CN108823312A - 快速检测alk融合基因的方法及富集探针和探测引物 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，属于基因检测领域。该方法先设置SEQ ID：1‑28的富集探针捕获特异性匹配的DNA，再设置SEQ ID：29‑50中的任意一对探测引物通过PCR方法检测ALK融合基因是否存在。该方法是基于富集探针和探测引物检测ALK融合基因的方法，具有快速准确、对样品要求低、灵敏度与特异性高等的优点，能够大幅提高肺癌的精治疗水平。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物。
背景技术
融合基因是指两个基因的全部或部分序列融合成一个新基因的过程，通常具有致癌性，对于肺癌ALK等融合基因尤为重要。传统的融合基因检测方法为荧光原位杂交方法，必须使用组织样品检测，且该方法存在检测通量低，人工判读对人员要求高，对样品质量要求高等缺点，限制了其应用。随着二代测序技术的发展，基于二代测序的方法衍生出了融合基因的检测新方法，具有灵敏度高，通量高，结果判断客观准确，可检测传统组织样品，同时可检测循环肿瘤DNA样品等优点，但是基于目前的测序仪器技术水平，存在检测周期长、成本高等缺点。
肺癌已经成为我国发病率与死亡率最高的癌症，实现快速、准确检测ALK融合基因能够有效地提高肺癌的精准治疗水平，对社会具有重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，该方法是基于富集探针和探测引物检测ALK融合基因的方法，具有快速准确、对样品要求低、灵敏度与特异性高等的优点，能够大幅提高肺癌的精治疗水平。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种快速检测ALK融合基因的富集探针，所述的富集探针序列选自SEQID：1-28所示的核苷酸序列中的两种以上。
根据SEQ ID：1-28的富集探针进行捕获特异性匹配的DNA，在快速检测ALK融合基因中的应用。
本发明的快速检测ALK融合基因的富集探针在制备诊断肿瘤产品中的用途。
本发明的一种快速检测ALK融合基因的探测引物，所述的探测引物的序列为SEQID：29-50中的任意一对。
本发明的快速检测ALK融合基因的探测引物在制备诊断肿瘤产品中的用途。
一种用于诊断肿瘤的试剂盒，该试剂盒包括序列为SEQ ID：29-50的一对探针引物和PCR试剂。
本发明的一种快速检测ALK融合基因的方法，包括以下步骤：
步骤1：在ALK基因上的断点位置设置针对ALK基因的SEQ ID：1-28的富集探针，与富集探针特异性匹配的DNA被保留下来，从而捕获特异性匹配的DNA；
步骤2：在捕获特异性匹配的DNA中，设置序列为SEQ ID：29-50的一对探测引物和Taqman探针，通过PCR方法扩增，检测ALK融合基因，用于探测最终富集的DNA中是否存在EML4的片段，根据结果进行分析，判定是否存在EML4-ALK融合基因。
所述的根据结果进行分析，具体为根据ΔCT值进行分析；其中，ΔCT值＝目的基因CT值-内参基因CT值。
本发明的快速检测ALK融合基因的方法中，正常人中不存在EML4融合基因，因此正常人只会保留ALK基因的DNA片段，而不会存在EML4基因的DNA片段；若测试样品中存在EML4-ALK融合基因，本来只能捕获ALK基因的探针，因ALK基因DNA片段是EML4的断点上游基因，最终富集的DNA中会同时存在EML4和ALK的DNA片段，通过对EML4片段进行扩增，即设置针对EML4的特异性探测引物和Taqman探针，用于探测最终富集的DNA中是否存在EML4的片段，就能反应是否存在EML4-ALK融合基因。
本发明的一种快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物，其先设置富集探针捕获特异性匹配的DNA，再设置探测引物通过PCR方法检测ALK融合基因是否存在。相比于现有技术，该方法具有检测速度快、对样品质量要求低、检测灵敏度与特异性高、检测成本相对较低等优点。
附图说明
图1为探测引物与富集探针的设置检测ALK融合基因的方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中，探测引物与富集探针的设置检测ALK融合基因的方法示意图见图1。
实施例
一种快速检测ALK融合基因的方法，具体包括如下步骤：
步骤1：提取血浆DNA或提取石蜡组织DNA；
步骤2：富集DNA，具体包括以下子步骤：
步骤2-1：对步骤1提取的DNA使用Qubit荧光定量仪器定量，取500ng步骤1提取的DNA，备用；
步骤2-2：富集探针的准备，即Ph8.0IDTE溶解多种富集探针，使得终浓度为0.75pmol/ul；其中，富集探针序列如下表1所示：
步骤2-3：将500ng DNA与5ug Cot-1DNA混合，用真空浓缩仪干燥PCR管中成分，温度设置为60℃；
步骤2-4：富集探针和DNA的杂交，即室温下解冻所有杂交试剂缓冲液，把表2中成分加入步骤2-3所述的PCR管中，室温孵育5-10min，用枪头上下吹打混匀，转移到200ul低吸附的PCR管中，热循环仪中95℃孵育10min，从热循环仪中取出样品，立即加入4ul的富集探针，震荡混匀，短暂离心，放入热循环仪中65℃孵育4h(仪器盖子温度设为75℃)，得到杂交序列；
表2
| 试剂 | 体积(ul) |
| 2X杂交缓冲液 | 8.5 |
| 杂交缓冲液增强剂 | 2.7 |
| 无核酸纯水 | 1.8 |
步骤2-5：对于单个捕获反应，制备1X的工作液，准备链霉亲和素标记的磁珠；
步骤2-6：杂交序列与磁珠结合，即将杂交好的样品转移到含有准备好的磁珠的PCR管中，用移液器上下吹打10次充分混匀，再将混匀的样本放入热循环仪中，65℃孵育45min，使DNA结合到磁珠上(盖子温度设为75℃)，在65℃孵育过程中，每隔12min涡旋震荡3秒确保磁珠仍处于悬浮状态；
步骤2-7：清洗磁珠去除未结合的DNA，即取100ul预热好的1X洗液1进行65℃缓冲液清洗，再分别使用加200ul室温的1X洗液I、1X洗液II、1X洗液III进行清洗；
步骤2-8：重悬磁珠，即从磁力架上取下离心管(含有已捕获DNA的磁珠)，离心管中加入20ul无核酸纯水，上下吹打10次，确保粘在离心管壁上的磁珠重悬。
步骤3：杂交后的PCR扩增检测，具体包括以下子步骤：
步骤3-1：按表3在PCR管中准备PCR混合物：
表3
| 试剂 | 反应量(ul) |
| 2X HotStart ReadyMix | 25 |
| 10μM引物1(或内参引物1) | 2.5 |
| 10μM引物2(或内参引物2) | 2.5 |
| 已捕获DNA的磁珠 | 20 |
| 总量 | 50 |
其中，引物或内参引物为探测引物，其序列如下表4所示：
表4
步骤3-2：短暂震荡混匀PCR混合物并离心，且确保磁珠悬浮在溶液中，PCR管放入实时荧光定量仪，保持仪器盖子温度为105℃，按以下表5的反应程序进行扩增：
表5
步骤4：结果判读，即ΔCT≥5，融合基因阳性；ΔCT≤3融合基因阳性；5＞ΔCT＞3，结果不确定，需加大模板量重新检测，所述的ΔCT按照以下公式进行计算：
ΔCT值＝目的基因CT值-内参基因CT值。
内参基因CT值为包含Primer-Forward11与Primer-Reverse11的反应管，在实时荧光定量仪上运行得到的CT值，目的基因CT值为包含Primer-Forward1-10与Primer-Reverse1-10每一反应管子在实时荧光定量仪上运行得到的CT值，只要任一管ΔCT值满足结果判读标准即可判读。
序列表
<110> 苏州科诺医学检验所有限公司
<120> 快速检测ALK融合基因的方法及富集探针和探测引物
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
cctcctagga gggctagggg tgcccatagg gagggctctg ccggcctttt gtggctagag 60
gagtctgcgg tgctgtgata acattcagcc cctacactgc acccctctcc tcccaggacg 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gagtctgcgg tgctgtgata acattcagcc cctacactgc acccctctcc tcccaggacg 60
gcagcagggc gctcaccgaa tgagggtgat gtttttccgc ggcacctcct tcaggtcact 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gcagcagggc gctcaccgaa tgagggtgat gtttttccgc ggcacctcct tcaggtcact 60
gatggaggag gtcttgccag caaagcagta gttggggttg tagtcggtca tgatggtcga 120
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gatggaggag gtcttgccag caaagcagta gttggggttg tagtcggtca tgatggtcga 60
ggtgcggagc ttgctcagct tgtactcagg gctctgcagc tccatctgca tggcttgcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ggtgcggagc ttgctcagct tgtactcagg gctctgcagc tccatctgca tggcttgcag 60
ctcctggtgc ttccggcggt acactgcagg tgggtggtca gctgcaacat ggcctggcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ctcctggtgc ttccggcggt acactgcagg tgggtggtca gctgcaacat ggcctggcag 60
cctggccctt gaagcactac acaggccact tcctacagga agcctccctg gatctccata 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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cctggccctt gaagcactac acaggccact tcctacagga agcctccctg gatctccata 60
tcctcccctg agctctgaac ctttccatca tacttagaaa tactaataaa atgattaaag 120
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<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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tcctcccctg agctctgaac ctttccatca tacttagaaa tactaataaa atgattaaag 60
aaggtgtgtc tttaattgaa gcatgattta aagtaaatgc aaagctaaaa atcagatata 120
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<212> DNA
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aaggtgtgtc tttaattgaa gcatgattta aagtaaatgc aaagctaaaa atcagatata 60
tggaaaataa ttatttgtat tatatagggc agagtcatgt tagtctggtt cctccaaga 119
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<213> 人工序列(Artificial)
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tgtgagtgac cattatcact cctacatgtg aggatgttct ggaaggcaaa ctccatggaa 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gccagaacaa aattgtgatt cagtgggtag attctgtgtg taaagcccag ccccccaaca 60
catgggccag ggcaaatgag tcacccgcta tgtgctcagt tccctcctct atgcaatgga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
catgggccag ggcaaatgag tcacccgcta tgtgctcagt tccctcctct atgcaatgga 60
ccgaccgtga tcagattagg gttacctgag gatcgaatga attgaaatgt gtaaattgcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ccgaccgtga tcagattagg gttacctgag gatcgaatga attgaaatgt gtaaattgcc 60
gagcacgtag taaccatgca acaagtgtta gctcctatta tcctgtccct ttgagggatg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gagcacgtag taaccatgca acaagtgtta gctcctatta tcctgtccct ttgagggatg 60
gcaccatatg gggacacagt gtgtgctgcc atctcccttc taccggcaga tccctttgcc 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
gcaccatatg gggacacagt gtgtgctgcc atctcccttc taccggcaga tccctttgcc 60
tgcaggggcc tggcctgcga gggctctcaa gagcctttcc ctctgccctt ttcaagcctc 120
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<213> 人工序列(Artificial)
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tgcaggggcc tggcctgcga gggctctcaa gagcctttcc ctctgccctt ttcaagcctc 60
tgcccatctg tcctgggcat gtctctgcca gcagtaagag ctggttggga ccacactgag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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tgcccatctg tcctgggcat gtctctgcca gcagtaagag ctggttggga ccacactgag 60
ttctctgtga cctgcaggtc agctcacctt ggctcacagg ctgaacagaa atatactcag 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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ttctctgtga cctgcaggtc agctcacctt ggctcacagg ctgaacagaa atatactcag 60
aaaccgattt tcctatctct ctgcctggag ggtggtggag ggctggtttg gggaagagtg 120
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<213> 人工序列(Artificial)
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ggctagtgca ttacataggg tgggagccaa acaggagctg cgccggtgga agcatgtggg 60
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<213> 人工序列(Artificial)
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agctagaagt gacgtctagg ggtgggggcg agctttcacc atcgtgatgg acactgaagg 60
agctccccac cccctgatca gccaggagga tacacacggg gctgaggtgc agaatcaggg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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agctccccac cccctgatca gccaggagga tacacacggg gctgaggtgc agaatcaggg 60
gctcctcagg gaactgcagc tgctctggtg gggggaaggt tgggagcttc cgttttggct 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gctcctcagg gaactgcagc tgctctggtg gggggaaggt tgggagcttc cgttttggct 60
tggcctgggc tgccctaatc accaccccac ccaattccag ggactagcat aacgaagtga 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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tggcctgggc tgccctaatc accaccccac ccaattccag ggactagcat aacgaagtga 60
caccttggca cctgtggcac agcctgagac actattcagt cctgccttcc tgcccccttg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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caccttggca cctgtggcac agcctgagac actattcagt cctgccttcc tgcccccttg 60
ggagtccctg gggctctgtg cactcaccaa tcatgatgcc ggagaaagcc aggaccaggg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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<213> 人工序列(Artificial)
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cggccacgag ggcagaggtc accacagaga ggatcagcga gagtggcagg tgtggctccg 60
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gggtgggtga cactggaaga caggtcccac tggggtattg acaaccacac caggtctcct 60
ttgagttggt cccaagtcag aaataacctc ccccactgag acaaaaacta cttgctcctt 120
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<213> 人工序列(Artificial)
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agacccgatt tacatatctg c 21
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<213> 人工序列(Artificial)
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aatttcgtac agatagtgcc t 21
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial)
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<213> 人工序列(Artificial)
<400> 50
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Claims (8)
1.一种快速检测ALK融合基因的富集探针，所述的富集探针序列选自SEQ ID：1-28所示的核苷酸序列中的两种以上。
2.如权利要求1所述的快速检测ALK融合基因的富集探针，其特征在于，利用权利要求1所述的富集探针进行捕获特异性匹配的DNA，在快速检测ALK融合基因中的应用。
3.如权利要求1所述的快速检测ALK融合基因的富集探针在制备诊断肿瘤产品中的用途。
4.一种快速检测ALK融合基因的探测引物，所述的探测引物的序列为SEQ ID：29-50中的任意一对。
5.如权利要求4所述的快速检测ALK融合基因的探测引物在制备诊断肿瘤产品中的用途。
6.一种用于诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求4所述的一对探针引物和PCR试剂。
7.一种快速检测ALK融合基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1：设置权利要求1所述的富集探针捕获特异性匹配的DNA；
步骤2：在捕获特异性匹配的DNA中，设置权利要求4所述的一对探测引物，通过PCR方法扩增，检测ALK融合基因，根据结果进行分析。
8.如权利要求7所述的快速检测ALK融合基因的方法，其特征在于，所述的根据结果进行分析，具体为根据ΔCT值进行分析；其中，ΔCT值＝目的基因CT值-内参基因CT值。
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