CN103014136B - 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 - Google Patents
基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103014136B CN103014136B CN201110282854.XA CN201110282854A CN103014136B CN 103014136 B CN103014136 B CN 103014136B CN 201110282854 A CN201110282854 A CN 201110282854A CN 103014136 B CN103014136 B CN 103014136B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kmd1
- homozygous
- transgenic
- exogenous gene
- flanking sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法,其是以5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′为引物,进行长距离聚合酶链式扩增,以纯合外源基因KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp),以杂合外源基因KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp),以非转基因水稻基因组DNA为模板能扩增出一条短片段(240bp),从而可以快速准确地鉴定出纯合型转基因抗虫水稻KMD1,为后续的转基因作物遗传育种奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及转基因植物检测领域,具体地说,涉及一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法。
背景技术
标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”,是开展转基因生物安全监管的基准物。开发转基因成分检测标准物质对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前,国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量,即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数,并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中,可以将外源DNA看作一个基因座位,一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列,即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2,一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1,非转基因材料中则为0。因而,转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围,主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中,必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认,即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。
目前,已报道的转基因成分检测方法,主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测,针对遗传转化载体的特征建立特异性检测,针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法,只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分,但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。国内外目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)外源基因纯合/杂合状态检测方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1(KMD1)的方法。
为了实现本发明目的,本发明的一种检测转基因抗虫水稻KMD1的特异性引物,其包括:正向引物5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和反向引物5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′。该引物对是基于KMD1外源基因的旁侧序列而设计的引物,利用该对引物进行长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR,LD-PCR),以纯合KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp),以杂合KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp),以非转基因水稻基因组DNA为模板只能扩增出一条短片段(240bp)。
本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型KMD1的方法,包括步骤:1)提取植物基因组;2)以步骤1)的基因组为模板,利用上述特异性引物进行PCR检测。
PCR反应条件优选为:94℃ 1min;98℃ 10s,66℃ 10min,30个循环;72℃ 10min。
PCR反应体系优选为:
本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检测纯合型转基因抗虫水稻KMD1中的应用。
本发明首次基于外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)的外源基因纯合的鉴定方法,可用于转基因检测用标准物质候选物的筛选鉴定。此外,在转基因作物遗传育种过程中,需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种,利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料,有利于缩短育种进程。
附图说明
图1为本发明通过LD-PCR在水稻中的扩增结果;其中,M:1kbplus DNA ladder;1:空白对照;2:非转基因水稻明恢63;3:外源基因纯合的KMD1;4:外源基因杂合的KMD1。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等的《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)中所述的条件,或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品,转基因抗虫水稻KMD1和非转基因水稻明恢63可市售获得。
实施例
利用引物,其中正向引物为LA-KMD1F:5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′,反向引物为LA-KMD1R:5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′进行LD-PCR扩增鉴定KMD1的外源基因纯合状态。
1.实验材料
1.1植物材料
转基因抗虫水稻KMD1,非转基因水稻明恢63。
1.2酶与试剂
分子生物学试剂,Takara LA Taq,10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus),dNTP Mixture(2.5mM)购自Takara Biotechnology,1kb Plus DNAMarker购自TransGen Biothech。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京生工生物技术有限公司合成。
1.3实验仪器
DNA处理仪器:低温混合球磨仪MM400(Retsch);
PCR扩增仪:AB Applied Biosystems veriti 96 well Thermal Cycler(AB);
核酸电泳仪:DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂);
DNA电泳分析系统:GeneSnap凝胶成像分析系统;
其它仪器包括:恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。
2.实验方法
2.1水稻基因组DNA的提取
水稻单粒种植,取幼嫩叶片作为DNA提取材料,依照TianGenPlant Genomic DNA Kit(购自天根生化科技(北京)有限公司,目录号:DP320;包括缓冲液LP1、LP2、LP3、洗脱缓冲液TE及吸附柱CB3)的操作手册,进行水稻总DNA的提取。
a.称取水稻新鲜叶片100mg,单株分别标记,剪刀剪碎装入2ml离心管中,放入液氮中预冷,用低温混合球磨仪充分破碎。加入400μl缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml),涡旋振荡1min,室温放置10min。
b.加入130μl缓冲液LP2,充分混匀,涡旋振荡1min。12,000rpm离心5min,将上清移至新的离心管中。
c.加入1.5倍体积的缓冲液LP3,充分振荡混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀。将所得的溶液或者絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中,12,000rpm离心30s,弃废液,吸附柱CB3放回收集管中。
d.向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW,12,000离心30s,弃废液,吸附柱CB3放回收集管中。重复此步骤如下:向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW,12,000离心30s,弃废液,吸附柱CB3放回收集管中。14,000rpm离心2min,弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
e.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl去离子双蒸水(pH7.0-8.5),室温放置2-5min,12,000离心2min,将溶液收集到离心管中。
2.2DNA浓度和纯度测定
使用NaNoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度,并用去离子双蒸水调节DNA浓度至100ng/μl。
2.3长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR,LD-PCR)
根据获得的3’侧翼序列和5’侧翼序列,从两端设计引物用于扩增出全长。其中正向引物LA-KMD1F在5’插入区的水稻序列,反向引物LA-KMD1R在3’插入区的水稻序列,引物序列见表1。
表1
引物 | 序列 |
LA-KMD1F | 5’-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3’ |
LA-KMD1R | 5’-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3’ |
LD-PCR扩增体系为:总体系25μl,Takara LA Taq 1.25U,10×LAPCR Buffer II(Mg2+Plus)2.5μl,dNTP Mixture(2.5mM)4μl,引物各1μl(10μM),水稻DNA 2μl(100ng/μl),剩余用ddH2O补足。
LD-PCR扩增程序:94℃ 1min;98℃ 10s,66℃ 10min,30个循环;72℃ 10min。
3.实验结果
根据转基因水稻KMD1 5’和3’两端侧翼序列设计的正向引物和反向引物,通过LD-PCR在非转基因水稻明恢63、纯合转基因水稻KMD1、杂合转基因水稻KMD1 DNA中进行扩增,能够快速准确地鉴定出KMD1中纯合体和杂合体。其中在纯合转基因水稻KMD1中仅能扩增出一条8884bp的片段;杂合转基因水稻KMD1扩增出两条片段,一条为8884bp,一条为240bp;而非转基因水稻中只能扩增出一条240bp片段。扩增结果如图1所示,其中琼脂糖凝胶浓度为1%,EB中染色20min。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)提取植物基因组;
2)以步骤1)的基因组为模板,利用检测转基因抗虫水稻克螟稻1的特异性引物进行PCR检测;
所述检测转基因抗虫水稻克螟稻1的特异性引物包括:
正向引物:5'-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3'和
反向引物:5'-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3';
其中在纯合转基因抗虫水稻克螟稻1中仅能扩增出一条8884bp的片段;杂合转基因抗虫水稻克螟稻1中扩增出两条片段,一条为8884bp,一条为240bp;而非转基因水稻中仅能扩增出一条240bp片段。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,PCR反应条件为:94℃1min;98℃10s,66℃10min,30个循环;72℃10min。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,PCR反应体系为:
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110282854.XA CN103014136B (zh) | 2011-09-21 | 2011-09-21 | 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110282854.XA CN103014136B (zh) | 2011-09-21 | 2011-09-21 | 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103014136A CN103014136A (zh) | 2013-04-03 |
CN103014136B true CN103014136B (zh) | 2014-09-10 |
Family
ID=47963251
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110282854.XA Active CN103014136B (zh) | 2011-09-21 | 2011-09-21 | 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103014136B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103436528B (zh) * | 2013-04-29 | 2015-10-21 | 邝筱珊 | 转基因水稻品系kmd的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
CN103966208B (zh) * | 2014-03-06 | 2016-04-20 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 转基因水稻pa110-15外源插入片段旁侧序列及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101020908A (zh) * | 2007-01-24 | 2007-08-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 转基因油菜t45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用 |
CN101240277A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系Bt汕优63的外源插入片段的旁侧序列 |
CN101240279A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列 |
CN101240278A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列 |
-
2011
- 2011-09-21 CN CN201110282854.XA patent/CN103014136B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101020908A (zh) * | 2007-01-24 | 2007-08-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 转基因油菜t45事件外源插入载体左边界旁侧序列及其应用 |
CN101240277A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系Bt汕优63的外源插入片段的旁侧序列 |
CN101240279A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列 |
CN101240278A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103014136A (zh) | 2013-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | A single-nucleotide polymorphism of TaGS5 gene revealed its association with kernel weight in Chinese bread wheat | |
EP1250461B1 (en) | Methods and kits for identifying elite event gat-zm1 in biological samples | |
Wang et al. | Haplotypes of the TaGS5-A1 gene are associated with thousand-kernel weight in Chinese bread wheat | |
CN106282394A (zh) | 高通量检测玉米南方锈病抗性基因分型的方法及其试剂盒 | |
Gonzaga et al. | Evaluation of SSR and SNP markers for molecular breeding in rice. | |
KR20190091708A (ko) | 한우육의 동일성 확인용 바이오 마커 및 이의 용도 | |
Randhawa et al. | Multiplex PCR-based simultaneous amplification of selectable marker and reporter genes for the screening of genetically modified crops | |
CN103131758B (zh) | 一种鉴定纯合型转基因抗虫水稻品系tt51-1的方法 | |
KR101680570B1 (ko) | 양배추 자색 품종 판별용 snp 마커 및 이의 용도 | |
CN113151440A (zh) | 一种用于阿司匹林疗效及不良反应预测的试剂盒及其检测方法和应用 | |
KR101854350B1 (ko) | 배추 글루코시놀레이트 함량 조절인자 기반의 snp 마커 및 이의 용도 | |
Yamamuro et al. | Rapid identification of drug-type and fiber-type cannabis by allele specific duplex PCR | |
EP3165613A1 (en) | Use of brown midrib-3 gene specific markers in maize for trait introgression | |
CN103014136B (zh) | 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 | |
Liu et al. | Identification of two functional markers associated with drought resistance in maize | |
CN105969890A (zh) | 一种与香猪产仔数相关的snp分子标记及其应用 | |
Omar et al. | Estimation of transgene copy number in transformed citrus plants by quantitative multiplex real‐time PCR | |
CN112695114A (zh) | 一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用 | |
CN103014133B (zh) | 一种用于鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的引物 | |
Li et al. | Development of a novel reference plasmid for accurate quantification of genetically modified Kefeng6 rice DNA in food and feed samples | |
CN105039526B (zh) | 基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法 | |
Akagi et al. | Quantitative real-time PCR to determine allele number for the astringency locus by analysis of a linked marker in Diospyros kaki Thunb | |
CN103509875A (zh) | 应用RPA技术检测CaMV 35S启动子和nos终止子 | |
CN109486988B (zh) | 高通量检测玉米抗茎腐病基因分型的方法及其试剂盒 | |
CN108315396B (zh) | 一种简单便捷检测snp的新方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |