CN105112526B - 一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记及其应用,采用杂交群体美锦(普通生长型)×99‑41‑63(温度敏感型半矮生桃)的186个单株F1代的分离群体(普通生长型95株;温敏型半矮生桃91株)为研究材料,结合基于SNP的第三代标记标记技术,采用图位克隆的方法,对调控温敏型半矮生桃节间长度的基因进行了精细定位。在精细定为区域内,获得了紧密连锁SNP标记SNP260k‑1和SNP260k‑13,分别位于桃Scaffold 3的2.850Mb和3.003Mb处。通过上述方式,本发明能够应用于早期目标性状的分子鉴定,可为桃株高的遗传改良奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记及其应用。
背景技术
桃[Prunus persica(L.)Batsch]为多年生落叶果树,萌芽力强、生长量大。优化树体结构是解决上述问题的关键途径,株高是优化树体结构的重要组成部分,降低树体高度有助于高密栽培、提高单位面积产量、节约劳动力成本、提高桃树种植的经济效益和果园的经济寿命(Bassi et al.,1994;王志强等,2004)。实现树体有限矮化和优化树冠结构有两种途径,一是通过栽培手段(砧木或化学调控等);二是通过品种的遗传改良。由于迄今未获得具有理想矮化效果的桃砧木,化学调控的安全性又存在争议,因此,培育树体有限矮化、树冠结构合理、经济系数高和易于管理的品种,已成为桃育种的重要目标(Chalmers etal.1981;Bassi et al.1994;王志强等,2004;牛良等,2012)。
半矮生型是重要的生长型之一,其植株高度介于普通生长型和矮化型之间,植株高度为普通生长型的2/3-1/2(Gradziel et al.1993)。目前,半矮生型有3种:不完全显性单基因控制的半矮生型(Monet et al.1975)、单基因显性控制的半矮生型(Gradziel etal.1993)以及我们发现的依赖温度调控节间长度的半矮生型。该性状受一对等位基因控制,对普通型为显性,树体仅为普通型的1/2-1/3,节间较短,果枝粗壮而长度适中,年修剪量极小,是比较理想的有限矮化树型(王志强等,2004)。
近年来随着生物技术的进步,特别是基于二代测序的标记技术加速了作物基因的精细定位和分子辅助选种体系的建立(Takagi et al.2013;Abe et al.2012)。果树进展较快,克隆了许多重要经济性状的基因并建立了分子辅助选种体系,如苹果红肉颜色基因(Chagnéet al.2007)、苹果柱型基因(Petersen and Krost,2013;Otto et al.2014;Baiet al.2012)、桃黄\白肉基因的克隆(Adami等2013)。控制桃树型基因的精细定位和基因克隆进展相对较慢,目前仅克隆了控制桃分枝角度的TAC1基因(Dardick et al.2013),精细定位控制其它树型基因并获得相关的分子标记是建立不同树型的分子辅助选种体系,并创制新的种质获得理想树型是桃产业中急需解决的关键问题之一。基于此,本发明在获得温度敏感型半矮生型桃新种质的基础上开展了目标性状的精细定位,并得到一个紧密连锁的SNP标记,实现对目标性状进行分子鉴定,确立目标性状的分子辅助选种体系。
发明内容
解决的技术问题:本发明针对以上情况,提供一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记及其应用。
技术方案:一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记,所获得的紧密连锁SNP标记为SNP260k-1和SNP260k-13,分别位于桃基因组(Version 1.0)Scaffold 3的2.850Mb和3.003Mb处。
上述SNP标记在调控温敏半矮生型桃节间长度中的应用。
一种鉴定与调控温敏半矮生型桃节间长度的引物对,如下所示:
SNP260k-1的引物对为:5-AGGGTTTCATGGCGTTAAAGC-3;
5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3;
SNP260k-13的引物对为:5-CTTTTCTCCGCCGCGTTAAT-3;
5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3。
上述引物对在鉴定与调控温敏半矮生型桃节间长度中的应用。
上述引物对在鉴定如上所述与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记中的应用。
含有上述引物对的试剂盒。
有益效果:本发明采用基于SNP的第三代标记标记技术,结合构建的分离杂交群体,采用图位克隆的方法,对调控温敏型半矮生桃节间长度的基因进行了精细定位,在精细定为区域内,开发稳定的、共显性和多态性的SNP标记,以获得与目标性状紧密连锁的标记。由于研究的对象为基于温度调控节间长度的半矮生型桃,可依据获得的紧密连锁标记克隆目标性状的基因,应用于分子辅助选种。
附图说明
图1温度启动半矮生型节间的伸长图;
图2温度对普通生长型节间伸长基本无影响图;
图3普通生长型(左)和半矮生型(右)节间长度比较图;
图4DNA琼脂糖电泳图(M为DL 2000DNA marker,1-13为部分提取DNA样品);
图5为PCR扩增片段电泳图(M为DL 2000DNA marker,1-9为部分PCR扩增样品);
图6为与目标性状紧密连锁的SNP标记SNP260k-1的测序峰图和SNP位点图;
图7为与目标性状紧密连锁的SNP标记SNP260k-13的测序峰图和SNP位点图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅为本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。其中,如无特殊说明,实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到;如无特殊说明,实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
实施例1
(一)、温度敏感型半矮生桃表型的鉴定
(1)温度处理及表型的确定
将杂交后代普通生长型和半矮生型各20株实生苗分别放入人工气候室(MLR-351H;Sanyo Electric)中进行温度处理,在前期研究的基础上,白天设置2种温度(23℃和30℃),湿度为70%,光照时长11h,光照强度为12000Lux,采用白色荧光灯管作为光源,暗处理温度为17℃。采用游标卡尺对不同温度处理(23℃和30℃)新稍的节间长度进行测定,测定10个节间求平均值。
温度处理表明,23℃时半矮生型桃处于极短矮化状态,30℃时温度启动了节间的伸长,节间长度接近普通生长型桃。温度启动了半矮生型节间长度的伸长,而温度对普通生长型桃的节间长度几乎没有影响。因此,我们将依赖温度调控该半矮生型桃节间长度的基因定义为温度敏感型基因(图1、2、3)。
(二)、杂交群体分离表型的鉴定
本发明以杂交群体美锦(普通生长型)×99-41-63(温度敏感型半矮生桃)的186个单株F1代的分离群体(普通生长型95株;温敏型半矮生桃91株)为研究材料,表型评价分别在4月-5月和6月初进行。半矮生型具体表型为4-5月节间长度极短,6月初后节间长度恢复普通生长型。通过生长特征确定半矮生型和普通生长型。
(三)、基因组DNA的提取,SNP标记的开发、目标性状的定位
(1)基因组DNA的提取
采用CTAB法提取桃叶片基因组DNA,略作修改,具体如下:(1)取新鲜或者硅胶干燥的叶子,放入玻璃碾钵中,加入液N2和PVP进行碾磨,直至碾磨细粉状为止;(2)用未污染的小匙将碾碎的叶片粉末转入2mL离心管,再加入配制好的CTAB液1300μL和6μLβ-巯基乙醇,进行1h长的65℃水浴,其间约每10min轻摇匀;(3)加入氯仿和异戊醇混合液,体积比为24:1,直至2mL的离心管满载线,后缓慢(防止剪裂)颠倒混匀10分钟。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R)4℃条件下,10000rpm,离心10分钟;(4)吸取上清液,转入2mL的离心管,加入氯仿、异戊醇和苯酚的混合液,体积比为24:1:25,直至离心管满载线,轻轻颠倒摇匀10min。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R),4℃条件下,10000rpm,离心10分钟;(5)再次吸取上清液,转入2.0mL的离心管,加入氯仿和异戊醇的混合液,体积比为24:1,直至离心管满载线,轻轻颠倒摇匀10min。放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R),4℃条件下,10000rpm,离心10分钟;(6)三次抽提后,用200μL的移液器小心吸取上清液于1.5mL管中,加入约150μL的NaAc和等体积的预冷异丙醇(混匀),于-20℃冰箱1小时;(7)将上述1.5mL离心管放入冷冻离心机(Eppendorf 5810R),4℃条件下,12000rpm,离心10分钟,弃上清液;(8)在带有沉淀的离心管中加入500μL的70%的乙醇,10000rpm瞬时离心,洗涤沉淀2次,加入无水乙醇洗涤沉淀一次,用200μL移液器(Eppendorf)吸除离心管底部剩余无水乙醇,后自然晾干;(9)在室温下自然风干沉淀后,加入100μL体积的0.1×TE溶解沉淀DNA,同时加入0.5μL的RNase,37℃放置1h,祛除RNA污染(长期保存在-20℃冰箱,常用则存于4℃冰箱);(10)采用NanoDrop 1000spectrophotometer(Themo)和1%的琼脂糖胶对提取的DNA进纯度浓度和完整度进行检测,并稀释成工作液浓度(25ng/μL),以用于后续研究。
(2)SNP开发的引物设计
参考Genome Database for Rosaceae数据库的桃基因组序列,采用primer3WebVersion4.0(http://primer3.ut.ee/)设计引物,引物参数为退火温度在60-63℃之间,引物长度20-23bp,开发基于Sanger测序的SNP标记,选择每1Mb设计一对引物,扩增片段长度约为1600bp。
(3)PCR反应体系以及SNP标记的获得
PCR扩增体系总体积为40μL,具体组分如下:
混匀后,在离心机(5810R,Eppendorf)离心,并在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。PCR扩增程序为95℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃90s,34个循环;72℃10min。
我们对父母本、后代各两个单株进行PCR扩增,PCR产物扩增后,送Invitrogen生物技术公司进行序列测定,根据测定序列信息在Contig软件中打开,序列对齐后寻找多态性SNP标记。
(四)、目标性状紧密连锁标记的开发
根据测序结果,我们寻找紧密连锁的SNP标记,具体基因型表现为,普通生长型母本基因型为aa、父本基因型为Aa,两个子代分别与亲本基因型一致,在4个子代中获得紧密连锁的SNP标记后,扩大至分离后代各20个单株中,确定紧密连锁后进一步扩大至全部样品中,进而确定紧密连锁的SNP标记后,进一步开发SNP标记,采用JionMap version 3.0(VanOoijen and Voorrips 2001)计算遗传距离。在精细定位区间依据父母本的基因型和表型开发SNP标记,用于区分不同杂交后代单株,确立完全连锁的SNP标记。
表1本发明所采用紧密连锁SNP标记的引物序列
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一种与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggtttcat ggcgttaaag c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaactgaact gctcttccac gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttttctccg ccgcgttaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccgggatgt gacaatttgg 20
Claims (3)
1.一种鉴定与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记的引物对,其特征在于如下所示:
SNP260k-1的引物对为:5-AGGGTTTCATGGCGTTAAAGC-3;
5-AAACTGAACTGCTCTTCCACGG-3;
SNP260k-13的引物对为:5-CTTTTCTCCGCCGCGTTAAT-3;
5-CCCGGGATGTGACAATTTGG-3。
2.权利要求1所述引物对在鉴定与调控温敏半矮生型桃节间长度紧密连锁的SNP标记中的应用。
3.含有权利要求1所述引物对的试剂盒。
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桃SRAP-PCR反应体系建立及与半矮生型;鲁振华等;《甘肃农业大学学报》;20101231;第35卷;52-55,84 * |
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