CN103789433B - 一种检测水稻穗结构基因ips1的特异分子标记及其检测方法 - Google Patents

一种检测水稻穗结构基因ips1的特异分子标记及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记及其检测方法，该分子标记为IPS1‑1；该方法得具体过程为：步骤a，DNA提取；步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50m MKCI，10mM Tris‑HCI(pH8.8)，0.1％Triton‑X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v/v)dimethyl sulfoxide and 0.5U Taq DNA聚合酶；步骤c，PCR产物检测；扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上述样品于1.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察；步骤d，获取IPS1基因。本发明分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPS1座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因；能够改善穗部结构、优化一二次枝梗穗粒数比例、提高穗实粒数、增加水稻单产水平，同时提高稻米品质。

Description

一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记及其检测方法
技术领域
本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，尤其涉及分子辅助选育高产优质水稻时，检测同时增产增效的IPS1等位基因的特异性分子标记及其检测方法。
背景技术
作为水稻的最终产量器官，穗的结构与形态始终是育种过程中的重要参考指标，其涉及了水稻产量构成三要素(每株穗数、穗粒数和粒重)的两个。由于生态条件等原因，东北粳稻穗数水平相对较高，在此基础上进一步增加的潜力较小。在长期自然选择和人工选择下，生产应用的品种间千粒重差异不大，对高产的作用相对较小，因此改善穗部结构、提高穗粒数是增加水稻单产水平的主攻方向。穗粒数由每穗颖花数和结实率共同决定，众多研究表明，增加颖花数的主要途径是提高二次枝梗颖花数，而二次枝梗颖花为弱势颖花，灌浆启动较晚，灌浆时间较长，在东北稻区往往结实率极低，改良意义不大。因而，东北稻区增加每穗颖花数的主要途径是尽可能增加一次枝梗数，同时维持适当的二次枝梗数，优化穗结构。长期的水稻育种实践表明，增加一次枝梗数，不仅能够实现产量的增加，而且能够在保证产量的前提下，提高精米率和整精米率等加工品质，同时能够大幅度改善稻米的垩白度和垩白米率。
目前关于水稻穗部结构相关QTL的解析取得了一定的进展，已经克隆了6个相关基因：Gn1a、DST、LOG、DEP1、Ghd7、Ghd7.1和Ghd8。其中Gn1a、DEP1控制二次枝梗颖花数的增加，DST调控Gn1a在分生组织中的表达，LOG是减效基因，Ghd7、Ghd7.1和Ghd8是通过延长生育期来提高穗粒数。这些基因均不适合东北稻区。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记及其检测方法，用以克服上述技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记，该分子标记为IPS1-1，其中，该分子标记的核苷酸序列如下：
IPS1-1的上游引物序列为：5’-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3’
IPS1-1的下游引物序列为：5’-ACAACATTCCCCTGGCAAGT--3’。
进一步，所述分子标记IPS1-1由东北粳稻‘沈农265’和云南地方品种‘丽江新团黑谷’构建的重组自交系群体基因进行扩增获取。
进一步，在所述重组自交过程中，所述分子标记IPS1-1与IPS1共分离。
本发明还提供一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记的方法，其过程为：
步骤a，DNA提取；具体为：
步骤a1，取长度为10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
步骤a2，加入预热至65℃的CTAB抽提液600μL；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；
步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上；
步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增；
步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50mMKCl，10mMTris-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μMof each primer，5％(v/v)dimethyl sulfoxide and 0.5 U Taq DNA聚合酶；
步骤c，PCR产物检测；
扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上述样品于1.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察；
步骤d，获取IPS1基因。
进一步，在上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LnaCl。
进一步，在上述步骤a8中，所述TE缓冲液包括10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0。
进一步，上述步骤b中，采用ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。
与现有技术相比较本发明的有益效果在于：本发明分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPS1座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因；能够改善穗部结构、优化一二次枝梗穗粒数比例、提高穗实粒数、增加水稻单产水平，同时提高稻米品质。
附图说明
图1为本发明IPS1在第4号染色体上的位置及连锁标记；
图2为本发明17个水稻品种分子标记IPS1-1的检测结果。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本发明东北粳稻‘沈农265’和云南地方品种‘丽江新团黑谷’构建的重组自交系群体，在沈阳和哈尔滨两地对穗部结构性状进行了QTL分析，共检测到控制一次枝梗数的QTL5个，并利用剩余杂合体衍生群体对同时控制一次枝梗数、一次枝梗实粒数的QTL IPS1进行了精细定位，同时提供了与IPS1紧密连锁且共分离的分子标记。
在本发明中用于检测IPS1的特异性分子标记为IPS1-1，其中，本发明的分子标记的核苷酸序列如下：
IPS1-1的上游引物序列为：5’-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3’
IPS1-1的下游引物序列为：5’-ACAACATTCCCCTGGCAAGT--3’。
请参阅图1所示，其为本发明IPS1在第4号染色体上的位置及连锁标记；图2为本发明17个水稻品种分子标记IPS1-1的检测结果，
其中，M：分子标记标准；1：沈农265；2：丽江新团黑谷；3：Habataki；4：Kasalath；5：9311；6：七山占；7：通系83；8：日本晴；9：辽粳5；10：辽星1号；11：盐丰47；12：辽粳294；13：龙粳21；14：牡丹江31；15：松粳9号；16：吉粳88；17：空育131。
本发明根据前期精细定位结果，分别测定了丽江新团黑谷和沈农265的目标区域，并进行了比对分析，挑选出一个接近6000bp的大片段IdDel差异，并设计出该标记。将此标记应用于丽江新团黑谷和沈农265进行验证，发现具有IPS1的丽江新团黑谷能够扩增出580bp左右的条带，而沈农265无扩增条带。并进一步对重组自交系进行验证，发现该分子标记与IPS1共分离。此外，还对一些水稻品种进行了目标基因的验证。综上，此分子标记可以用于鉴定待测材料是否在IPS1座位上含有丽江新团黑谷的控制穗结构的增效等位基因。
该检测方法具体为：
步骤a，DNA提取；具体为：
步骤a1，取长度为10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
步骤a2，加入预热至65℃的CTAB抽提液[2％(w/v)CTAB；100mmol/LTris-Hcl，pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl]600μL；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀。
步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上；
步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
步骤a8，用100μL的TE缓冲液(10mmol/LTris-Hcl；1mmol/LEDTA，pH8.0)回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增。
步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50mMKCl，10mMTris-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μMof each primer，5％(v/v)dimethyl sulfoxide and 0.5 U Taq DNA聚合酶。
本实施例采用ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。
步骤c，PCR产物检测；
扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上述样品于1.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察。
步骤d，获取IPS1基因，本实施例中，能够扩增出条带的水稻品种具有IPS1基因。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记，其特征在于，该分子标记为IPS1-1，其中，该分子标记的扩增引物核苷酸序列如下：
IPS1-1的上游引物序列为：5′-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3′
IPS1-1的下游引物序列为：5′-ACAACATTCCCCTGGCAAGT--3′
所述分子标记IPS1-1由东北粳稻′沈农265′和云南地方品种′丽江新团黑谷′构建的重组自交系群体基因进行扩增获取。
2.根据权利要求1所述的检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记，其特征在于，在所述重组自交过程中，所述分子标记IPS1-1与IPS1共分离。
3.一种检测如权利要求1所述的水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记的方法，其特征在于，其过程为：
步骤a，DNA提取；具体为：
步骤a1，取长度为10cm黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的EP微量离心管中；
步骤a2，加入预热至65℃的CTAB抽提液600μL；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；
步骤a4，取出后，待冷至室温后加入等体积的24∶1的氯仿∶异戊醇，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上；
步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增；
步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM pH8.8的Tris-HCl，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，0.2μM扩增引物，其中扩增引物核苷酸序列如下：
IPS1-1的上游引物序列为：5′-AGCCGAGGGACGTGCAAACTACT-3′
IPS1-1的下游引物序列为：5′-ACAACATTCCCCTGGCAAGT--3′
5％(v/v)二甲基亚砜，0.5U Taq DNA聚合酶；
步骤c，PCR产物检测；
扩增产物中加入上样缓冲液，取8μL上述样品于1.5％的琼脂糖凝胶，在100V的恒定电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统成像观察；
步骤d，能够扩增出条带的水稻品种具有IPS1基因。
4.根据权利要求3所述的检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记的方法，其特征在于，在上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包含2％(w/v)CTAB；100mmol/L Tris-HCl，pH8.0；20mmol/L EDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl。
5.根据权利要求4所述的检测水稻穗结构基因IPS1的特异分子标记的方法，其特征在于，在上述步骤a8中，所述TE缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0。
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