
接合状態を有するトウモロコシ植物、並びに低リグニン含有率の形質をトウモロコシ植物
生殖質に確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための本開示の方法に従って生産される
、低リグニン含有率の形質を呈示する遺伝子組換えトウモロコシ植物も開示する。
BMR 褐色中肋
MGBNFQ Minor Grove Binding Non Flouresce
nce Quencher(商標)I
FAM 6−カルボキシ−フルオレセイン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RFU 相対蛍光単位
VIC 6−カルボキシ−ローダミン
後に続く説明及び表において多数の用語を用いる。そのような用語が与えられている範
囲を含む、本明細書及び特許請求の範囲の明確な及び一致した理解をもたらすために、以
下の定義を提供する:
戻し交配:戻し交配は、育種家が、親の1つに雑種後代、例えばF1雑種の親遺伝子型
の1つを有する第一世代雑種F1を戻すように繰り返し交配するプロセスである。
BMRトウモロコシ:本明細書において用いる場合、用語「BMRトウモロコシ」は、
褐色中肋突然変異、例えばbm1、bm2、bm3及びbm4として特性決定される突然
変異を有するトウモロコシ品種を指す。BMRトウモロコシ品種は、概して、葉の中肋の
赤褐色着色を呈示する。BMRトウモロコシは、概して、より低いリグニン含有率、より
高い繊維可消化率及びより高い乾物摂取量も特徴とする。BMRトウモロコシ品種の非限
定的な例としては、F2F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F
566、F2F610、F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F
2F721、F2F700、及びF2F797が挙げられる。
ハイブリダイゼーション:オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体は、相補塩基間で、
ワトソン・クリック(Watson−Crick)、フーグスティーン(Hoogste
en)又は逆フーグスティーン水素結合を含む、水素結合によってハイブリダイズする。
一般に、核酸分子は、ピリミジン(シトシン(C)、ウラシル(U)、及びチミン(T)
)又はプリン(アデニン(A)及びグアニン(G))のいずれかである窒素含有塩基から
なる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジ
ンのプリンへの結合は、「塩基対合」と呼ばれる。より具体的には、Aは、T又はUに水
素結合することとなり、Gは、Cに結合することとなる。「相補的」は、2つの異なる核
酸配列間で又は同じ核酸配列の2つの異なる領域間で発生する塩基対合を指す。
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「特異的に相補的な」は、安定した特異的な結
合がオリゴヌクレオチドとDNA又はRNAターゲットとの間で発生するような十分な相
補性度を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるた
めにそのターゲット配列に100%相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、該
オリゴヌクレオチドのターゲットDNA又はRNA分子への結合が、該ターゲットDNA
又はRNAの正常な機能に干渉するとき、及び特異的結合が望まれる条件下、例えばイン
ビボアッセイ又は系の場合に生理条件下で非ターゲット配列への該オリゴヌクレオチドの
非特異的結合を回避するために十分な相補性度が存在するとき、特異的にハイブリダイズ
可能である。そのような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
特定のストリンジェンシー度を生じさせる結果となるハイブリダイゼーション条件は、
選択されるハイブリダイゼーション法の性質、並びにハイブリダイズする核酸配列の組成
及び長さに依存して、様々である。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリ
ダイゼーション緩衝液のイオン強度(とりわけ、Na+及び/又はMg2+濃度)は、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーの一因となるが、洗浄時間もストリンジェン
シーに影響を及ぼす。特定のストリンジェンシー度を達成するために必要とされるハイブ
リダイゼーション条件についての計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11において論じられている。
本開示のために、「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子とターゲ
ット配列の間に25%未満のミスマッチがある場合にハイブリダイゼーションが発生する
条件を包含する。「ストリンジェント条件」は、特定のストリンジェンシーレベルにさら
に定義することができる。従って、本明細書において用いる場合、「中程度(moder
ate)ストリンジェンシー」条件は、25%より多くのミスマッチを有する分子がハイ
ブリダイズしない条件である。「中(medium)ストリンジェンシー」の条件は、1
5%より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、及び「高ス
トリンジェンシー」の条件は、10%より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイ
ズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」の条件は、6%より多くのミスマッチ
を有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態において、ストリンジェント条件は、製造業者の説示に従って希釈され
たTaqMan(登録商標)遺伝子型判定用マスターミックス(カリフォルニア州フォス
ター・シティーのApplied Biosystems、カタログ#4371355)
中、60℃でのハイブリダイゼーションを含み得る。
単離された:「単離された」生体成分(例えば、核酸又はタンパク質)は、該成分が天
然に存在する生物の細胞内の他の生体成分、すなわち他の染色体及び染色体外DNA及び
RNA並びにタンパク質から実質的に分離された、該他の生体成分とは別に生産された、
又は該他の生体成分から精製された。「単離された」核酸分子及びタンパク質は、標準的
な精製法によって精製された核酸分子及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞にお
ける組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子
、タンパク質及びペプチドも包含する。
オリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレ
オチドは、より長い核酸セグメントの切断によって、又は個々のヌクレオチド前駆体を合
成することによって形成され得る。自動合成装置は、数百塩基対までの長さのオリゴヌク
レオチドの合成を可能にする。オリゴヌクレオチドは相補ヌクレオチド配列に結合するこ
とができるので、DNA又はRNAを検出するためのプローブとしてそれらを使用するこ
とができる。DNAで構成されているオリゴヌクレオチド(オリゴデオキシリボヌクレオ
チド)をPCR、小さいDNA配列の増幅のための技術において使用することができる。
PCRにおいて、該オリゴヌクレオチドは、概して、「プライマー」と呼ばれ、これは、
DNAポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長すること及び相補鎖を複製することを可
能にするものである。
接合状態:本明細書において用いる場合、用語「接合状態」は、生物における遺伝形質
のための遺伝子の対立遺伝子の類似性又はそれらの欠失を指す。両方の対立遺伝子が同じ
である場合、その生物は、その形質について「ホモ接合性」である。両方の対立遺伝子が
異なる場合、その生物は、その形質について「ヘテロ接合性」である。一方の対立遺伝子
が欠けている場合、それは、「ヘミ接合性」である。両方の対立遺伝子が欠けている場合
、それは、「ヌル接合性」である。
特に別の説明がない限り、本明細書において用いるすべての専門用語及び科学用語は、
本開示が属する分野の通常の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する
。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford Univ
ersity Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia
of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);及びMey
ers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Refere
nce, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる
。
A.概観
BMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子
特異的エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイをここで説明する。特定
の実施例は、同じアッセイにおいてbm3欠失に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する
野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスとを利用する。これらの実施
例では、bm3突然変異体及び野生型COMT対立遺伝子の存在/不在によって、接合状
態を決定することができる。該アッセイをさらなる実行のためにハイスループットゲノム
分析グループに付託した。該アッセイは、BMR遺伝子移入プロジェクトの育種プロセス
を大きく向上させることができる。
褐色中肋(BMR)トウモロコシ植物は、V4からV6期における葉の中肋の褐色着色
及び房を付けた後の髄の淡褐色呈色を特徴とする。褐色中肋ハイブリッドトウモロコシは
、トウモロコシ植物組織中のリグニン含有率を低下させる遺伝子突然変異、例えば、bm
2突然変異又はbm3突然変異を有する。褐色中肋3遺伝子は、染色体4の短いアーム上
に位置し、bm3対立遺伝子は、劣性である。褐色中肋2遺伝子は、染色体1の長いアー
ム上に位置し、bm2対立遺伝子も劣性である。リグニンポリマーは、トウモロコシ植物
中の繊維の可消化性を制限する。褐色中肋トウモロコシ中の低減されたリグニンは、結果
として、通常のトウモロコシより可消化性が高い繊維を有するサイレージを生じさせる。
動物飼養試験により、通常のサイレージと比較して、BMRトウモロコシサイレージでの
約10パーセント多い摂取量及び増加された産乳量が証明された。
コシ植物、又は特定のトウモロコシ品種をBMRトウモロコシとして同定するのに有用で
あり得る。開示する方法は、BMRトウモロコシと他のトウモロコシ品種を交配させるこ
とによる、又は第一のBMR突然変異を有するBMRトウモロコシと第二のBMR突然変
異を有するBMRトウモロコシとを交配させること(例えば、bm1トウモロコシ品種と
bm3トウモロコシ品種を交配させること)による、トウモロコシ生殖質へのBMR形質
の信頼できる及び予測できる遺伝子移入にも有用であり得る。多くのBMR突然変異が当
業者に公知であり、一部のBMR突然変異は特性決定(例えば、マッピング及びシークエ
ンシング)されている。本開示の方法は、BMR突然変異を同定するために、BMRトウ
モロコシ植物又は品種の遺伝子型及び/又は接合状態を決定するために、並びにトウモロ
コシ生殖質への任意のBMR突然変異の遺伝子移入に、用いることができる。
BMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子
特異的エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイをここで説明する。特定
の実施形態では、遺伝子特異的エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイ
を用いて、トウモロコシの接合状態をbm3突然変異について分析することができる。
遺伝子特異的エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイにおいて使用す
るためのプライマー及びプローブを、対象の遺伝子における公知突然変異に基づいて、設
計することができる。例えば、bm3特異的アッセイ用のプライマー及びプローブを、コ
ーヒー酸O−メチルトランスフェラーゼ(COMT)遺伝子の3’末端での978bp欠
失に基づいて、設計することができる。突然変異(例えば、bm3)に特異的なオリゴヌ
クレオチド及び破壊されていない野生型遺伝子(例えば、COMT)に特異的なオリゴヌ
クレオチドを同じアッセイにおいて使用するバイプレックス反応において、該特異的オリ
ゴヌクレオチドは、ゲノムDNAサンプル中に存在する該突然変異遺伝子及び/又は該野
生型遺伝子のいずれか又は両方からの配列を選択的に増幅する。
トであって、978bpのヌクレオチド配列が野生型COMT遺伝子から欠失されたジャ
ンクション部位に固有であるものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態におい
て、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、BM3_Probe(配列
番号:6))は、2つのPCRプライマー(例えば、BM3_F(配列番号:4)及びB
M3_R(配列番号:5))の間のゲノムDNAサンプル中のターゲット配列に、高スト
リンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
あるCOMT遺伝子のフラグメントであって、COMT遺伝子座の非bm3配列を増幅す
ることができないように(bm3突然変異体では欠失されている)エキソン2内に位置す
るものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリ
ゴヌクレオチドプローブ(例えば、COMT_Probe(配列番号:9))は、2つの
PCRプライマー(例えば、COMT_F(配列番号:7)及びCOMT_R(配列番号
:8))の間のゲノムDNAサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズする。
及びMGBNFQ)で、標識することができ、それによってターゲット特異的蛍光シグナ
ルの迅速な定量を可能にすることができる。所定数のサイクルの後、例えば、反応が初期
指数関数的増幅期にあるときに、PCR生成物を測定することができる。陰性対照サンプ
ルは、例えばbm3突然変異を有さない、任意のトウモロコシ品種からのゲノムDNAを
含むことができる。陽性対照サンプルは、BMR突然変異、例えばCOMT遺伝子におけ
るbm3欠失突然変異を有するトウモロコシ品種からのゲノムDNAを含むことができる
。対照ヘミ接合性サンプルは、bm3突然変異についてヘミ接合性であると前もって判定
されたトウモロコシ品種からのゲノムDNAを含むことができ、又はヘミ接合性サンプル
は、bm3についてホモ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのDN
Aと同じ割合の陰性対照DNAを含むことができる。
抽出する、及び精製する)ことができる。DNA単離用の市販のキット、例えばQiag
en,Inc.からのものを利用することができる。一部の実施形態では、特定の植物か
らの葉ディスクを打ち抜き、コレクションチューブに移す。各サンプリング後にパンチャ
ーを70%アルコールで浄化し、水ですすぎ、乾燥させることができる。DNA抽出用緩
衝液を、製造業者の推奨に従って調製することができる。その後、キットを製造業者の説
示に従って使用して、DNAを単離することができる。最後に、その単離されたDNAの
濃度を、例えば、Quant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)定量キット
(カリフォルニア州カールズバッドのInvitrogen)及び分光光度計を使用して
、又は任意の他の適する技術によって、決定することができる。
すると、PCR反応を行って該ゲノムDNAサンプル中の対象の核酸配列(例えば、BM
R突然変異に特有の配列)を同定することができる。特定の実施形態では、ゲノムDNA
サンプルを除いてすべての反応成分を含有する個々のPCR反応混合物を調製する。bm
3突然変異体及び野生型COMTトウモロコシのためのプライマー及び遺伝子特異的プロ
ーブを含むバイプレックス反応のための反応混合物は、酵素、反応用緩衝液、bm3突然
変異のためのフォワード及びリバースプライマー、野生型COMT遺伝子のためのフォワ
ード及びリバースプライマー、bm3突然変異のための遺伝子特異的プローブ、COMT
遺伝子のための遺伝子特異的プローブ、並びに水を含み得る。一部のPCRアッセイ系(
例えば、TaqMan(登録商標)PCRアッセイ)において、酵素及び緩衝液は、単一
のキット構成要素(例えば、TaqMan(登録商標)遺伝子型判定用マスターミックス
;カリフォルニア州フォスター・シティーのApplied Biosystems、カ
タログ#4371355)中に存在することがある。
とができる。サンプル中のゲノムDNAの量を正規化する必要はない。しかし、当業者は
、比較的等濃度のゲノムDNAサンプルを使用することにより、最良の結果を獲得するこ
とができる。
録商標)PCRアッセイ)を構成することができる。例えば、(1)試薬を有するがDN
Aサンプルを有さない陰性対照、(2)bm3トウモロコシゲノムDNAを含むホモ接合
性陽性対照、(3)及び上で説明したようなヘミ接合性陽性対照を含む対照ウエルを伴う
マルチ・ウエル・プレートにおいて反応を行うことができる。その後、適するサイクル条
件下でPCRによってDNAを増幅する。例えば、GenAmp(登録商標)PCR S
ystem 9700を使用する一部の実施形態では、95℃で15分間の単一の初期変
性サイクルがあり、それに30サイクルの変性(92℃で15秒間)そしてアニーリング
/伸長(60℃で60秒間)というサイクルが続き得る。PCRサイクル条件を現場の人
間の自由裁量によって変えて、匹敵する結果を得ることができることは、当業者には理解
される。
PCRアッセイ(例えば、エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイ)
を、BMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの遺伝子型及び/又は接合状態分析
に使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブをレポーター(例えば、蛍光部分)で標識することができる。蛍光検出を用いるアッセ
イについては、プローブの検出に適している励起及び発光波長設定を用いて分光蛍光光度
計(例えば、Tecan GENios(商標);スイス、メンネドルフ)でPCR反応
生成物を分析することができる。例えば、蛍光色素、FAMを、485nmの励起波長及
び535nmの発光波長で測定することができる。あるいは、蛍光色素、VICを、52
5nmの励起波長及び560nmの発光波長で測定することができる。
ク・ソフトウェアを使用して、表及び分布グラフを生成することができる。類似した遺伝
子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性DNAで得られた結果は、陰
性及び陽性対照として使うことができる。ある分離集団において、データ点の3つのクラ
スタを得、それによって、それらの分離されたクラスタの1つに属する可能性が高いとい
うサンプル結果の視覚的決定を可能にすることができる。あるいは、データ解析コンピュ
ータソフトウェアを使用して、サンプル結果がそれぞれの分離されたクラスタに属する尤
度を計算することができ、最も尤度の高いクラスタがそのサンプルの名称になる。視覚的
決定を行うとき、例えばデータ点の3つのクラスタが明瞭に見えるとき、各クラスタの境
界は任意であり得る。
ステム)を使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析することもで
きる。突然変異体対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナル
の相対蛍光単位(RFU)を一方の軸にプロットし、野生型対立遺伝子についての特異的
プローブによって生成された蛍光シグナルのRFUを他方の軸にプロットして、グラフを
生成することができる。その後、データのグラフィック表示でのクラスタ分離に基づいて
、接合状態決定を行うことができる。
して、野生型PCR生成物の蛍光読取値しかもたらすことができない。ヘミ接合性又はホ
モ接合性突然変異体ゲノムDNAを含有するサンプルは、結果として、陰性バックグラウ
ンド対照のものより高い突然変異体特異的プローブについてのRFU読取値をもたらすこ
とができる。サンプルが妥当な結果を生じさせない場合、そのサンプル中のゲノムDNA
は、妥当な質及び/又は量のものでないことがあり、新たなDNA調製及び/又は新たな
PCR反応を行うべきである。好ましくは、DNAサンプルを含有しない陰性対照サンプ
ルは、遺伝子特異的プローブの非常に低い検出を示す。公知ホモ接合性対照が、該対照中
の突然変異体DNA又は野生型DNAの高い検出のみを示すこと、及び公知ヘミ接合性対
照が、突然変異体DNAと野生型DNAの両方の高い検出を示すことも好ましい。
型及び/又は接合状態決定の「試験ラン」を行うことができる。該方法のさらなる最適化
は、用い方(例えば、ゲノムDNA調製方法、Taq DNAポリメラーゼ、オリゴヌク
レオチド、実験装置など)によって差があることがある成分には望ましいものであり得る
。許容可能なプローブ検出レベル(例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブについ
ての許容可能なRFU)で、公知ゲノムDNAテンプレートにおいて突然変異体配列及び
/又は野生型配列の両方を増幅する、PCR及び熱サイクリング条件を確立することがで
きる。
有性生殖を含む従来の植物育種によって、リグニン含有率が低いトウモロコシ植物(例
えば、BMRトウモロコシ)を生産するための方法をここで説明する。方法は、BMR突
然変異の少なくとも1つのコピー(例えば、bm3、bm3−1、bm3−2)をそのゲ
ノム内に含む第一の親トウモロコシ植物を第二の親トウモロコシ植物に交配させて、F1
後代を生産することを含み得る。該第一の植物は、例えば、BMRトウモロコシ品種F2
F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F566、F2F610、
F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F2F721、F2F70
0及びF2F797を含む、任意のBMRトウモロコシ植物であり得る。該第二の親トウ
モロコシ植物は、該第一のトウモロコシ植物と交配させたときに生育可能な後代トウモロ
コシ植物(すなわち、種子)を生産することができる任意のトウモロコシ植物であり得る
。該第一及び第二の親トウモロコシ植物は、同じトウモロコシ種(例えば、ジーメイズ(
Zea mays)(トウモロコシ))のものであってもよい。該方法は、F1後代を自
家受粉させてF2後代を生産することをさらに含むことができる。方法は、F1又はF2
後代植物を第一又は第二いずれかの親トウモロコシ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物へ
と戻し交配することから1又はそれ以上の世代をさらに含むことができる。あるいは、第
一の交配のF1後代、又は任意の後続の交配種を、第一又は第二いずれかの植物とは異な
る系統又は遺伝子型のものである第三のトウモロコシ植物に交配させることができる。
代植物の遺伝子型を判定すると、及び/又はそれらの接合状態を決定すると、当業者は、
所望の遺伝子構成を有する後代植物を選択することができる。そのような選択された後代
植物を、さらなる交配、自家受粉、又は栽培に使用することができる。本開示の方法によ
って導かれるBMR突然変異の遺伝子移入方法は、所望の遺伝子構成を有さない植物の栽
培及び/又は繁殖を低減又は排除し、それによって、(予想されるメンデル遺伝様式によ
り)望ましい信頼性及び予測性をもたらす。
実施例を、説明する特定の特徴又は実施形態に本開示を限定するものと解釈すべきでない
。
植物及び遺伝物質。ホモ接合性bm3対立遺伝子及びホモ接合性野生型COMT対立遺
伝子を含有するトウモロコシ葉サンプルを用意した。
nogrinder(登録商標)2000を使用して微粉に粉砕した。DNAをQiag
en DNeasy(商標)96ウエルキット(カリフォルニア州バレンシア)で抽出し
た。PCRの前に、製造業者の説示を用いてQuant−iT(商標)PicoGree
n(登録商標)定量キット(カリフォルニア州カールズバッドのInvitrogen)
で定量した。
−TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC−3’;配列番号:1)及びBM34
_R(5’−TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG−3’;配
列番号:2)を用い、ABI GeneAmp(登録商標)PCR System 97
00(カリフォルニア州フォスター・シティーのApplied Biosystems
)を使用して、2.5単位のTaKaRa LA Taq(商標)(日本、滋賀県のTa
kara Bio Inc.)と400nM dNTPと200nM フォワード(BM3
5_F)及びリバースプライマー(BM34_R)と30ngのゲノムDNAとを含有す
る反応物で、12のbm3系統及び3つの非bm3サンプル(表1を参照のこと)から部
分COMT遺伝子のトウモロコシゲノムDNAフラグメントを増幅した。PCRプログラ
ムを94℃で2分の変性で開始し、それに30サイクルの94℃で45秒間、55℃で4
5秒間そして72℃で2分間というサイクルが続いた。PCR生成物を2% E−Gel
(登録商標)(カリフォルニア州、カールズバッドのInvitrogen)で可視化し
、その後、0.8% E−Gel(登録商標)CloneWells(商標)で抽出した
。その後、精製されたPCR生成物をpCR4−TOPO(登録商標)ベクター(カリフ
ォルニア州、カールズバッドのInvitrogen)に、その製造業者の説示に従って
、クローニングした。選択されたコロニーを、一晩、1Xフリーザー培地(freeze
r media)で成長させ、この培地は、2.5% LB(1L LB培地に10g ト
リプトン、10g NaCl及び5g 酵母エキス)、36mM K2HPO4、13mM
KH2PO4、1.7mM クエン酸ナトリウム、6.8mM (NH4)2SO4、4.
4% グリセロール、0.4mM MgSO4・7H2O、12.5μg/mL クロラム
フェニコール(使用直前に添加)及び50μg/ml カナマイシンを含有した。その後
、選択されたコロニーを、T7及びT3プロモーター、並びにCOMT遺伝子内に位置す
るBM1234R(5’−ATCAGCATCAGCCAGGCAGG−3’;配列番号
:3)でのシークエンシングのために、Cogenics(登録商標)(テキサス州ヒュ
ーストン)に送った。Sequencher(登録商標)4.8ソフトウェアを使用して
、配列を分析した。bm3系統からのコンセンサス配列を野生型COMTサンプルと比較
することにより、bm3突然変異を同定した。
センサス配列に基づいて、プライマー(BM3_F;配列番号:4及びBM3_R:配列
番号:5)、及び突然変異体対立遺伝子を同定するためのCOMT遺伝子の部分配列の3
’末端を欠失させたジャンクションに特異的なプローブ(BM3_Probe;配列番号
:6);プライマー(COMT_F及びCOMT_R)及び野生型対立遺伝子を同定する
ための該欠失領域内のプローブ(COMT_Probe)を設計した。Primer E
xpress 3.0を、TaqMan(登録商標)アッセイ設計に使用した。すべての
プライマー、及びFAM又はVICとMinor Grove Binding Non
Flourescence Quencher(商標)I(MGBNFQ)色素とを有
する二重標識プローブは、Applied Biosystems(カリフォルニア州フ
ォスター・シティー)によって合成された。すべてのプライマー及びプローブを1X T
ris−EDTAに溶解して100μMにした。TaqMan(登録商標)遺伝子型判定
用マスターミックス(カリフォルニア州フォスター・シティーのApplied Bio
systems、カタログ#4371355)をすべてのPCR反応に使用した。
ニア州ハーキュリーズのBioRad)を用いて、95℃で15分の変性で開始し、それ
に50サイクルの92℃で15秒間そして60℃で1分間というサイクルが続く、20μ
L容量でのリアルタイムPCR反応を表2に従って構成した。各サイクル終了時に蛍光シ
グナルを記録した。
録商標)PCRアッセイを表3に従って構成した。95℃で15分の変性で開始し、それ
に30サイクルの92℃で15秒間そして60℃で1分間というサイクルが続く増幅のた
めに、ABI GeneAmp(登録商標)PCR System 9700(カリフォ
ルニア州フォスター・シティーのApplied Biosystems)を使用した。
最適な数のサイクルの後、反応が初期指数関数的増幅期にあるとき、分光蛍光光度計(T
ecan GENios(商標)、スイス、メンネドルフ)によって推奨計器設定(FA
M(bm3突然変異体):励起−485nm、発光−535nm;VIC(野生型COM
T):励起−525nm、発光−560nm)でPCR生成物を測定した。
である蛍光閾値をiCycler(登録商標)ソフトウェアによって自動計算した。規定
閾値より上の蛍光を発生させるために必要とされるサイクル数により、閾値サイクル(C
t値)を決定した。その後、対立遺伝子識別アッセイを用いて遺伝子型を決定した。
色素1のバックグラウンドを超えるシグナル(SOB1)及びレポート色素2のバックグ
ラウンドを超えるシグナル(SOB2)を計算した。サンプル数と対数尺度でのSOB1
/SOB2の絶対比の間の分布グラフを生成した。類似した遺伝子型バックグラウンドの
野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性植物のサンプルを対照として使用した。クラスタ分離
に基づいて遺伝子型判定を行った。
レートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。FAMのRFU(相対蛍光単位
)をx軸にプロットし及びVICのRFU(相対蛍光単位)をy軸にプロットしてグラフ
を生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。
bm3突然変異体についての遺伝子特異的TaqMan(登録商標)アッセイを設計す
るために、正確な配列情報を必要とした。そのために、2つのオリゴヌクレオチドを設計
して、12のbm3及び3つの非bm3系統からのゲノムDNAからの部分COMT遺伝
子(図1)を増幅した。図2。これらのフラグメントをpCR4−TOPO(登録商標)
ベクターにクローニングし、T7及びT3プロモーター、並びにBM1234R(配列番
号:3)でのシークエンシングのためにCogenics,Inc.に送った。BM12
34Rは、COMT遺伝子の中央に位置し、それを使用して完全長配列情報を獲得した。
Sequencher(登録商標)4.8を使用して、9つのbm3系統からの高品質配
列を分析及びアラインした。bm3系統からのコンセンサス配列を野生型サンプルと比較
した。COMT遺伝子の3’末端において複数の欠失/挿入突然変異が同定された。例え
ば、3つの突然変異が確認され、それらに下線を引いた。図3。
OMT遺伝子の3’エキソンに大きな欠失突然変異を有する。そこでこの突然変異を遺伝
子特異的TaqMan(登録商標)アッセイ設計のために使用した。図4は、オリゴヌク
レオチドの位置を示す略図を含む。野生型COMT遺伝子特異的プライマー及びプローブ
は、978bp欠失部位内に位置する。bm3特異的プライマー及びプローブは、欠失部
位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわ
たる、ジャンクションに位置する。
(登録商標)アッセイを試験した。bm3系統からのDNAと非bm3系統からのDNA
の同量を併せることにより、6つのヘミ接合性サンプルを作製した。リアルタイムPCR
を用いて、アッセイの効率を試験した。bm3突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチド
と対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて併用した。
FAMを使用してbm3のアンプリコンをモニターし、及びVICを使用して野生型CO
MTについてのアンプリコンをモニターした。指数関数的増幅期が、bm3遺伝子と野生
型COMT遺伝子の両方についてサイクル22から36まで観察された。図5a及び5b
。サイクル30において、FAMに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子1
と、及びVICに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子2と、正しい遺伝子
型決定を生じさせた。図6。
性及びヌル(野生型)として分離するbm3集団を含有するDNAサンプルの1つの96
ウエルプレートを使用して、エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRアッセイを
試験及び検証した。エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRの1つの利点は、使
用の容易さである。エンドポイントTaqMan(登録商標)PCRは、より高価なリア
ルタイムPCR機を必要としない。いずれの常用PCR機も96又は384ウエルプレー
トに適合し、アッセイを行うには、相対蛍光シグナルを読み取ることができるプレートリ
ーダーで十分である。
MT遺伝子からbm3遺伝子を効率的に分離することができる。サイクル30でPCR反
応を停止させた。TaqMan(登録商標)PCR及び蛍光読み取りの完了後、バックグ
ラウンド(H2O)を超えるFAM(bm3)の蛍光シグナルを、バックグラウンド1を
超えるシグナル(SOB1)として、及びバックグラウンド2を超えるVIC(野生型C
OMT)(SOB2)を計算した。対数尺度でのSOB1/SOB2を用いて、分布グラ
フを生成した。図7。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ
接合性対照は、陰性及び陽性対照となった。ある分離集団において、データ点の3つのク
ラスタを得、それによってカットオフ点を視覚的に決定することができた。図7における
実施例では、データ点の3つのクラスタが明瞭に見えた。野生型についてのデータ点は、
1未満であり、ヘミ接合性サンプルについてのものは、1から5の範囲であり、及びホモ
接合性のものについてのものは、5より上である。
ーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。FAMのRFU(相対蛍光単位)をx軸
にプロットし及びVICのRFU(相対蛍光単位)をy軸にプロットしてグラフを生成し
た。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。図8。FAMを
使用してbm3の増幅をモニターし、VICを使用して野生型COMTの増幅をモニター
したので、FAMの強いシグナルを有し、VICのシグナルを殆ど又は全く有さないサン
プルは、ホモ接合性bm3であり、VICの強いシグナルを有し、殆ど又は全くFAMを
有さないサンプルは、野生型COMT(ヌル)であり、及びFAMとVICの両方の強い
シグナルを有するサンプルは、ヘミ接合性であった。
の遺伝子型及び接合状態決定は、当分野において収集された表現型データと100%一致
した。このアッセイは、ハイスループット様式でbm3接合状態ステータスを特性決定す
る簡単かつ正確な方法を提供する。
bm3突然変異に関してのトウモロコシ植物の接合状態を上で説明したように決定する
。トウモロコシ植物がbm3突然変異についてホモ接合性であることを決定する。植物を
、従来の植物育種により、野生型COMT遺伝子についてホモ接合性であることが公知で
あるトウモロコシ植物、及びbm3突然変異についてホモ接合性のトウモロコシ植物と交
配させる。その交配種のF1後代を生産する。その後、該交配種のF1後代を自家受粉さ
せてF2後代を生産する。F2後代のゲノムDNAのサンプルを調製し、F2後代植物の
接合状態を上で説明したように決定する。
た後代を低リグニン含有率についてアッセイし、望ましく低いリグニンレベルを呈示する
後代を交配及び自家受粉によってさらに繁殖させ、得られた後代を栽培する。
とおり限定されないことは当業者にはわかるし、理解される。むしろ、下の特許請求の範
囲に記載する本発明の範囲を逸脱することなく、それらの好ましい実施形態に多くの付加
、欠失及び修飾を施すことができる。加えて、1つの実施形態からの特徴を別の実施形態
の特徴と組み合わせることができるが、本発明者らが考える本発明の範囲内になお包含さ
れる。
[1]トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び/又は存在/不在を決定するための方法であって、
単離されたゲノムDNAのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
上記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子と接触させる工程、及び
上記単離されたゲノムDNA中のbm3突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。
[2]上記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの核酸分子、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる2つの核酸分子と接触させる工程、
上記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む上記2つの核酸分子にハイブリダイズする上記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
上記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む上記2つの核酸分子にハイブリダイズする上記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子、及び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子を、上記増幅反応に含める工程、及び
上記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程
をさらに含む、上記[1]に記載の方法。
[3]上記第一のレポーター及び上記第二のレポーターが、区別可能な励起/発光スペクトルを有する蛍光色素である、上記[2]に記載の方法。
[4]上記第一のレポーターがFAMであり、及び上記第二のレポーターがVICである、上記[3]に記載の方法。
[5]配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも1つの核酸分子が、10ヌクレオチドと35ヌクレオチドの間の長さである、上記[1]に記載の方法。
[6]配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも1つの核酸分子が、15ヌクレオチドと30ヌクレオチドの間の長さである、上記[5]に記載の方法。
[7]配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも1つの核酸分子の1つが、配列番号:10の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95%同一である、上記[5]に記載の方法。
[8]配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む上記少なくとも1つの核酸分子が、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6からなる群より選択される、上記[7]に記載の方法。
[9]高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子が、区別可能な励起/発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、上記[1]に記載の方法。
[10]高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、FAMで標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子が、VICで標識される、上記[9]に記載の方法。
[11]上記ヌクレオチド配列の増幅が、PCR反応での増幅を含む、上記[1]に記載の方法。
[12]上記ヌクレオチド配列の増幅が、非PCRベースの反応での増幅を含む、上記[1]に記載の方法。
[13]ジーメイズ(Zea mays)におけるCOMT突然変異を同定するための方法であって、配列番号:6を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。
[14]植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法であって、
COMT遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
上記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムDNAのサンプルを得る工程、
上記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも1つの核酸分子と、接触させる工程、及び
COMT遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させることにより、高ストリンジェンシーで少なくとも1つの核酸分子を結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が上記遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。
[15]上記[1]に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
[16]上記[2]に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
[17]上記[14]に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え植物。
[18]上記[14]に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
[19]上記[14]に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。
BMR含有系統についての育種プロセスを大きく向上させることができるBMRトウモロコシ品種(例えば、bm3突然変異体)のハイスループットPCRベース分子特性決定方法を本明細書に開示する。bm3突然変異体及び野生型COMT対立遺伝子の存在又は不在を決定することによる、植物組織サンプル、及び従って該サンプルを調製した植物の接合状態の決定方法を開示する。従って、bm3遺伝子座における接合状態ステータスを特異的に検出及び試験する、エンドポイント加水分解プローブPCRベース接合状態アッセイ(これを本明細書ではTaqMan(登録商標)アッセイとして言及する)を提供する。アッセイであって、bm3突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスを同じアッセイにおいて利用するものであるアッセイを開示する。
Claims (19)
- トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び/又は存在/不在を決定す
るための方法であって、
単離されたゲノムDNAのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、
前記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高ス
トリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも
1つの核酸分子と接触させる工程、及び
前記単離されたゲノムDNA中のbm3突然変異の接合状態を決定する工程
を含む方法。 - 前記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイ
ブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの核酸分子、及び高
ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる2つの核
酸分子と接触させる工程、
前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配
列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記
2つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間
で増幅する工程、
前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配
列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記
2つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間
で増幅する工程、
第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10に
ハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子、及
び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11に
ハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子を、前記増幅反応に含める工
程、及び
前記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第一のレポーター及び前記第二のレポーターが、区別可能な励起/発光スペクトル
を有する蛍光色素である、請求項2に記載の方法。 - 前記第一のレポーターがFAMであり、及び前記第二のレポーターがVICである、請
求項3に記載の方法。 - 配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも1つの核酸分子が、10ヌクレオチドと35ヌクレオチドの間の長さである、請求項
1に記載の方法。 - 配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも1つの核酸分子が、15ヌクレオチドと30ヌクレオチドの間の長さである、請求項
5に記載の方法。 - 配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも1つの核酸分子の1つが、配列番号:10の10と35の間の連続したヌクレオチド
と少なくとも95%同一である、請求項5に記載の方法。 - 配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なく
とも1つの核酸分子が、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6からなる群より
選択される、請求項7に記載の方法。 - 高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌク
レオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリン
ジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの
核酸分子が、区別可能な励起/発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、請
求項1に記載の方法。 - 高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌク
レオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、FAMで標識され、及び高ストリンジ
ェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核
酸分子が、VICで標識される、請求項9に記載の方法。 - 前記ヌクレオチド配列の増幅が、PCR反応での増幅を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列の増幅が、非PCRベースの反応での増幅を含む、請求項1に記
載の方法。 - ジーメイズ(Zea mays)におけるCOMT突然変異を同定するための方法であ
って、配列番号:6を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。 - 植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための
方法であって、
COMT遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、
前記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムDNAのサンプルを得る工
程、
前記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイ
ズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも1つの核酸分子と、接触させる
工程、及び
COMT遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させる
ことにより、高ストリンジェンシーで少なくとも1つの核酸分子を結合する後代を選択す
る工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が前記遺伝
子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
- 請求項2に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。
- 請求項14に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え
植物。 - 請求項14に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコ
シ植物。 - 請求項14に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコ
シ植物。
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