CN104837985B - 用于floury(fl2)性状基因渗入的玉米中的floury 2基因特异性测定法 - Google Patents

用于floury(fl2)性状基因渗入的玉米中的floury 2基因特异性测定法 Download PDF

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Abstract

本公开内容关注用于测定含有一个或多个floury2(fl2)突变的玉米植物的接合性的组合物和方法。在实施方案中，本公开内容关注用于鉴定植物中的floury2性状的基于PCR的基因特异性分子测定法。在某些实施方案中，公开了用于就fl2等位基因而言测定玉米植物的接合性的组合物和方法。在具体的实施方案中，测定法可以用于fl2种质鉴定，这加速玉米和其它植物中的基因渗入和分子育种程序。

Description

用于FLOURY(FL2)性状基因渗入的玉米中的FLOURY 2基因特 异性测定法
对相关申请的交叉引用
本申请主张35U.S.C.§119(e)下的2012年5月30日提交的美国临时申请系列号第61/653,287号的优先权，其公开内容通过全文引用并入本文。
通过提及并入电子提交的材料
因此与本文同时提交并且标示如下：1个28,672字节ASCII(文本)文件、名称为“225450_SEQ_LISTING_ST25.txt”、创建于2013年5月28日的计算机可读的序列表，通过全文引用并入本文。
发明领域
本发明公开一般涉及植物育种。提供了用于测定fl2突变的存在和植物在此突变上的接合性的方法。本发明公开的方法可用于选择携带floury2(fl2)性状的植物及fl2性状对植物诸如玉米的基因渗入。
发明背景
玉米青贮饲料由于其高能量和可消化性而成为反刍动物的一种常用草料。经常将玉米谷物添加到定量给粮(ration)配方以改善营养平衡。谷粒硬度和质地在淀粉可消化性中发挥重要的作用。较软的谷粒或在其不太成熟时收获的杂种更容易在瘤胃中消化。天然存在的玉米突变，诸如褐色中脉(brown midrib)(BMR)、floury2(fl2)、和opaque2(O2)由于它们与较软的谷粒中脉相关已成为青贮饲料产品开发的焦点。例如，BMR种质降低了细胞壁木质素含量。Cherney等(1991)Adv.Agron.46:157-98。具有fl2或O2突变的植物生成软的，具有不规则形状的蛋白质体和比野生型更高的赖氨酸含量的淀粉质乳胚。Coleman等(1997)PNAS 94:7094-97。将具有fl2或O2突变的谷物添加到定量给粮可以提高反刍动物的消化性，降低了营养要求所需的谷物量并降低收获时谷粒加工的需要。参见Ladely等(1995)J.Anim.Sci.73:228-235。
据报告，floury2性状与玉米醇溶蛋白基因家族(玉米种子中主要的醇溶谷蛋白贮存蛋白)的成员之一中的突变有关。Song等(2001)Gen.Res.11:1817-25。fl2突变对玉米系中的基因渗入是一个费时的过程。由于fl2突变体等位基因是半显性的，基于谷粒透明状态(vitreousness)的表型分型是困难的且经常是不明确的。Coleman等(1997)。需要一种快速的，基因特异性的分子测定法来检测fl2突变体等位基因，并测定候选植物中的接合性。此测定法会通过缩短选择具有期望特征的植物需要的时间而大大促进育种工作。
发明概述
本文中描述了用于floury2玉米品种(例如fl2突变体)的基于PCR的高通量分子表征的方法，其可以大大增强含有fl2的玉米系的基因渗入的育种方法。本发明公开了通过测定fl2突变体和野生型alpha-玉米醇溶蛋白等位基因的存在或缺乏而用于测定植物组织样品及由此制备该样品的植物的接合性的方法。因此，提供了基于PCR的荧光探针接合性测定法(在本文中称为测定法)，其特异性检测并测试fl2基因座处的接合性状态，并且能够分辨分离群体间基因中的独特SNP变体。还公开了包含此独特SNP的核苷酸序列，和使用这些方法选择的植物和种质。
在一个特定的实施方案中，使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法包括：从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；使所述分离的基因组DNA与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；并测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性。
在另一个实施方案中，用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法包括：将在fl2基因中具有突变的植物与另一个植物杂交；从通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；使所述分离的核酸与至少一种具有核苷酸序列的核酸分子接触，所述核苷酸序列能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交；并如下选择在所述fl2基因中包含突变的来自所述杂交的后代，即繁殖获得在高严格性情况下结合所述至少一种核酸分子的样品的植物，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中。
附图简述
图1显示了来自野生型玉米系B73(B73)、野生型玉米系1(NF7_3)、L3430(其是公开可获得的floury2玉米系1(L3430))、floury2玉米系2(FF1_1)、floury2玉米系3(FF2_1)的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因组序列的比对。鉴定出72个SNP和7个插入缺失(InDel)。
图2显示了来自B73、野生型玉米系1(NF7_3)、floury2玉米系1(L3430)、floury2玉米系2(FF1_1)和floury2玉米系3(FF2_1)的预测22-kDaα-玉米醇溶蛋白蛋白质序列的比对。亮色字体标示-1信号肽处的A至V取代。
图3显示了基于在-1信号肽上丙氨酸至缬氨酸取代用测定法测定基因型的23个玉米近交系的KLIMS数据分析(突变体等位基因的FAM信号作为x-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴)。
图4显示了基于在第39个氨基酸处的丙氨酸至缬氨酸取代用测定法测定基因型的23个玉米近交系的KLIMS数据分析(突变体等位基因的FAM信号作为x-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴)。
图5显示了用玉米近交系进行的确认测试，所述玉米近交系基于在第39个氨基酸处的丙氨酸至缬氨酸取代用测定法测定基因型(突变体等位基因的FAM信号作为x-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴)。
图6显示了用分离群体进行的验证测试，所述分离群体基于在第39个氨基酸处的丙氨酸至缬氨酸取代用测定法(fl2_zygo)测定基因型(突变体等位基因的FAM信号作为x-轴和野生型等位基因的CAL信号作为y-轴)。
序列表
所附序列表中所列的核酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写显示，如37C.F.R.§1.822中显示的。仅显示每个核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的任何引用而包括在内。在所附序列表中：
SEQ ID NO:1显示了用于扩增22kDa B73α-玉米醇溶蛋白基因的正向引物序列(玉米醇溶蛋白_68F)：GAGATCATGCATGTCATTCCA。
SEQ ID NO:2显示了用于扩增22kDa B73α-玉米醇溶蛋白基因的反向引物序列(玉米醇溶蛋白_68R)：TTGGTGTTGTTAAGTTCACATGC。
SEQ ID NO:3显示了用于测序B73α-玉米醇溶蛋白部分基因的来自α-玉米醇溶蛋白基因的寡核苷酸序列(玉米醇溶蛋白_513F)：AATCCTTGGCACATCTAA。
SEQ ID NO:4显示了用于测序B73α-玉米醇溶蛋白部分基因的来自α-玉米醇溶蛋白基因的寡核苷酸序列(玉米醇溶蛋白-23R)：TAGGTGGCTCAGTGATGGCAGAA。
SEQ ID NO:5显示了用于测序B73α-玉米醇溶蛋白部分基因的来自α-玉米醇溶蛋白基因的寡核苷酸序列(385_R)CTAAAAGATGGCACCTCCAA。
SEQ ID NO:6显示了等位基因特异性引物序列(A1)。
SEQ ID NO:7显示了等位基因特异性引物序列(A2)。
SEQ ID NO:8显示了共同(反向)引物序列(C1)。
SEQ ID NO:9显示了来自植物系B73的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10显示了来自植物系L34340的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11显示了来自植物系FF2_1的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12显示了来自植物系FF1_1的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13显示了来自植物系NF7_3的22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14显示了来自植物系B73的α-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示了来自植物系L34340的α-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示了来自植物系FF2_1的α-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示了来自植物系FF1_1的α-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:18显示了来自植物系NF7_3的α-玉米醇溶蛋白基因的预测氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示了引物序列A1-1。
SEQ ID NO:20显示了引物序列A2-1。
SEQ ID NO:21显示了引物序列C1-1。
SEQ ID NO:22显示了引物序列A1-2。
SEQ ID NO:23显示了引物序列A2-2。
SEQ ID NO:24显示了引物序列C1-2。
SEQ ID NO:25显示了引物序列A1-3。
SEQ ID NO:26显示了引物序列A2-3。
SEQ ID NO:27显示了引物序列C1-3。
SEQ ID NO:28显示了引物序列A1-4。
SEQ ID NO:29显示了引物序列A2-4。
SEQ ID NO:30显示了引物序列C1-4。
SEQ ID NO:31显示了引物序列A1-5。
SEQ ID NO:32显示了引物序列A2-5。
SEQ ID NO:33显示了引物序列C1-5。
SEQ ID NO:34显示了引物序列A1-6。
SEQ ID NO:35显示了引物序列A2-6。
SEQ ID NO:36显示了引物序列C1-6。
发明详述
I.几个实施方案的概述
本文中公开了基于PCR的基因特异性分子测定法检测玉米中的floury2(fl2)性状存在的方法。
在本文中的实施方案中，所述方法可以公开在fl2突变体等位基因上测定植物的接合性的方法。
本文中的实施方案描述了从多个玉米系克隆α-玉米醇溶蛋白基因。在一些实施方案中，鉴定了与floury表型有关的几个突变。
在一个优选的实施方案中，描述了针对fl2性状的基因特异性测定法。在特定的实施方案中，描述了使用fl2基因特异性测定法选择植物种质的方法。
在一些实施方案中，描述了使用fl2基因特异性测定法促进fl2突变体基因的基因渗入的方法。fl2的基因渗入不如O2那样复杂。
II.缩写
III.术语
碱基位置：如本文中使用的，“碱基位置”指在指定核酸内的给定碱基或核苷酸残基的位置。指定核酸可以通过与参照核酸的比对(参见下文)限定。
良种系：如本文中使用的，术语“良种系”意指已经源自育种和选择卓越的农艺学性能的任何系。良种植物是来自良种系的任何植物。
基因渗入：如本文中使用的，指通过杂交那些个体、物种、品种或栽培种，从一个个体、物种、品种或栽培种移入到另一个个体、物种、品种或栽培种的基因组中的基因组区段。如本文中使用的，术语“基因渗入”、“基因渗入的”、“基因渗入地”指通过杂交那些物种、品种或栽培种，将个别基因或全部性状从一个个体、物种、品种或栽培种移入到另一个物种、品种或栽培种的基因组中的天然过程和人工过程两者。在植物育种中，所述过程通常牵涉自交或与轮回亲本回交以提供纯合性增加的植物，其在基因渗入的基因或性状外基本上具有轮回亲本的特征。
系：如本文中使用的，“系”或“植物系”指在至少一个性状上在个体间展现很少的遗传变异(例如无遗传变异)的一组植物。可以通过自花传粉的几个世代和选择或备选通过使用组织或细胞培养技术从单一亲本的营养繁殖产生近交系。如本文中使用的，术语“栽培种”、“品种”和“类型”是同义的，并且这些术语指用于商业生产的系。
核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括cDNA、基因组DNA、RNA的有义链和反义链两者、和上述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任意类型的核苷酸的经修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。核酸分子的长度通常是至少10个碱基，除非另外说明。该术语可以指不确定长度的RNA或DNA的分子。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸或通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起的经修饰的核苷酸或这两者。
寡核苷酸：寡核苷酸是一种短的核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割较长的核酸区段，或者通过聚合单个核苷酸前体形成。自动化合成仪容许长度长达几百个碱基对的寡核苷酸的合成。由于寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，它们可以作为探针用于检测DNA或RNA。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可以在PCR(一种用于扩增小DNA序列的技术)中使用。在PCR中，寡核苷酸通常称为“引物”，其容许DNA聚合酶延长寡核苷酸并且复制互补链。
序列同一性：如在两个核酸或多肽序列的背景中使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两个序列中在规定的比较窗里为了最大对应性而比对时相同的残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性的百分比”可以指通过在比较窗里比较两个最佳比对的序列(例如核酸序列，氨基酸序列)测定的数值，其中比较窗中的序列部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比为了实现两个序列的最佳比对可以包含添加或缺失(即缺口)。如下计算百分比，即测定这两个序列中的相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
用于比对序列以进行比较的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑可以参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)(BLASTTM；Altschul等(1990))可获自几个来源，包括国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)，及在因特网上，与几种序列分析程序结合使用。如何使用此程序测定序列同一性的描述在BLASTTM的“帮助”部分下在因特网上可得到。为了比较核酸序列，可以使用缺省参数采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。与参照序列具有甚至更大的相似性的核酸序列在通过此方法评估时会显示增加的百分比同一性。
单核苷酸多态性(SNP)：如本文中使用的，术语“单核苷酸多态性”可以指在基因组(或其它共享序列)中的单核苷酸在物种的成员或个体中的配对染色体间不同时存在的DNA序列变异。
性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。为了本公开内容的目的，特别感兴趣的性状是种皮颜色。一些芸苔品种展现出黄色种皮，而其他品种展现出暗色(例如黑色，暗色和杂色)种皮。
玉米醇溶蛋白：如本文中使用的，术语“玉米醇溶蛋白”应当指玉米和其它植物中玉米醇溶蛋白超家族中或自该玉米醇溶蛋白超家族衍生的一类基因、及其基因产物、基因片段、部分基因、蛋白质产物和RNA产物的任何成员。玉米醇溶蛋白可以包括以下已知的类别或家族成员：α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白和δ-玉米醇溶蛋白。在实施方案中，指α-玉米醇溶蛋白基因、基因区段、部分基因、或其蛋白质或RNA产物。
接合性：如本文中使用的，术语“接合性”指生物体中遗传性状的基因的等位基因的相似性或其缺乏。若两个等位基因都是相同的，则生物体在性状上是“纯合的”。若两个等位基因是不同的，则生物体在所述性状上是“杂合的”。若一个等位基因是缺少的，则它是“半合子的”。若两个等位基因是缺少的，则它是“失效合子的”。
除非另外明确解释，本文中使用的所有技术和科学术语与公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见例如Lewin B.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；及Meyers R.A.(编),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非另外指示，如本文中使用的术语“一个”和“一种”指至少一个/种。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请在此通过提及以其不与本公开内容的明确详情不一致的程度并入，并且以与就像每篇参考文献单独且明确指定通过提及并入并且在本文中完整列出一样的程度如此并入。本文中讨论的参考文献仅提供其在本申请的提交日前的公开内容。凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。
IV.用于fl2的基因型和接合性测定的基因特异性分子测定法
A.概述
本文中描述了用于表征植物中的floury2(fl2)性状的基因特异性分子测定法。特定的例子利用基于PCR的测定系统检测特定的fl2突变，并且在相同测定法中与相应的野生型序列比较。在相同的例子中，可以通过fl2突变体等位基因和野生型α-玉米醇溶蛋白等位基因的存在或缺乏测定植物的接合性。特定的例子描述了在39氨基酸位置处的独特的丙氨酸至缬氨酸取代，其可以用于分子表征。此测定法可以区别fl2突变体等位基因与野生型等位基因，并且已经用分离群体进行确认。在例子中，可以使用测定法进行期望性状，诸如floury2性状对携带其他期望特征的植物系的基因渗入。此种基于基因的标志物/测定法会是一种用于加速具有fl2的分子育种方法的有力工具。
B.Floury2(fl2)玉米
玉米醇溶蛋白是在传粉后10-45天开始合成的玉米种子中的主要醇溶谷蛋白贮存蛋白，并且占总种子蛋白的60-70％。Coleman等(1997)；Kodrzycki等(1989)Plant Cell 1:105-114。野生型玉米醇溶蛋白蛋白质是富含谷氨酰胺和脯氨酸的，但是缺少赖氨酸和色氨酸，使谷物在营养上劣等，尤其对于单胃的动物。Coleman(1995)PNAS 92:6828-31。
已经命名不同的4类玉米醇溶蛋白蛋白质，分类为α-、β-、γ-、和δ-玉米醇溶蛋白。Coleman等(1997)。α-玉米醇溶蛋白(最丰富的类别)是19和22kDa。Hagen and Rubenstein(1981)Gene 13(3):239-49。Song等分离并测序玉米22kDaα-玉米醇溶蛋白基因家族的所有23个成员。(2001)Gen.Res.11:1817-25。22个α-玉米醇溶蛋白基因位于染色体4S的短臂上的串联排列中，23个基因位于相同染色体上的更近侧的位置。Song(2001)。据报告，基于cDNA概况(profile)，这些基因中仅7个是表达的，表达的基因在非表达基因间散布。Song(2001)。
玉米中的floury2(fl2)和opaque2(O2)性状与较软的谷粒(正常玉米的赖氨酸含量的几乎两倍)和在反刍动物和鸡中的可消化性增加有关。Nelson等(1965)Science 150:1469-70。以fl2玉米喂养的鸡更快生长。Cromwell等(1968)Poul.Sci.57:840-47。喂养高赖氨酸玉米食物的小牛比喂养正常玉米的小牛是10％更有效的，并且快多达27％地降解粗制蛋白质。Ladely等(1995)J.Anim.Sci.73:228-35。由于其较软的谷粒，floury2种子经受机械损伤，使它们易受到昆虫和真菌应激，但是fl2等位基因对携带其它期望特征的植物系的基因渗入可以减轻此问题。
floury2基因型由玉米醇溶蛋白基因家族中的突变引起。Coleman等(1997)PNAS94:7094-97。与fl2突变有关的野生型等位基因是表达的α-玉米醇溶蛋白基因之一。Coleman等鉴定出玉米22-kDaα-玉米醇溶蛋白基因中信号肽-1位置处的丙氨酸至缬氨酸取代([T/C]SNP)，认为其造成fl2突变。(1995和1997)。信号肽通常将α-玉米醇溶蛋白蛋白质靶向到粗面内质网(RER)的腔。所述突变阻止信号肽的切割，并且导致比预期大2kDa的成熟蛋白质。缺陷性24kDa蛋白质在胚乳发育期间触发玉米醇溶蛋白家族蛋白质的不正确装配和包装，从而导致醇溶谷蛋白贮存蛋白质合成降低和赖氨酸的积累。Coleman等(1997)。
C.针对floury2性状的表型选择
育种人员已经尝试将fl2和O2突变引入高性能BMR系中，但是这些突变体的选择是复杂的。可以使用透明状态在表型上选择影响玉米粒的不透明性的突变，包括fl2和O2突变。不幸的是，透明状态也受到谷粒的形态学和天然变色影响，从而使使用光盒的表型表征变得费时且经常令人误解。针对O2的表型选择还由于多个修饰基因的存在而变得复杂。Holding等(2010)Theor.App.Gen.122:783-94。fl2突变体等位基因是半显性的，表型的严格性(severity)根据突变体等位基因的拷贝数确定。玉米胚乳含有来自母本的遗传材料的两个拷贝和来自父本的一个拷贝。因此，后代种子的表型随着fl2突变体等位基因来自哪个亲本而显著变化。
D.分子检测测定法
针对BMR和fl2性状的基因特异性分子测定法会通过改善选择精确性并降低育种循环而大大促进用于生成较低木质素和较软谷粒青贮饲料的程序。先前，已经针对褐色中脉1(bm1)和褐色中脉3(bm3)开发出基因特异性测定法，但是先前对fl2突变不可用基因特异性测定法。
在实验中，将22-kDaα-玉米醇溶蛋白基因从源自J15和Oh-43系的2个floury2供体，及野生型玉米近交系克隆并测序。确认-1位的SNP突变，并且设计接合性测定法。然而，此测定法由于玉米醇溶蛋白家族基因的高同源性而不能区别突变体与野生型。发现了39氨基酸位置处的独特的丙氨酸至缬氨酸取代。设计靶向关联的SNP的分子测定法，并且发现其可用于区别fl2突变体等位基因与野生型等位基因。用分离群体确认测定法的有效性。
本文中描述了基因特异性PCR测定法，其一般可用于fl2玉米或推定的fl2玉米的接合性分析。在特定的实施方案中，可以使用基因(等位基因)特异性PCR测定法分析玉米关于fl2突变的接合性。在实施方案中，基因特异性测定法可以提供用于对植物快速筛选选择的基因型，包括例如floury2(fl2)性状的高通量系统和方法。在这些中的一些实施方案中，例如可以同时测定含有96、384或1536个孔样品的孔板或微阵列系统。
可以基于感兴趣的基因中的已知突变设计用于基因特异性PCR测定法的引物和探针。例如，突变可以是单核苷酸多态性(SNP)或插入或缺失突变。在某些实施方案中，基于与fl2基因的-1信号肽处的丙氨酸至缬氨酸取代有关的核苷酸495处的SNP(C/T)设计用于fl2特异性测定法的引物和探针。在一个优选的实施方案中，基于与基因的39氨基酸位置处的丙氨酸至缬氨酸取代有关的SNP设计引物和探针。在一些实施方案中，基因特异性PCR测定法可以靶向可与感兴趣的性状，诸如floury2性状有关的其它突变。
在实施方案中，两个等位基因特异性引物可以与单一共同(反向)引物一起使用以选择性扩增fl2基因的等位基因特异性片段。在一些实施方案中，fl2特异性测定法扩增对于fl2的一个等位形式，诸如携带495位C/T SNP的等位基因而言是独特的片段。在某些实施方案中，靶物特异性寡核苷酸探针在高严格性条件下与基因组DNA样品中在两个PCR引物间的靶序列杂交。
例如，靶物特异性寡核苷酸可以用荧光染料(例如FAM、VIC和MGBNFQ)标记，所述荧光染料可以容许靶物特异性荧光信号的快速量化。可以在预先确定的循环数目后，例如在反应为早期指数期时测量PCR产物。例如，阴性对照样品可以包含来自没有fl2突变的任何玉米品种的基因组DNA。阳性对照样品可以包含来自具有已知的fl2突变的玉米品种的基因组DNA。对照半合子样品可以包含来自预先确定为在fl2突变上半合子的玉米品种的任一基因组DNA；或半合子样品可以包含相同比例的阴性对照DNA与来自预先确定为在fl2上纯合的玉米品种的DNA。
可以通过本领域技术人员已知的方法从玉米植物组织分离(例如提取和纯化)DNA。例如，用于DNA分离的商业试剂盒可购自Qiagen,Inc.。在一些实施方案中，将来自特定植物的叶盘冲孔，并转移到收集管中。可以在每次取样后将穿孔机用70％乙醇清洗，在水中漂洗，并干燥。可以根据制造商的推荐制备DNA提取缓冲液。然后，可以依照制造商的说明书使用试剂盒分离DNA。最后，可以使用例如Quant-iTTM 量化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)和分光光度计，或者通过任何其他合适的技术测定分离的DNA的浓度。
一旦已经制备或以其它方式获得引物、探针和基因组DNA样品，可以使用商业软件，诸如Dow AgroSciences Kraken Workflow Manager，可购自KBiosciences(KBiosciences,Hoddesdon,Hertfordshire,UK)设计竞争性等位基因特异性PCR测定法以鉴定基因组DNA样品中的感兴趣核酸序列(例如对于fl2突变而言特殊的序列)。在具体的实施方案中，制备单个的PCR反应混合物，其除了基因组DNA样品外含有所有的反应组分。对于包含针对fl2突变体和野生型玉米的引物和基因特异性探针的反应，反应混合物可以包含测定混合物，其含有两个等位基因特异性(正向)引物、共同(反向)引物、缓冲液、反应混合物、50mM MgCl2、和水。可以对此混合物添加基因组DNA，并且可以根据标准方案启动PCR循环以扩增感兴趣的片段。
在一些实施方案中，可以用合适的对照设置PCR(例如)测定法。例如可以与对照孔一起实施多孔板中的反应，所述对照孔包含：(1)具有试剂但无DNA样品的阴性对照；(2)包含fl2玉米基因组DNA的纯合阳性对照；和(3)半合子阳性对照，如上文描述的。然后，在合适的循环条件下通过PCR扩增DNA。例如，在使用PCR系统9700的一些实施方案中，可以有于94℃持续15分钟的单一初始变性循环，然后是变性(94℃持续10秒)和退火(57℃持续5秒)和延长(72℃持续40秒)的20个循环，接着是具有更长的退火的22个额外循环(于94℃变性10秒；于57℃退火20秒，于72℃延长40秒)。本领域技术人员理解PCR循环条件可以随着实施者的判断或涉及的特异性引物/寡核苷酸序列而变化，并且获得相当的结果。
E.测定floury 2(fl2)性状的基因型和/或接合性
可以使用基于基因的(等位基因特异性)分子测定法对植物进行基因型和/或接合性分析。在一些实施方案中，可以使用基于PCR的测定系统靶向独特的SNP。在一个优选的实施方案中，被靶向的SNP可以与22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的39氨基酸位置处的丙氨酸至缬氨酸取代有关。对于使用法的测定法，可以使用荧光测量检测分析PCR产物。例如，可以用485nm的激发波长和520nm发射波长(对于FAM的荧光信号)和520nm的激发波长和560nm发射波长(对于CAL的荧光信号)测量荧光染料。
在完成PCR反应和探针检测后，可以例如使用任何合适的计算机制图学软件生成表和分布图。用类似和/或已知基因型背景的野生型、半合子和纯合DNA获得的结果可以充当阳性或阴性对照。在分离的群体中，可以获得数据点的三个簇，从而容许将样品结果视觉测定为可能属于分离簇之一。或者，可以使用数据分析计算机软件计算样品结果属于每个分离簇的可能性，其中最可能的簇充当样品名称。在进行视觉测定时，每个簇的边界可以是任意的，例如，在数据点的三个簇清楚可见时。
也可以使用合适的分析包，诸如KLIMS(KBioscience实验室信息管理系统)从读板仪直接分析原始荧光强度数据。可以产生图像，该图像具有在一条轴上绘制的由突变体等位基因的特异性探针生成的荧光信号的相对荧光单位(RFU)和在另一条轴上绘制的由野生型等位基因的特异性探针生成的荧光信号的RFU。然后，可以基于数据的图形显示中的簇分离进行接合性测定。
不含突变体基因组DNA(例如BMR突变)的样品可以仅产生野生型PCR产物的荧光读数。含有半合子或纯合突变体基因组DNA的样品可以产生比阴性背景对照的RFU读数高的突变体特异性探针的RFU读数。若样品不产生足够的结果，则样品中的基因组DNA可能没有足够的质量和/或数量，并且应当实施新的DNA制备和/或新的PCR反应。优选地，不含DNA样品的阴性对照样品显示基因特异性探针的非常低的检测。还优选的是，已知的纯合对照仅仅显示对照中突变体或野生型DNA的高检测，并且已知的半合子对照显示突变体和野生型DNA两者的高检测。
可以在筛选样品前用所有合适的对照实施PCR方法和基因型和/或接合性测定的“测试运行”。方法的进一步优化对于在用途(例如基因组DNA制备方法、Taq DNA聚合酶、寡核苷酸、实验室设备，等等)间可有所不同的组分可以是期望的。可以建立PCR和热循环条件，其以可接受的探针检测水平(例如对于经荧光标记的寡核苷酸探针为可接受的RFU)扩增已知的基因组DNA模板上的突变体和/或野生型序列两者。
VI.高赖氨酸含量的性状对植物种质的基因渗入
可以通过重复回交促进植物中期望性状的基因渗入。
本文中描述了通过牵涉有性繁殖的常规植物育种生成具有高赖氨酸含量的玉米植物(例如fl2玉米)的方法。方法可以包括杂交第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物，从而生成F1后代，所述第一亲本玉米植物在其基因组中包含至少一个拷贝的fl2突变。第一植物可以是任何fl2玉米植物或品种，包括例如Oh-43或J15。第二亲本玉米植物可以是能够在与第一玉米植物杂交时生成能育后代玉米植物(即种子)的任何玉米植物。第一和第二亲本玉米植物可以是相同玉米物种的(例如玉蜀黍(Zea mays)(玉米))。所述方法可以进一步牵涉自交F1后代以生成F2后代。方法可以进一步牵涉将F1或F2后代植物与同第一或第二亲本玉米植物相同的系或基因型的植物回交的一个或多个世代。或者，可以将第一次杂交或任何后续杂交的F1后代与第三玉米植物杂交，所述第三玉米植物属于与第一或第二植物不同的系或基因型。
在一些实施方案中，对后代植物进行基因型和/或接合性测定，如公开内容中概述的。一旦对后代植物确定基因型，和/或测定其接合性，本领域技术人员可以选择具有期望遗传组成的那些后代植物。此类选择的后代植物可以在进一步的杂交、自交、或栽培中使用。根据公开内容的方法指导的fl2突变基因渗入的方法降低或消除没有期望遗传组成的植物的栽培和/或繁殖，由此提供期望的可靠性和可预测性(通过预期的孟德尔遗传形式)。
提供以下实施例以例示某些具体的特征和/或方面。这些实施例不应解释为将公开内容限于描述的具体特征或方面。
实施例
实施例1：从DAS种质克隆22kDaα-玉米醇溶蛋白基因
从玉米遗传材料中心(maize genetic stock center)请求选择的玉米植物系J15和Oh-43，并由DAS植物育种人员繁殖。玉米植物源自J15系，并且在floury2性状方面是纯合的。同样地，其它玉米植物源自Oh-43系，并且含有floury2性状。另外，使用缺乏floury表型的另一组玉米植物(野生型)开发测定法。
DNA分离
对于DNA提取，使用Genogrinder 2000TM将从种子切出的胚或新鲜的叶冲孔研磨成细粉末，并使用来自Agilent Technologies(Santa Clara,CA)的定制BioCel机器人系统TM用标准的MagAttract 96DNA Plant Core KitTM(Qiagen,Valencia,CA)提取。在PCR前，用Quant-iTTM 量化试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)用制造商的用法说明量化DNA样品。
22-kDaα-玉米醇溶蛋白的PCR扩增和测序
从NCBI(AC229981.2)检索到22-kDaα-玉米醇溶蛋白的玉米B73近交基因组序列，其含有具有一个单一外显子的约1.7kb。基于B73序列设计引物玉米醇溶蛋白_68F(SEQ IDNO:15’-GAGATCATGCATGTCATTCCA-3’)玉米醇溶蛋白_68R(SEQ ID NO:25’-TTGGTGTTGTTAAGTTCACATGC-3’)，并且在ABIPCR System 9700(AppliedBiosystems,Foster City,CA)中在反应中实施PCR，所述反应含有2.5个单位的TaKaRa LATaqTM(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)、400nM dNTP、200nM正向和反向引物和30ng基因组DNA。使用以下PCR程序：PCR以于94℃变性2分钟开始，如推荐的，接着是94℃持续45秒，55℃持续45秒和72℃持续2分钟的30个循环。将PCR产物在2％E-GelTM上显现，然后使用PurelinkTM Quick凝胶提取试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取。然后，按照制造商的用法说明将纯化的PCR产物克隆到pCR4-TOPO载体TM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。将选择的菌落在1X冷冻培养基中培养过夜，并且外包给外部测序提供商(Houston,TX)，以用设计为结合T7和T3启动子(其在pCR4-TOPOTM载体插入位点侧翼)的引物及22-kDaα-玉米醇溶蛋白基因内的寡聚物玉米醇溶蛋白513F(SEQ ID NO:35’AATCCTTGGCACATCTAA 3’)、玉米醇溶蛋白-23R(SEQ ID NO:45’TAGGTGGCTCAGTGATGGCAGAA 3’)和玉米醇溶蛋白-385_R(SEQ IDNO:55’CTAAAAGATGGCACCTCCAA 3’)进行测序，所述1X冷冻培养基含有2.5％LB(对于1L LB培养基，10g胰蛋白胨、10g NaCl、和5g酵母提取物)、36mM K2HPO4、13mM KH2PO4、1.7mM柠檬酸钠、6.8mM(NH4)2SO4、4.4％甘油、0.4mM MgSO4 .7H2O和12.5μg/ml氯霉素(刚好在使用前添加)及50μg/ml卡那霉素。使用Sequencher 4.8TM序列比对计算机程序分析序列。
测定法设计和循环条件
设计基于SNP或插入和缺失(In/Dels)的KBiosciences竞争等位基因特异性测定法(KBiosciences,Hoddesdon,Hertfordshire,UK)。依照表1和表2设置反应。PCR循环于94℃持续15分钟开始；然后是20个循环，其中于94℃变性10秒和于57℃退火5秒；然后于72℃延伸10秒；接着是22个循环，其中于94℃变性10秒和于57℃退火20秒；然后是于72℃延长40秒。使用ABIPCR系统9700(AppliedBiosystems,Foster City,CA)进行扩增。以485nm的激发波长和520nm的发射波长(对于FAM的荧光信号)和520nm的激发波长和560nm的发射波长(对于CAL的荧光信号)通过PheraStarspectrofluorometerTM(BMG LABTECH Inc.,Cary,NC)测量PCR产物。
表1：用于测定混合物设置的配方。
表2：用于5μl总体积中反应的配方。
从2个floury系和野生型玉米系成功PCR克隆1.7kb 22-kDaα-玉米醇溶蛋白基因组片段。将序列与B73(NCBI登录AC229981.2)和公共fl2等位基因(L34340，来自W64fl2的floury 2突变体)比对。用外显子区内的24个变异鉴定总共72个SNP和7个插入/缺失(InDel)(图1)。在-1信号肽处从丙氨酸至缬氨酸的取代(floury外观的原因)存在于fl2玉米系2和fl2玉米系3两者(图2)，它们分别源自J15和Oh-43。
任一玉米系都不含报告为也造成floury2表型的其他两个突变，即第164和第165个氨基酸之间的组氨酸插入或第173个氨基酸处丙氨酸至苏氨酸的取代。工作已经聚焦于基因特异性测定法以检测与floury2表型关联的来自J15和Oh43的突变。在蛋白质水平上比较fl2玉米系2与fl2玉米系3揭示了氨基酸位置159处从组氨酸(H)至谷氨酰胺(Q)的一处变化(图2)。由于没有floury2突变的这两个来源间报告的表型变化，没有对此突变进行进一步表征。
实施例2：针对fl2的基因特异性分子测定法
信号肽的-1位处的丙氨酸至缬氨酸取代足以创建24kDa未加工的α-玉米醇溶蛋白和floury2表型。为了开发针对fl2的基因特异性分子测定法，基于C至T的此单核苷酸多态性设计测定法。它用多种多样的一组23个玉米近交系，包括floury2样品的6个系测试。基于突变体等位基因(其含有SNP碱基对C)的拷贝数变化，测定法有效区别floury2系与剩余的近交系。然而，具有碱基对T的野生型等位基因以相等强度从所有样品扩增，这指示测定法不能用于基因特异性检测(图3)。这似乎主要是由于22-kDaα-玉米醇溶蛋白与其他玉米醇溶蛋白家族成员的高同源性。α-玉米醇溶蛋白家族含有具有超过75％氨基酸同一性的75个成员。
使用描述的分子测定法将与22-kDaα-玉米醇溶蛋白基因的单一外显子中的氨基酸变化一起的4个额外的取代和2个Ins/Dels(表3)作为候选测试。大多数试验证明了相同的簇形式，如用23个近交玉米系测试的图3中显示的。虽然这些测定法能检出拷贝数变化，但是它们对于大规模的接合性分析(其中fl2等位基因和野生型等位基因之间的清楚分离是重要的)不足够稳健。
然而，基于第39个氨基酸处的第二处丙氨酸至缬氨酸取代的一种测定法在floury2和野生型样品之间产生截然不同的簇，其中FAM信号指示fl2基因(图4)。此测定法在表3中称为测定号3。为了确认测定法的特异性，然后测试额外的82个非floury玉米近交系。所有82个野生型系在靶定的fl2等位基因上测试呈阴性，这强烈指示测定法对于floury2基因是高度选择性的。然后，测定法命名为fl2_zygo。
表3：基于22kDaα-玉米醇溶蛋白基因的外显子内的变异设计的测定法。
实施例3：用分离群体的测定法确认
用分离群体确认
使用来自两种遗传背景的分离样品确认fl2_zygo基因特异性测定法。每个集合含有25个样品。将来自每个样品的10个种子切开，并从胚提取DNA，总共500个种子(50个穗，每个穗10个种子)，并用fl2_zygo测试(图6)。用田间实验进一步评估具有差异的样品：将来自每个样品的10个种子在Arlington,IL种植。收获新鲜的叶冲孔以进行DNA提取和基因型测试。然后，将植物自花传粉，并收获穗。通过将谷粒放置于光盒上收集表型数据，并基于透明状态量表评分：半透明-野生型；部分不透明-杂合子和完全不透明-纯合子。
测定法清楚区别纯合、半合子和野生型基因型。对于纯合floury2及野生型穗，97％具有匹配的基因型和表型数据，超过半数的杂合穗(26个中的15个)显示了基因型和表型结果之间的差异。
确认接合性测定法
由于光盒方法的不明确，在表型依赖于少量种子时会预期低精确性。然而，理想的接合性测定法会需要完全匹配。
为了进一步确认fl2_zygo测定法的特异性，将来自具有差异的每个穗的10个种子在Arlington,IL种植。从自2个月龄植物收集的叶冲孔提取DNA，并且用fl2_zygo测定基因型。然后，将植物自花传粉，并收获种子。在干燥后将种子进行光盒表型分型。
比较视觉评分与来自fl2_zygo测定法的基因型数据揭示了95％匹配(152个中的145个)，剩余的7个穗都以可疑的表型分离。这些源自具有青铜色变色的Iodent系，或者具有圆的大体积(bulky)形状，因此非常难以用光盒评分。若表型是正确的，则在22-kDaα-玉米醇溶蛋白外可以有促成floury2性状的基因，这是因为所有7个穗在遗传上测试为野生型。使用标志物辅助选择，从推进中排除无效植物。22-kDaα-玉米醇溶蛋白中的丙氨酸至缬氨酸取代足以引起floury2突变。鉴于针对39氨基酸关联突变的测定法的高特异性，基因特异性测定法fl2_zygo的延伸使用应当选择与floury2表型有关的其他突变。所有目前在转化中的fl2供体系含有突变的22-kDaα-玉米醇溶蛋白，并且使用fl2_zygo在fl2等位基因上测试呈阳性(数据未显示)。
来自此fl2基因特异性分子的基因型和接合性测定与从田间收集的表型数据非常接近地匹配。此测定法提供了一种使用基于分子的高通量测定系统表征fl2接合性状态的容易、快速且精确的方式。
实施例4：floury2(fl2)性状对植物系的基因渗入
fl2的基因渗入
可以使用突变fl2_zygo作为fl2基因渗入的稳健测定法。如实施例1-2中描述的，可以测定玉米植物就fl2突变而言的接合性。可以通过常规的植物育种将在fl2突变上测定为纯合的选择玉米植物与在期望的性状，诸如BMR或COMT上已知为纯合的玉米植物杂交。然后，可以将F1后代自交以生成F2后代。可以制备F2后代的基因组DNA的样品，并且测定F2后代植物的接合性，如上文描述的。然后，可以选择在fl2突变上纯合的F2后代植物。然后，测定选择后代的高赖氨酸含量，降低的细胞壁木质素含量和/或增加的可消化性，并且展现出期望性状的那些后代可以通过杂交和自交进一步繁殖，栽培所得的后代。
虽然本发明在本文中已经关于某些优选实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应当认可并领会其不是如此限制的。相反，可以在不偏离所附权利要求书要求保护的发明范围的前提下对优选实施方案进行多种添加、删除和修改。另外，可以组合来自一个实施方案的特征与来自另一个实施方案的特征，而其仍然涵盖在发明人设想的发明范围内。

Claims (8)

1.一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，该方法包括：
从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；并
使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：
使所述分离的基因组DNA与两个各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子，和两个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列；
在扩增反应中包含至少一个包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列且用第一报告物标记的核酸分子，和至少一个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交且用第二报告物标记的核酸分子；并
检测所述第一和第二报告物的水平。
3.权利要求2的方法，其中所述第一报告物和所述第二报告物是具有可区别的激发/发射光谱的荧光染料。
4.权利要求3的方法，其中所述第一报告物是FAM，且所述第二报告物是VIC。
5.权利要求1的方法，其中至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的所述核酸分子用第一荧光染料标记，且至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的所述核酸分子用具有可区别的激发/发射光谱的第二荧光染料标记。
6.权利要求5的方法，其中所述第一荧光染料是FAM，且所述第二荧光染料是VIC。
7.权利要求1的方法，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)。
8.一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，所述方法包括：
将具有fl2突变的植物与另一个植物杂交，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)并且其中位置495处的核苷酸是T；
从通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；
使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2突变；并
从所述杂交选择对于所述fl2突变纯合的后代，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中。
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