CN106282357A - 一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法 - Google Patents

一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测Ph‑like相关融合基因位点的方法，包括S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；S4：使用特异性扩增引物通过PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；S5：对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。本发明采用的RT‑PCR方法从实用的角度选择了ABL类的融合基因，用传统的RT‑PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。

Description

一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法
技术领域
本发明属于生物技术和生物信息学领域，具体地，涉及一种Ph-like相关检验融合基因的方法。
背景技术
Ph染色体是由人类9号和22号染色体的异位产生的,染色体异位的结果是BCR/ABL融合基因的出现。Ph染色体阳性(Ph+)的急性淋巴细胞性白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)约占成人ALL的20-25％,占儿童及青少年ALL的3-7。Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)患者接受标准化疗方案后完全缓解率(Complete remission,CR)较Ph染色体阴性ALL患者低,且其持续缓解的时间较短,平均8个月,因此预后较差。在伊马替尼问世前,单接受化疗的Ph+ALL患者,其3年总生存率小于20％,而行异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)可使3年总生存率达36-44％。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKl)伊马替尼联合化疗使得此类白血病的预后大大改善,表现为完全缓解率大大提高,可达90％以上；长期生存率也有一定程度的提高。最新的长期随访数据显示,基于伊马替尼的治疗在4年总生存率上较经典的无伊马替尼治疗方案LALA-94从20％提高到52％。
尽管如此,allo-HSCT依然是伊马替尼时代Ph+ALL不可替代的、最重要的根治手段。釆用伊马替尼联合化疗诱导巩固治疗,并在CR1期尽早行allo-HSCT是当前治疗年轻Ph+ALL患者的标准方案。法国一项长期随访结果再次强化了这个观点,在联合伊马替尼的巩固化疗方案基础上,接受过allo-HSCT的患者4年，总生存率达50％,而未行移植患者仅33％。德国、日本及英美的数据显示,基于伊马替尼的诱导化疗加上清髓性allo-HSCT,3年OS率可达到59％-72％；单使用基于TKI的诱导化疗,后续不行allo-HSCT,在长期生存上并无优势。尽管移植在治愈白血病上不可替代,但移植后面临着较高的复发及移植相关死亡的风险,使得移植的疗效受到考量。因此,寻找和识别影响移植疗效的危险因素,对合适的人群行allo-HSCT具有重要的意义。
Ph-like ALL是一类BCR/ABL基因融合阴性的，但是基因的表达与ph阳性的ALL相似的一类ALL。近来的基因分析发现Ph-like ALL患者中的一些基因如ABL1，ABL2和其他基因的融合导致了酪氨酸激酶的持续激活。而且当与其他标准风险的ALL患者相比，BCR/ABL基因融合阳性的和Ph-like ALL患者有同样差的预后。由于这两种ALL的分子发病机制是类似的，因此，可以假定BCR/ABL基因融合阳性的ALL患者的治疗方案是可以转移到Ph-likeALL患者中的。K.G.Roberts等在2014年发表的文献Targetable Kinase-ActivatingLesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia中指出，Ph-like ALL患者中有ABL类融合基因存在，可以用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼进行治疗。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法，选择了ABL类的融合基因，用传统的RT-PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；
S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；
S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；
S4：使用特异性扩增引物通过多重PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；
S5:对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；
S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；
S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。
根据本发明的一个实施例，所述特异性扩增引物是核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23中的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述RNA的浓度为160ng/uL-260ng/uL。
根据本发明的一个实施例，所述融合基因是针对以下多种可以自由组合的融合基因：ETV6(5)，NUP214(34)，ABL1(3)，NUP214(32)，ABL1(2)，ABL1(4)，SNX2(3)，RANBP2(18)，ZMIZ1(18)，RCSD1(3)，ABL2(4)，ZMIZ1(14)，ZEB2(9)，PDGFRB(9)，TNIP1(14)，PDGFRB(11)，EBF1(14)，EBF1(11)，EBF1(15)，SSBP2(16)，CSF1R(12)，SSBP2(6)，ZC3HAV1(12)，PAG1(8)，ABL2(6)，RCSD1(3)。
根据本发明的一个实施例，按照20μL反应体系计算，所述步骤S4中PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积
GoTaq Green Master Mix 10μL
ddH2O 7μL
Primers(5μM each) 1.5μL
cDNA 1.5μL
总体积 20μL
所述PCR扩增的反应程序为：
根据本发明的一个实施例，所述步骤S6中所述酶解消化中使用的酶为TAKARA的Alkaline Phosphatase(Shrimp)和ExonucleaseI。
根据本发明的一个实施例，步骤S7中还包括将测序反应产物进行乙醇沉淀纯化步骤。
根据本发明的一个实施例，所述琼脂糖凝胶电泳是用北京鼎国昌盛DG-600C电泳仪进行电泳，上海天能1600数码凝胶图像分析系统进行拍照成像。
本发明采用的RT-PCR方法从实用的角度选择了ABL类的融合基因，用传统的RT-PCR的方法进行检测。该方法简便快速，成本低。一个标本从到实验室到报告的发出总共只需要一天左右的时间，同时成本也大幅度降低，只需要几十块钱。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例1扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图2为根据本发明实施例2扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图3为根据本发明实施例3扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图4为根据本发明实施例4扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图5为Sanger测序验证从开始一直到214的区域为NUP124exon32与ABL1exon2融合的位置的示意图
图6为Sanger测序验证从215一直到最后的区域为ABL1exon2与NUP124exon32融合的位置的示意图
图7为根据本发明实施例5扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图8为Sanger测序验证从开始一直到661的区域为TELexon5与ABL1exon2融合的位置的示意图
图9为Sanger测序验证从662开始一直到最后的区域为ABL1exon2与TEL exon5融合的位置的示意图
图10为根据本发明实施例6扩增得到8个多重PCR反应扩增后的产物的2％凝胶电泳图
图11为Sanger测序验证从开始到271的区域为RUNBP2exon18与ABL1exon2发生融合的位置的示意图
图12为Sanger测序验证从272到最后的区域为ABL1exon2与RUNBP2exon18发生融合的位置的示意图
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
二代测序又称高通量测序是核酸测序研究的一次革命性技术创新，该技术通过文库的构建，模板的制备，上机测序以及数据的分析等步骤来完成目的基因的测序分析。科研人员可利用该技术在基因组、转录组和表观基因组等领域展开多层次、多组学的研究，为基因组学和后基因组学的研究带来新的科研方法和解决方案。
该技术应用于临床，从标本到实验室到实验结果的下机最少需要3天左右的时间，操作过程比较繁琐复杂。而且根据标本量和测序引物的多少，一个标本的平均成本达到了几百甚至上千。详细的可见参考文献Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia。
标本来源：ALL患者的骨髓标本
实施例1
(1)样本DNA的准备
样本信息：中国女患者，6岁，临床诊断为ALL复发。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为186.1ng/ul，达到检测标准。
(2)对待检样品进行RNA的提取并逆转录成cDNA
(3)引物的设计和扩增
使用Primer5软件针对16个基因的编码区进行引物的设计，共设计了23个引物。
按如下扩增体系将逆转录好的cDNA进行多重PCR反应，按照20μL反应体系计算，所述步骤(4)中PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积
GoTaq Green Master Mix 10μL
ddH2O 7μL
Primers(5μM each) 1.5μL
cDNA 1.5μL
总体积 20μL
PCR扩增的反应程序为：
(5)反应完后对产物进行琼脂糖凝聚电泳看是否有对应的融合基因大小的目的的条带
每一孔反应产物条带大小的判断如下表：
每孔引物的组合情况及条带大小
琼脂糖凝胶电泳见图1。结果说明：是阴性的，只有最右边的marker和每一孔PCR的内参条带。
实施例2
(1)样本RNA的准备
样本信息：中国男患者，5岁，临床诊断为ALL。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为202.3ng/ul，达到检测标准。
其他步骤同实施例1。
琼脂糖凝胶电泳见图2。结果说明：是阴性的，只有最右边的marker和每一孔PCR的内参条带。
实施例3
(1)样本RNA的准备
样本信息：中国男患者，50岁，临床诊断为ALL。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为260.2ng/ul，达到检测标准。
其他步骤同实施例1。
琼脂糖凝胶电泳见图3。结果说明：是阴性的，只有最右边的marker和每一孔PCR的内参条带。
实施例4
(1)样本RNA的准备
样本信息：中国男患者，29岁，临床诊断为ALL。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为160.2ng/ul，达到检测标准。
其他步骤同实施例1。
琼脂糖凝胶电泳见图4。结果说明：为阳性的，且为NUP124exon32与ABL1exon2融合，阳性结果在最右边的挨着marker的第一孔。
对PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；
酶解消化反应条件和步骤：
实验前填写酶解消化步骤的操作记录，写清样本名和待测区域。
每孔反应体系1：
ddH2O 1.2μL
SAP Buffer 0.3μL
SAP酶(1U/μL) 1μL
Exo I酶(5U/μL) 0.5μL
PCR产物 5μL
Total 8μL
体系配制完后，8联管盖上写清楚编号、时间和“CX Clean”字样→将8联管放在漩涡振荡器上混匀至少10s→短暂离心甩下壁上液体→放在ABI 9700、ABI Veriti PCR仪上运行：
反应程序(即PCR仪的SEQ\CLeanUp程序)：
37℃ 30min
95℃ 15min
12℃ ∞
酶解后产物应保存在4℃(24h内继续下游操作)或-20℃(超过24h不会使用)。
对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。
第一测序反应步骤：
实验前填写测序反应的操作记录，写清样本名、待测区域和正、反向。
每孔反应体系-1：
ddH2O 6μL
5x Sequencing Buffer 1.8μL
BigDye 3.1 0.4μL
测序引物(5μM) 1μL
酶解后的模板*1 0.8μL
Total 10μL
若用8联管做，则体系配制完后，在8联管盖上写清楚编号、时间和“CX Seq”字样；若用96孔板做，则体系配制完后，在96孔板上写清楚编号、时间→将8联管或96孔板放在漩涡振荡器上混匀至少5s→短暂离心甩下壁上液体→放在ABI 9700、ABI Veriti PCR仪上运行：
反应程序(即PCR仪的SEQ\Sequencing程序)：
测序反应产物应避光保存在-20℃。
对测序反应产物进行乙醇沉淀纯化：
盛装无水乙醇和75％乙醇的容器要经常洗涤，然后再加入新的液体，保证其浓度恒定。
计算要配制多少孔的自制PPT溶液*，优先使用冰箱里没有用完的PPT溶液。
配平，离心所有96孔板→取干净的吸水纸铺在桌上，取下96孔板上的8联管凸盖，按一定的顺序放在吸水纸上→向96孔板的相应孔中每孔加入2μL自制PPT溶液，加在每孔壁上，不用换枪头→悬空向每孔加入40μL无水乙醇，把PPT溶液冲下去，不用换枪头。
盖上8联管凸盖并压紧。96孔板和8联管凸盖上都做好标记。放在Thermo平板振荡器上。振荡器调至7档，振荡至少4min30s(重要！)。
或者将96孔板放在摇床上，转速360rpm，振荡至少5min。
用架盘天平配平后，正向放置96孔板到冷冻离心机摇篮内，转速2100g，温度4℃，离心30min(即程序1)。此时将Hi-Di甲酰胺从冰箱中拿出，放到室温下回温，然后去登记标本或者去测序仪建板(先做加急板的建板)。
离心完成后，取下8联管凸盖，取3层KIMTECH Science Kimwipes无尘纸，垫在至少4张普通吸水纸上，一起放置在96孔板上。用架盘天平配平后，倒置96孔板+无尘纸+吸水纸，转速500g，温度4℃，离心1min(即程序2)，甩干所有上清。
每孔加入100μL 75％无水乙醇，盖上8联管凸盖，不要混匀！用架盘天平配平后，正向放置96孔板到摇篮内，转速2100g，温度4℃，离心5min(即程序3)。
离心完成后，取下8联管凸盖，重新取3层KIMTECH Science Kimwipes无尘纸，垫在至少3张普通吸水纸上。倒置96孔板至无尘纸+吸水纸上(无尘纸紧贴96孔板)，使大部分上清液被无尘纸吸收。
重新取3层KIMTECH Science Kimwipes无尘纸，垫在至少3张普通吸水纸上，一起放置在96孔板上。用架盘天平配平后，倒置96孔板+无尘纸+吸水纸，转速500g，温度4℃，离心1min(即程序2)，甩干所有上清。
将96孔板放置在避光盒内至少30min，并用电风扇吹，使乙醇挥发干净。
每孔加入10μL甲酰胺，盖上8联管凸盖，放在Thermo平板振荡器上。振荡器调至7档，振荡至少4min30s。
短暂离心96孔板，甩下壁上的液体，准备上机测序。注意先上机加急测序的板。
*：自制PPT溶液配制：取1.5mL EP管，加入等体积的125mM EDTA溶液和3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)，振荡混匀。用不完的可放在4℃保存。
125mM EDTA溶液配制：
EDTA二钠分子量：372.24
125mM＝372.24*0.125g/L＝46.53g/L
向50mL 18.2MΩH2O中加入46.53*(50/1000)＝2.3265g EDTA二钠，混匀即配得125mM EDTA溶液。4℃保存。
3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)配制：
乙酸钠分子量：136.08
3M＝136.08*3g/L＝408.24g/L
向28mL 18.2MΩH2O中加入408.24*(50/1000)＝20.412g乙酸钠，再加入2mL乙酸，混匀，然后倒入量筒中定容至50mL。倒回小烧杯中，用乙酸调至pH到5.2，即配得3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)。4℃保存。
阳性结果进一步测序结果见图5和图6，实施例4这两基因的融合方式是NUP124exon32在上游，ABL1exon2在下游，由于序列比较长，截图只截了融合位置的部分序列。
实施例5
(1)样本RNA的准备
样本信息：中国女患者，30岁，临床诊断为ALL。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为180.5ng/ul，达到检测标准。
其他步骤同实施例1。
琼脂糖凝胶电泳见图7。结果说明：为阳性的，且为TEL/ABL1融合，TEL即ETV6基因的另一个表示方式，该图是和其他的图一起跑的，而且是用的单独的另外的TEL/ABL1引物来跑的，所以条带大小和SOP中的有所不同。阳性结果为箭头所指的位置。
后续反应步骤同实施例4。
上述阳性结果进一步的测序结果见图8和图9，融合位点为TELexon5与ABL1exon2融合，实施例5这两基因的融合方式是TEL exon5在上游，ABL1exon2在下游，由于序列比较长，截图只截了融合位置的部分序列。
实施例6
(1)样本RNA的准备
样本信息：中国男患者，4岁，临床诊断为ALL-L1。
收集患者的骨髓标本，使用美国OMEGA全血RNA提取试剂盒提取RNA，使用NanoDrop2000分光光度计对提取好的RNA进行浓度测定。测定浓度为160.8ng/ul，达到检测标准。
其他步骤同实施例1。
琼脂糖凝胶电泳见图9。结果说明：为阳性的，且为RANBP2/ABL1融合，阳性孔在最右边靠近marker的第二孔。
后续反应步骤同实施例4。
上述阳性结果进一步的测序结果见图11和图12，实施例6这两基因的融合方式是RUNBP2exon18在上游，ABL1exon2在下游，由于序列比较长，截图只截了融合位置的部分序列。同时，由于测序结果不是很理想，部分位点是通过人工校准来看的，但是该结果足以证明该融合是阳性的。
确认结果后发出临床报告在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种检测Ph-like相关基因融合位点的方法，其特征在于，包括
S1：获取骨髓标本，所述骨髓标本来自于患有ALL疾病的人体；
S2：从所述骨髓标本中提取基因组RNA；
S3：将所述基因组RNA进行逆转录成cDNA；
S4：使用特异性扩增引物通过多重PCR扩增所述基因组cDNA，从而获得PCR扩增产物；
S5：对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看是否有对应的融合基因大小的目的的条带；
S6：对所述PCR扩增产物进行酶解消化，以便获得酶解消化产物；
S7：对所述酶解消化产物进行第一测序反应，以便进行验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物是核苷酸序列为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA的浓度为160ng/uL-260ng/uL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合基因是针对以下多种可以自由组合的融合基因：ETV6(5)，NUP214(34)，ABL1(3)，NUP214(32)，ABL1(2)，ABL1(4)，SNX2(3)，RANBP2(18)，ZMIZ1(18)，RCSD1(3)，ABL2(4)，ZMIZ1(14)，ZEB2(9)，PDGFRB(9)，TNIP1(14)，PDGFRB(11)，EBF1(14)，EBF1(11)，EBF1(15)，SSBP2(16)，CSF1R(12)，SSBP2(6)，ZC3HAV1(12)，PAG1(8)，ABL2(6)，RCSD1(3)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照20μL反应体系计算，所述步骤S4中PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积 GoTaq Green Master Mix 10μL ddH2O 7μL Primers(5μM each) 1.5μL cDNA 1.5μL 总体积 20μL
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6中所述酶解消化中使用的酶为TAKARA的Alkaline Phosphatase(Shrimp)和ExonucleaseI。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S7中还包括将第一测序反应产物进行乙醇沉淀纯化步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳是用DG-600C电泳仪完成的。
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