CN105671176A - 一种用于检测alk融合断裂点的探针组及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测alk融合断裂点的探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测ALK融合断裂点的探针组及试剂盒，所述探针可覆盖ALK全外显子序列，探针序列为SEQ？ID？No：1-230。本发明结合基因捕获测序技术，提供一种对ALK融合基因进行全外显子深度捕获并高通量测序，找到断裂点的方法，进一步针对断裂点设计个性化引物预后进行监测。本发明还提供一种用于ALK融合断裂点检测的试剂盒，所述试剂盒包含可检测ALK融合断裂点的捕获探针及相关试剂，本发明的使用可快速准确的检测ALK融合序列。

Description

一种用于检测ALK融合断裂点的探针组及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测及分子遗传学领域，具体涉及一种用于检测ALK融合断裂点的探针组及试剂盒。
背景技术
ALK融合基因是非小细胞肺癌(NSCLC)患者接受靶向治疗中重要的依据。ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5％，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例。同时，ALK融合基因可发生多个位点的断裂，同时其可以和多种基因发生融合，根据断裂点的不同可区分为许多种，为检测带来了极大的困难。为了准确检测ALK融合基因以及利用基因捕获加二代测序技术，检测ALK融合基因。综上所述，本发明提供了一种检测ALK融合的捕获探针组及试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测ALK融合断裂的捕获探针组及其试剂盒，所述探针组包含能特异性捕获ALK全外显子的探针。可以全面、快速、准确的检测ALK融合及断裂。
一方面，本发明提供一种用于检测ALK融合断裂的探针组，所述探针组包含230个寡核苷酸探针，所述230个寡核苷酸探针的碱基序列如SEQIDNo.1-230所示。
另一方面，本发明提供一种用于一种检测ALK融合断裂的试剂盒。所述试剂盒包括：本发明所述的用于ALK融合断裂检测的探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、文库富集洗脱液、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。
本发明所提供的检测ALK融合断裂序列的操作过程，包括以下几个步骤：
(1)设计相应的捕获探针
(2)DNA提取、片段化及构建DNA文库
(3)文库目标区域捕获及定量
(4)新一代基因测序
(5)基因序列的生物信息分析
(6)肿瘤基因的突变信息分析
优选的，本发明提供一种对ALK融合基因进行全基因深度捕获并高通量测序，找到断裂点的方法。进一步针对断裂点设计个性化引物进而对预后进行监测。具体为：从待测样本中提取DNA进行ALK基因的捕获，进行新一代测序分析，序列分析ALK基因，找出ALK融合基因以及断裂点的位置；设计个性化的引物去扩增ALK基因融合位置，检测样本血液中的融合基因所占比例，对预后进行监测。
更优选的，本发明提供一种对ALK融合基因进行捕获的方法，具体捕获过程包括：对待检测DNA全基因组进行随机打断成200-300bp大小的片段后，部分片段同时含有ALK和其融合基因的序列；迈基诺公司拥有ALK外显子的捕获探针SEQIDNo.1-230，该探针进一步修饰后携带生物素标记，并能特异性杂交ALK相关的序列，因此含有ALK和其融合基因的序列通过探针上生物素与磁珠的结合，被特异性杂交下来；将不含ALK的序列洗涤除去后；通过对融合片段进行左端100bp，右端100bp测序可以发现，如果右边是ALK序列，而左端序列为于其他基因上，则能够判断出ALK融合的基因类型。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明涉及了可进行快速准确捕获ALK融合基因序列的探针组，能够提高检测特异性，对捕获出目标区域的文库标本利用高通量测序技术使用HiSeq2000测序，通量高、准确度高、成本低。
2、本发明灵敏度高，并由于该方法是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获，所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的Sanger测序要高出许多。为全面检测准确的进行ALK融合基因序列检测提供了更好的平台。
具体实施方式
以下通过实施案例对本发明作进一步阐述。
实施例1：本发明探针组的设计和制备
ALK基因全外显子序列位置如表1所示，根据ALK基因的全外显子序列，对每个区域中非重复区域设计78bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计。利用原位合成技术，大量合成设计的探针(MyGenostics.US)，并利用PCR的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针。
表1：
所述PCR方法具体为：
将上述合成的探针均匀混合在总体积1.2ml的dH2O中，取其中15μl利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA)，分三管进行PCR扩增，其中引物GACTACATGGGACAT为带有生物素标记的引物。
PCR扩增体系：底物DNA，5μl；正向引物(25μM)，2μl；反向引物(25μM)，2μl；MgCl2(50mM)，4μl；10xPlatinumTaq缓冲液(购自LifeTechnologies)，5μl；dNTPs(每种10mM)，4μl；PlatinumTaq(5U/μl,购自LifeTechnologies)，1μl；H2O，27μl；总体积50μl。
扩增条件：98℃，30s；(98℃，30s，60℃，25s，72℃，45s)35个循环；72℃，5min。
将PCR产物用MinElutePCR纯化试剂盒(购自LifeTechnologies)纯化后，取500ng，用MyOne亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来；然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤，使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组，所述探针组的碱基序列如SEQIDNo.1-230所示。
实施例2：本发明试剂盒组成、制备及使用
本实施例所述的用于ALK融合断裂序列检测试剂盒，是通过检测ALK全基因组的突变来进行分子遗传学检测的试剂盒。
所述试剂盒包含的成分为：实施例1所获得的探针组、缓冲液HY、缓冲液BL、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液。具体组成为：
所述试剂盒的使用方法为：
1、样本文库制备：
(1)超声片段化：起始量为3μg,用1×lowTEBuffer稀释到30ng/μL。采用CovarisS2超声仪进行超声片段化,按标准设定Covaris系统的值,6次循环×60s,水浴温度:5℃,占空比:20％,强度:5,模式:Frequencysweeping。
(2)末端补平：分别取100μL片段化的DNA、8μLdNTPs、2μLEndPolishing酶Ⅰ(10U/μL,Agilent)、16μLEndPolishing酶Ⅱ(5U/μL,Agilent),加水到总体积200μL。25℃孵育30min。用PureLinkPCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。
(3)连接P1和P2接头：Illumina接头1(P1eA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Illumina)，末端补平的DNA48μL，T4DNA连接酶10μL(50U)，加水到总体积200μL，室温孵育15min。产物纯化。采用预制的2％SizeSelectGel(AppliedBiosys-tems)，放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bpladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。
(4)DNA片段回收：采用预制的2％SizeSelectGel(AppliedBiosys-tems)，放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bpladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。
(5)缺口平移：回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL回收样品加400μL的mastermix(Agilent),按程序进行反应：72℃20min,95℃5min；然后95℃15s，54℃15s，70℃1min进行10到12个循环；70℃再延伸5min；4℃保存。纯化产物并定量，取1μL样本产物进行FlashGel(2.2％,Lonza公司)电泳，约10min。
2、样本富集杂交：
(1)杂交液制备：4μgDNA基因文库(20ul，200ng/μl)、13ul缓冲液BL、5μlGenCapTM制备好的探针混匀并放置在95℃7分钟，65℃2分钟，(注：探针必须在95℃的条件下加热)再加入22μl预热的缓冲液HY(65℃预热，使用前充分震荡重悬沉淀)。65℃杂交22小时。
注：缓冲液HY的体积根据所制备文库体积调整而调整，调整比例为HY缓冲液体积＝总体积/1.8
(2)纯化：此步骤所用的缓冲液除了WB2外，均室温放置。
1)取1.5ml离心管，加入50ulMyOne磁珠，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将离心管放置在磁力架(例如：DynaMag)上1分钟；
2)保持离心管在磁力架上不动，弃清液；
3)取下离心管，加入50ul1XBinding缓冲液，剧烈震荡至少5秒，短暂离心收集管壁的液体，将将离心管放置在磁力架上1分钟，保持离心管在磁力架上不动，齐清液；
4)重复第三步两次(共三次洗涤)；
5)用80ul1XBinding缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，轻旋收集管壁的液体；
6)向杂交液中加入等体积Binding缓冲液，并转移进第五步所得的液体中。(总体积约200ul)；
7)剧烈震荡混合液至少5秒钟，室温放置于旋转混匀仪上一小时；
8)剧烈震荡混合液至少5秒钟，短暂离心，并放置于磁力架上1分钟；
9)保持离心管于磁力架上，弃清液；
10)加入0.5ml洗涤缓冲液WB1，剧烈震荡混匀至少5秒，室温放置在旋转混匀仪上15分钟；
11)取下离心管，剧烈震荡至少5秒，短暂离心，放置于磁力架上一分钟；
12)保持离心管在磁力架上，弃清液；
13)加入0.5ml洗涤缓冲液WB2，剧烈震荡至少5秒；
14)将离心管至于恒温混匀仪(65℃，850rpm)15分钟；
15)重复步骤11-14四次(共5次WB3洗涤)；
16)剧烈震荡5秒，短暂离心，放置于磁力架上一分钟；
17)保持离心管至于磁力架上，彻底弃清液；
18)加入50μlElute缓冲液重悬沉淀，剧烈震荡至少5秒，置于旋转混匀仪上至少10分钟；
19)取下离心管，震荡混匀5秒，短暂离心，置离心管于磁力架上1分钟；
20)将清液转移至加有70ulNE缓冲液的1.5ml离心管中；
21)用QIAquickMinElute试剂盒纯化所得溶液，最后得体积20μl模板DNA。
3、样本富集
(1)PCR反应体系
注：引物A为IlluminaforwardprimerPCRPE1.0，引物B为lluminareverseprimerPCRPE2.0，酶为HotstartPhusionenzyme(NewEnglandBiolabs)；
(2)PCR循环条件：98℃预变性30秒；15个循环：98℃25秒,65℃30秒72℃30秒；72℃5分钟；4℃～1h；
(3)PCR产物经由NucleoSpin纯化试剂盒纯化，最终产物由65℃预热的Elute缓冲液17.5μl分两次洗脱，最终得35ul富集DNA；
注：不同的纯化方法获得的产物浓度会有差别。根据不同的纯化方法，可是适当调整PCR的循环数。
(4)产物经1％琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop测浓度并做定量PCR。
4、以上得到的DNA通过IlluminaHiSeq2000测序，得到测序的数据。
5、SNP分析流程
IlluminaHiSeq2000获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据等；把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，具体请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，具体请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；过滤低质量值(质量值<＝20)和低覆盖度(深度<＝10)的SNP；利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
6、InDel分析流程
把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-WheelerAligner(BWA)比对到人类基因组上，具体请参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)；
7、FusionGene分析流程
把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-WheelerAligner(BWA)比对到人类基因组上，具体请参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；将不能比对到基因组上的数据筛选出来；分别使用不能比对到基因组上的数据的前35bp和后35bp与人类基因组进行比对，筛选出前端35bp和后端35bp能够比对到基因组不同位置的数据进行分析。通过分析前后两端比对到的基因判断融合的存在与否。
实施例3：本发明试剂盒的使用效果验证
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
1、一例ALK融合基因的高通量测序检测
样本编号S06143，男，47岁。检测结果：对该样本我们利用本发明的方法及试剂盒检测到了ALK-EML4的融合基因，并利用一代Sanger测序进行了验证，验证结果与利用本发明所得结果一致，说明本发明可对实际样本进行准确快速的检测，具有实际可利用价值。本发明提供的用于ALK融合基因检测的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点。
表1一例ALK-EML4融合基因的高通量测序检测结果
基因 外显子 位置 氨基酸变化 结果
ALK ALK/EML4 ALK/EML4 ALK/EML4 Fusion 阳性
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测ALK融合基因的探针组序列，其特征在于：所述探针为DNA序列，所述探针根据ALK基因的全外显子区序列设计，所述具体探针序列为SEQID：1-230，每条探针长度为78bp的寡核苷酸。
2.根据权利要求1的探针序列，其特征在于：所述具体探针序列为SEQID：1-230。
3.一种检测ALK融合基因的捕获测序方法，其特征在于：利用权利要求2所述的探针进行杂交捕获和测序分析。
4.根据权利要求3所述的方法，具体步骤为：
1)制备DNA全基因组文库
2)捕获目标基因区域；
3)基因测序：利用新一代测序仪进行高通量测序；
4)基因序列的生物信息分析。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于：
其中步骤2)中的所述的捕获目标基因区域具体步骤为：1)捕获探针的设计与制备；2)目标基因的杂交捕获；其中步骤3)中的基因测序具体为：采用第二代测序技术—如IlluminaNexseq500测序平台，LifeTech公司的IonProton测序仪等平台，从而获得样本中的核酸分子的核苷酸序列；其中步骤4)中所述的生物信息学分析具体为对ALK融合断裂序列进行分析；其中步骤4)中所述的生物信息分析具体为：SNP分析流程；InDel分析流程；FusionGene分析流程。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述1)具体步骤为：
对待检测DNA全基因组进行随机打断成200-300bp大小的片段后，部分片段同时含有ALK和其融合基因的序列；将所述ALK外显子的捕获探针SEQIDNo.1-230，该探针进一步修饰后携带生物素标记，并能特异性杂交ALK相关的序列，因此含有ALK和其融合基因的序列通过探针上生物素与磁珠的结合，被特异性杂交下来；将不含ALK的序列洗涤除去后；通过对融合片段进行左端100bp，右端100bp测序可以发现，如果右边是ALK序列，而左端序列为于其他基因上，则能够判断出ALK融合的基因类型。
7.一种用于检测ALK融合断裂点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述ALK基因的全外显子捕获探针组、富集缓冲液BL、富集缓冲液HY、文库富集结合缓冲液、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2、文库富集洗脱液、缓冲液NE、PCR反应液、产物纯化洗脱液，用于对ALK基因捕获产物进行检测。
8.如权利要求6所述的探针在制备ALK融合基因检测试剂盒中的应用。
9.一种如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：在检测ALK融合断裂序列中的应用。
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