BR112013008357B1 - Métodos de taqman de ponto final para a determinação da zigosidade do algodão compreendendo o evento cry1ac 3006-210-23 - Google Patents

Abstract

métodos de taqman de ponto final para a determinação da zigosidade do algodão compreendendo o evento cry1ac 3006-210-23. é fornecido um método para a análise de zigosidade do evento cry1ac 3006-210-23 do algodão. o método fornece iniciadores específicos do evento 3006-210-23 e específicos do genoma do algodão e combinações de sonda taqman para uso em um ensaio de pcr taqman biplex de ponto final capaz de determinar a zigosidade do evento e para o auxílio na intogressão do evento e reprodução.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] WIDESTRIKE é um produto de algodão que compreende dois eventos genéticos sintéticos de Bacillus thuringiensis: um evento baseado em cry 1 Ac 3006-210-23 e um evento baseado em cry1F 281 - 24-236, que juntos fornecem amplo espectro de resistência ao ataque de insetos. Os eventos são debatidos com maiores detalhes na, por exemplo, Patente U.S. N2 7.179.965.

[0002] O algodão é uma espécie alotetraplóide que contém um subgenoma A e um subgenoma D por cromossomo haplóide. Os algodoeiros trasgênicos WIDESTRIKE contêm um único evento de cópia da inserção do transgene em apenas um dos dois subgenomas. Visto que os dois subgenomas possuem alta similaridade nas sequências de nucleotídeos, iniciadores de oligonucleotídeo e sondas específicas para o alelo nulo (projetado a partir da região de flanqueamento do transgene inserido em um subgenoma) frequentemente amplificar o fragmento no outro subgenoma. Como tal, pode ser difícil diferenciar as amostras do tipo selvagem a partir de amostras vegetais que contém o transgene.

[0003] Vários métodos podem ser utilizados para detectar a presença de um dado evento em uma amostra. Um exemplo é a técnica Pyrosequencing descrita por Winge (Innov. Pharma. T ech. 00:18-24, 2000). Neste método um oligonucleotídeo é planejado o qual se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e insere a junção de DNA. O oligonucleotídeo é hibridizado com o produto da PCR de único filamento a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e outro na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da inserção de transge- ne/sequência de flanqueamento devido à amplificação, hibridização e extensão única ou de múltiplas bases bem sucedidas. (Esta técnica é geralmente utilizada para o sequenciamento inicial, não para a detecção de um gene específico quando ele for conhecido).

[0004] A polarização de fluorescência é outro método que pode ser usado para detectar um amplicon (fragmento amplificado). Seguindo este método, um oligonucleotídeo é planejado para se sobrepor ao flanqueamento genômico e junção inserida do DNA. O oligonucleotídeo é hibridizado com o produto de PCR de único filamento a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP rotulado fluorescente. A extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorôme- tro. Uma mudança na polarização indica a presença da inserção de transgene/sequência de flanqueamento devido a amplificação, hibridização e extensão de única base bem sucedidas.

[0005] O ensaio Invader (Third Wave Technologies, now Hologic, Inc., Wl, EUA) é um método não baseado na PCR e envolve a desnaturação do DNA genômico (25 a 50 min), que prepara as placas de ensaio Invader (adicionando mistura, controles, padrões, e DNA), incubação das placas em Thermo Cyclers ou incubadoras (2 a 2 1/2 horas), e leitura da placa de ensaio na leitora de placas Tecan. O ensaio Invader, embora novo nas suas cinéticas, possui muitas limitações. É muito demorado e trabalhoso. Visto que é um ensaio não baseado na PCR, requer DNA de alta qualidade e o resultado é altamente variável se a concentração de DNA for sub-ideal (< 11 ng/pl). Se a separação insuficiente de valores de RFU (unidades de fluorescência relativa) for observada, um periodo de incubação de 30 minutos adicionais é requerido e a placa então será lida novamente.

[0006] TAQMAN (Roche Molecular Systems, ver também, por exemplo, Life Technologies Corp., Carlsbad Calif.) é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômico de flanqueamento para a de detecção específico do evento. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na inserção da sequência de DNA e um no flanqueamento da sequência genômica) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibri- dização da sonda FRET resulta na divagem e liberação do componente fluorescente para longe do componente de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção de flanqueamento/transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedidas.

[0007] Os Sinais Moleculares têm sido descritos para uso na detecção de sequência. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada de modo que sobrepõe ao flanqueamento da junção de DNA genômico e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta em conter a estrutura secundária que mantém os componentes fluorescentes e de extinção em proximidade íntima. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação por PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET na sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial dos componentes fluorescentes e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica de flanqueamento/de inserção de transgene devido à amplificação e hi- bridização bem sucedidas.

[0008] Outro desafio, entre muitos, é encontrar um gene de referência adequado para um determinado teste. Por exemplo, conforme mencionado no resumo de Czechowski et al. “Um conjunto de dados excepcionalmente grande de estudos GeneChip do genoma inteiro Af- fymetrix ATH1 forneceu os meios para identificar uma nova geração de genes de referência com níveis de expressão muito estáveis nas espécies vegetais modelos Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Centenas de genes de Arabidopsis foram observados os quais superam os genes de referência tradicionais em termos de estabilidade de expressão ao longo do desenvolvimento e sob uma faixa de condições ambientais”. (Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17).

[0009] Brodmann et al. (2002) refere-se à detecção da PCR quantitativa em tempo real do conteúdo de milho transgênico no alimento para quatro diferentes variedades de milho aprovadas na European Union. Brodmann, P.D., P.D., Hg E.C., Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. ofAOAC international 2002 85 (3).

[00010] Baeumler et al. refere-se a um método de detecção da PCR quantitativa em tempo real específico para o algodão transgênico Wl- DESTRIKE. J. Agric. Food Chem. (2006) 54(18), 6527-6534.

[00011] Hernandez et al. (2004) menciona os quatro genes possíveis para uso com a PCR em tempo real. Hernandez, M., Duplan, M.- N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.

[00012] Costa et al. (2007) examinaram estes quatro genes (também no contexto da PCR em tempo real) e concluíram que o álcool desidrogenase e os genes de zeína foram os melhores genes de referência para a detecção de uma amostra de “evento” (um gene de lecti- na) para as questões de intermistura de alimento transgênicos. Costa, L. D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.

[00013] Huang et al. (2004) utilizaram pMulM2 plasmideo como moléculas de referência para a detecção de transgenes MON810 e NK603 no milho. Huang and Pan, “Detection of Genetically Modified Cotton MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods,” J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3264-3268.

[00014] Gasparic et al. (2008) sugerem a tecnologia LNA, a partir de uma comparação com a tecnologia de sonda em ciclos, TaqMan, e várias químicas de PCR em tempo real, para a análise quantitativa de eventos de algodão (tais como MON810). Gasparic, Cankar, Zel, and Gruden, “Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms”, BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.

[00015] A US 20070148646 refere-se a um método de extensão do iniciador para a quantificação que requer a dispensa controlada de nu- cleotídeos individuais que podem ser detectados e quantificados pela quantidade de nucleotídeos incorporados. Isto é diferente do método de PCR TaqMan que utiliza um gene de referência interno.

[00016] Para distinguir entre genótipos homozigotos e hemizigotos de evento TC1507 do milho, um ensaio Invader tem sido usado com sucesso para este evento. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects SingleCopy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008, 21, 173- 181.

[00017] Huabang (2009) refere-se ao teste de zigosidade com base na PCR de milho transgênico. No entanto, nenhum gene de referência parece ser usado. Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00018] A presente invenção refere-se em parte a um ensaio molecular para a determinação da zigosidade do evento 3006-210-23 no algodão. Mais especificamente, a presente invenção refere-se em parte a um ensaio de PCR TaqMan de ponto final para um evento 3006- 210-23 de crylAc WIDESTRIKE no algodão utilizando o DNA genômi- co de referência endógena em algodão. Algumas modalidades são direcionadas aos ensaios que são capazes de análise da zigosidade de alto rendimento. Os ensaios objetos oferecem uma opção confiável, consistente e rentável. Alguns ensaios preferidos se baseiam na fluorescência e consistem de uma configuração de PCR com a placa sendo subsequentemente lida em uma leitora de placas. Isto elimina a etapa de desnaturação e a necessidade de longos períodos de incubação. Assim, os ensaios objetos melhoram o tempo, trabalho e eficiência de custos.

[00019] Os ensaios objetos podem ser usados para a detecção específica do evento (3006-210-23) do transgene crylAc em plantas de algodão através da PCR TaqMan de ponto final. Este ensaio da zigosidade com base na PCR TaqMan é um ensaio biplex. Alguns dos en- saios objetos utilizam oligonucleotídeos específicos para o evento 3006-210-23 e suas sequências genômicas de flanqueamento; alguns outros ensaios utilizam oligonucleotídeos que correspondem ao DNA genômico do algodão utilizado como uma sequência de referência em uma reação isolada. A zigosidade é determinada pela intensidade relativa de fluorescência específica para o Evento 3006-210-23 como a sequência de referência.

[00020] Em uma modalidade, um ensaio específico do evento 3006- 210-23 exemplificado amplifica um fragmento 281-pb, único para o evento resultante da inserção do cassete de constructo 3006-210-23 no DNA genômico de algodão. Uma sonda de oligonucleotídeo específica do alvo se liga ao alvo entre os dois iniciadores por PCR (como exemplificado, WT_R9, complementar à sequência genômico de flanqueamento 3’, e WT_F9, complementar à extremidade 3’ da inserção contendo cry 1 Ac) e é rotulada com tintura fluorescente (tintura repórter) em sua extremidade 5’ e um supressor (tal como MGBNFQ (supressor não fluorescente de ligação em arvoredos menores)) em sua extremidade 3’. Os produtos de PCR são medidos após o número ideal ciclos, quando a reação está na fase exponencial prematura.

[00021] Devido à natureza poliploidia do algodão e da estrutura molecular do Evento 3006-210-23, oligos específicos para as sequências genômicas de flanqueamento do algodão deste evento amplificam em todas as plantas individuais de populações de segregação, e assim podem ser usados para separar o tipo selvagem de homozigotos em uma questão mais/menos. Assim, os oligos específicos da sequência do genoma foram usados como uma referência para a quantificação relativa do DNA genômico.

[00022] Isso é um ensaio de ponto final com base na fluorescência que permite que os resultados sejam lidos diretamente em uma leitora de placas para a identificação do Evento 3006-210-23 no algodão. Os amplicons gerados não se destinam a ser resolvidos em géis de agarose.

[00023] Em algumas modalidades preferidas, os protocolos objetos são preferivelmente utilizados para aplicações de reprodução, isto é, o teste relacionado à introgressão de um evento WIDESTRIKE em outras linhagens de algodão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00024] A Figura 1 mostra os resultados de uma leitora de placa para a medição de RFU e validação de controle.

[00025] A Figura 2 mostra a localização dos iniciadores e sondas para a determinação da zigosidade em relação ao evento de cry 1 Ac.

[00026] A Figura 3 ilustra a conexão de localização dos iniciadores do tipo selvagem.

[00027] A Figura 4 ilustra a conexão de localização dos iniciadores de transgene.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[00028] A SEQ ID NO: 1 é a sequência de DNA para a inserção do evento 3006-210-23 de crylAc e suas sequências de frontei- ra/flanqueamento.

[00029] A SEQ ID NOs: 2 a 7 são iniciadores e sondas exemplificados para uso de acordo com a invenção exposta.

[00030] A SEQ ID NO: 8 é o amplicon transgene.

[00031] A SEQ ID NO: 9 é o amplicon tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00032] A invenção exposta refere-se em parte a um ensaio de PCR TaqMan de ponto final com base na fluorescência utilizando o DNA genômico do algodão endógeno como um controle de referência para a análise de zigosidade de alto rendimento de 3006-210-23, um evento de CrylAc do algodão.

[00033] A invenção exposta refere-se também em parte ao desen- volvimento de uma PCR TaqMan de ponto final biplex para a análise de zigosidade específica do evento 3006-210-23. Além disso, a invenção exposta refere-se em parte ao desenvolvimento de kits de teste de reprodução do 3006-210-23.

[00034] Os ensaios TaqMan de ponto final baseiam-se em uma estratégia mais/menos, através da qual um “mais” significa que a amostra é positiva para o gene avaliado e um “menos” significa que a amostra é negativa para o gene avaliado. Estes ensaios tipicamente utilizam dois conjuntos de oligonucleotídeos para identificar a sequência de transgene de 3006-210-23 e a sequência do gene tipo selvagem, respectivamente, assim como as sondas rotuladas de forma dual para medir o teor da sequência de transgene e tipo selvagem.

[00035] Embora o ensaio Invader tenha sido uma técnica robusta para a caracterização dos eventos, é muito sensível à qualidade do DNA. Além disso, o ensaio requer uma elevada quantidade de DNA. O Invader também requer uma etapa de desnaturação adicional que, se não manipulada adequadamente, pode tornar o ensaio Invader malsucedido. Adicionalmente, o tempo de ensaio mais longo do ensaio Invader é limitado na sua flexibilidade para eficientemente manipular grandes números de amostras de 3006-210-23 para análise em uma configuração comercial. Uma vantagem principal da invenção exposta é a economia de tempo e eliminação da etapa de desnaturação. A análise TaqMan de ponto final objeto para detectar os eventos 3006-210-23 oferece vantagens surpreendentes sobre o Invader, particularmente na análise de grande número de amostras.

[00036] Em uma modalidade, a reação PCR específica do evento 3006-210-23 amplifica um fragmento 281-pb, único para o evento, re-sultante da inserção do cassete de constructo de 3006-210-23 no DNA genômico do algodão. Uma sonda de oligonucleotídeo específico do alvo 3006-210-23 se liga ao alvo entre dois iniciadores de PCR e é ro- tulado com uma tintura fluorescente e supressor. Os rótulos fluorescentes possíveis incluem FAM como uma tintura repórter na extremidade 5’ da sonda de 3006-210-23 e um Black Hole Quencher 1 (BHQ1) como o supressor na extremidade 3’ da sonda de 3006-210- 23.

[00037] Os iniciadores e as sondas para a inserção do gene cry 1 Ac e o DNA endógeno do algodão foram testados quanto à eficiência da PCR. As combinações de iniciador e sonda para o DNA endógeno do algodão foram exploradas com relação às capacidades de multiplexa- ção e ensaio de zigosidade TaqMan de ponto final.

[00038] Em algumas modalidades, os ensaios de zigosidade objetos utilizam um biplex de oligonucleotídeos específicos para o evento 3006-210-23 e para o DNA endógeno do algodão sem o evento (as sequências de flanqueamento carecendo da inserção de cry 1 Ac) no mesmo ensaio de amplificação. A zigosidade é determinada pela in-tensidade relativa da fluorescência específica para o Evento 3006-210- 23 em comparação com o DNA de referência.

[00039] Em algumas modalidades, o ensaio específico do evento 3006-210-23 amplifica um fragmento 281-pb, único para o evento, re-sultante da inserção do cassete de constructo 3006-210-23 no DNA genômico do algodão. Uma sonda de oligonucleotídeo específica do alvo se liga ao alvo entre dois iniciadores da PCR de 3006-210-23 específicos do evento e é rotulada com duas tinturas fluorescentes (tais como FAM como uma tintura repórter em sua extremidade 5’ e BHQ como uma tintura supressora em sua extremidade 3’). Os produtos da PCR são medidos após o número ideal de ciclos, tipicamente quando a reação estiver na fase exponencial precoce.

[00040] Em algumas modalidades, o ensaio TaqMan de ponto final com base na fluorescência para a análise da zigosidade de 3006-210- 23 permite que os resultados sejam diretamente lidos em uma leitora de placas para determinar a zigosidade do Evento 3006-210-23 WIDESTRIKE no algodão (sem uso de urn gene de referência perse).

[00041] A invenção exposta inclui aplicativos de reprodução tais como testar a introgressão de WIDESTRIKE em outras linhagens de algodão.

[00042] Os métodos de detecção e kits da invenção exposta podem ser utilizados para identificar os eventos de acordo com a invenção exposta. Os métodos e kits da invenção exposta podem ser usados para estratégias de reprodução acelerada e para estabelecer os dados de ligação.

[00043] As técnicas de detecção da invenção exposta são especialmente úteis em conjunto com a reprodução de plantas, para determinar quais as plantas descendentes compreendem um determinado evento, após uma planta de origem compreendendo um evento de interesse ter sido cruzada com outra linhagem de planta em um esforço para conferir um ou mais traços adicionais de interesse na descendência. Estes métodos de análise da PCR TaqMan beneficiam os programas de reprodução do algodão, assim como o controle de qualidade, especialmente para sementes transgênicas de algodão comercializadas. Os kits de detecção da PCR TaqMan para essas linhagens de algodão transgênico agora também podem ser produzidos e utilizados. Isso também pode beneficiar o registro do produto e manejo do produto.

[00044] Ainda mais, a invenção exposta pode ser utilizada para estudar e caracterizar os processos de integração do transgene, as características do sítio de integração genômica, a classificação do evento, a estabilidade dos transgenes e suas sequências de flanqueamento, e a expressão do gene (especialmente relacionadas com o silenci- amento do gene, padrões de metilação do transgene, efeitos de posição, e elementos relacionados com a expressão potencial tais como MARS [regiões de fixação da matriz], e outros mais).

[00045] Esta invenção ainda inclui os processos de execução de cruzamentos usando uma planta 3006-210-23 como pelo menos uma fonte. Por exemplo, a invenção exposta inclui uma planta híbrida Fi tendo como uma ou ambas as fontes qualquer uma das plantas aqui exemplificadas. Esta invenção inclui um método para a produção de uma semente híbrida F1 através do cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, origem de raça), colhendo a semente híbrida resultante, e testando a amostra de semen- tes/planta de acordo com a invenção exposta. As características das plantas resultantes podem ser melhoradas através de exame cuidadoso das plantas de origem.

[00046] Uma planta de algodão resistente aos insetos pode ser produzida pelo primeiro cruzamento sexual de uma primeira planta de algodão de origem que consiste em uma planta de algodão cultivada a partir da semente de qualquer uma das linhagens aqui referidas, e uma segunda planta de algodão de origem, produzindo assim uma pluralidade plantas de primeira geração; e depois a seleção de uma planta de primeira geração que é resistente a insectos (ou que possui pelo menos um dos eventos da invenção exposta); e a fertilização cruzada contínua da primeira planta de origem, produzindo assim uma pluralidade de plantas de segunda geração; e depois a seleção das plantas de segunda geração de uma planta que é resistente aos insetos (ou que possui pelo menos um dos eventos da invenção exposta). Estas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da planta de primeira geração ou da planta de segunda geração com a planta de algodão de origem ou uma terceira planta de algodão de origem. Uma cultura de algodão compreendendo sementes de algodão da invenção exposta, ou sua descendência, pode então ser plantada.

[00047] Também deve ficar entendido que duas plantas transgêni- cas diferentes também podem ser cruzadas para produzir a descendência que contém duas segregações independentes de genes exógenos adicionados. A fertilização cruzada contínua da descendência apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta de origem e a fecundação cruzada com uma planta não transgênica também são contemplados, tal como é a propagação vegetativa. Outros métodos de reprodução comumente usados para diferentes características e culturas são conhecidos na técnica. A reprodução por retrocruzamento tem sido usada para transferir os genes de uma característica simplesmente herdada, altamente hereditária para um cultivar homozi- goto desejável ou linhagem congênita, que é a origem recorrente. A fonte da característica a ser transferida é chamada a origem doadora. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da origem doadora. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzadas) com a origem recorrente. A origem resultante é esperada de ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da origem doadora.

[00048] As moléculas de DNA da presente invenção podem ser utilizadas com marcadores moleculares em um método de reprodução assistida por marcadores (MAB). As moléculas de DNA da presente invenção podem ser utilizadas com os métodos (tais como, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNPs e SSRs) que identificam as características geneticamente ligadas agro- nomicamente úteis, como é conhecido na técnica. A característica de resistência a insetos pode ser rastreada na descendência de um cruzamento com uma planta de algodão da invenção exposta (ou seu descendência e qualquer outro cultivar ou variedade de algodão) utili- zando os métodos de MAB. As moléculas de DNA são marcadores para essa característica, e os métodos de MAB que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para rastrear as características de resistência a insetos nas plantas de algodão, onde pelo menos uma linhagem de algodão da invenção exposta, ou sua descendência, foi um ancestral ou antepassado. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para identificar qualquer variedade de algodão tendo o evento de resistência a insetos a partir da linhagem de algodão 3006-210-23.

[00049] Os métodos da invenção exposta incluem um método de produção de uma planta de algodão resistente a insetos, em que referido método compreende a reprodução com uma planta da invenção exposta. Mais especificamente, referidos métodos podem compreender o cruzamento de duas plantas da invenção exposta, ou de uma planta da invenção exposta e qualquer outra planta, e o rastro do evento objeto de acordo com a invenção exposta. Os métodos preferidos ainda compreendem a seleção da descendência de referido cruzamento através da análise de referida descendência de um evento detectável de acordo com a invenção exposta.

[00050] Uma planta preferida, ou uma semente, propagada e desenvolvida de acordo com a invenção exposta compreende em seu genoma pelo menos uma das sequências de inserção (resíduos 528- 8900 da SEQ ID NO: 1) em conjunto com pelo menos 20 a 500 ou mais nucleotídeos de flanqueamento contíguos em ambos os lados da inserção (resíduos de 1 a 527 e 8901 a 9382 da SEQ ID NO: 1). A não ser que de outra maneira indicada, “evento 3006-210-23” ou referência semelhante refere-se ao DNA da SEQ ID NO: 1 que inclui o DNA hete- rólogo inserido no local genômico identificado por toda ou parte de ambas as sequências genômicas de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido, que se espera que seja transferido para a descendência que recebe o DNA inserido como um resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem de origem que inclui o evento.

[00051] As definições e exemplos são aqui fornecidos para ajudar a descrever a presente invenção e para orientar aqueles de habilidade prática na técnica para praticar a invenção. A não ser que de outra maneira mencionada, os termos devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional por aqueles de habilidade prática na técnica relevante. A nomenclatura para as bases de DNA conforme apresentado na 37 CFR § 1.822 é usada.

[00052] Um “evento” transgênico é produzido pela transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, um constructo de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e a seleção de uma planta em particular caracterizada pela inserção em um local particular do genoma. O termo “evento” refere-se ao transformante original e a descendência do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo “evento” também se refere à descendência produzida por uma fecundação cruzada sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgene. Mesmo após o retrocruzamento repetido com uma origem recorrente, o DNA transgene inserido e o DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/transgene) da origem transformada estão presentes na descendência do cruzamento no mesmo local cromossômico. O termo “evento” também se refere ao DNA do transformante original e sua descendência que compreende o DNA inserido e a sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que seria esperado de ser transferido para uma descendência que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem de origem que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a descendência que re- sulta da fertilização cruzada contínua) e uma linhagem de origem que não contém o DNA inserido.

[00053] Uma “sequência de junção” abrange o ponto em que o DNA inserido no genoma está ligado ao DNA a partir do genoma nativo do algodão que flanqueia o ponto de inserção, a identificação ou a detecção de uma ou das outras sequências de junção em um material genético da planta que é suficiente para ser um diagnóstico para o evento. Incluem-se as sequências de DNA que abrangem as inserções nos eventos de algodão aqui descritos e comprimentos semelhantes de flanqueamento do DNA. Os exemplos específicos de tais sequências de diagnóstico são aqui fornecidos, no entanto, outras sequências que se sobrepõem às junções das inserções, ou às junções das inserções e à sequência genômica, também são de diagnóstico e podem ser usados de acordo com a invenção exposta.

[00054] Os iniciadores, amplicons e sondas podem ser designadas para uso de acordo com a invenção exposta com base em parte nas sequências de flanqueamento, junção e/ou inserção. Os iniciadores e amplicons relacionados podem ser incluídos como componentes da invenção. Métodos de análise da PCR que utilizam amplicons que se estendem através do DNA inserida e as suas margens podem ser usados para detectar ou identificar as variedades transgênicas de algodão comercializadas ou linhagens derivadas das linhagens de algodão transgênicas proprietárias objetos.

[00055] A sequência da inserção de cry 1 Ac (juntamente com as se-quências reguladoras), flanqueada pelas sequências de flanqueamento, é fornecida como SEQ ID NO: 1. As coordenadas das sequências de inserção e flanquamento em relação à SEQ ID NO: 1 são como se segue: o flanquamento 5’ é os resíduos de 1 a 527, a inserção genética de Evento 3006-210-23 é os resíduos 528 a 8900, e a sequência de flanqueando 3’ é os resíduos de 8901 a 9382.

[00056] Este evento de inserção, incluindo os seus componentes, é ainda ilustrado, por exemplo, na Patente U.S. Ns 7.179.965. Informações sobre o depósito de sementes também são nela fornecidas. Com base nestas sequências de inserção e de margem, os iniciadores específicos do evento eram, e podem ser, gerados. A análise de PCR demonstrou que estas linhagens de algodão podem ser identificadas em diferentes genótipos de algodão através da análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos do evento. Assim, estes e outros procedimentos relacionados podem ser usados para somente identificar estas linhagens de algodão.

[00057] Como aqui utilizado, uma “linhagem” é um grupo de plantas que apresentam pouca ou nenhuma variação genética entre os indivíduos por pelo menos uma característica. Tais linhagens podem ser criadas por diversas gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetative a partir de uma única origem usando técnicas de cultura de tecidos ou de células.

[00058] Como aqui usado, os termos “cultivar” e “variedade” são sinônimos e referem-se a uma linhagem que é usada para a produção comercial. “Estabilidade” ou “estável” significa que em relação ao componente fornecido, o componente é mantido de geração para geração e, preferivelmente, pelo menos três gerações substancialmente no mesmo nível, por exemplo, de preferência ± 1 5%, mais preferivelmente ± 10%, o mais preferível ± 5%. A estabilidade pode ser afetada pela temperatura, localização, estresse e época do plantio. A comparação das gerações subsequentes sob as condições de campo deve produzir o componente de uma maneira semelhante.

[00059] “Utilidade Comercial” é definida como tendo um bom vigor e alta fertilidade da planta, de tal modo que a cultura pode ser produzida por agricultores utilizando equipamento convencional de agricultura, e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído a partir da semente utilizando equipamento de trituração e extração convencional. Para ser comercialmente útil, o rendimento, como medido por peso da semente, teor de óleo, e óleo total produzido por acre, está dentro de 15% do rendimento médio de uma variedade de canola comercial de outro modo comparável sem as características do valor de prêmio cultivada na mesma região.

[00060] “Elite agronômica” significa que uma linhagem possui ca-racterísticas agronômicas desejáveis tais como rendimento, maturidade, resistência a doenças, e outras mais, além da resistência a insetos devido ao evento exposto.

[00061] Como uma pessoa versada na técnica irá reconhecer à luz desta divulgação, as modalidades preferidas de kits de detecção, por exemplo, podem incluir sondas e/ou iniciadores direcionados às “sequências de junção” ou “sequências de transição” e/ou compreendendo-as (onde a sequência de flanquamento genômico do algodão encontra a sequência de inserção). Por exemplo, isso inclui uma sonda, iniciador ou amplicon de polinucleotídeo compreendendo uma sequência que inclui os resíduos, como indicado na Tabela 1. Alguns iniciadores preferidos podem incluir pelo menos ~15 resíduos da sequência de flanquamento adjacente e pelo menos ~15 resíduos da sequência de inserção adjacente. Os resíduos dentro de 200 bases mais ou menos das sequências de junção podem ser direcionados. Com esta disposição, outro iniciador na região de flanquamento ou inserção pode ser utilizado para gerar um amplicon detectável que indica a presença de um evento da invenção exposta. Em algumas modalidades preferidas, um iniciador se liga na região de flanquamento e um se liga na inserção, e estes iniciadores podem ser utilizados para gerar um amplicon que abrange (e inclui) uma sequência de junção.

[00062] Uma pessoa versada na técnica também irá reconhecer que os iniciadores e sondas podem ser designados para hibridizar, sob uma faixa de hibridização padrão e/ou condições de PCR, em um segmento da SEQ ID NO: 1, e os seus complementos, em que o iniciador ou a sonda não é perfeitamente complementar à sequência exemplificada. Isto é, certo grau de ligação imperfeita pode ser tolerado. Para um iniciador de aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente um ou dois mais ou menos nucleotídeos não necessitam se ligar com o filamento oposto se a base mal combinada for interna ou na extremidade do iniciador que é oposta ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Os análogos sintéticos de nucleotídeo, tais como inosina, também podem ser utilizados nas sondas. As sondas de ácido nucleico peptídico (PNA), assim como as sondas de DNA e RNA, também podem ser usadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores são de diagnóstico com relação à presença (capaz de somente identificar e distinguir) de um evento da invenção exposta.

[00063] Os componentes da “inserção” ou constructo de transgene são divulgados, por exemplo, na Patente U.S. N2 7.179.965. As sequências de polinucleotídeo ou fragmentos destes componentes podem ser utilizados como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos da presente invenção.

[00064] Em algumas modalidades da invenção, as composições e métodos são fornecidos para detectar o número de cópias da região de inserção de transgene/genômica, em plantas e sementes e outras mais, de uma planta de algodão designada WIDESTRIKE compreendendo o evento 3006-210-23 de CrylAc. As sequências de DNA são fornecidas as quais compreendem pelo menos um sequência de junção da região de inserção de transgene/genômica aqui fornecida na SEQ ID NO: 1, os seus segmentos, e os complementos das sequências exemplificadas e qualquer um de seus segmentos. A sequência de junção da região de inserção abrange a junção entre o DNA heteró- logo inserido no genoma e o DNA da célula de algodão que flanqueia o sítio de inserção. Tais sequências são de diagnóstico para o evento exposto.

[00065] Com base nessas sequências de inserção e de margem, os iniciadores específicos do evento foram gerados. A análise de PCR TaqMan da invenção exposta demonstrou que o evento 3006-210-23 de algodão pode ser identificado em diferentes linhagens e genótipos de algodão mediante a análise dos amplicons de PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos do evento. Estes e outros procedimentos relacionados podem ser utilizados para somente identificar estas linhagens de algodão.

[00066] Em algumas modalidades, as sequências de DNA que compreendem (ou são complementares, pelo menos em parte) um parte/segmento contíguo das regiões de inserção de transge- ne/genômica são um aspecto desta invenção. São incluídas as sequências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência de inserção do transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência genômico do algodão de uma ou mais das plantas de algodão objetos.

[00067] As modalidades relacionadas pertencem às sequências de DNA que compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos contíguos de uma parte de transgene de uma sequência de DNA da SEQ ID NO: 11, ou seus complementos, e um comprimento semelhante da sequência de flanqueamento do DNA de algodão, ou seus complementos. Tais sequências são úteis como, por exemplo, iniciadores de DNA nos métodos de amplificação do DNA. Os componentes da invenção também incluem os amplicons produzidos por tais iniciadores de DNA e iniciadores homólogos.

[00068] Esta invenção também inclui métodos para a detecção da presença de DNA, em uma amostra, a partir de pelo menos uma das plantas de algodão aqui referidas. Tais métodos podem compreender: (a) colocar em contato a amostra compreendendo DNA com um conjunto de iniciadores, quando utilizado em uma reação de amplificação do ácido nucleico, da invenção exposta, com o DNA de pelo menos um destes eventos de algodão; (b) executar uma reação de amplificação por PCR TAQMAN utilizando o DNA de referência aqui identificado; e (c) analisar os resultados.

[00069] Em mais outras modalidades, a invenção exposta inclui métodos de produção de uma planta de algodão que compreende um evento de cry 1 Ac da invenção exposta, em que referido método compreende as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linhagem de algodão de origem (compreendendo um cassete de expressão da presente invenção, que confere referida característica de resistência a insetos nas plantas de referida linhagem) e uma segunda linhagem de algodão de origem (que carece desta característica de tolerância a insetos), produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes; e (b) selecionar uma planta descendente com base nos resultados de pelo menos uma técnica de ensaio da invenção exposta. Tais métodos podem opcionalmente compreender a etapa adicional de retrocruza- mento da planta descendente para a segunda linhagem de algodão de origem para produzir uma planta de algodão de reprodução genuína que compreende a referida característica de tolerância a insetos. De acordo com outro aspecto da invenção, os métodos relacionados para a determinação da zigosidade de descendência de um cruzamento são fornecidos.

[00070] Os kits de detecção do DNA podem ser desenvolvidos utilizando as composições aqui divulgadas e métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do DNA do evento de algodão exposto em uma amostra e podem ser aplicados aos métodos para a reprodução de plantas de algodão contendo este DNA. Os kits contêm sequências de DNA homólogas ou complementares aos amplicons, por exemplo, aqui divulgadas, ou às sequências de DNA homólogas ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgenes dos eventos expostos. Estas sequências de DNA podem ser usadas nas reações de amplificação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits também podem conter os reagentes e os materiais necessários para a execução do método de detecção.

[00071] Uma “sonda” é uma molécula isolada de ácido nucleico a qual é ligada um rótulo detectável convencional ou molécula repórter (tal como um isótopo radioativo, ligando, agente quimioluminescente ou enzima). Uma tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de um dos referidos eventos de algodão, quer a partir de uma planta de algodão ou a partir de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não apenas os ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos, mas também as poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser utilizados para detectar a presença desta sequência de DNA alvo.

[00072] Os “iniciadores” são ácidos nucleicos isolados que são tratados com calor em um filamento de DNA alvo complementar através da hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, e podem ser usados em conjunto com uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Os pares de iniciador da presente invenção referem-se ao seu uso para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais.

[00073] As sondas e iniciadores (e amplicons) são geralmente de 5 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461,462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481,482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500 polinucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente em uma sequência alvo sob as condições de hibridização de alta severidade. De preferência, as sondas e os iniciadores de acordo com a presente invenção possuem similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo e que retêm a capacidade de hibridizar as sequências alvo possam ser planejadas por meio de métodos convencionais.

[00074] Os métodos para a preparação e utilização de sondas e iniciadoras são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Os pares de iniciador da PCR podem ser derivados de uma sequência conhecida, por exemplo, através do uso de programas de informática destinados para este propósito.

[00075] Os iniciadores e as sondas com base no DNA de flanquamento e as sequências de inserção aqui divulgadas podem ser utilizados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as sequências divulgadas pelos métodos convencionais, por exemplo, através da re- clonagem e sequenciamento de tais sequências.

[00076] As sondas de ácido nucleico e os iniciadores da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas em uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação convencional de ácido nucleico pode ser usado para identificar a presença do DNA a partir de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácido nucleico ou seus fragmentos são capazes de especificamente hibridizar com outras moléculas de ácido nucleico sob determinadas circunstâncias. Como aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são consideradas capazes de especificamente hibridizar entre si se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico anti-paralela de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucleico é referida de ser o “complemento” de outra molécula de ácido nucleico se elas apresentam complementaridade total. Como aqui utilizado, as moléculas são supostas de apresentar “complementaridade total” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são referidas “minimamente complementares” se elas puderem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam recozidas uma com a outra pelo menos sob as condições convencionais de “baixa severidade”. Similarmente, as moléculas são referidas de ser “complementares” se puderem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam recozidas entre sob condições convencionais de “alta severidade”. As condições de severidade convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989. Desvios de complementaridade total são, portanto, permissíveis, contanto que tais desvios não impeçam completamente a capacidade das moléculas em formar uma estrutura de filamento duplo. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela necessita apenas ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações particulares de solvente e sal empregadas.

[00077] Como aqui utilizado, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que especificamente hibri- diza com o complemento da sequência de ácido nucleico a qual está sendo comparada sob condições de elevada severidade. O termo “condições rigorosas” é funcionalmente definido no que diz respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucleico com um ácido nucleico alvo (isto é, com uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento específico de hibridização debatido em Sambrook et al., 1989, em 9.52-9.55. Ver também, Sambrook et al., 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-9.58. Consequentemente, as sequências de nucleotídeo da invenção podem ser usadas pela sua capacidade de seletivamente formar moléculas duplex com alongamentos complementares de fragmentos de DNA.

[00078] Dependendo da aplicação visionada, pode-se utilizar condições variáveis de hibridização para alcançar vários graus de seletividade da sonda em direção a sequência alvo. Para aplicações que requerem elevada seletividade, tipicamente se empregará condições relativamente rigorosas para formar os híbridos, por exemplo, selecio- nam-se condições com teor de sal relativamente baixo e/ou de alta temperatura, tais como proporcionadas por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCI em temperaturas de cerca de 50°C a cerca de 70°C. As condições rigorosas, por exemplo, pode envolver a lavagem do filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta severidade (0,2 X SSC, 0,1% SDS, 65°C). As condições de severidade apropriadas que promovem a hibridização do DNA, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio 6,0 X (SSC) ao redor de 45°C, seguido de uma lavagem de 2,0 X SSC a 50°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de uma baixa severidade de cerca de 2,0 X SSC a 50 0 C até uma elevada severidade de cerca de 0,2 X SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir das condições de baixa severidade na temperatura ambiente, ao redor de 22°C, até as condições de elevada severidade ao redor de 65 °C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Tais condições seletivas toleram pouca, talvez nenhuma, ligação imperfeita entre a sonda e o molde ou filamento alvo. A detecção de sequências de DNA através da hibridização é bem conhecida daqueles de habilidade na técnica, e os ensinamentos das Patentes U.S. N22 4.965.188 e 5.176.995 são exemplares dos métodos de análises de hibridização.

[00079] Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção especificamente irá hibridizar com um ou mais dos iniciadores (ou amplicons ou outras sequências) aqui exemplificados ou sugeridos, incluindo os seus complementos e fragmentos, sob condições de elevada severidade. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção possui a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 2 a 7, ou seus complementos e/ou fragmentos.

[00080] Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade com tais sequências de ácido nucleico. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser usadas nos métodos de reprodução de plantas, por exemplo, para identificar a descendência dos cruzamentos genéticos. A hibridização da sonda para a molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, estes podem incluir, mas não são limitados por eles, rótulos fluorescentes, rótulos radioativos, rótulos à base de anticorpos, e rótulos quimioluminescentes.

[00081] Com respeito à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, através da PCR) usando um par de inicia- dores de amplificação particular, as “condições rigorosas” são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize apenas com a sequência de ácido nucleico alvo em que um iniciador tendo a sequência tipo selvagem correspondente (ou o seu complemento) deve se ligar e preferivelmente produzir um único produto de amplificação, o amplicon.

[00082] O termo “específico para (uma sequência alvo)” indica que uma sonda ou um iniciador hibridiza sob condições de hibridização rigorosas apenas para a sequência alvo em uma amostra que compreende a sequência alvo.

[00083] Como aqui utilizado, o “DNA amplificado” ou “amplicon” re- fere-se ao produto da amplificação de ácido nucleico de uma sequência de ácido nucleico alvo que faz parte de um modelo de ácido nucleico. Por exemplo, para determinar se a planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico do evento transgênico do algodoeiro da presente invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido da planta de algodão pode ser submetido ao método de amplificação de ácido nucleico utilizando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da sequência de flanquamento no genoma da planta adjacente no sítio de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é de diagnóstico com relação à presença do DNA de evento. O amplicon é de um comprimento e possui uma sequência que também é de diagnóstico para o evento. O amplicon pode variar no comprimento a partir do comprimento combinado dos pares de iniciadores acrescido de um par de bases de nucleotídeo, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciadores acrescido de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489,490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, or 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, ou mais pares de bases de nucleotídeo (mais ou menos qualquer um dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da sequência de flan- quamento em ambos os lados do DNA inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui toda a sequência de nucleotídeo inserida. Um membro de um par de iniciadores obtido a partir da sequência genômica da planta pode estar localizado a uma distância da sequência de DNA inserida. Esta distância pode variar a partir de um par de bases de nucleotídeo até cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeo. O uso do termo “amplicon” especificamente exclui os dímeros de iniciador que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA.

[00084] A amplificação de ácido nucleico pode ser executada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação é conhecid na técnica e é descrita, inter alia, na Patente U.S. N2 4.683.195 e na Patente U.S. N2 4.683.202. Os métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos assim como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência da inserção de DNA transgênico heterólogo ou a sequência genômica de flanquamento de um evento de algodão objeto pode ser verificada (e corrigida se necessário) através da amplificação de tais sequências do evento utilizando iniciadores derivados das sequências aqui fornecidas, seguido pelo sequenciamento do DNA padrão do amplicon da PCR ou do DNA clonado.

[00085] O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Electroforese em gel de agarose e manchamento com brometo de etídio é um método comum bem conhecido para detectar amplicons de DNA. Outro tal método é Genetic Bit Analysis onde um oligonucleotideo de DNA é planejado o qual se sobrepõe tanto à sequência de DNA genômico de flanquamento adjacente quanto à sequência de DNA inserida. O oligonucleotideo é imobilizado em reservatórios de uma placa de micro-reservatórios. Após a PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e outro na sequência genômica de flanquamento adjacente), um produto da PCR de filamento único pode ser hibridizado com o oligonucleotideo imobilizado e serve como um modelo para uma reação de extensão de base isolada usando uma polimerase de DNA e ddNTPs rotulados específicos para a base seguinte esperada. A leitura completa pode ser fluorescente ou com base em ELISA. Um sinal indica a presença da sequência de inserção/flanquamento devido à amplificação, hibridização e extensão de base isolada bem sucedida.

[00086] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações referidas ou aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade, na medida em que elas não sejam incon-sistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Extração do DNA genômico

[00087] O DNA foi extraído do tecido da folha de algodão obtido de uma única planta usando QIAGEN’S DNeasy 96 Plant Kit (Qiagen, Valencia, CA). O protocolo QIAGEN foi implementado de acordo com as recomendações do fabricante com algumas modificações para a extração do DNA de algodão como se segue: Uma concentração final de metabissulfito de sódio 10 mM foi adicionada durante a lise das células e uma concentração final de DTT 10 mM foi adicionada ao DNA final (Home et al., 2004). O DNA foi quantificado usando o corante Pico- Green® da Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Cada reservatório de uma placa de microtitulação continha 100 pl de PicoGreen 200 vezes combinados com 5 pl de amostra de DNA ou padrões de DNA lambda (0, 2,5, 5 e 10 ng/pl). As placas foram agitadas brevemente usando o agitador de placas padrão e leitura usando o fluorômetro Spectra Max® da Molecular Devices (Sunnyvale, CA). As concentrações da amostra de DNA foram diluídas para 12 ng/pl com água estéril.

Exemplo 2 - Planejamento e Seleção do Iniciador

[00088] Os iniciadores e sondas (um fluoróforo na extremidade 5’ e um Black Hole Quencher™ na extremidade 3’) foram projetados tanto para o tipo selvagem quanto para o transgene usando o software Primer Express®, versão 3.0 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) e o software Vector NTI® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Os iniciadores dianteiros e inversos foram dispostos em pares, a PCR foi executada e os resultados foram analisados por electroforese em gel (e-gel agarose a 2%). Os candidatos mais promissores foram então combinados com as sondas e operados sobre a PCR em tempo real. Com base nos resultados da PCR em tempo real, um par de iniciadores transgene e um par de iniciadores tipo selvagem com as respectivas sondas foram selecionados.

Exemplo 3 - Condições Padrão da PCR

[00089] As sondas foram rotuladas com diferentes tinturas fluorescentes (FAM-490 para o transgene e Texas Red para o tipo selvagem). As reações PCR foram executadas em um volume final de 25 pl contendo: 0,2 pM do iniciador de evento comum e do iniciador dianteiro transgene, 0,4 pM do iniciador dianteiro tipo selvagem, 0,08 pM de cada sonda, 0,3 mM de dNTP, 4 mM de MgCh, 2,5 pl de PVP-40 a 10%, 1 unidade de HotStarTaq DNA Polimerase (Qiagen, Valencia, CA), e 36 ng de DNA modelo. PVP-40 foi adicionado à reação para melhorar a fidelidade da PCR (Home et al, 2004). As reações de PCR foram operadas em GeneAmp® PCR System 9700 Thermocyclers (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) utilizando as seguintes condições de ciclagem: Reações PCR individuais tipo selvagem e transgene desnaturadas a 95°C durante 15 min; 40 ciclos de 95°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg. 72°C durante 30 seg, seguido de uma extensão final a 72,0°C durante 5 min. A reação PCR combinada - 95°C durante 15 min; 35 ciclos de 95°C durante 15 seg, 60°C durante 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C durante 5 min.

Exemplo 4 - Preparação do Protocolo de PCR

[00090] Um protocolo existente Cotton 3006 CrylAc e um protocolo publicado intitulado “Event Specific Method for the Quantification of Cotton 3006-210-23 Using Real-Time PCR” were reviewed. [Horne, E.C., S.P. Kumpatla, K.A. Patterson, M. Gupta and S.A. Thompson. 2004. Improved high-throughput sunflower and cotton genomic DNA extraction and PCR fidelity. Plant Molecular Biology Reporter 22:93a- 83L] [Protocol cotton 3006-210-23 - Community Reference Laboratory for GM Food and Feed. Method validated by Joint Research Centre - European Commission. Biotechnology & GMOs Unit. CRLVL14/05VP. 04/21/2006.] Ver também a Patente U.S. N- 7.179.965. As concentrações dos reagentes utilizados nos dois protocolos foram calculadas e uma receita inicial de PCR foi gerada (Tabela 1). Tabela 1: O protocolo inicial TaqMan®

[00091] Esta receita, junto dos iniciadores e controles anteriormente planejados, foi utilizada para gerar uma reação PCR de linha de base. Uma PCR gradiente foi operada (faixa de temperatura de 50°C a 66°C), e análise de E-gel foi utilizada para determinar a temperatura ideal. Os géis iniciais mostraram baixa especificidade, assim as concentrações de MgCh e dNTP foram ajustadas. Temperaturas de 60°C e 55°C foram selecionadas como as temperaturas de recozimento mais eficientes. A reação PCR transgene e a reação PCR tipo selvagem foram operadas separadamente neste momento.

Exemplo 5 - Seleção de Sondas e Pares de Iniciadores

[00092] Os pares de iniciador de #1 a #7 (diretos e inversos) foram anteriormente projetados e um adicional de 15 novos iniciadores foram planejados.

[00093] Os iniciadores dianteiros e inversos (20 uM) foram dispostos em pares (ver a Tabela 2), combinados com a receita de PCR e operados em PCRs gradientes de recozimento com temperaturas variando de 45°C a 66°C. Os melhores resultados foram observados utilizando pares de iniciadores #13, #14, #20, #21 e #22 em temperaturas de recozimento de 55°C e 60°C. Tabela 2: Lista de iniciadores utilizados na otimização do ensaio TaqMan® de CrylAc do algodão.

[00094] 3006_WT_P4 3006 e 3006_WT_P6 foram rotulados com a tintura Texas Red para uso como sondas na reação PCR transgene e 3006_IAC_Probe_8796 e 3006_TG_P2 foram rotulados com a tintura FAM-490 para uso como sondas na reação PCR tipo selvagem. Os pares de iniciadores #13 e #14 foram combinados com as sondas 3006_IAC_Probe_8796 e 3006_TG_P2. Os pares de iniciador #20, #21 e #22 foram combinados com as sondas 3006_WT_P4 e 3006_WT_P6. As sequências para estes iniciadores e sondas são apresentadas na Tabela 3. Tabela 3: Sequências de iniciador/sonda utilizadas para validar e otimizar o ensaio TaqMan® de CrylAc.

[00095] O amplicon transgene (SEQ ID NO: 8) é de 325 pares de bases. Ver a Figura 3. O amplicon tipo selvagem é fornecido como SEQ ID NO: 9. Ver a Figura 4.

[00096] A Tabela 4 mostra a disposição da placa para a reação PCR em tempo real. Tabela 4: Disposição da Placa de PCR em Tempo Real.

Exemplo 6 - Análise da PCR em Tempo Real

[00097] O protocolo utilizado para a PCR em tempo real é como se segue:

[00098] Os parâmetros de dados para a PCR em tempo real são: “O limiar calculado foi substituído pelo limiar selecionado pelo usuário de 57,6. Os ciclos da linha de base por reservatório foram determinados automaticamente. A janela de análise de dados é configurada em 95,00% de um ciclo, centralizada no firn do ciclo. A filtragem digital média ponderada foi aplicada. A filtragem global é desligada”. Os resultados da PCR em tempo real mostraram que 60°C (em vez de 55°C) é uma temperatura melhor (mais específica) para a reação. O conjunto de iniciadores #20 com sonda 3006_WT_P4 mostrou amplificação ideal entre 27,9 e 30,3 ciclos. O conjunto de iniciadores #14 com sonda 3006_IAC_Probe_8796 mostrou amplificação ideal entre 27,6 e 29,2 ciclos.

[00099] A reação PCR em tempo real foi de configurada com uma temperatura de recozimento de 60°C e as reações PCR tanto transge- nes quanto do tipo selvagem foram combinadas. Os resultados mostraram amplificação ideal entre 25,6 e 28,2 ciclos. Com base nestes resultados e a redução do tempo total de reação PCR, o número de ciclos de PCR foi reduzido para 35 e a reação PCR foi reduzida para uma reação de 2 etapas com o tempo de desnaturação a 95 °C reduzido para 15 segundos e as etapas de recozimento/extensão a 60°C do protocolo combinadas durante um tempo total de 60 segundos.

Exemplo 7 - Validação de Controle

[000100] As sementes de controle positivo e negativo do evento an-teriormente testadas usando o sistema de ensaio de zigosidade INVADER (Third Wave Technologies, Inc.) foram utilizadas. O DNA preparado a partir dos controles foi rotulado como hemizigoto, homozigoto ou nulo. Estas amostras de DNA foram normalizadas para 12 ng/pl e testadas com o ensaio baseado na PCR TaqMan®.

[000101] Uma mistura principal da PCR foi preparada com 22 pl de mistura e 3 pl de DNA normalizada adicionado a cada reservatório. Cinco (5) reproduções de cada controle (hemi, homo e nulo) foram testadas e lidas na leitora de placas Tecan para a medição de RFU. Uma análise de mais/menos dos resultados foi executada e todos os contro- les testados como esperado. Os resultados podem ser observados na Figura 1.

Exemplo 8 - Validação da PCR

[000102] A receita da PCR foi ajustada para refletir o iniciador comum do evento (3006_WT_R9) que é usado para ambas as reações (ver a Figura 2), e uma placa de amostra foi operada usando o DNA de algodão normalizado (12 ng/pl). O produto da PCR foi então lido na leitora de placa Tecan e analisado utilizando um método de análise mais/menos. As escalas de zigosidade foram feitas e comparadas com as escalas geradas a partir do ensaio Invader existente sob a suposição de que as escalas Invader estavam corretas. O ensaio TaqMan tinha 15 das 90 escalas produzidas de forma diferente (17%) quando comparado com o ensaio Invader.

[000103] Para melhorar os resultados, o iniciador dianteiro WT e a sonda WT foram cada um duplicado nas reações PCR separadas e ambos foram duplicados em uma terceira reação. Isto foi feito para se obter os valores de RFU superiores em nossas amostras de DNA desconhecidas e criar uma maior separação dos valores de RFU para os controles negativos e positivos. Os resultados desta modificação apresentaram o iniciador dianteiro tipo selvagem 2X mais promissor. Durante esta etapa no processo de validação, ocorreram problemas repetidamente com a sonda 3006_WT_P4 (motivos importantes) e com a leitora de placas Tecan, assim uma nova sonda foi ordenada a qual foi rotulada com uma tintura diferente. As questões antecedentes continuaram e eventualmente a sonda sobressalente (3006_WT_P6 rotulada com tintura Texas Red) foi usada para substituir a sonda original para a reação do tipo selvagem. Tabela 5: O protocolo da PCR final e otimizado com base em TaqMan® para a detecção de CrylAc.

[000104] A validação da receita de PCR foi executada usando 4 placas de DNA (Cotton Cotyledon Boxes 3, 4, 5 e 6). Os resultados foram comparados com os resultados do Invader e observou-se que as escalas (hemi, homo ou nula) de ambos os ensaios foram iguais a uma média de 95,85%. Cotton Cotyledon Box 3 teve 77 amostras analisadas e 6 escalas variadas (92,2% idênticas); Cotton Cotyledon Box 4 teve 74 amostras analisadas e 3 escalas variadas (95,9% idênticas); Cotton Cotyledon Box 5 teve 72 amostras analisadas e 2 escalas variadas (97,2% idênticas) e Cotton Cotyledon Box 6 teve 53 amostras analisadas e 1 escala variada (98,1% idênticas - ver a Tabela 6). O ensaio assim desenvolvido foi utilizado com sucesso. Tabela 6: Protocolo da PCR otimizado com base em TaqMan para o formato de 384 reservatórios para a detecção de CrylAc.

Exemplo 9 - Conversão em Formato de 384 Reservatórios

[000105] A otimização deste ensaio necessários exigiu ajustes tanto para o MgCh quanto para as concentrações de dNTP. O volume da mistura de PCR foi reduzido para 12 pl com 3 pl de DNA adicionado a cada reservatório para um volume total de 15 pl por reação.

Claims (10)

1. Método para a determinação da zigosidade de evento de uma planta de algodão que compreende SEQ ID NO: 1, o referido evento compreendendo um constructo de transgene que compreende um gene cry 1 Ac, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra de DNA genômico da referida planta de algodão, colocar a referida amostra em contato com a. um primeiro iniciador de flanqueamento compreendendo SEQ ID NO: 2 b. um segundo iniciador de flaqueamento compreendendo SEQ ID NO: 4 ou o seu complemento c. um iniciador de transgene compreendendo SEQ ID NO: 3 em que referido primeiro iniciador de flanqueamento e referido segundo iniciador de flanqueamento formam um amplicon tipo selvagem quando submetidos às condições de PCR, em que referido iniciador de transgene forma um amplicon transgene com referido primeiro iniciador de flanqueamento ou referido segundo iniciador de flanqueamento quando submetido às condições de PCR, ainda colocar em contato referida amostra com d. uma sonda de evento fluorescente que hibridiza com referido amplicon transgene e. uma sonda tipo selvagem fluorescente que hibridiza com referido amplicon tipo selvagem submeter referida amostra às condições de PCR TaqMan de ponto final com base na fluorescência, quantificar referida sonda de evento fluorescente que hibridizou referido amplicon do evento, quantificar referida sonda tipo selvagem fluorescente que hibridizou referido amplicon tipo selvagem, comparar as quantidades de sonda de evento fluorescente hibridizada com a sonda tipo selvagem fluorescente hibridizada; e determinar a zigosidade de referido tecido de algodão mediante a comparação das relações de fluorescência da sonda de evento fluorescente hibridizada e da sonda tipo selvagem fluorescente hibridizada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referida planta compreende um primeiro subgenoma e um segundo subgenoma, referido amplicon transgene sendo formado a partir de referido primeiro subgenoma, e referido amplicon tipo selvagem sendo formado a partir de referido segundo subgenoma.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os resultados do referido método são lidos diretamente em uma leitora de placa.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas sondas são rotuladas com uma tintura fluorescente e supressor.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sonda de transgene compreende uma tintura fluorescente na extremidade 5’ da referida sonda de transgene e um supressor na extremidade 3’ de referida sonda de transgene.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referida sonda tipo selvagem é rotulada com uma tintura fluorescente na extremidade 5’ de referida sonda tipo selvagem e um supressor na extremidade 3’ de referida sonda tipo selvagem.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que referida sonda tipo selvagem compreende a SEQ ID NO: 6.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que referida sonda de transgene compreende a SEQ ID NO: 5.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido amplicon transgene compreende SEQ ID NO: 8.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido amplicon tipo selvagem compreende SEQ ID NO: 9.

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