CN112481379A - 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒。本发明公开的检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合,由序列表中序列1‑42所示的42条单链DNA与TaqMan探针1‑13组成;TaqMan探针1‑13的序列依次为序列表中43‑55。本发明的检测Ph样ALL患者融合基因的引物探针组合可以用于B‑ALL患者Ph样ALL相关融合基因的快速准确的筛查,并具有覆盖全面、准确可靠、操作简便、快速、成本低廉的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中,一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种由于异常增殖和分化形成的克隆性原始淋巴细胞群体的造血系统恶性肿瘤。ALL是急性白血病的主要类型,占到儿童急性白血病的75-80%、成人急性白血病的20-25%,约80%的ALL为B细胞型(B-ALL)。依据细胞遗传学及分子特征B-ALL分为多种类型,Ph+ALL是常见类型之一,而Ph样ALL(Ph-like ALL)是近年来新定义的一种类型。
Ph+ALL中,9号和22号染色体交互异位(即t(9;22)(q34;q11))形成Ph染色体,分子水平表现为BCR-ABL1融合基因。Ph+ALL患者曾经具有非常差的预后,不过近10年来,随着小分子靶向药物——酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的应用使得该类型患者的疗效获得极大的提高。2009年,国际上两大研究组(美国的COG和荷兰的DCOG)基于同时检测大量基因mRNA水平的基因芯片技术,分别提出了Ph样ALL(又称为BCR-ABL样ALL)的概念,它是指基因表达谱与Ph+ALL相似,但是不具有Ph染色体/BCR-ABL融合基因的B-ALL。在2016年版的国家卫生组织(WHO)髓系肿瘤及白血病分类中,Ph样ALL以临时条目形式被列出,然而到目前为止,其诊断仍然面临巨大挑战。
Ph样ALL的概念来自于基因表达谱,需要通过表达谱聚类分析确定,因而导致临床诊断实际应用困难。此外由于COG和DCOG研究组包含的基因及入组患者的不同,导致他们各自包含的核心基因有很大差异,因而同样的患者可能被COG和DCOG定义是否为Ph样ALL的结果不同。近几年随着转录组测序技术的应用,人们发现Ph样ALL主要是发生了酪氨酸激酶信号通路的异常,包括酪氨酸激酶相关的融合基因和突变两大类分子学异常形式,由于涉及的突变类型并不为Ph样ALL所特有,因而根据突变无法确诊Ph样ALL。而检测到酪氨酸激酶相关的融合基因即可诊断Ph样ALL,并且约占50%的Ph样ALL具有融合基因,因此融合基因筛查对于Ph样ALL诊断具有重要的临床意义。
到目前为止已发现,Ph样ALL涉及近10种酪氨酸激酶的数十种融合基因类型,主要包含ABL1融合基因、ABL2融合基因、JAK2融合基因、CSF1R融合基因、PDGFRB融合基因、CRLF2融合基因等,其中ABL1融合基因包括NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因,ABL2融合基因包括RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因等,JAK2融合基因包括PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因等,CSF1R融合基因包括MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因等,PDGFRB融合基因包括ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因、SSBP2-PDGFRB融合基因等,CRLF2融合基因类型为P2RY8-CRLF2融合基因。
Ph样ALL筛查的临床意义还体现在:1)预后分层。一系列临床研究显示Ph样ALL预后差,因而在美国NCCN指南等各大指南中被归于高危组。根据不同的预后将决定患者采取相应合适的治疗方案,如高危患者建议接受异基因造血干细胞移植。2)指导临床用药:由于Ph样ALL主要为酪氨酸激酶信号通路异常,因而采用相应的靶向TKI有效,例如ABL1和ABL2异常可使用伊马替尼和达沙替尼、JAK2异常可使用芦可替尼等。目前,多个TKI治疗Ph样ALL的国际临床实验正在进行中。3)提供微小残留病(MRD)监测指标:融合基因为白血病细胞特有,是理想的MRD监测分子标志,能够特异敏感地反映白血病负荷、指导临床尽早采取干预措施预防复发。因此Ph样ALL相关融合基因筛查临床意义重大。
融合基因筛查可采用转录组测序技术,它尽管具有覆盖全面等优点,但是其应用于临床常规尚存在分析过程繁琐复杂、费时等问题,因而在寻找未知类型方面更具优势。相比之下,实时定量PCR(RQ-PCR)与多重PCR相结合的多重RQ-PCR技术是适用于临床常规的筛查特定融合基因类型的检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一组检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合,所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合包括A1、A2和A3:
A1、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1,由序列表中序列2、3、12-16与24-27所示的11条单链DNA、序列表中序列30-33所示的4条单链DNA与探针1-4组成;所述探针1-4的序列依次为序列表中43-46;
A2、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2,由序列表中序列1-11、17-23所示的18条单链DNA、序列表中序列34-40所示的7条单链DNA与探针5-11组成;所述探针5-11的序列依次为序列表中47-53;
A3、检测P2RY8-CRLF2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列28所示的单链DNA、序列表中序列41所示的单链DNA与探针12组成;所述探针12的序列为序列表中54。
所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合还可包括如下A4-A23中的任意n种,n为小于等于20的自然数:
A4、检测NUP214-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列12-16所示的5条单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A5、检测ETV6-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A6、检测ZMIZ1-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列27所示的单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A7、检测RCSD1-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列25所示的单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A8、检测RCSD1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列25所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A9、检测ZC3HAV1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列26所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A10、检测PAG1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列24所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A11、检测PAX5-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列17和18所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A12、检测SSBP2-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A13、检测ETV6-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A14、检测ATF7IP-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A15、检测BCR-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列4-6所示的4条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A16、检测EBF1-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列7和8所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A17、检测PCM1-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列19-21所示的3条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A18、检测MEF2D-CSFR1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列9-11所示的3条单链DNA、序列表中序列34所示的单链DNA与探针10组成;
A19、检测SSBP2-CSFR1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列34所示的单链DNA与探针10组成;
A20、检测ATF7IP-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A21、检测EBF1-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列7和8所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A22、检测ETV6-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A23、检测SSBP2-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
所述探针1-12的序列依次为序列表中序列43-54。
上文中,所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合还可包括检测内参基因ABL1基因的引物探针组合,所述检测内参基因ABL1基因的引物探针组合由序列表中序列29所示的单链DNA、序列表中序列42所示的单链DNA与探针13组成,所述探针13的序列为序列表中序列55。
上文中各探针均可为TaqMan探针。
上文中,所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合中各探针的3’末端均可标记TAMRA,5’末端可标记FAM或HEX。
所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合可由上述A1、A2和A3组成,还可由A1、A2、A3与A4-A23中的任意n种组成,还可由A1、A2、A3与A4-A23中的任意n种以及所述检测内参基因ABL1基因的引物探针组合组成,n为小于等于20的自然数。
所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合中各单链DNA间的摩尔数均相等,各探针间的摩尔数均相等,每条单链DNA与每条探针的摩尔比可为3:2。
本发明还提供了所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合在制备检测Ph样ALL融合基因试剂盒中的应用。
上述应用中,所述融合基因可为ABL1融合基因、ABL2融合基因、JAK2融合基因、CSF1R融合基因、PDGFRB融合基因或CRLF2融合基因。
本发明还提供了所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合在制备筛查或辅助筛查Ph样ALL患者试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测Ph样ALL融合基因的试剂盒,所述试剂盒包括所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合。
上述试剂盒还可包括进行荧光PCR所需的试剂。所述荧光PCR所需的试剂可为通用Mastemix(美国ThermoFisher,货号:4369016)。
上述试剂盒中,所述融合基因可为ABL1融合基因、ABL2融合基因、JAK2融合基因、CSF1R融合基因、PDGFRB融合基因或CRLF2融合基因。
本发明还提供了所述试剂盒在制备筛查或辅助筛查Ph样ALL融合基因试剂盒中的应用。
本发明中,所述ABL1融合基因可为NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因或RCSD1-ABL1融合基因。
所述ABL2融合基因可为RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因或PAG1-ABL2融合基因。
所述JAK2融合基因可为PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因或PCM1-JAK2融合基因。
所述CSF1R融合基因可为MEF2D-CSFR1融合基因或SSBP2-CSFR1融合基因。
所述PDGFRB融合基因可为ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因或SSBP2-PDGFRB融合基因。
所述CRLF2融合基因可为P2RY8-CRLF2融合基因。
本发明的检测Ph样ALL患者融合基因的引物探针组合可以用于B-ALL患者Ph样ALL相关融合基因的快速准确的筛查,具有如下特点:
1、覆盖全面:本试剂盒是根据数篇文献报道的转录组测序结果设计引物探针,包含6大类共21种常见融合基因类型,每种融合基因包括多种可能的融合位点,基本覆盖了目前已报道的常见Ph样ALL相关融合基因类型。
2、准确可靠:本试剂盒采用的是基于TaqMan探针的RQ-PCR,保证了扩增的特异性。在多重RQ-PCR体系检测到阳性结果后,再进行分管RQ-PCR分别检测各个融合基因,以确定具体类型。
3、操作简便、快速、成本低廉:首先采用3管反应(2管多重RQ-PCR体系和1管单一RQ-PCR体系)同时筛查6大类融合基因,若为阳性可以判断出大类,然后再把该大类包括的各种融合基因类型进行分管检测;若为阴性则直接报告结果。
附图说明
图1为检测流程图。
图2为1例阳性患者(患者3)的扩增曲线。A:多重体系1HEX通道,B:检测RCSD1-ABL2融合基因的引物探针组合体系。A和B图中,横坐标是cycle number,数值从左至右依次为1、2、3……、40,纵坐标是Delta Rn,数值从上至下依次为1.0e+001、1.0e+000、1.0e-001、1.0e-002、1.0e-003、1.0e-004。
图3为患者1(NUP214-ABL1)测序结果。
图4为患者2(ETV6-ABL1)测序结果。
图5为患者3(RCSD1-ABL2)测序结果。
图6为患者4(EBF1-JAK2)测序结果。
图7为患者5(EBF1-PDGFRB)测序结果。
图8为患者6(P2RY8-CRLF2)测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下述实施例中,如无特殊说明,序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸,末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
通用Mastemix:美国ThermoFisher,货号:4369016。
实施例1、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合的制备
本实施例提供了检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合,具体如下:
检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1,由上游引物2、3、12-16与24-27、下游引物1-4与探针1-4组成。
检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2,由上游引物1-11、17-23、下游引物5-11与探针5-11组成。
检测P2RY8-CRLF2融合基因的引物探针组合,由上游引物28、下游引物12与探针12组成。
检测NUP214-ABL1融合基因的引物探针组合,由上游引物12-16、下游引物1和2与探针1和2组成。
检测ETV6-ABL1融合基因的引物探针组合,由上游引物2和3、下游引物1和2与探针1和2组成。
检测ZMIZ1-ABL1融合基因的引物探针组合,由上游引物27、下游引物1和2与探针1和2组成。
检测RCSD1-ABL1融合基因的引物探针组合,由上游引物25、下游引物1和2与探针1和2组成。
检测RCSD1-ABL2融合基因的引物探针组合,由上游引物25、下游引物3和4与探针3和4组成。
检测ZC3HAV1-ABL2融合基因的引物探针组合,由上游引物26、下游引物3和4与探针3和4组成。
检测PAG1-ABL2融合基因的引物探针组合,由上游引物24、下游引物3和4与探针3和4组成。
检测PAX5-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物17和18、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测SSBP2-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物22和23、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测ETV6-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物2和3、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测ATF7IP-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物1、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测BCR-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物4-6、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测EBF1-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物7和8、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测PCM1-JAK2融合基因的引物探针组合,由上游引物19-21、下游引物6-10与探针5-9组成。
检测MEF2D-CSFR1融合基因的引物探针组合,由上游引物9-11、下游引物5与探针10组成。
检测SSBP2-CSFR1融合基因的引物探针组合,由上游引物22和23、下游引物5与探针10组成。
检测ATF7IP-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由上游引物1、下游引物11与探针11组成。
检测EBF1-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由上游引物7和8、下游引物11与探针11组成。
检测ETV6-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由上游引物2和3、下游引物11与探针11组成。
检测SSBP2-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由上游引物22和23、下游引物11与探针11组成。
检测内参基因ABL1基因的引物探针组合,由上游引物29、下游引物13与探针13组成,用于反映标本cDNA质量。
上述各引物探针组合中,有大于一条上游引物的,上游引物间的摩尔数均相等,有大于一条下游引物的,下游引物间的摩尔数均相等,有大于一条探针的,探针间的摩尔数均相等,且每条上游引物、每条下游引物与每条探针间的摩尔比均为3:3:2。
各探针组合中的上游引物、下游引物与探针信息分别见表1-3,各探针均为TaqMan探针。
表1.上游引物信息
表2.下游引物信息
下游引物编号 | 基因 | 序列(5'-3') |
1 | ABL1 | CTCAGACCCTGAGGCTCAAAGT(序列30) |
2 | ABL1 | GGATAATGGAGCGTGGTGAT(序列31) |
3 | ABL2 | CTCCATTTCCCATTTGTCGT(序列32) |
4 | ABL2 | AGCTCCACCTGATAGCCTCA(序列33) |
5 | CSF1R | CAGCATCTTCACAGCCACCT(序列34) |
6 | JAK2 | GTGTAGGATCCCGGTCTTCA(序列35) |
7 | JAK2 | GCTCTGAAAGAAGGCCTGAA(序列36) |
8 | JAK2 | CTCCTCCACTGCAGATTTCC(序列37) |
9 | JAK2 | GCGAACAGTTTCCATCTGGT(序列38) |
10 | JAK2 | GGCTGGAGGTGCTACTTCTTT(序列39) |
11 | PDGFRB | TTCTGCCAAAGCATGATGAG(序列40) |
12 | CRLF2 | TGTCACCTGCACGGTTTCTA(序列41) |
13 | ABL1 | GATGTAGTTGCTTGGGACCCA(序列42) |
表3.探针信息
实施例2、利用实施例1的检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合检测Ph样ALL融合基因的方法
1、提取待测骨髓样本总RNA,每10μL反转录体系中加入1-2μg RNA,反转录cDNA。
2、RQ-PCR反应
多重体系1:
待测样本cDNA 2μL,实施例1中的检测Ph样ALL的引物探针组合1,通用Mastemix10μL,双蒸水补至20μL。
多重体系2:
待测样本cDNA 2μL,实施例1中的检测Ph样ALL的引物探针组合2,通用Mastemix10μL,双蒸水补至20μL。
检测P2RY8-CRLF2融合基因、NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因、PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因、MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因、ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因和SSBP2-PDGFRB融合基因的体系(21个体系)均如下:
待测样本cDNA 2μL,实施例1中的检测相应融合基因的引物探针组合,通用Mastemix10μL,双蒸水补至20μL。
检测内参基因ABL1基因的体系:
待测样本cDNA 2μL,实施例1中的检测内参基因ABL1基因的引物探针组合,通用Mastemix 1μL,双蒸水补至20μL。
上述各体系中,各上游引物、各下游引物的浓度均为0.3μM,探针的浓度均为0.2μM。
将上述各反应体系在具有FAM、HEX通道的荧光定量PCR仪中进行反应,反应条件为:50℃2min,1个循环;95℃10min,1个循环;95℃15s,62℃1min,40个循环。
RQ-PCR反应结束后,采集各体系在不同通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增。
3、检测待测样本融合基因的方法
在实际应用中,首先按照步骤1与2的方法采用检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2、检测P2RY8-CRLF2融合基因的引物探针组合和检测内参基因ABL1基因的引物探针组合分别对待测样本进行RQ-PCR反应,反应结束后,采集各体系在不同通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增。如内参基因的体系FAM通道显示无指数扩增,则需重新进行RNA提取或反转录cDNA再检测;在内参基因的体系有指数扩增的情况下按照如下①-⑥判断:
①如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1的多重体系1中FAM通道显示无指数扩增,则待测样本不含有NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因;如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1的多重体系1中FAM通道显示有指数扩增,则分别采用检测NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因的引物探针组合对待测样本进行进一步的RQ-PCR反应,反应结束后,采集各体系在FAM通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增,并确定融合基因类型:
如检测NUP214-ABL1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有NUP214-ABL1融合基因;如检测NUP214-ABL1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含NUP214-ABL1融合基因;
如检测ETV6-ABL1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ETV6-ABL1融合基因;如检测ETV6-ABL1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ETV6-ABL1融合基因;
如检测ZMIZ1-ABL1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ZMIZ1-ABL1融合基因;如检测ZMIZ1-ABL1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ZMIZ1-ABL1融合基因;
如检测RCSD1-ABL1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有RCSD1-ABL1融合基因;如检测RCSD1-ABL1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含RCSD1-ABL1融合基因;
②如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1的多重体系1中HEX通道显示无指数扩增,则待测样本不含有RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因;如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1的多重体系1中HEX通道显示有指数扩增,则分别采用检测RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因的引物探针组合对待测样本进行进一步的RQ-PCR反应,反应结束后,采集各体系在HEX通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增,并确定融合基因类型:
如检测RCSD1-ABL2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有RCSD1-ABL2融合基因;如检测RCSD1-ABL2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含RCSD1-ABL2融合基因;
如检测ZC3HAV1-ABL2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ZC3HAV1-ABL2融合基因;如检测ZC3HAV1-ABL2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ZC3HAV1-ABL2融合基因;
如检测PAG1-ABL2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有PAG1-ABL2融合基因;如检测PAG1-ABL2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含PAG1-ABL2融合基因;
③如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2的多重体系2中FAM通道显示无指数扩增,则待测样本不含有PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因;如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2的多重体系2中FAM通道显示有指数扩增,则分别采用检测PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因的引物探针组合对待测样本进行进一步的RQ-PCR反应,反应结束后,采集各体系在FAM通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增,并确定融合基因类型:
如检测PAX5-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有PAX5-JAK2融合基因;如检测PAX5-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含PAX5-JAK2融合基因;
如检测SSBP2-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有SSBP2-JAK2融合基因;如检测SSBP2-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含SSBP2-JAK2融合基因;
如检测ETV6-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ETV6-JAK2融合基因;如检测ETV6-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ETV6-JAK2融合基因;
如检测ATF7IP-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ATF7IP-JAK2融合基因;如检测ATF7IP-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ATF7IP-JAK2融合基因;
如检测BCR-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有BCR-JAK2融合基因;如检测BCR-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含BCR-JAK2融合基因;
如检测EBF1-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有EBF1-JAK2融合基因;如检测EBF1-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含EBF1-JAK2融合基因;
如检测PCM1-JAK2融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有PCM1-JAK2融合基因;如检测PCM1-JAK2融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含PCM1-JAK2融合基因;
④如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2的多重体系2中HEX通道显示无指数扩增,则待测样本不含有MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因、ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因和SSBP2-PDGFRB融合基因;如检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2的多重体系2中HEX通道显示有指数扩增,则分别采用检测MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因、ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因和SSBP2-PDGFRB融合基因的引物探针组合对待测样本进行进一步的RQ-PCR反应,反应结束后,采集各体系在HEX通道下的荧光信号,并根据有无S型扩增曲线确定有无指数扩增,并确定融合基因类型:
如检测MEF2D-CSFR1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有MEF2D-CSFR1融合基因;如检测MEF2D-CSFR1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含MEF2D-CSFR1融合基因;
如检测SSBP2-CSFR1融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有SSBP2-CSFR1融合基因;如检测SSBP2-CSFR1融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含SSBP2-CSFR1融合基因;
如检测ATF7IP-PDGFRB融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ATF7IP-PDGFRB融合基因;如检测ATF7IP-PDGFRB融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ATF7IP-PDGFRB融合基因;
如检测EBF1-PDGFRB融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有EBF1-PDGFRB融合基因;如检测EBF1-PDGFRB融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含EBF1-PDGFRB融合基因;
如检测ETV6-PDGFRB融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有ETV6-PDGFRB融合基因;如检测ETV6-PDGFRB融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含ETV6-PDGFRB融合基因;
如检测SSBP2-PDGFRB融合基因的体系有指数扩增,则待测样本含有SSBP2-PDGFRB融合基因;如检测SSBP2-PDGFRB融合基因的体系无指数扩增,则待测样本不含SSBP2-PDGFRB融合基因;
⑤如检测P2RY8-CRLF2融合基因的体系FAM通道显示有指数扩增,则待测样本含有P2RY8-CRLF2融合基因;如检测P2RY8-CRLF2融合基因的体系FAM通道显示无指数扩增,则待测样本不含P2RY8-CRLF2融合基因;
⑥含有P2RY8-CRLF2融合基因、NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因、PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因、MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因、ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因和SSBP2-PDGFRB融合基因中的任一种的待测样本为Ph样ALL(+)(即Ph样ALL阳性样本);不含P2RY8-CRLF2融合基因、NUP214-ABL1融合基因、ETV6-ABL1融合基因、ZMIZ1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL1融合基因、RCSD1-ABL2融合基因、ZC3HAV1-ABL2融合基因、PAG1-ABL2融合基因、PAX5-JAK2融合基因、SSBP2-JAK2融合基因、ETV6-JAK2融合基因、ATF7IP-JAK2融合基因、BCR-JAK2融合基因、EBF1-JAK2融合基因、PCM1-JAK2融合基因、MEF2D-CSFR1融合基因、SSBP2-CSFR1融合基因、ATF7IP-PDGFRB融合基因、EBF1-PDGFRB融合基因、ETV6-PDGFRB融合基因和SSBP2-PDGFRB融合基因中任一种的待测样本说明不具有这些Ph样ALL融合基因。
上述步骤见图1。
实施例3、利用实施例2方法的检测检测实际样本
1、单一患者诊断
待测对象为表4患者3,该患者按照实施例2中的方法依次进行骨髓总RNA的提取、反转录、RQ-PCR反应,结果显示,该患者在利用检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1的多重体系1中FAM通道无指数扩增,HEX通道有指数扩增(图2中A),说明该患者具有ABL2融合基因中的一种,为确定ABL2的伙伴基因,再分别检测各种类型,其中检测RCSD1-ABL2融合基因的引物探针组合的扩增曲线如图2中B所示,其余各管均无扩增,因此确定该患者具有RCSD1-ABL2融合基因,为Ph样ALL患者,Sanger测序亦证实该融合基因的存在(图5)。
2、批量患者筛查
待测对象:2009年1月-2018年8月在北京大学人民医院接受治疗的242例Ph(-)B-ALL患者(即非Ph+ALL型B-ALL患者),初诊时采集的骨髓样本均已送检临床常规项目TCF3-PBX1、ETV6-RUNX1和MLL相关融合基因(伙伴基因包括AF4、AF9、ENL、AF1p和AF1q)用于分子分型,其中35例检测为以上融合基因之一阳性。对于其余207例阴性患者,利用剩余待废弃骨髓样本RNA反转录为cDNA的样本,采用上述实施例2的方法检测Ph样ALL融合基因。结果筛查到10例阳性与197例阴性,类型如下:1例含有NUP214-ABL1融合基因,1例含有ETV6-ABL1融合基因,2例含有RCSD1-ABL2融合基因,1例含有EBF1-JAK2融合基因,2例含有EBF1-PDGFRB融合基因,3例含有P2RY8-CRLF2融合基因。
3、与转录组测序结果的比较及Sanger测序验证
待测对象:包括6例Ph样ALL融合基因筛查阳性和64例筛查阴性样本,阳性样本分别为步骤1中的患者3;步骤2筛查到的1例含有NUP214-ABL1融合基因的Ph样ALL患者,1例含有ETV6-ABL1融合基因的Ph样ALL患者,1例含有EBF1-JAK2融合基因的Ph样ALL患者,2例含有EBF1-PDGFRB融合基因的Ph样ALL患者中随机选取的1例,3例含有P2RY8-CRLF2融合基因的Ph样ALL患者中随机选取的1例,见表4。64例筛查阴性样本为步骤2为197例阴性中随机选取的64例。采用以上70份初诊骨髓RNA样本进行转录组测序,结果显示,本发明筛查到的Ph样ALL融合基因均得到了转录组测序的验证,筛查阴性的样本转录组测序均未检测出本发明包含的Ph样ALL融合基因类型,说明本发明具有很好的准确性和特异性。
表4.本发明检测结果与Sanger测序结果的比较
患者编号 | 本发明检测结果 | Sanger测序检测融合基因类型 |
1 | NUP214-ABL1 | NUP214外显子24-ABL1外显子3 |
2 | ETV6-ABL1 | ETV6外显子5-ABL1外显子2 |
3 | RCSD1-ABL2 | RCSD1外显子3-ABL2外显子4 |
4 | EBF1-JAK2 | EBF1外显子14-JAK2外显子17 |
5 | EBF1-PDGFRB | EBF1外显子16-PDGFRB外显子11 |
6 | P2RY8-CRLF2 | P2RY8外显子1-CRLF2外显子1 |
对6例Ph样ALL融合基因筛查阳性的骨髓样本的cDNA样本进行PCR扩增,将得到的PCR产物进行Sanger测序,测序结果见3-8。
PCR扩增所用引物如下:
患者1:上游引物16和下游引物2。
患者2:上游引物2和下游引物2。
患者3:上游引物25和下游引物3。
患者4:上游引物8和下游引物8。
患者5:上游引物8和下游引物11。
患者6:上游引物28和下游引物12。
6例患者的Sanger测序结果与本发明的检测结果及转录组测序结果均一致,说明本发明的方法具有很好的准确性,分别如表4及图3-8所示。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京大学人民医院
<120> 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tgcgaggaac tgttatgcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cattcttcca ccctggaaac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctctgtctcc ccgcctgaa 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ccgctgacca tcaayaagga a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gctctacgag atccacaagg a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ctggcccaac gatggcga 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aagagtgctt tcgcaccagt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gcgtgaattc gttcagtgg 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aggcaggaaa ggggttaatg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
cagcagccag cactacagag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
catcgagacc ctgaggaaga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cttggaggaa aacccagtca 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
acaatgcttg ccacgaaaac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ctgcttttgg gcagagtcct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gccaagacat ttggtggatt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
agcagcaaca ccacatcctt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ggctcgtcgt actccatcag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
gacgacatga aggccaatct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ctctggctgg aagtcctgat 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
actcctagtg agagccttgc t 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ttacccagca aaatgatgag ag 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
ggccaatgca gagaatgact 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
gagtaatcaa ccgggcactc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
gggaagaaga ccccactctc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
aggtagacct gggccagaat 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
gacaagccgt gcctatgtg 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
gctgcaagga ctcctcaaga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ctacttctgc cgctgcttct 20
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
ctcagaccct gaggctcaaa gt 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
ggataatgga gcgtggtgat 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
ctccatttcc catttgtcgt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
agctccacct gatagcctca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
cagcatcttc acagccacct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
gtgtaggatc ccggtcttca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gctctgaaag aaggcctgaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
ctcctccact gcagatttcc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
gcgaacagtt tccatctggt 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
ggctggaggt gctacttctt t 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
ttctgccaaa gcatgatgag 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
tgtcacctgc acggtttcta 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
tccgagagcc gcttcaacac 20
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
agcccttcag cggccagtag catct 25
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
tgtgatgttg aaccccaggc a 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
agccgcttca gcaccttggc 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
accccagggc acctatcctc a 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
tcagcttcct gcaccaaagt gg 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
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<400> 49
ccatgggtac cacctgaatg ca 22
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
tgctgaagtt cttctttgtc ccactga 27
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 51
aatgacacga aagacaaagc ttccctt 27
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
aggacagcat cctccttgcc ca 22
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
cctggtggtg ctcaccatca tc 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
tttggggcaa ggaggagcag 20
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
Claims (10)
1.检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合,包括A1、A2和A3:
A1、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合1,由序列表中序列2、3、12-16与24-27所示的11条单链DNA、序列表中序列30-33所示的4条单链DNA与探针1-4组成;所述探针1-4的序列依次为序列表中43-46;
A2、检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合2,由序列表中序列1-11、17-23所示的18条单链DNA、序列表中序列34-40所示的7条单链DNA与探针5-11组成;所述探针5-11的序列依次为序列表中47-53;
A3、检测P2RY8-CRLF2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列28所示的单链DNA、序列表中序列41所示的单链DNA与探针12组成;所述探针12的序列为序列表中54。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于:所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合还包括A4-A23中的任意n种,n为小于等于20的自然数:
A4、检测NUP214-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列12-16所示的5条单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A5、检测ETV6-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A6、检测ZMIZ1-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列27所示的单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A7、检测RCSD1-ABL1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列25所示的单链DNA、序列表中序列30-31所示的2条单链DNA与探针1和2组成;
A8、检测RCSD1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列25所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A9、检测ZC3HAV1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列26所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A10、检测PAG1-ABL2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列24所示的单链DNA、序列表中序列32-33所示的2条单链DNA与探针3和4组成;
A11、检测PAX5-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列17和18所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A12、检测SSBP2-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A13、检测ETV6-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A14、检测ATF7IP-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A15、检测BCR-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列4-6所示的4条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A16、检测EBF1-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列7和8所示的2条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A17、检测PCM1-JAK2融合基因的引物探针组合,由序列表中序列19-21所示的3条单链DNA、序列表中序列35-39所示的5条单链DNA与探针5-9组成;
A18、检测MEF2D-CSFR1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列9-11所示的3条单链DNA、序列表中序列34所示的单链DNA与探针10组成;
A19、检测SSBP2-CSFR1融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列34所示的单链DNA与探针10组成;
A20、检测ATF7IP-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列1所示的单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A21、检测EBF1-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列7和8所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A22、检测ETV6-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列2和3所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
A23、检测SSBP2-PDGFRB融合基因的引物探针组合,由序列表中序列22和23所示的2条单链DNA、序列表中序列40所示的单链DNA与探针11组成;
所述探针1-12的序列依次为序列表中序列43-54。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合,其特征在于:所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合中各探针的3’末端均标记TAMRA,5’末端标记FAM或HEX。
4.权利要求1-3中任一所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合在制备检测Ph样ALL融合基因试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述融合基因为ABL1融合基因、ABL2融合基因、JAK2融合基因、CSF1R融合基因、PDGFRB融合基因或CRLF2融合基因。
6.权利要求1-3中任一所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合在制备筛查或辅助筛查Ph样ALL患者试剂盒中的应用。
7.检测Ph样ALL融合基因的试剂盒,包括权利要求1-3中任一所述检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括进行荧光PCR所需的试剂。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒,其特征在于:所述融合基因为ABL1融合基因、ABL2融合基因、JAK2融合基因、CSF1R融合基因、PDGFRB融合基因或CRLF2融合基因。
10.权利要求7-9任一所述试剂盒在制备筛查或辅助筛查Ph样ALL融合基因试剂盒中的应用。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106282357A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-04 | 武汉康圣达医学检验所有限公司 | 一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法 |
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---|---|---|---|---|
CN106282357A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-04 | 武汉康圣达医学检验所有限公司 | 一种检测Ph‑like相关基因融合位点的方法 |
CN110218790A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-09-10 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片、试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
RICHARD C HARVEY等: "Clinical diagnostics and treatment strategies for Philadelphia chromosome-like acute lymphoblastic leukemia", 《BLOOD ADV》 * |
陈志宏: "多重实时PCR技术用于Ph-like急性淋巴细胞白血病融合基因检测的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023090491A1 (ko) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 필라델피아 염색체 유사 급성 림프모구 백혈병의 진단 또는 예후 예측용 조성물 |
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