CN110172502A - 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 - Google Patents
一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，其特征在于，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，设计出单碱基延伸引物后进行单碱基延伸后，通过质谱分析精确测量目标DNA序列。可一次性检测血小板同种抗原HPA‑1～21bw等位基因。然后直接打质谱，直接出数据。整个过程封闭，时间短，成本低。通过对患者和供血者血小板同种抗原基因分型检测，可以找到配型成功的血小板，有效避免免疫因素引起的血小板输注无效的问题。本产品成本低，更准确，有望作为一种临床常规检测手段，替代血清学的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
人类血小板同种抗原（humanplateletalloantigen，HPA）是分布在血小板糖蛋白上一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原。在目前已检测出的24个HPA抗原中，除HPA-14bw基因是因核苷酸1909到1911位置上AAG3个碱基缺失产生外,其他的HPA基因均具有单核苷酸多态性(SNP)。HPA可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，引发同种免疫性血小板减少，如输血后血小板减少性紫癜（PTP）、血小板输注无效（PTR）及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜（NAITP），同时在临床移植中，还会引起移植排斥等相关的疾病。准确检测和鉴定HPA，对于临床医学和输血实践具有重要意义。
长期以来，人们一直沿用传统的血清学方法进行HPA分型，但由于检测成本高、假阴性、方法复杂等多种原因一直未能列为常规，HPA分型工作难以深入下去。随着对HPA基因的深入研究，国内外已将基因检测技术用于血小板分型应用中，所采用的方法很多，有RFLP、SSP、SSCP、SSOP等。但是这些方法要几十孔PCR，还要酶切、杂交，步骤繁琐，成本高，灵密度和准确性低，难以推广。
本发明人类血小板同种抗原基因分型检测试剂盒。只需一孔PCR，然后直接打质谱，操作简单、省时、成本低、有更高的灵敏性和准确度。更适合临床常规应用。解决了血小板输注前HPA基因分型难的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，并设计出单碱基延伸引物，单碱基延伸后，通过质谱分析精确测量目标DNA序列。
优选的，所述特异性引物包括：
用于扩增HPA-1片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
用于扩增HPA-2片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
用于扩增HPA-3片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示；
用于扩增HPA-4片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示；
用于扩增HPA-5片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.9所示，反向引物序列如SEQ ID No.10所示；
用于扩增HPA-6片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.11所示，反向引物序列如SEQ ID No.12所示；
用于扩增HPA-7片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.13所示，反向引物序列如SEQ ID No.14所示；
用于扩增HPA-8片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.15所示，反向引物序列如SEQ ID No.16所示；
用于扩增HPA-9片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.17所示，反向引物序列如SEQ ID No.18所示；
用于扩增HPA-10片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.19所示，反向引物序列如SEQ ID No.20所示；
用于扩增HPA-11片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.21所示，反向引物序列如SEQ ID No.22所示；
用于扩增HPA-12片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.23所示，反向引物序列如SEQ ID No.24所示；
用于扩增HPA-13片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.25所示，反向引物序列如SEQ ID No.26所示；
用于扩增HPA-14片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.27所示，反向引物序列如SEQ ID No.28所示；
用于扩增HPA-15片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.29所示，反向引物序列如SEQ ID No.30所示；
用于扩增HPA-16片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.31所示，反向引物序列如SEQ ID No.32所示；
用于扩增HPA-17片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.33所示，反向引物序列如SEQ ID No.34所示；
用于扩增HPA-18片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.35所示，反向引物序列如SEQ ID No.36所示；
用于扩增HPA-19片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.37所示，反向引物序列如SEQ ID No.38所示；
用于扩增HPA-20片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.39所示，反向引物序列如SEQ ID No.40所示；
用于扩增HPA-21片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.41所示，反向引物序列如SEQ ID No.42所示。
优选的，所述单碱基延伸引物包括：
用于HPA-1片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.43所示；
用于HPA-2片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.44所示；
用于HPA-3片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.45所示；
用于HPA-4片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.46所示；
用于HPA-5片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.47所示；
用于HPA-6片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.48所示；
用于HPA-7片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.49所示；
用于HPA-8片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.50所示；
用于HPA-9片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.51所示；
用于HPA-10片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.52所示；
用于HPA-11片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.53所示；
用于HPA-12片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.54所示；
用于HPA-13片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.55所示；
用于HPA-14片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.56所示；
用于HPA-15片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.57所示；
用于HPA-16片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.58所示；
用于HPA-17片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.59所示；
用于HPA-18片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.60所示；
用于HPA-19片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.61所示；
用于HPA-20片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.62所示；
用于HPA-21片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.63所示。
优选的，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃ 20秒，72℃ 60秒，45个循环，72℃ 5分钟，4℃保存。
以上所述的人类血小板同种抗原基因分型的检测方法制备的检测试剂盒。
本发明的有益效果是：人类血小板同种抗原基因分型检测试剂盒是一个中等通量的检测产品，一次性检测血小板同种抗原HPA-1～21bw等位基因。然后直接打质谱，直接出数据。整个过程封闭，时间短，成本低。通过对患者和供血者血小板同种抗原基因分型检测，可以找到配型成功的血小板，有效避免免疫因素引起的血小板输注无效的问题。传统的血小板同种抗原分型方法为血清学，该方法步骤复杂、成本高、假阴性等问题，难以在临床推广。本产品成本低，更准确，有望作为一种临床常规检测手段，替代血清学的检测方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明的一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，包括以下步骤：
1）提取样本DNA
1、将离心管中的样品10000 rpm 离心 2 min，去除上清液，留沉淀备用。
2、向上述离心管中加入350 μL Buffer MCL和20 μL Proteinase K，震荡混匀，65℃水浴20 min，间或混匀。
3、水浴完成之后向离心管中加入350 μL Buffer MA和25 μL SanMag Beads，振荡或者颠倒混匀，室温静置3 min，间或混匀。
4、将离心管置于磁力架上30 s，待SanMag Beads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
5、向离心管中加入700 μL 70%乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30 s，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
6、重复步骤5一次，室温开盖干燥10 min至管内无液体残留。
7、向离心管中加入50 μL TE Buffer (pH8.0)，间或混匀。
8、取出离心管并置于磁力架上30 s，待SanMag Beads完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组 DNA。
涉及到主要试剂耗材：DNA 抽提试剂盒（Order NO. B518766）移液器、枪头、小型离心机、磁力架。涡旋震荡器
2）设计出特异性引物
NCBI网站上查询并下载该基因序列信息，在待测的位点的上下游选取20nt的特异性序列作为扩增引物。设计原则是：包含待测位点的DNA片段长度100bp-300bp均可，避免发夹结构和重复序列。设计完成以后，在引物5'端加入一段固定序列ACGTTGGATG，其引物序列如序列表中SEQ ID No 1-42所示。
3）设计出单碱基延伸引物
单碱基延伸引物的设计同样是在该基因序列上设计，选择待测碱基位点上游和下游紧临的碱基，并根据质谱检测范围（4000道尔盾-9000道尔盾），设计引物长度，设计原则引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复序列，其引物序列如序列表中SEQ ID No 43-63所示。
4）核酸质谱分析
1、配制1 µM（每个引物）PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个SNP位点的forward（正向）和reverse（反向）引物。
2、根据实际说明书以2mL、管配制PCR混液，DNA样本和对照不要加在其中。
3、加入2μL DNA样本，漩涡振荡器混匀，贴上封口膜。
4、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：95oC 2 分钟，95oC 30 秒，56oC 30 秒，72oC60 秒，45 个循环，72oC 5 分钟，4oC保温。
5、将各个位点的延伸引物稀释到100Um，计算在体系中的比例，配制iPLEX延伸引物混液。
6、在1.5mL管中配制iPLEX延伸混液。
7、每一个孔加入2 µl iPLEX延伸混液并混好。
8、把板用膜封好，涡旋震荡和离心（4000 rpm 5 秒）。
9、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：
10、在样本板的每一个有样本的孔里加入41μL水然后离心。
11、将96孔板放入质谱仪，打开点样程序，进行自动点样操作。
12、打开飞行质谱软件，设置好参数，进行检测。
13、检测介绍后，在软件中自动生成结果，导出即可。
涉及到主要试剂耗材：96孔PCR板的离心机、涡旋震荡器、PCR仪（thermo）、MassARRAY质谱仪（agena）、PCR试剂盒（Agena Bioscience货号：11327）、单碱基延伸试剂盒（AgenaBioscience货号：10165）、移液器、枪头、96孔板、封口膜。
序列表
<110> 为康（苏州）基因科技有限公司
<120> 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒
<141> 2019-03-25
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 51
cctttgcccc cccag 15
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 52
ccagtgagtg aggccc 16
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 53
tccgaaaata cctgcaacc 19
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 54
cgctcgtgga ctgcg 15
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 55
ctttcccttt tatttttcag c 21
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 56
ctgcccagat gcctgcacct ttaag 25
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 57
tttatattta ttatcttgac ttcagtt 27
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 58
gagctttcgc atctgg 16
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 59
ccacctggtc agttagc 17
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 60
gcgagcacat catttatata ca 22
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 61
ggagcatcca gaacctgggt acc 23
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 62
ctctttcccc acagga 16
<210> 63
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 63
acggttgcag gtatttt 17
Claims (5)
1.一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，其特征在于，通过设计出特异性引物再利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段，设计出单碱基延伸引物后进行单碱基延伸后，通过质谱分析精确测量目标DNA序列。
2.根据权利要求1所述的人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，其特征在于，所述特异性引物包括：
用于扩增HPA-1片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
用于扩增HPA-2片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.3所示，反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
用于扩增HPA-3片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示；
用于扩增HPA-4片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.7所示，反向引物序列如SEQ ID No.8所示；
用于扩增HPA-5片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.9所示，反向引物序列如SEQ ID No.10所示；
用于扩增HPA-6片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.11所示，反向引物序列如SEQ ID No.12所示；
用于扩增HPA-7片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.13所示，反向引物序列如SEQ ID No.14所示；
用于扩增HPA-8片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.15所示，反向引物序列如SEQ ID No.16所示；
用于扩增HPA-9片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.17所示，反向引物序列如SEQ ID No.18所示；
用于扩增HPA-10片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.19所示，反向引物序列如SEQ ID No.20所示；
用于扩增HPA-11片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.21所示，反向引物序列如SEQ ID No.22所示；
用于扩增HPA-12片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.23所示，反向引物序列如SEQ ID No.24所示；
用于扩增HPA-13片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.25所示，反向引物序列如SEQ ID No.26所示；
用于扩增HPA-14片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.27所示，反向引物序列如SEQ ID No.28所示；
用于扩增HPA-15片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.29所示，反向引物序列如SEQ ID No.30所示；
用于扩增HPA-16片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.31所示，反向引物序列如SEQ ID No.32所示；
用于扩增HPA-17片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.33所示，反向引物序列如SEQ ID No.34所示；
用于扩增HPA-18片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.35所示，反向引物序列如SEQ ID No.36所示；
用于扩增HPA-19片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.37所示，反向引物序列如SEQ ID No.38所示；
用于扩增HPA-20片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.39所示，反向引物序列如SEQ ID No.40所示；
用于扩增HPA-21片段的特异性引物，正向引物序列如SEQ ID No.41所示，反向引物序列如SEQ ID No.42所示。
3.根据权利要求1或2所述的人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，其特征在于，所述单碱基延伸引物包括：
用于HPA-1片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.43所示；
用于HPA-2片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.44所示；
用于HPA-3片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.45所示；
用于HPA-4片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.46所示；
用于HPA-5片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.47所示；
用于HPA-6片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.48所示；
用于HPA-7片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.49所示；
用于HPA-8片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.50所示；
用于HPA-9片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.51所示；
用于HPA-10片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.52所示；
用于HPA-11片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.53所示；
用于HPA-12片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.54所示；
用于HPA-13片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.55所示；
用于HPA-14片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.56所示；
用于HPA-15片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.57所示；
用于HPA-16片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.58所示；
用于HPA-17片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.59所示；
用于HPA-18片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.60所示；
用于HPA-19片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.61所示；
用于HPA-20片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.62所示；
用于HPA-21片段的单碱基延伸引物，序列如 SEQ ID No.63所示。
4.根据权利要求3所述的人类血小板同种抗原基因分型的检测方法，其特征在于，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃ 20秒，72℃ 60秒，45个循环，72℃ 5分钟，4℃保存。
5.权利要求3所述的人类血小板同种抗原基因分型的检测方法制备的检测试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910229082.XA CN110172502A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910229082.XA CN110172502A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110172502A true CN110172502A (zh) | 2019-08-27 |
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ID=67689312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN201910229082.XA Withdrawn CN110172502A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种人类血小板同种抗原基因分型的检测方法和检测试剂盒 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110964799A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板表面抗原hpa与hla-ab基因分型的试剂盒 |
| CN111235239A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-06-05 | 浙江大学医学院附属妇产科医院 | 一种多重pcr_snp基因分型检测方法 |
| CN111235261A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-06-05 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1~29基因分型的试剂盒 |
| CN111455027A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-07-28 | 江苏省血液中心 | 血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒 |
-
2019
- 2019-03-25 CN CN201910229082.XA patent/CN110172502A/zh not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110964799A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板表面抗原hpa与hla-ab基因分型的试剂盒 |
| CN111235261A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-06-05 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1~29基因分型的试剂盒 |
| CN110964799B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-10-04 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板表面抗原hpa与hla-ab基因分型的试剂盒 |
| CN111235261B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-11-04 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1～29基因分型的试剂盒 |
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| CN111455027A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-07-28 | 江苏省血液中心 | 血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒 |
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