CN104195225A - 一种快速鉴定转基因水稻纯合子的定量pcr法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因作为内参基因，以转入水稻基因组的外源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应；并根据比较Ct值2-△△Ct法计算鉴别纯合子或杂合子。

Description

一种快速鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可靠的可快速鉴定转基因水稻纯合子并用于基因叠加的定量PCR法。 
背景技术
通过遗传转化以产生基因改变的植株在基础应用研究中被广泛应用，这也促进了具有优良性状的经济作物的发展。快速筛选出纯合子植株可减少转基因作物的育种时间，尤其是之后还需要进行多个基因的叠加。筛选纯合子和确定转基因水稻的拷贝数在选择和培育转基因品种中至关重要，是研究中不可或缺的步骤。特别是对于需要大量空间来繁殖下一代的作物，更需要快速准确地鉴定出转基因水稻纯合子。因此，一个可以在早期准确筛选出纯合子植株并确定转基因水稻拷贝数的方法在分子标记辅助育种中就显得格外重要。从传统来说，我们通常使用目的基因常规PCR和southern杂交分析来确定转基因水稻的纯合子和拷贝数。但是很遗憾，这些方法都费时费力，不仅需要大量新鲜或冷冻的样品来提取DNA，更有可能有放射性污染。 
为了解决这些问题，有人使用定量PCR来分析基因的整合。定量PCR在整个定量PCR过程中收集数据，因此把扩增和检测合为一步。检测通过一系列的荧光分子完成，即定量PCR产物的浓度与荧光强度相关。定量PCR的终点是阈值循环数，即报告染料的荧光信号超过我们所定义的阈值时定量PCR的循环数。以Ct值来显示数据是为了确保定量发生在扩增的延伸阶段。在反应中Ct值与复制子的数量高度相关。在起始样品材料中目的DNA的数量越多，荧光信号的显著性增长出现得越快，Ct值就越低。 
在现有技术的基础上，本发明提供了一种鉴定纯合子的定量PCR方法，且在转基因叠加中进行准确、可靠的鉴定，并将此应用于分子育种。本方法可以成功应用于3个转基因的叠加，与southern杂交分析和其他现有的转基因水稻研究方法相比具有快速，准确，省时省力等优点。 
发明内容
本发明提供了一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因(基因号EF055878.1)作为内参基因，以转入水稻基因组的外源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应，并根据比较Ct值2-△△Ct法计算鉴别纯合子或杂合子。 
具体地，所述内参基因引物的核苷酸序列为： 
正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT； 
反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。 
本发明所述定量PCR的反应体系为： 
10μl的反应体系，包括： 
定量PCR反应过程包括：95℃10min，1个循环；95℃10s，60℃20s，40个循环。 
附图说明
图1是本发明所使用的质粒结构图。 
分别为pOsPMP122、pOsPMP132、pOsPMP515、pOsPMP516。 
图2是RBE4的扩增曲线，标准曲线和溶解曲线。 
其中，(a)扩增曲线；(b)标准曲线；(c)溶解曲线；Ct表示阈值循环数，ΔRn表示荧光信号强度-荧光基线强度。 
图3是转基因叠加和常规PCR扩增方案图。 
(a)转基因叠加的缩略图；(b)4个质粒图谱和本方法所鉴定出的纯合子F2代基因特异性引物常规PCR验证示例。常规PCR产物大小以及HindIII和EcoRI之间的完整表达元件如图所示。A代表FUT8基因，B代表GalT基因，C代表AAT基因。大小写字母分别代表显性位点和隐性位点。 
图4是转基因水稻品系515-2和515-1的Southern杂交分析。 
基因组DNA经HindIII，EcoRI或者HindIII/EcoRI酶切后，用FUT8基因标 记的探针杂交。经HindIII，EcoRI和HindIII/EcoRI酶切后的双元载体pOsPMP515用作阳性对照。M代表HindII酶切后的λDNA；第2-4和8-10孔是分别经HindIII(H3)，EcoRI(R1)和HindIII/EcoRI(H3/R1)酶切后的质粒DNA；第5-7孔是分别经HindIII(H3)，EcoRI(R1)和HindIII/EcoRI(H3/R1)酶切后的转基因水稻品系515-2的基因组DNA；第11-13是分别经HindIII(H3)，EcoRI(R1)和HindIII/EcoRI(H3/R1)酶切后的转基因水稻品系515-2的基因组DNA。 
具体实施方式
以下实施例中所使用的材料和试剂，除特别说明外，均为普通市售。 
材料与方法 
质粒构建和培育转基因水稻植株 
FUT8基因(α-1,6-fucosyltransferase；基因号D89289.1)和GalT基因(β-1,4-galactosyltransferase；基因号M22921.1)按照水稻密码子偏好，由GenScript公司(美国)合成(优化后的基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)。本发明用具有胚乳特异性表达启动子Glb(globulin)的pOsPMP512质粒作为中间载体。合成的基因经SchI和XhoI分步酶切后，插入由NaeI和XhoI酶切后的pOsPMP512载体，由此得到pOsPMP513(FUT8)和pOsPMP514(GalT)。pOsPMP513和pOsPMP514经HindIII和EcoRI酶切后插入同样经过HindIII和EcoRI酶切后的JH2600载体，得到双元载体pOsPMP515和pOsPMP516(如图1所示)。质粒转化到农杆菌菌株EHA105。含有CP启动子和潮霉素(HPT)基因的质粒pOsPMP122作为筛选标记(如图1所示)。含有目的基因的质粒和筛选标记质粒通过农杆菌介导的转化法共同侵染水稻TP309的愈伤组织。 
抗潮霉素的转化子通过基因特异性引物HPT-F/HPT-R的常规PCR反应来鉴定(表1)。本发明用到一个表达人α抗胰蛋白酶(AAT)的转基因水稻品系(132-17)(Zhang L,Shi J,Jiang D,Stupak J,Ou J,Qiu Q,An N,Li J,Yang D，Expression and characterization of recombinant human alpha-antitrypsin in transgenic rice seed.Journal of biotechnology，2013)。包含HPT基因和FUT8或GalT基因的共转化子由目的基因引物FUT8-F2/FUT8-R2或GalT-F2/GalT-R2(表1)的常规PCR反应鉴定。纯合子转基因水稻品系515首先与纯合子转基因水稻品系516杂交，得到的F1代再与132-17杂交。(515×516)×132-17杂 交后的F2代植株用于接下来通过本方法鉴定纯合子和杂合子的研究。 
表1.定量PCR和常规PCR分析的引物 
DNA提取 
用于定量PCR的水稻基因组DNA使用CTAB法从新鲜叶片中提取。基因组DNA的浓度由260nm紫外吸光值计算，DNA的质量由260nm/280nm紫外吸光值计算。DNA样品用1％琼脂糖凝胶电泳。 
PCR(包括定量PCR和常规PCR)扩增和引物 
本发明所需要的引物由Primer5.0软件设计(如表2)。为提高扩增效率，SYBR Green定量PCR引物的扩增片段最好小于200bp。在定量PCR中，引物RBE4-F/RBE4-R用于扩增内参基因RBE4，引物FUT8-F1/FUT8-R1用于扩增目的基因FUT8，引物GalT-F1/GalT-R1用于扩增目的基因GalT，引物AAT-F1/AAT-R1用于扩增目的基因AAT，扩增片段分别为106bp，118bp，96bp和91bp。在常规PCR中，引物FUT8-F2/FUT8-R2用于扩增目的基因FUT8，引物GalT-F2/GalT-R2用于扩增目的基因GalT，引物AAT-F2/AAT-R2用于扩增目的基因AAT，扩增片段分别为965bp，645bp和644bp。每个基因的定量PCR扩增效率由梯度稀释得到的标准曲线来确定。 
SYBR Green定量PCR 
扩增反应由定量PCR仪完成(Applied Biosystems，美国)。10μl的反应体系，其中包括：5μl定量PCR buffer mix(Invitrogen，美国)，1μl DNA模板(30ng)和500nM基因特异性引物。整个定量PCR过程包括95℃10min，1个循环；95℃10s，60℃20s，40个循环。基因的Ct值由系统自动产生。扩增数据由StepOne软件分析(Applied Biosystems，美国)。每个样品重复三次，每次重复包含三个相同样品。 
转基因水稻纯合子的鉴定 
纯合子的鉴定采用比较Ct值(2-△△Ct)法。由于纯合子植株中所含有的转基因水稻拷贝数是杂合子的两倍，那么纯合子植株的2-△△Ct值也应为杂合子的两倍。FUT8和RBE4的比较Ct值可由下列公式计算： 
△△Ct＝(Ct，FUT8-Ct，RBE4)样品2-(Ct，FUT8-Ct，RBE4)样品1
目的基因的扩增效率可由内参基因的扩增效率校正。每个反应重复3次，每次重复包含三个相同样品。其中每个样品是指同种转基因植株的不同单株。 
纯合子植株的常规PCR验证 
常规PCR的反应体系为20μl(Fisher Scientific，美国)，其中包括：1μl DNA模板(30ng)，2μl10x PCR buffer，0.8μl1mmol l-1dNTP,1.2μl25mmol l-1Mg2+，1个单位Taq DNA聚合酶和500nM引物。PCR程序包括：95℃10min，1个循环；95℃30s，56℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min。样品最后保存在25℃。每个反应重复3次。 
为验证之前鉴定的纯合子植株是否准确，本发明进行了T2代检测。如果T2代中没有基因分离，就认为T1代的植株是纯合子；如果T2代中有基因分离，就认为T1代的植株是杂合子。 
转基因水稻拷贝数的确定 
转基因水稻拷贝数的计算采用与标准曲线相关的绝对定量法(Ahmed FE，Detection of genetically modified organisms in foods.TRENDS in Biotechnology，2002；Livak KJ,Schmittgen TD，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2-△△Ct method.Methods，2001)。质粒浓度由260nm下的紫外吸光值得到，基因的拷贝数计算公式如下： 
拷贝数＝阿伏伽德罗常数×质粒的浓度拷贝数(g ml-1)/质粒相对分子质量(g mol-1) 
基因组和质粒DNA分别进行10倍梯度稀释(稀释倍数为105，104，103，102和10拷贝μl-1)，由两个基因的Ct值与浓度的对数值之间存在的线性关系得到标准曲线。转基因植株中目的基因的绝对拷贝数由Ct值对应于其标准曲线得到。RBE4是一个单拷贝基因，目的基因的拷贝数计算公式如下： 
目的基因的拷贝数＝A/B或目的基因的拷贝数＝A/B×2 
A表示目的基因的起始拷贝数，B表示内参基因RBE4的起始拷贝数。 
RBE4在水稻基因组中具有特异性。在上述公式中，如果目的基因是杂合的，那么拷贝数就应该乘以2。每个反应重复3次，每次重复包含三个相同样品。 
Southern杂交分析 
基因组DNA(10μg)采用CTAB法从新鲜嫩叶片中提取。经HindIII，EcoRI或者HindIII/EcoRI酶切后用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离。DNA大小由DNA marker(经HindIII酶切后的λDNA)确定。分离后的DNA转移至硝酸纤维素膜上(Gene公司，中国)。探针由引物FUT8-F2/FUT8-R2扩增FUT8基因得到，长约965bp。DNA探针用随机引物标记试剂盒标记(Roche，瑞士)。烤膜，预杂交和杂交都按照说明书进行(高效DNA地高辛标记和检测试剂盒I，Roche，瑞士)。 
【实施例1】用于纯合子鉴定的内参基因的选择 
为了运用定量PCR来鉴定纯合子，选择一个合适的内参非常重要。它可以消除样品间的波动，并对Ct值进行校正。即使目的基因扩增时变化很大，内参基因也应保持不变。一个完美的内参应该具有物种特异性，在单倍体基因组中具有单拷贝或低拷贝。为筛选出合适的内参基因，我们检测了在水稻基因组中为单拷贝或双拷贝的8个基因：RBE4(淀粉分支酶)，SPS(蔗糖磷酸合成酶)，gos9(水稻根部特异性基因)，eEF1a(真核延伸因子1-Alpha)，RAc1(水稻肌动蛋白基因)，dxr(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)，Os3bet3和Os4trs20(trs-like基因)，如表3所示。为达到理想的扩增效率，我们共试验了21对引物(如表2所示)。定量PCR分析中的DNA模板经过梯度稀释。我们比较了8个基因的扩增曲线，标准曲线(包括斜率，平均相关系数R2和扩增效率)以及溶解曲线。其中RBE4的标准曲线相关系数最高(R2＝0.994；图2b)，同时定量PCR的扩增效率接近100％。其他基因要么不能完全满足所有条件，要么没有RBE4的效果好(表3)。因此，单拷贝的RBE4基因就被选作内参基因用于接下来的分析。 
表2.用于定量PCR检测的21对引物 
引物名称 引物序列
dxr-F GTTGTTGCTGCTGCACTTTC
dxr-R GAGTGTTTCACAGGTGGGTT
Os3bet3-F TCCGGGGACGCCCTCTTC
Os3bet3-R CATACCTACTTGATGCTGCCG
 
Os7bet3-F GTCCGGGGACGCTCTCTTC
Os7bet3-R GGATCGTAAACGCTTTGTCAAA
Os1bet5-F GAAGCTCATGTTCGGCCTCC
Os1bet5-R CAAGGTGCTTATTGAAAAGCTCG
Os2trs20-F GTCTCGTCTCCTCCGCTC
Os2trs20-R GGCGGTGTGGAGCTTACAG
Os4trs20-F CGACATCCCAATCTATGAGGC
Os4trs20-R CATAAGCACTGGAGAAAGCCC
Os6trs23-F ATGGCGTCAGCAGCAATCTAC
Os6trs23-R CCAAAGGCAGTGCAGGAATC
Os7trs23-F ATGGCGTTAGCAGCAATCTAC
Os7trs23-R CACATACAAAGACATGGTGCG
Os1trs31-F GAGGAGGGTGGGCAAGATG
Os1trs31-R CACAAATCATGTGGAGTCAGC
Os7trs33-F GGGTGGTCATGCAGATGG
Os7trs33-R CTTAATAAGCGCACAAGGCAG
Os9trs33-F GAGGTTGCGGAGAGCTGTG
Os9trs33-R GGAGTTGCATGCAAAGTAAAGG
SPS2-F TTGCGCCTGAACGGATAT
SPS2-R CGGTTGATCTTTTCGGGATG
RBE4-F GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT
RBE4-R CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA
gos9-F TTAGCCTCCCGCTGCAGA
gos9-R AGAGTCCACAAGTGCTCCCG
eEFla-F TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT
eEFla-R GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA
RAc1-F TGGTATGGTCAAGGCTGGGT
RAc1-R CGACGTAGGCGTCCTTCTG
GAPDH-F AAGCCAGCATCCTATGATCAGATT
GAPDH-R CGTAACCCAGAATACCCTTGAGTTT
Actin1-F CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA
Actin1-R CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA
18S rRNA-F ATGGTGGTGACGGGTGAC
18S rRNA-R CAGACACTAAAGCGCCCGGTA
 
ACTIN2-F ATCCTCCGTCTTGACCTTGC
ACTIN2-R CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG
SPS-F TTGCGCCTGAACGGATAT
SPS-R CGGTTGATCTTTTCGGGATG
表3.所有检测基因的相关系数(R2)和定量PCR扩增效率 
基因 相关系数(R2) 定量PCR扩增效率(E％)
RBE4 0.994 101.00
SPS 0.983 116.36
gos9 0.986 95.14
eEF1a 0.953 123.33
RAc1 0.984 105.76
dxr 0.986 90.03
Os3bet3 0.991 95.43
Os4trs20 0.987 119.92
【实施例2】利用Ct值(2-△△Ct)鉴定转基因植株的纯合子和杂合子 
为检验内参基因RBE4是否可用于纯合子和杂合子的鉴定，本发明检测了其在T1代转基因植株应用中的准确性。我们选用了相对定量的比较Ct值法(2-△△Ct)。首先要确定内参和目的基因的标准曲线以及定量PCR的扩增效率。RBE4和FUT8标准曲线的相关系数分别为0.998和0.994，扩增效率分别为99％和101％，说明内参和目的基因均可有效用于接下来的实验。我们从5个转基因水稻品系的T1代中各选取了100个单株。由于△Ct值可定量检测出FUT8/RBE4基因的比例，因此纯合子和杂合子FUT8/RBE4拷贝数之比就可以反映在他们的 △Ct值上。我们认为纯合子的2-△△Ct值是杂合子的两倍。每个样品的2-△△Ct值要么接近于1，要么接近于2(表4)，这就准确地把纯合子和杂合子区分开来。 
表4.用于检测纯合子单株的T1代转基因植株的2-△△Ct值 
【实施例3】在T2代中验证已检测出的纯合子的准确性 
为检验用定量PCR方法检测出的纯合子和杂合子植株是否准确，我们通过其T2代植株有无基因分离来确定。纯合子，杂合子或者阴性植株通过自交产生T2代，T2代植株用基因特异性引物进行常规PCR扩增(表5)。结果显示，具有一个转基因位点的转基因水稻品系其纯合子和阴性植株的准确率均达到100％，杂合子的准确率达到93.33％。具有两个转基因位点的转基因水稻品系纯合子植株的准确率达到92.31％，杂合子的准确率达到86.67％。这些数据说明本方法可在早期准确筛选出纯合子单株。 
表5.T1代纯合子定量PCR鉴定和T2代常规PCR验证 
【实施例4】确定基因叠加中的纯合子单株 
为验证本发明的方法是否可用于基因叠加，我们在FUT8，GalT和AAT这3个基因的杂交品种中试验了运用此方法筛选纯合子的准确性(图3a)。如表6所示，我们采用逐步筛选的方式，共检测了(515×516)×132-17杂交F2代中的500个单株。首先，(515×516)×132-17杂交F2代中所有FUT8纯合的植株被挑出，共133株。这些单株用于第二轮GalT纯合子的筛选,共得到36株既含有FUT8纯合基因又含有GalT纯合基因的纯合子。最后这些植株用AAT的引物筛选，最终得到了8株含有FUT8，GalT和AAT三个基因的纯合子单株(表6)。 
为检验以上由本方法筛选出的纯合子的准确性，我们随机选取了一个FUT8，GalT和AAT三个基因的纯合子自交产生F3代，用3个基因特异性引物常规PCR看有无基因分离。在所检测的100株F3代植株中，均无目的基因的分离(图3b)。这个结果说明本方法可有效用于多个基因叠加中筛选纯合子单株。 
表6定量PCR法用于基因叠加中的纯合子筛选 
【实施例5】插入位点的确定和验证 
由于内参基因RBE4在水稻基因组中为单拷贝，目的基因的拷贝数可通过与RBE4比较后得到。为检验此方法确定拷贝数是否可行，我们首先对具有不同转基因位点的5个独立转基因水稻品系进行了遗传学分析。从T1代的杂合单株产生的T2代中选取30个单株，根据阳性单株和阴性单株的遗传学分离比例来确定目的基因的插入位点。在定量PCR中，目的基因FUT8的拷贝数由目的基因和内参RBE4的起始拷贝数量决定，而起始拷贝数由各基因的平均Ct值对应于其标准曲线得到。结果显示，有3个转基因水稻品系含有一个转基因位点，有两个转基因水稻品系含有两个转基因位点(表7)。这个结果与遗传学分析一致。 
为进一步验证此方法的可信性，我们选取了一个单位点植株(515-1)和一个双位点植株(515-2)进行southern杂交分析。如图4所示，HindIIII和EcoRI分别单酶切515-2基因组DNA时均产生两条不同大小的带，HindIIII和EcoRI分别单酶切515-1基因组DNA时均产生1条大小相似的带。并且，当用HindIIII和EcoRI双酶切时，两个单株都只有一条带，说明这些位点都含有完整的表达元件。Southern杂交分析进一步证实了515-2含有两个转基因位点，515-1含有一个转基因位点，这与定量PCR和遗传学分析的结果相符(表7)。这些结果再一次证明了此定量PCR方法可有效且准确地确定转基因的插入位点。 
表7.遗传学分析和定量PCR所确定的不同插入位点 

Claims (11)

1.一种鉴定转基因水稻纯合子的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR方法以水稻RBE4基因作为内参基因，以水稻基因组外源基因或内源基因作为目的基因，分别在相同的反应体系中进行定量PCR反应；并根据比较Ct值2-△△Ct法计算鉴别纯合子或杂合子和基因拷贝数。
2.如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述内参基因的引物的核苷酸序列为：
正向：GTTTTAGTTGGGTGAAAGCGGTT；
反向：CCTGTTAGTTCTTCCAATGCCCTTA。
3.如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR的反应体系为10μl的反应体系，包括：
定量PCR反应过程包括：95℃10min，1个循环；95℃10s，60℃20s，40个循环。
4.如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，当2-△△Ct接近于2时判断为纯合子；当2-△△Ct接近于1时判断为杂合子。
5.如权利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，当鉴定单拷贝转基因水稻的纯合子时，其纯合子和杂合子的鉴定准确率为100％。
6.如权利要求4所述的定量PCR方法，其特征在于，当鉴定双拷贝转基因水稻的纯合子时，其纯合子和杂合子的鉴定准确率为92.31％。
7.如权利要求1所述的定量PCR方法，在鉴别多基因叠加的转基因水稻纯合子中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，对至少含有三种以上外源基因的转基因水稻进行基因叠加分析。
9.如权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于，在鉴定转基因水稻的外源基因拷贝数的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述拷贝数鉴定的准确率100％。
11.如权利要求3所述的定量PCR方法，其特征在于，所述定量PCR buffermix包含荧光染料SYBR Green。
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