CN105316327A - 小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了小麦TaAGO4a基因的CRISPR-Cas9载体及其应用，属于作物分子生物学领域。本发明首先提供了特异性靶向TaAGO4a第三个外显子的gRNA，其DNA序列如SEQ？ID？NO.1所示，包含一个酶切位点XmnI，本发明接着提供了含有该gRNA的CRISPR-Cas9载体，通过共转化Cas9和该特异性gRNA到小麦原生质体中，利用酶切和测序技术，成功检测到该gRNA可以引导Cas9切割分别位于TaAGO4a染色体3A、3B和3D上的三个拷贝，从而引起该基因发生移码突变，致使其功能缺失或部分缺失，可用于制备TaAGO4a基因缺失的转基因小麦。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及小麦TaAGO4a基因的CRISPR/Cas9载体及其应用。
背景技术
小麦作为一种重要的粮食作物，全世界有35％-40％的以小麦为主要粮食。同时作为三大谷物之一，产量几乎全做食用，是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着分子生物学技术的不断发展和对基因功能研究的逐步深入，表观遗传学如DNA甲基化、组蛋白修饰等在修饰基因、调控基因表达进而控制重要农艺性状如千粒重、开花等，发挥重要作用。AGO4a是AGO大家族成员，通过介导sRNAs参与DNA甲基化路径，进而调控相关基因的表达。AGO4蛋白作为RdDM路径的核心组分不仅参PAMP(pathogen-associatedmolecularpattern)启动的基础抗性，同时参与抗病基因介导的小种专化抗性。最新研究则显示，拟南芥接种细菌后，包括AGO4、AGO6在内的10个RdDM路径组分的表达均下调，这种基因表达下调直接导致了一个受甲基化调控的NLR(NOD-likereceptor)类抗病基因RMG1的上调，进而启动抗病反应。说明包括AGO4在内的整个RdDM路径在植物抗病反应中发挥重要作用。在小麦中AGO4a基因有三个拷贝，分别位于3A、3B和3D染色体上，分别命名为TaAGO4a-A、TaAGO4a-B和TaAGO4a-D。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解AGO4a如何在小麦抗病中的发挥作用，揭示其工作原理。
CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒，致使目的基因功能的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效，是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编辑新技术。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂(doublestrandbreak,DSB),细胞可通过非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)进行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究等领域得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦的CRISPR-Cas9载体及其在制备TaAGO4a基因突变的转基因小麦中的应用。
本发明首先根据TaAGO4a-A、TaAGO4a-B和TaAGO4a-D的cDNA保守序列设计一个长度为20bp的gRNA，该gRNA位于TaAGO4a第三个外显子上，中间具有一个酶切位点，为XmnI。
具体地，本发明提供的特异性靶向小麦TaAGO4a基因第三外显子的gRNA的DNA序列如SEQIDNO.1所示或如SEQIDNO.2所示。
本发明提供了上述gRNA在制备小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体中的应用。
本发明利用gRNA所构建小麦TaAGO4a基因的CRISPR/Cas9载体，可以对TaAGO4a的三个拷贝，分别位于3A、3B和3D染色体上进行基因编辑，从而引起该基因发生移码突变，致使功能部分或全部缺失。
进一步地，本发明提供了上述gRNA在制备TaAGO4a基因突变的转基因小麦中的应用。
含有本发明所述gRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9载体属于本发明的保护范围，其能够特异地针对小麦TaAGO4a基因。
进一步地，本发明的CRISPR/Cas9载体，其通过以下方法制备得到，将SEQIDNO.1、2所示的寡聚核苷酸在95℃，5min，从95℃开始降温，每分钟降低1℃，历时70min降至25℃，在10℃下保持；U6-sgRNA骨架载体用限制性内切酶BbsI进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。
本发明提供了上述小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体在TaAGO4a-A引起基因移码突变的应用。
本发明提供了上述小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体在TaAGO4a-B引起基因移码突变的应用。
本发明提供了上述小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体在TaAGO4a-D引起基因移码突变的应用。
更进一步地，本发明提供了上述小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体在制备TaAGO4a基因突变的转基因小麦中的应用。
本发明提供了上述小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体在制备抗病力提高的小麦中的应用。
本发明还提供了用于检测CRISPR/Cas9-TaAGO4a基因突变的引物组合，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。
本发明提供了核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示的引物组合在检测CRISPR/Cas9-TaAGO4a基因突变中的应用。
具体地，上述应用包括以下步骤：
(1)提取待测小麦原生质体DNA，用XmnI酶切；
(2)以酶切产物为模板，以SEQIDNO.3-4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，若目的片段大小为956bp，回收PCR产物，用XmnI酶切回收产物，此时没有被切的片段为阳性，发生切割的则没有突变产生，为阴性。
本发明通过构建TaAGO4a基因的CRISPR/Cas9载体，实现部分沉默或同时沉默TaAGO4a基因，对研究该基因参与DNA甲基化路径的功能和对小麦抗病研究。进一步了解小麦抗病中由RdDM介导的机理，对未来培育小麦抗病新品种有重要作用。
附图说明
图1A-图1E为TaAGO4a基因三个拷贝的同源序列比对图。*是指TaAGO4a-A、TaAGO4a-B和TaAGO4a-D三个拷贝间相同的序列。
图2为TaAGO4a的gRNA连接到CRISPR/Cas9系统的载体上，通过测序验证正确连接结果。虚框线是gRNA序列，通过多个样品测序说明gRNA已经正确连接。
图3为XmnI酶切割PCR产物的琼脂糖凝胶图，1泳道为DNAmarker；2泳道为未转化CRISPR/Cas9-AGO4a载体的野生型TaAGO4a，为对照；3、4泳道为转化CRISPR/Cas9-AGO4a载体后，互为重复。2泳道中上面的亮度较弱的条带大小为956bp,下面的较亮条带约为470bp和486bp(由于大小相差很小，电泳图中区分不是很明显)。3和4泳道分别为被Cas9编辑过后，经过XmnI酶无法切割，表明该片段为阳性突变，3和4的条带分别为956bp。
图4A-图4C为CRISPR/Cas9-AGO4a载体切割目的基因引起突变，经过测序确定突变类型。图中AGO4A1-3-11-A/D的描述中，1-3-11是编号顺序，A/D是说明该基因可能在A基因组上也可能在D基因组上。WT-AGO4A-D是野生型该基因的序列。Consensus是指序列一样的。其中图4A中的AGO4A1-3-11-A/D和野生型WT-AGO4A-A和WT-AGO4A-D相比缺失2个碱基，分别是AT，AGO4A1-3-17-A/D和野生型WT-AGO4A-A和WT-AGO4A-D相比缺失3个碱基，分别是AAG；AGO4A1-3-21-A/D和野生型WT-AGO4A-A和WT-AGO4A-D相比，缺失1个碱基，为C。图4B中，AGO4a1-3-2-B和野生型WT-AGO4A-B相比，缺失六个碱基，分别为AAGCCA；AGO4a1-3-3-B和野生型WT-AGO4A-B相比，缺失2个碱基，分别为AT；AGO4a1-3-8-B与野生型WT-AGO4A-B相比，缺失2个碱基，分别为CA。图4C中，AGO4A1-10-A/D与野生型WT-AGO4A-A和WT-AGO4A-D相比，插入67个碱基，分别为CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCGTCCACTTCATCATATTTAAA。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的材料、生物化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知常规手段。
实施例1小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9的gRNA设计
1、小麦TaAGO4a基因三个拷贝序列的比对
以中国春小麦(TriticumaestivumL.)AGO4a基因的三个拷贝序列用DNAMAN进行比对，结果如图1A-图1E所示。
2、小麦TaAGO4a基因酶切分析
以中国春小麦AGO4a基因序列用Primer5.0进行酶切位点和数量的分析，尤其关注在三个拷贝保守的序列，和在目标区间内存在单一酶切的位置。
3、寻找PAM(protoadjacentmotif)基序
在合适的酶切位置附件寻找PAM基序，即NGG。保证酶切位置刚好位于NGG的5’端4-6碱基处。
4、确定gRNA序列
确定合适的PAM位置，在其5’端20bp的一段序列即为gRNA序列，一般小麦CRISPR/Cas9中使用U6启动子来转录sgRNA，因此优先NGG的5’端20位的碱基为G，即G(N)19NGG。
5、gRNA添加粘性末端
在找到的gRNA上分别在F：5’CTTGG(N)193’；R:5’ATTC(N)19C3’,然后合成两条序列。其DNA序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。
实施例2小麦TaAGO4a基因gRNA连接到CRISPR/Cas9载体上
1、双链gRNA的合成体系
将实施例1合成的gRNA，分别如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示分别加去离子水，使其浓度为10μM，然后配制双链合成体系如下：
2、双链gRNA合成条件
3、酶切CRISPR/Cas9-U6-sgRNA质粒
酶切体系如下：
充分混匀，37℃酶切3-16小时。
4、回收酶切片段
用1.2％的琼脂糖凝胶来检测酶切产物，酶切正确大小的质粒片段约为2.9Kb。然后依据胶回收试剂盒操作说明来回收酶切片段。
5、将双链sgRNA连接到U6-sgRNA上
4℃过夜。
6、将连接产物转化到大肠杆菌中
将过夜连接的双链sgRNA和U6-sgRNA产物转化到大肠杆菌DH5α中，并在有Amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜。
7、挑选单克隆摇菌
在LB平板上挑选5-10个单克隆，进行摇菌并用特异性的菌液PCR引物进行PCR鉴定，上、下游引物序列如SEQIDNO.5、6所示。PCR程序：94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，3min；30个循环；72℃，10min；4℃hold。
PCR体系：
然后用1.2％的琼脂糖凝胶来检测目的PCR产物，正确的目的片段约为460bp。挑选3个阳性菌液送样去测序。
8、质粒连接确认
分析比对测序结果，检测是否成功将双链sgRNA连接到U6-sgRNA载体上，结果如图2所示。结果说明TaAGO4a-sgRNA连接到U6-sgRNA载体上，得到含有特异性靶向小麦TaAGO4a基因gRNA的CRISPR/Cas9载体。
实施例3小麦CRISPR/Cas9-AGO4a载体转化小麦原生质体及突变检测
1、高浓度CRISPR/Cas9-AGO4a质粒的提取
摇菌250μl(LB+Amp)，使其OD600约为1.5左右，然后依据Promega质粒提取试剂盒的说明书提取实施例2制得的连接了TaAGO4a-sgRNA的U6-sgRNA质粒，使最终质粒浓度大于1000ng/μl。
2、小麦原生质体制备及转化
挑选种植7-9天小麦幼苗的新鲜叶片，根据小麦原生质体制备的步骤说明(参见文献Shanetal,naturebiotechnology,2014(10):2395-2410)制备原生质体。一般每5×105个小麦原生质体细胞来转化质粒。然后将Cas9质粒和连接了TaAGO4a-sgRNA的U6-sgRNA质粒在PEG4000诱导下转化到小麦原生质体中，28℃培养48h。
3、原生质体DNA的提取
先12000g离心步骤2制得的小麦原生质体2分钟，用来富集原生质体细胞，然后用CTAB法提取原生质体DNA，并检测浓度(一般需大于30ng/μl)，用来后续实验检测。
4、PCR特异性扩增目的片段
以提取的原生质体DNA为底物，先用XmnI进行酶切，然后以酶切产物为模板，用特异性的检测引物(SEQIDNO.3-4所示)进行PCR扩增，然后用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，目的片段约为950bp左右。并用胶回收试剂盒回收目的片段，用于后续实验。
5、XmnI酶切检测突变情况
用XmnI酶切胶回收的目的片段，酶切反应体系如下：
37℃酶切1小时，同时用野生型的作为对照。然后用2％的琼脂糖凝胶检测酶切产物，结果如图3。此时没有被切的片段为基因突变阳性，发生切割的则没有基因突变产生，为阴性。
6、将酶切过后未能消化的片段进行胶回收并连接
将酶切后，片段大小仍然在956bp左右的片段回收，然后将此片段连接到P-BluntVector上。
7、转化
将连接产物转化大肠杆菌，在含有Kana的LB平板上培养过夜，然后挑选单克隆进行摇菌，用特异性引物如SEQIDNO.3-4来验证扩增，挑选阳性菌液若干送样测序。
8、序列比对
将测序的结果与野生型进行比对，分析确定目的区间的突变情况。如图4A、图4B、图4C所示。该质粒载体可以在小麦原生质体中发挥功能来切割目的基因TaAGO4a，并对该基因的三个拷贝TaAGO4a-A、TaAGO4a-B和TaAGO4a-D进行切割，从而引起突变。这些突变包括在TaAGO4a-A和TaAGO4a-D中引入1-3个碱基的缺失以及67个碱基的插入。在TaAGO4a-B中也检测到2个和6个碱基缺失，从而引起移码突变，致使该基因功能丧失或部分丧失。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.特异性靶向小麦TaAGO4a基因第三外显子的gRNA，其特征在于，分别位于染色体3A、3B、3C上，其DNA序列包含一个酶切位点XmnI。
2.如权利要求1所述的gRNA，其特征在于，其DNA序列如SEQIDNO.1所示或如SEQIDNO.2所示。
3.如权利要求1或2所述gRNA在制备小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体中的应用。
4.如权利要求1或2所述gRNA在制备TaAGO4a基因突变的转基因小麦中的应用。
5.含有权利要求1或2所述gRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9载体。
6.如权利要求5所述的CRISPR/Cas9载体，其通过以下方法制备得到，将SEQIDNO.1、2所示的寡聚核苷酸在95℃，5min，从95℃开始降温，每分钟降低1℃，历时70min降至25℃，在10℃下保持；U6-sgRNA骨架载体用限制性内切酶BbsI进行酶切过夜，回收后，与退火的寡聚核苷酸连接。
7.权利要求5或6所述的CRISPR/Cas9载体在制备TaAGO4a基因突变的转基因小麦中的应用。
8.用于检测CRISPR/Cas9-TaAGO4a基因突变的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示。
9.权利要求8所述的引物组合在检测CRISPR/Cas9-TaAGO4a基因突变中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测小麦原生质体DNA，用XmnI酶切；
(2)以酶切产物为模板，以SEQIDNO.3-4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，若目的片段大小为956bp，回收PCR产物，用XmnI酶切回收产物，此时没有被切的片段为基因突变的阳性，发生切割的则没有基因突变产生，为阴性。
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