CN104087575B - 水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，通过对粳型超级稻“沈农265”和云南地方品种“丽江新团黑谷”的F₂和RILs群体进行抗倒伏相关性状的QTL分析，鉴定了一个在不同群体类型(F₂和RILs)、不同年份(2008年、2009年和2011年)、不同地点(沈阳和哈尔滨)稳定表达的主效QTL，其增效等位基因来自于云南地方品种“丽江新团黑谷”。进一步分析发现，其同时控制植株下部抗推力、茎秆抗折力、茎壁厚度、大小维管束面积和大小维管束木质部面积，命名为prl4(pushing resistance of the lower part4)。本发明同时公开了prl4的分子标记，所述分子标记与prl4不仅紧密连锁而且在植株后代与所述基因共分离，因而适于通过分子标记辅助手段选育兼顾高产和抗倒的水稻品种。

Description

水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用

技术领域

本发明涉及一种水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，属于水稻育种中的检测技术领域。

背景技术

倒伏是影响水稻、小麦、玉米等作物高产的重要因素之一，水稻等作物在大风、大雨作用下，易导致倒伏，由此会造成作物减产20-30％。此外，作物群体倒伏后，其冠层结构被破坏，导致光合和干物质生产能力下降，严重的倒伏还会引起水、营养物质和同化物的转运受阻，减少籽粒灌浆时的养分供给。同时倒伏会使群体内部的湿度增加，诱发真菌性病害或引起穗发芽，进而影响稻米的品质和外观。随着黑龙江“国家战略粮仓”地位的日益突出，水稻高产稳产已成为关系国计民生的关键问题。据不完全统计，黑龙江每年因为倒伏导致的减产在10％左右，严重年份达到20％以上。因此，深入开展对水稻抗倒能力的研究，进一步提高黑龙江省水稻的抗倒性，实现水稻高产、稳产有着重要的现实意义。已有研究表明株高是影响水稻倒伏的最重要因素，绿色革命(矮化育种)使矮化品种代替了传统的高秆品种，提高了水稻的耐肥抗倒性和收获指数，但植株过矮，致使叶片密集、相互遮掩，从而降低群体的光能利用率。近年来的研究表明，欲使水稻产量进一步增加，通过提高收获指数的难度越来越大，只能通过提高品种的生物产量来实现。然而，实现生物产量的突破必然依赖于株高的增加，但这一策略将会重新带来倒伏的危险。因此，在保证适当提高株高的前提下，发掘“矮秆”以外的优良抗倒基因资源，揭示新的抗倒机制，培育优良的抗倒材料，对于破解倒伏难题，实现水稻生产潜力的下一个跨越，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是筛选和开发位于prl4两侧的特异性分子标记，并将这个分子标记命名为prl4-1和prl4-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。具体地，本发明设计开发的分子标记的核苷酸序列如下：

prl4-1的上游引物序列为：5’-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；

prl4-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；

prl4-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；

prl4-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’。

本发明采用以下技术方案：根据前期定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并设计出该标记。将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有pr l 4的丽江新团黑谷在利用prl4-1检测时，能够扩增出210bp左右的条带，而沈农265能够扩增出200bp左右的条带。在利用prl4-2检测时，丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带，而沈农265能够扩增出190bp左右的条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与prl4共分离。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏增效等位基因。

水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记与应用，应用下述步骤检测待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具体实施步骤为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管中。

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液600μL，所述CTAB抽提液中的成分为2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl。

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中。

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止。

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上。

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干。

(1h)用100μL的TE缓冲液回溶待用，所述TE缓冲液中的成分为10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0。

(1i)取1.5μL用于PCR扩增。

(2)进行PCR扩增，具体过程为：PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tri s-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v/v)dimethylsulfoxide和0.5U Taq DNA聚合酶。应用美国AB公司的ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5mi n；每个循环94℃预变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。

(3)进行PCR产物检测：扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上样于3.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。

该发明的有益效果在于：本发明技术筛选了两个水稻抗倒伏基因prl4的分子标记，所述分子标记与prl4不仅紧密连锁而且在植株后代与所述基因共分离，因而为筛选适于直播水稻品种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径。

附图说明

图1是本发明实施例中prl4-1分子标记的检测结果示意图。

图2是本发明实施例中prl4-2分子标记的检测结果示意图。

图中标记说明：M：分子标记标准；1：沈农265；2：丽江新团黑谷；3-12：不抗倒伏株系；13-22：抗倒伏株系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。

实施例

按照水稻倒伏发生的位置，通常将倒伏分为两种类型：“茎倒”和“根倒”。针对两种不同类型，分别通过“秆强化”和“支持力强化”两种策略加以解决。本发明实施例中，前期通过对粳型超级稻“沈农265”和云南地方品种“丽江新团黑谷”的F₂和RILs群体进行抗倒伏相关性状的QTL分析，鉴定了一个在不同群体类型(F₂和RILs)、不同年份(2008年、2009年和2011年)、不同地点(沈阳和哈尔滨)稳定表达的主效QTL，其增效等位基因来自于地方品种“丽江新团黑谷”，表1为利用沈农265/丽江新团黑谷的F₂群体(176)和重组自交系群体(94)分别于2008、2009和2011年在沈阳和哈尔滨两地检测到的第4染色体上控制倒伏相关性状的主效QTL，分析发现其控制植株下部茎秆抗折力，也就是具有“强秆化”的应用潜力，暂命名为pushing resistance of the lower part 4(prl4)。进一步分析发现该区间未定位到与株高及其构成相关的QTL，这也避免了株高对该位点抗倒伏分析的影响。通过全基因组的分子标记辅助选择，从重组自交系群体中选出目标区域为“黑谷”，而75％的遗传背景为“沈农265”的“初始材料”，其茎秆解剖结构与“沈农265”差异显著。此外，为保障能够将本基因成功克隆，于2012年利用“黑谷/二九南”的F2群体进行了植株下部茎秆抗折力的QTL分析，共检测到3个控制植株下部茎秆抗折力的QTL。其中，位于第4染色体的主效QTL-qPRL4与prl4在相同区域，且增效等位基因也来自“黑谷”，表2为利用丽江新团黑谷/二九南的F₂群体(190)于2012年在哈尔滨检测到的控制植株下部茎秆抗折力的QTL，从中可以看出，不仅表明prl4的真实存在，也表明其在不同遗传背景下稳定表达。2013年利用该群体的F_2：3家系进行了验证，表3为利用丽江新团黑谷/二九南的F_2：3家系群体(190)于2013年在哈尔滨检测到的控制植株下部茎秆抗折力的QTL，发现该QTL稳定表达且真实存在，并筛选了两个水稻抗倒伏基因prl4的分子标记，所述分子标记与prl4不仅紧密连锁而且在植株后代与所述基因共分离，因而为筛选适于直播水稻品种和分子标记辅助育种提供了一条很好的途径。

表1

表2

表3

本发明实施例中，筛选和开发位于prl4两侧的特异性分子标记，并将这个分子标记命名为prl4-1和prl4-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

具体地，本发明设计开发的分子标记的核苷酸序列如下：

prl4-1的上游引物序列为：5’-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；

prl4-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；

prl4-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；

prl4-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’。

本发明实施例中，根据前期定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并发计出该标记。将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有prl4的丽江新团黑谷在利用prl4-1检测时，能够扩增出210bp左右的条带，而沈农265能够扩增出200bp左右的条带。在利用prl4-2检测时，丽江新团黑谷能够扩增出200bp左右的条带，而沈农265能够扩增出190bp左右的条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与prl4共分离。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏增效等位基因。

本发明实施例中的水稻强秆抗倒基因prl4的分子标记，应用下述步骤检测待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具体实施步骤为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管中。

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液600μL，所述CTAB抽提液中的成分为2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl。

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中。

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止。

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上。

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干。

(1h)用100μL的TE缓冲液回溶待用，所述TE缓冲液中的成分为10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0。

(1i)取1.5μL用于PCR扩增。

(2)进行PCR扩增，具体过程为：PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v/v)dimethyl sulfoxide和0.5U Taq DNA聚合酶。应用美国AB公司的ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。

(3)进行PCR产物检测：扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上样于3.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。如图1所示为prl4-1分子标记的检测结果，能够扩增出210bP条带的株系具有prl4基因。如图2所示为prl4-2分子标记的检测结果，能够扩增出200bP条带的株系具有prl4基因。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种水稻强秆抗倒基因prl4的应用，其特征在于：筛选和开发位于prl4两侧的特异性分子标记，并将这个分子标记命名为prl4-1和prl4-2，所述片段如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述分子标记的核苷酸序列如下：prl4-1的上游引物序列为：5’-CCTATCCCATTAGCCAAACATTGC-3’；prl4-1的下游引物序列为：5’-GATTTACCTCGACGCCAACCTG-3’；prl4-2的上游引物序列为：5’-ATGAGATGAGTTCAAGGCCC-3’；prl4-2的下游引物序列为：5’-AACTCTGTACCTCCATCGCC-3’，并且应用所述分子标记检测待测水稻材料是否在prl4座位上含有抗倒伏的增效等位基因。

2.根据权利要求1所述的水稻强秆抗倒基因prl4的应用，其特征在于：采用所述分子标记，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一对微卫星差异，并设计出该标记；将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有prl4的丽江新团黑谷在利用prl4-1检测时，能够扩增出210bp的条带，而沈农265能够扩增出200bp的条带；在利用prl4-2检测时，丽江新团黑谷能够扩增出200bp的条带，而沈农265能够扩增出190bp的条带；并进一步对重组自交系进行验证，发现这两个该分子标记与prl4共分离；此分子标记能用于鉴定待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏增效等位基因。

3.根据权利要求2所述的水稻强秆抗倒基因prl4的应用，其特征在于：应用下述步骤检测待测材料是否在prl4座位上含有丽江新团黑谷的抗倒伏的增效等位基因，其具体实施步骤为：

(1)DNA提取，具体过程为：

(1a)取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管中；

(1b)加入预热至65℃的CTAB抽提液600μL，所述CTAB抽提液中的成分为2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl；

(1c)轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；

(1d)取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；

(1e)重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；

(1f)将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上；

(1g)此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；

(1h)用100μL的TE缓冲液回溶待用，所述TE缓冲液中的成分为10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0；

(1i)取1.5μL用于PCR扩增；

(2)进行PCR扩增，具体过程为：PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v/v)dimethyl sulfoxide和0.5U Taq DNA聚合酶；应用美国AB公司的ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min；

(3)进行PCR产物检测：扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上样于3.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。