CN110218790A - 用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测Ph‑like ALL相关基因重排的探针组、探针芯片和试剂盒，及其在制备费城染色体样急性淋巴细胞白血病的诊断剂中的应用。采用本发明的探针组、探针芯片和试剂盒能在一张玻片上检测Ph‑like ALL相关的多个基因重排靶点，检测成本更低，操作更加便捷，结果误差更小。

Description

用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及白血病分子诊断技术领域，尤其是一种用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片、试剂盒及其应用。
背景技术
费城染色体样急性淋巴细胞白血病(philadelphia chromosome-like acute lymPhoblastic leukemia,Ph-like ALL)是一种新的急性淋巴细胞白血病亚型，表现为Ph染色体或BCR/ABL1融合基因阴性，但基因表达谱与Ph阳性ALL相似，与不良预后相关。Ph-likeALL通常引起细胞因子受体和/或酪氨酸激酶信号的激活并级联放大，导致下游相关信号通路的活化。
BCR-ABL1-like B-lymphoblastic leukaemia/lymphoma(B-ALL/LBL)鉴别困难，镜下没有典型的可于ALL其他类型区别的形态学或细胞化学特征。BCR-ABL1-like B-ALL/LBL占ALL中10-25％，在标危(美国NCI分类)儿童群体中的频率低于高危儿童、青少年和成人。BCR-ABL1-like B-ALL在遗传学特征上表现出不同类型的染色体重排，涉及许多基因和各种伙伴基因，其中CRLF2重排可能占到一半，此外，涉及酪氨酸激酶突变的易位可以累及ABL1(伙伴基因并非BCR)、ABL2、PDGFRB、NTRK3、TYK2、CSF1R、JAK2等，形成30余种伴侣基因。还有很多病例中出现与白血病生成相关的基因的缺失或突变，如IKZF1和CDKN2A/B。预后方面，BCR-ABL1-like ALL预后差，MRD残留风险高【1、2】。NCCN指南诊断建议使用包括间期FISH在内的技术用于细胞遗传学异常检测，当BCR-ABL1阴性时要考虑进行与Ph-like ALL相关的其他融合基因的检测【3】。
临床研究显示此类白血病对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)敏感，可提高患者5年生存率，改善患者预后。临床检测ph-like ALL需要联合流式细胞术、细胞遗传学、FISH(荧光原位杂交)以及分子突变和缺失的检测。通过分层诊治、风险分层，能够确保高危ALL患者获得适当强度化疗、对低危ALL避免不必要的毒副作用。
Philadelphia chromosome(Ph)–like或BCR-ABL1–like ALL是ALL中的高危亚型，涉及激酶或细胞因子受体基因的重排、突变或拷贝数改变。目前，在不同研究中使用多种方法进行Ph-like ALL相关染色体或基因异常检测。例如Roberts K G的一项针对成人的Ph–like ALL研究中采用多种方法进行了检测：Affymetrix U133Plus 2.0microarrays、Taqman low-density array针对性检测P2RY8-CRLF2、BCR-ABL1、ETV6-ABL1、TCF3-PBX1、DUX4/ERG等融合基因；Affymetrix SNP 6.0microarrays或Illumina Infinium Omni2.5检测SNP位点；Illumina HISeq 2000platform进行RNA-seq测定；FISH确定CRLF2重排(IGH-CRLF2或P2RY8-CFRLF2)；PCR和Sanger测序验证JAK1和JAK2的序列突变等。通过Ph-likeALL转录组测序发现，基因重排包括CRLF2(51％)、ABL class fusions(ABL1,ABL2,CSF1R,PDGFRA和PDGFRB；9.8％)、JAK2(7.2％)或EPOR(5.2％)【4】。
目前临床上针对Ph-like ALL的检测方法众多，各方法各有优缺点。例如使用转录组测序列可以检测已知或未知的融合基因，但技术门槛高，成本高，且因肿瘤的复杂性，实际检测出的异常基因远超前于临床认知，结果分析具一定难度。使用RT-PCR结合Sanger测序或Taqman技术或芯片技术只能检测已知融合基因类型，需要进行RNA提取，检测受正常细胞干扰，结果受试剂盒的检测限影响较大。
FISH技术目前主要基于单组(一般为双色)探针进行检测，即单组探针用于单个样本，用户使用时对应单组探针制备单张样本片。使用环节也是由临床进行选择，挑选多组探针实现针对某一病种的检测。这种检测方式上有两个问题：1)组合较随意，不同医院或医师认知差异使检测项目和结果不能做到标准化，不利于诊疗院间标准化推广；2)单组探针对应单个样本片的模式，使得操作起来较麻烦。
常规FISH样本载玻片(用于滴加待检样本的载体)上无样本阻隔区，通常是在载玻片背面进行刻划标记，制片时，样本细胞悬液以刻划线为滴加位点进行制片。因为样本稀释/保存液通常是甲醇和醋酸组成，两者均具一定挥发性，扩散性较好，当用2uL的悬液来制片时，扩散区直径可达1.5cm，形成中间密集、两旁细胞密度低的自然扩散区。因此在杂交过程中为保证杂交效率，对盖玻片规格和/或杂交液体积均有要求。除此之外，在常规FISH中是需要在杂交前进行橡皮胶封片，从而保证杂交过程中杂交环境的相对独立性，避免因湿度影响杂交效果；而封片胶具有刺激性气味，且价格高昂。
总而言之，现有技术用于检测Ph-like ALL相关基因重排时，均具有较大的局限性，例如，技术门槛高，结果分析难度高，结果容易受影响、误差大，只能进行单张玻片、单种类探针的检测，成本过高，操作过程繁琐等。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于检测Ph-like ALL相关基因重排的方法，该方法能在一张玻片上检测多个基因重排靶点，检测成本更低，操作更加便捷，结果误差更小。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针组，所述探针组包括BCR/ABL1融合探针、PDGFRB断裂探针、ABL1断裂探针、CRLF2断裂探针、ABL2断裂探针、JAK2断裂探针、CSF1R断裂探针和EPOR断裂探针，所述探针组分别采用phi29DNA聚合酶进行探针标记。需要说明的是，BCR/ABL1融合探针包括两个基因探针，分别靶向BCR、ABL1基因序列；PDGFRB断裂探针包括两个探针，分别靶向PDGFRB基因断裂点两侧的DNA序列，ABL1断裂探针、CRLF2断裂探针、ABL2断裂探针、JAK2断裂探针、CSF1R断裂探针和EPOR断裂探针可依次类推，均靶向断裂点两侧的DNA序列。由此，采用本发明的探针组可实现ALL患者的分子分型，用于临床进行风险分层、预后判断及治疗选择。
优选地，BCR/ABL1融合探针包括两个基因探针，分别为GSP BCR(绿色)和GSP ABL1(红色)，选择的克隆组分别覆盖两个发生融合的基因(即BCR、ABL1)上；优选地，ABL1断裂探针包括ABL1基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，ABL2断裂探针包括ABL2基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，CSF1R断裂探针包括CSF1R基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，PDGFRB断裂探针包括PDGFRB基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，CRLF2断裂探针包括CRLF2基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，JAK2断裂探针包括JAK2基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端；优选地，EPOR断裂探针包括EPOR基因断裂点两端的克隆，选择的克隆组分别位于断裂点的两端。
优选地，所述探针组进行探针标记时，采用随机六聚体引物进行扩增。本申请的发明人经多次试验发现，相比八聚体引物、十聚体引物，采用随机六聚体引物进行扩增时，扩增效果最好，产率最高。
优选地，所述探针组进行探针标记时，扩增温度为30℃，扩增时间为12小时。
在第二个方面，本发明提供了用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片，所述探针芯片包括固相载体，上述探针组设于所述固相载体上。
优选地，所述固相载体上的探针周围均设有隔离圈。优选2层(双层)隔离，由此，双层间隔能有效隔离细胞和/或杂交缓冲液渗漏，能够有效避免交叉污染；隔离圈可以是圆形、方形或其它封闭的形状，优选内层圆形，外层方形的结构。
优选地，所述隔离圈为至少20μm厚的涂层，所述涂层采用丝印蚀刻方法实现，且所述涂层采用硅烷化进行防脱处理。
在第三个方面，本发明提供了用于检测Ph-like ALL相关基因重排的试剂盒，所述试剂盒包括上述的探针芯片。
优选地，所述试剂盒还包括样本玻片、杂交缓冲液和/或胃蛋白酶。由此，胞质较厚样本，预先采用胃蛋白酶进行消化；或者当样本较脏时，胃蛋白酶消化可以能降低杂交背景。
在第四个方面，本发明提供了上述的探针组、探针芯片、试剂盒在制备费城染色体样急性淋巴细胞白血病患者的诊断剂、分子分型试剂、预后判断辅助试剂或治疗方案选择的辅助试剂中的应用。
优选地，所述试剂盒用于判断基因重排的标准为：当阳性细胞在待测样本中占比高于阈值时，则待测样本为阳性；其中，BCR/ABL1融合探针对应的阈值为7％，PDGFRB断裂探针对应的阈值为2％，ABL1断裂探针对应的阈值为2％，CRLF2断裂探针对应的阈值为3％，ABL2断裂探针对应的阈值为2％，JAK2断裂探针对应的阈值为2％，CSF1R断裂探针对应的阈值为2％，EPOR断裂探针对应的阈值为2％。
综上所述，本发明的有益效果为：
(1)本发明的探针组集合了与Ph-like ALL诊疗相关的基因重排探针，形成商品化试剂，可辅助临床应用与诊断；
(2)在原位杂交检测中，常有多探针同时评估的需求；本发明通过固相载体，预固定探针后，可以实现一张玻片多检测靶点的目标；
(3)相对单探针检测系统，本发明的试剂盒用于检测Ph-like ALL相关基因重排的检测成本更低，操作更加便捷；
(4)本发明利用原位杂交技术，选择临床有意义的基因，结合常规病理和血液诊断的特点，制片后，可以在细胞核中直接观测相关基因的重排，辅助现有方法进行Ph-likeALL的准确分层、精准诊断、治疗；
(5)本发明选择了与Ph-like ALL相关的探针进行组合，一是实现了典型特征(BCR/ABL1)的检测，二是可用于激酶靶向用药参考，如ABL1、ABL2、CSF1R、PDGFRB可使用酪氨酸激酶抑制剂(如Dasatinib)，CRLF2、JAK2和EPOR使用JAK2抑制剂治疗。检测组合和标准更加明确。
(6)本发明中将Ph-like ALL相关8组探针集合到一张探针芯片上，利用芯片高通量的特征，但检测步骤上与常规FISH操作一致性高，临床易接受；探针组与玻片通过理化工艺偶联，形成固体载体芯片系统，该系统结合1管通用杂交缓冲液形成Ph-like ALL探针芯片，替代了常规的8管探针/基因杂交液，使用更清晰(出错几率显著降低)、便捷，有效节约人力、物力；
(7)本发明中在探针片和/或样本片区域设定疏水隔离带，仿照堤坝原理，通过摸索隔离带高度，达到既能有效物理阻隔样本渗出、杂交液渗出/互渗，又不影响杂交效果；使用疏水隔离带来的另一个好处是有效隔离了杂交过程中水汽的渗入，省去封片步骤；
(8)常规FISH使用切口平移法将包含dUTP修饰物掺入到核酸序列中，或者通过直接合成包含标记物的短核酸片段，用于FISH检测；
本发明中创造性地将phi29DNA聚合酶用于探针标记，通过对反应条件进行摸索，确定了标记流程和质控方法，与现有的切口平移法制备探针进行比较，使用效果优于对照。
附图说明
图1为本发明中间隔圈仅含圈线时的载体芯片的结构示意图，其中，箭头指示杂交液的流动方向；
图2为本发明中载体芯片上的隔离区的结构示意图；
图3为现有的FISH技术与本发明的芯片系统(即本发明的探针芯片)的检测流程比较图；
图4是探针芯片的结构示意图；
图5是样本玻片的结构示意图；
图6是本发明的探针芯片和样本杂交时的剖面结构示意图，其中，1、加样区，2、孔圈，3、载玻片。
具体实施方式
本发明提供的Ph-like ALL探针芯片包含8组探针，如下表1所示。8组探针(双色)通过特定工艺预先包埋或连接在固相载体(例如病理常用玻璃载玻片)，形成多基因探针并行检测的固相载体芯片系统；通过检测这8组探针的异常，可以辅助肿瘤分层诊治和风险分层。本申请中集合了Ph-like ALL中激酶融合相关的基因异常，既可以用于辅助诊断，也可以辅助医师进行Ph-like ALL患者的靶向用药。
表1 8组探针
对表1的8组探针的检测靶标介绍如下：
BCR/ABL1(DF)融合探针用于检测费城染色体，这一指标也是Ph+ALL的典型特征，一般在儿童ALL中出现频率约3％～5％，随年龄增长比例逐渐升高。TKIs针对性治疗能够显著改善疗效，约95％患者能够达到完全缓解，3年生存率可达55％【5】。
此外，本发明的探针组中还包含了具有激酶活化的基因突变检测探针，如ABL1、ABL2、CSF1R、PDGFRB、CRLF2、JAK2和EPOR。这些基因断裂重排可能会引起细胞因子受体和/或酪氨酸激酶信号的激活，激活下游磷酸化，影响信号通路造成细胞增殖、分化。其中ABL1、ABL2、CSF1R、PDGFRB可使用酪氨酸激酶抑制剂(如Dasatinib)，CRLF2、JAK2和EPOR使用JAK2抑制剂治疗。
Ph-like或BCR/ABL1-like ALL是ALL中的高危亚型，涉及激酶或细胞因子受体基因的重排、突变或拷贝数改变。目前检测方法较多，各有优缺点。Ph-likeALL转录组测序发现，基因重排包括CRLF2(51％)、ABL class fusions(ABL1，ABL2，CSF1R，PDGFRA和PDGFRB；9.8％)、JAK2(7.2％)或EPOR(5.2％)【4】。从异常类型看，主要涉及某一明确基因的断裂重排，但因伙伴基因众多，具体融合类型据检测方法的差异存在较大变动。
如下表2所示，ABL1重排伙伴基因包括ETV6、NUP214、RCSD1、SNX2、SFPQ等，ABL2重排伙伴基因包括PAG1、RCSD1、ZC3HAV1，CSF1R重排伙伴基因包括MEF2D，JAK2重排伙伴基因包括ATF1IP、BCR、ETV6、PAX5、PPFIBP1、SMU2等。
表2在费城染色体样急性淋巴细胞白血病中已鉴定的激酶基因融合
涉及基因重排检测的技术包括转录组二代测序、PCR-Sanger测序、RT-PCR、Taqman探针法、FISH等。除FISH外的技术均需提取样本核酸，利用序列特异性引物进行目标序列的检测。从上表2中可知，激酶基因重排涉及的伙伴基因众多，如果利用PCR方法进行检测，一是只能检测目前已经报道的已知型别，二是设计难度较大。而FISH方法在临床上已经用于大片段重排、缺失、扩增等异常检测，只需明确重排基因，通过断裂探针的设计，在基因断裂点两端分别设计红色和绿色信号。检测过程中，当基因完整未发生重排时，镜下便可以看到融合或红绿邻近信号；当重排发生时，便可直观检测到红、绿分离信号。而当复杂易位发生时，例如可能的多伙伴基因，或多次断裂，或是缺失后重排，也能从信号类型上进行直观分析。因此，选择FISH技术应用于基因重排检测，设计简单、检测直观，结合细胞形态学，具其他方法不可比拟的优势。
Ph-like ALL中的基因改变分为主要亚型(即包括ABL1相关的重排，涉及ABL1,ABL2,CSF1R和PDGFRB)和激活JAK/STAT通路的CRLF2,JAK2,andEPOR重排。此外，还包括BLNK,DGKH,FGFR1,IL2RB,LYN,NTRK3,PDGFRA,PTK2B,TYK2和RAS信号通路突变(NRAS、KRAS、PTPN11等)【6、7】。
因Ph-like ALL的高度异质性，激酶融合/突变活化导致信号通路激活，导致对标准化疗的耐药性。近年来随着研究深入及相应遗传表型的明确，重点逐步放在靶向治疗对预后的改进上。与BCR/ABL1阳性的细胞相似，包含ABL1,ABL2,CSF1R或PDGFRB重排的患者对ABL类抑制剂Imatinib或Dastinib敏感，而JAK激酶抑制剂对于JAK/STAT通路激活的Ph-like ALL有效。
本发明选择针对Ph检测的BCR/ABL1和靶向治疗相关的基因ABL1、ABL2、CSF1R、PDGFRB、CRLF2、JAK2和EPOR作为检测靶标，用以Ph-like ALL相关基因异常的检测，可以辅助临床诊断及用药评估。
在一些实施例中，本发明的探针组包含8组双色探针，制备过程包括：
BAC克隆选择→购买(商品化)→标记、测试→确认探针克隆组(可用于后续生产)。其中，采用了新的探针标记方法；同时，使用三种方法(①商品化试剂盒、②phi29DNA聚合酶、③常规切口平移方法)进行探针标记，方便后续进行使用效果评估时，评价phi29DNA聚合酶的使用效果，结果表明新的标记方法(phi29DNA聚合酶)使用效果优于对照组①和③。另外，实验表明探针的点样量、长度都会影响杂交效果。
杂交检测过程中发现探针点样量30～50ng/孔，探针长度在100～500bp时制备的探针芯片都得到了较好的信噪比，即信号亮度2+(中等亮度)，荧光背景1+(弱背景)。
以三种方法(下表3)制备的不同长度探针进行芯片制备，与4例随机样本进行杂交检测，结果表现出探针长度在100～500bp时制备的探针芯片都得到了较好的信噪比，即信号亮度2+(中等亮度)，荧光背景1+(弱背景)。当探针长度达到800bp时，会出现较高背景，表现为核内非特异吸附杂质或杂交信号，核外背景高。因此，选择质控小于500bp弥散带的探针进行后续杂交检测。
表3探针长度
使用10ng～60ng的ABL1断裂探针进行芯片制备(参见表4)，以人外周血培养细胞为样本进行检测，分析杂交后探针亮度和背景情况。结果发现，对于GSP ABL1-红色探针来说，20ng～50ng可得到较好的检测结果，即中等亮度，弱背景；对于GSP ABL1-绿色探针来说，30ng～50ng可得到较好的检测结果，即中等亮度，弱背景。随着探针用量的增加，背景也会升高，表现为核内和/或核外背景加深，部分区出现荧光吸附(杂质)。
综上，选择探针点样量选择30～50ng/孔。
表4探针用量
其中，R示红色探针；G示绿色探针。
鉴于探针检测时，样本可能存在的差异，在确认探针用量后，选择不同样本进行检测效果评估。样本均为骨髓样本。检测结果(参见表5)发现，样本检测中，绿色信号对于一些胞质较厚或低渗状态不足的样本受探针用量影响较明显，如骨髓样本2在50ng后表现较稳定的信号亮度。红色信号则干扰较少，在4例样本中30ng～60ng均表现出稳定的杂交信号。与预期一致的是，当探针用量增加时，会增加核内和/或核外背景，部分区干扰信号判读。
因此，选择50ng作为红/绿探针的点样量，制备芯片，并用于样本检测评估。
表5
*信号亮度2+(中等亮度)，1+(信号弱)；荧光背景1+(弱背景)，2+(强背景，可能干扰信号判读)。R示红色探针；G示绿色探针。
在一些实施例中，制备探针的载体—玻片时，对玻片上的物理隔离区进行了特别考量：
①仅含圈线的间隔圈。如图1所示，使用时发现孔圈外有逃逸细胞，且滴加杂交缓冲液进行杂交时，杂交液间有交融汇合的可能性，即存在随机交叉污染的可能。使用相邻分别为男性(46，XY)和女性(46，XX)的样本制片，以XY探针为杂交探针进行检验，证明了上述推断。
②包含圈线方线的双层间隔区。如图2所示，针对仅含圈线间隔阻隔度不足的问题，设计第二层圈或线结构。也使用相邻分别为男性(46，XY)和女性(46，XX)的样本制片，以XY探针为杂交探针进行多次重复杂交检验。结果表明双层间隔有效隔离细胞和/或杂交缓冲液渗漏，能够有效避免交叉污染。同样的，设计其他形状，如多边形、圈线等也具有同样的作用。采用图2的结构其优点在于：一限定区域，二隔离水汽，三多探针通量增加。
在一些实施例中，芯片载体联结探针涉及如下步骤：
(1)探针芯片制备
质控合格的探针使用50ng/孔进行点样；
探针点样固定→加热恒温干燥→真空包装/待用。完成后45℃烘干，放入包装盒，真空保存。
(2)处理流程
点样后的探针片为一次性使用，有两种使用场景：
场景A.适用于不需消化的核胞质较少的细胞类型，如骨髓样本。
探针片取出，平衡至RT→滴加样本悬液至孔圈区，干燥→过预处理液(如，SSC等)→梯度乙醇脱水→滴加杂交缓冲液→37度或42度或45度杂交1～2小时→杂交后洗涤→梯度乙醇脱水→DAPI复染，观察。
场景B.适用于核胞质较多，或者细胞陈旧，细胞悬液中有杂质的细胞类型。
该方法处理的杂交背景更低，信号更优。
取出样本片(制备同探针片)→滴加样本悬液至孔圈区，干燥→过预处理液(如，SSC等)→梯度乙醇脱水→探针片取出，平衡至RT→滴加杂交缓冲液至探针片→将样本片与探针片对合→37度或42度或45度杂交1～2小时→杂交后保留样本片，进行洗涤→梯度乙醇脱水→DAPI复染，观察。
上述两种使用场景中的预处理、洗涤及复染均与常规FISH操作一致。差异点体现在常规FISH单张玻片只处理单一样本和/或单一探针，而利用芯片的高通量性，在此案中实现多个样本和/或多组探针的联合检测。由此，本发明的探针芯片具有两个优点，一是载体处理流程与常规FISH一致，但更简便；二是多探针集结，操作更标准。
在一些实施例中，本发明的用于检测Ph-like ALL相关基因重排的试剂盒包括两种设置：
设置1：探针片+杂交缓冲液(对应上述场景A)
设置2：样本片+探针片+杂交缓冲液(对应上述场景B)
探针芯片质控及阈值建立包括如下步骤：
人外周血培养细胞用于灵敏度和特异性评估(常规方法)→建立阈值。
骨髓样本用于使用效果评估(基质样本来源于临床)。
在一些实施例中，对本发明的探针和试剂盒的临床应用进行了相应的评估，发现：(1)与市售探针的比较
因市场上无本发明的探针芯片产品销售，购买单个探针，对比使用效果。
区别在于，市场上单个探针产品进行过夜(10～16小时)杂交，本发明的探针芯片仅需1小时就能快速完成杂交。
(2)临床应用评价
选择20例左右样本进行该试剂的应用评估。使用建立的阈值进行结果判读。
(3)自动阅片操作便利性评价
随机选择两张样本片进行自动阅片，定位样本区的玻片更容易进行结果自动扫描。而手工刻划玻片需要手动定位，设定扫描范围后才能进行结果记录，且不同探针组和不同样本均需在扫描完成后重复换片、定义区间的操作。
因此，使用本发明的探针芯片有利于临床判读实现标准化和无人值守扫描。具有简便，高效，可进行自动化阅片的优点。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本申请中试剂或材料均可以从市场或其它公开渠道获得。
实施例1探针芯片的制备
(1)本实施例的探针组包括8组双色探针，设计过程包括：
BAC克隆筛选→标记、测试→确认克隆组(可用于后续生产)。
BAC克隆筛选方法参照《医学遗传学数据库资源利用实例教程》赵佳等p26-28。BAC克隆选择参见表6：
表6 BAC克隆的一种组合
(2)探针标记：
以BAC克隆为基础模板，使用phi29DNA聚合酶，利用随机六聚体引物，常温下扩增。基因探针的标记利用phi29DNA聚合酶进行常温标记。phi29DNA聚合酶是从噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，具有3'→5'外切酶校读能力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性；65℃10分钟左右失活。因其等温扩增的特点，操作上更加便利。标记中使用短的随机六聚体引物进行扩增，扩增温度30℃，标记时间12小时。
使用下述表中参数进行ABL1断裂探针和BCR/ABL1融合探针的标记测试，测试结果参见表7，标记实测温度范围约16±2℃、18±5℃、25±5℃和30℃。低于20℃时，无论2小时标记或过夜(12小时)标记效果均不理想，表现为信号弱(1+)，不满足镜下判读要求(结果未展示)。室温标记时会受温度波动影响，标记效率也会受影响，表现出ABL1断裂探针与BCR/ABL1融合探针的杂交信号亮度的差异。使用30℃的恒温条件进行标记时，两种探针的结果稳定，均达到预期效果；标记时间的差异在背景上有差异，长时标记的背景略高于短时标记，但同时信号亮度又优于短时标记，分析此现象与标记分子的掺入效率相关。
综上，选择扩增温度30℃，标记时间12小时制备探针。
表7 phi29DNA聚合酶标记温度/时间测试对比
随机六聚体引物含有6个碱基的随机序列。5`末端带有磷酸基，3`末端为羟基。序列为5`-P-d(NNNNNN)-3`，N＝G\A\C\T。随机引物的组合形式多，因此，特异性较低，但对于长的或带有二级结构区域模板扩增效果较好。
探针标记中，因选择的克隆模板除载体序列(载体序列为非人基因组)外，余序列为靶区域特异互补区段。标记过程需在扩增中合成带荧光标记序列。为提高扩增效率，分别使用了随机六聚体引物、随机八聚体引物、随机十聚体引物进行测试(表8)，以ABL1断裂(包括红色和绿色两色)克隆质粒作为扩增模板，扩增后通过对产物定量确定扩增得率。结果显示随机六聚体引物的扩增效果最佳，产率最高，相比随机六聚体引物、随机八聚体引物，随机六聚体引物扩增所得探针产量至少提高了95％和100％。
表8不同引物扩增产率比较
(3)探针质控与点样：
包括探针定量、电泳确定条带范围。满足要求的探针可用于后续的探针芯片制备。
探针点样：固相载体探针吸附区点样制备好的探针工作液。
探针定量，用磷酸盐缓冲液稀释至20ng～60ng/uL，根据孔径大小取1uL点样于芯片载体。室温(湿度低于65％)自然干燥或低于56度烘干。
(4)探针芯片制备
探针标记(使用商品化试剂盒或常规切口平移方法等)→质控(#探针的点样量、长度都会影响杂交效果)→点样固定→干燥→真空包装/待用。
具体步骤如下：
1)探针标记。
探针标记不局限于本发明中提及的方法(以BAC克隆为基础模板，使用phi29DNA聚合酶，利用随机六聚体引物，常温下扩增，以下简称为PD标记)。使用商品化试剂盒或切口平移方法制备的探针均可用于芯片制备。标记目的是将信号分子掺入到短片段中，在检测过程中，通过荧光激发，得到镜下可被观察到的信号。标记方法各种各样，本发明中探针芯片上的点样探针不局限于本案中提到的标记方法，其他荧光标记探针也可用于探针芯片的制备。
2)探针质控。
质控包括片段长度和定量，比较了不同标记方法的适用性。
使用不同方法得到的探针长度会存在差异。切口平移方法得到的片段在500bp以下混合物；PCR标记探针长度略短，集中在100～300bp；人工合成带标记核酸片段一般小于100bp；本案中提及的phi29DNA聚合酶标记产物长度200bp左右。
以JAK2断裂探针克隆作为标记对象，使用不同方法进行标记，比较标记差异。质粒用量1ug；JAK2断裂探针为双色探针，断裂位点两端分别标记为红色和绿色，使用60ng探针配制双色杂交液，以人外周血培养细胞验证标记效果。结果如下表9所示。
表9标记方法效果比较
*以BAC克隆为基础模板，使用phi29DNA聚合酶，利用随机六聚体引物，常温下扩增，以下简称为PD标记。
phi29DNA聚合酶用量优化：
配制溶液I，将质粒DNA、NNNNNN引物、dNTPs和荧光素dUTP混合，水补足10μL，95℃3min，然后迅速转移至冰上。溶液I中各成分用量如下所示：
然后依次加入10×Reaction bμffer 2μL、phi29DNA聚合酶(10U/μL)2～7μL、Tween20 1μL、H2O补足20μL。按照下述反应体系(参见表10)设置。
表10 phi29DNA聚合酶用量
配完后混匀，30℃标记16小时，65℃10分钟灭活酶。取20μL标记产物加入1.5mL离心管，然后依次加入3mol/L醋酸钠2μl和无水乙醇50μl，混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，去上清；加入500μl的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，去上清，避光干燥。使用100μL纯化水溶解沉淀。将溶解后的产物置于Covaris M220超声波DNA破碎仪，20℃处理40秒。完成DNA片段化后，取出产物，按照1:1.8比例使用Ampure XP纯化磁珠纯化产物，最后溶于20μL纯化水中。取1μl使用2％琼脂糖凝胶电泳，要求在200bp左右存在弥散带。
分析结果发现，phi29DNA聚合酶(10U/μL)4.0～6.0μL时，信噪比最优。
参见表9，杂交检测过程中发现100～500bp探针用于制备探针芯片都得到了较好的信噪比(即，信号亮度2+/中等亮度，荧光背景1+/弱背景，依此类推)，但是PD标记法的信号强度显著高于切口平移法和PCR标记法。
需要注意的是不同标记体系中，酶量的差异、克隆质粒的用量或标记的条件选择都会影响探针的实际效果。本发明为比较Phi29聚合酶的标记效果，列举的条件保持一致(质粒用量)，但不局限于列举方法。
(5)点样固定
A.载体准备
载体是外购物料，厂家按照设定图纸(参见图2)进行制作。质控合格的探针使用50ng/孔进行点样(圆形孔圈内)；完成后45℃烘干，放入包装盒，真空保存。
根据探针组成，设计丝印模板(丝印蚀刻的技术使定制更加灵活)，包括确定涂层位置、涂层厚度、孔圈直径信息；
选择8组探针，在相应载体上预印刷8个孔圈结构(如图4)(8孔/3mm直径/20μm厚涂层)，使用硅烷化进行防脱处理，然后在载玻片的表面需要疏水涂层的区域涂覆一层具有超疏水性质的涂层，采用印刷或真空电镀的方法涂覆此涂层；涂覆疏水涂层后，运用真空溅射的方法对需要亲水的区域进行亲水涂层处理，即完成探针芯片制备前准备工作。
使用十字星标线进行定位印刷，从而匹配探针芯片与样本玻片(参见图5)。
样本玻片的制备工艺与探针芯片相似，但不需点样探针，进行防脱处理后，待用。
需要说明的是，采用结构近似的载体或者依实施例相近的方法制备的载体可能会达到同样的检测效果，因此也落在本发明的保护范围内。
B.探针准备
以Ph-like ALL探针芯片为例，8组探针均为双色探针，具体设计参见上述第(1)点。8组探针的特点分别介绍如下：
1、BCR/ABL1融合探针
探针包括两个基因探针，分别为GSP BCR(绿色)和GSP ABL1(红色)，探针检测靶区长度分别为455Kbp(覆盖区域chr22:23,024,150-23,479,450)和565Kbp(覆盖区域chr9:130,529,919-131,095,046)。选择的克隆组分别覆盖两个发生融合的基因上，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
2、ABL1断裂探针
探针包括ABL1基因(chr9:130,713,946-130,885,683)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP ABL1-G和GSP ABL1-R，探针检测靶区长度分别为378Kbp(覆盖区域chr9:130,460,368-130,838,759)和473Kbp(覆盖区域chr9:130,985,503-131,458,941)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
3、ABL2断裂探针
探针包括ABL2基因(chr1:179,099,327-179,229,601)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP ABL2-G和GSP ABL2-R，探针检测靶区长度分别为283Kbp(覆盖区域chr1:178,820,672-179,103,813)和334Kbp(覆盖区域chr1:179,143,100-179,476,872)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
4、CSF1R断裂探针
探针包括CSF1R基因(chr5:150,053,291-150,113,372)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP CSF1R-G和GSP CSF1R-R，探针检测靶区长度分别为375Kbp(覆盖区域chr5:149,666,187-150,041,539)和313Kbp(覆盖区域chr5:150,088,371-150,401,700)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
5、PDGFRB断裂探针
探针包括PDGFRB基因(chr5:150,113,837-150,155,860)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP PDGFRB-G和GSP PDGFRB-R，探针检测靶区长度分别为260Kbp(覆盖区域chr5:149,781,463-150,041,539)和390Kbp(覆盖区域chr5:150,088,371-150,478,108)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
6、CRLF2断裂探针
探针包括CRLF2基因(chrX:1,190,492-1,212,723)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP CRLF2-G和GSP CRLF2-R，探针检测靶区长度分别为242Kbp(覆盖区域chrX:902,598-1,145,148)和196Kbp(覆盖区域chrX:1,216,917-1,413,377)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
7、JAK2断裂探针
探针包括JAK2基因(chrX:1,190,492-1,212,723)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP JAK2-G和GSP JAK2-R，探针检测靶区长度分别为464Kbp(覆盖区域chr9:4,503,047-4,966,878)和289Kbp(覆盖区域chr9:5,148,028-5,437,265)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
8、EPOR断裂探针
探针包括EPOR基因(chr19:11,377,205-11,384,312)断裂点两端的克隆，分别标记为GSP EPOR-G和GSP EPOR-R，探针检测靶区长度分别为317Kbp(覆盖区域chr19:11,063,460-11,380,543)和340Kbp(覆盖区域chr19:11,444,168-11,784,625)。选择的克隆组分别位于断裂点的两端，经过验证能够满足检测要求，可以区分出样本的阴、阳性。
需要说明的是，区段近似的克隆替换可能会达到同样的检测效果；区段延长后制备的探针可能会增强探针亮度，但随着覆盖靶区的增加，涉及的基因有所增加，可能会造成检测结果的不确定性，需要实际验证检测效果进行评判。验证可以使用人外周血培养细胞进行位点特异性验证，使用明确阴、阳性的样本(PCR方法或商品化FISH探针或可用于基因异常检测的其他方法学试剂进行对照检测)进行准确性判断。
(6)探针芯片的使用
质控合格的探针使用50ng/孔进行点样；完成后45度烘干，放入包装盒，真空保存。
探针芯片使用方法：
6.1取出探针芯片和样本片，平衡至室温；
6.2将处理好的细胞悬液(如骨髓样本)按2μL/孔滴加到样本玻片孔圈(如图6所示)内，室温自然干燥；
6.3室温2×SSC溶液中浸泡2分钟；如果是胞质较厚样本，则在此步骤增加胃蛋白酶消化步骤；或者当样本较脏时，胃酶消化也能降低杂交背景。
6.4依次在室温70％、90％、100％的乙醇中浸泡2分钟脱水；
6.5室温晾干；
6.6滴加预热2uL芯片杂交缓冲液至探针片孔圈，样本玻片与探针芯片对合。
6.7 90±1℃变性3分钟，45±1℃2小时杂交。
6.8杂交结束后，取出片子，72±1℃洗液I 5分钟，室温(25±5℃)洗液II2分钟；
6.9放入70％、90％、100％乙醇中各2分钟脱水；
6.10取出，自然干燥。滴加原位杂交蓝染染色液或者DAPI复染剂至样本玻片；
6.11待观察。
(7)探针芯片检测结果判读：
7.1、探针芯片质控及阈值建立
为了检测本实施例的8组探针的阈值，采用人外周血培养细胞用于8组探针的灵敏度和特异性评估；并采用骨髓样本对8组探针的使用效果评估(基质样本来源于临床)。具体的处理步骤如下：
1)制片
取骨髓2～3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5分钟，去大部分上清；
取1ml细胞加入10ml的0.075M KCl,吹打混匀，静置2分钟；
37±1℃恒温水浴锅低渗20分钟；
加卡诺氏固定液1ml，吹打混匀，室温预固定10分钟；
吹打混匀，2000rpm离心5分钟；
去上清，沉淀加固定液10ml，吹打混匀，-20℃静置30分钟；
2000rpm离心5分钟，去上清；
加入适量固定液重悬细胞，取3μl悬液滴加到干净的样本片孔圈内；
2)预处理/变性杂交
将滴好的玻片置于室温2×SSC溶液中浸泡2分钟；
依次在室温70％、90％、100％的乙醇中浸泡2分钟脱水；然后取出玻片，室温晾干；
处理好的样本片待用。
取出探针片，平衡至室温；
杂交液滴至探针区，然后将样本片反转，对齐后轻合。轻压使探针均匀分布，避免产生气泡；
湿润原位杂交仪湿度条，将玻片置于原位杂交仪上，关闭原位杂交仪盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性78±1℃2分钟，杂交37±1℃1～16小时(若无杂交仪，可使用替代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持杂交湿度)。
3)洗涤复染
关闭杂交仪电源，取出玻片，轻轻分离样本片和探针片(探针片为一次性使用)；
样本片放入72±1℃0.3％NP-40/SSC中2分钟；
取出，将其放入室温0.1％NP-40/2×SSC中30秒；
取出，再将其放入室温70％、90％、100％乙醇中各2分钟脱水；
取出，暗处自然干燥玻片；
室温，滴加10μlDAPI复染剂，暗处存放，待观察。
本实施例的8组探针的检测结果与表11所示的理论结果一致，表明本实施例制备的8组探针的特异性100％，灵敏度100％，能够满足检测预期。本实施例制备的8组探针在骨髓样本的检测中，检测信号明亮，易于辨认。
表11探针检测理论结果
中期染色体 骨髓样本
BCR/ABL1融合探针 2F,50/50 2F,50/50
ABL1断裂探针 2R2G 2R2G
ABL2断裂探针 2R2G 2R2G
CSF1R断裂探针 2R2G 2R2G
PDGFRB断裂探针 2R2G 2R2G
CRLF2断裂探针 2R2G 2R2G
JAK2断裂探针 2R2G 2R2G
EPOR断裂探针 2R2G 2R2G
*R示红色信号；G示绿色信号。
计数100个人外周血培养细胞，分别计算典型异常和正常细胞比例，计算异常细胞平均值，计算标准差，以平均值±3SD作为8组探针的检测阈值。结果参见表12，检测结果大于阈值时可判断为阳性，在阈值附近时可以通过增加计数细胞或第三人计数的方式提高检测准确性。若增加计数仍在阈值附近，需在报告中进行提示，使用其他方法学进行验证，综合分析。
表12检测结果判读阈值
实施例2实施例1的探针芯片与市售单探针的比较
因市场上无此探针芯片产品销售，购买单个探针对比使用效果。从市场上购买商品化的单探针杂交液：BCR/ABL、CRLF2、PDGFRB、ABL1、ABL2、JAK2、EPOR及CSF1R。同时制备包含这8组探针的探针芯片，以双结构探针/样本芯片为制片方式，比较两种结构使用便利性、结果一致性。结果显示，区别在于，市场上单个探针产品进行过夜(10～16小时)杂交，探针芯片为1小时快速杂交，探针杂交结果的判读标准参见表13。
表13探针杂交结果判读
以人外周血培养细胞和骨髓样本为检测对象，使用外购单探针和探针芯片系统同时进行检测，评估荧光信号亮度、背景噪声、杂交效率，结果参见表14。检测结束后从使用便捷性、成本、信号强度、背景等方面进行综合评价，结果参见表15。探针芯片在更短的杂交(操作)时间内实现了中等强度(2+)信号，杂交效率两者都达到100％。常规单探针中CRLF2杂交背景高，但不影响信号判读。
表14探针检测结果统计
表15本发明的探针芯片综合性能评价
参见表15以及图3，当检测1例样本时，需要准备n组检测探针，将现有的FISH检测技术与本发明的芯片检测系统(即本发明的探针芯片)比较可知，本发明将检测次数从n简化为1，试剂的用量更少，更易实现自动化阅片。由此，本发明的双结构探针/样本芯片操作更便捷，使用成本更低。利于后续自动化阅片分析扫描的要求，能极大节约人力，且检测信号亮度与常规FISH相似。
实施例3临床应用评价
收集20例ALL样本进行本发明的探针芯片的应用评估。使用实施例1建立的阈值(参见表12)进行结果判读。
具体的实验步骤如下：
1)制片
取骨髓2～3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5分钟，去大部分上清；
取1ml细胞加入10ml的0.075M KCl,吹打混匀，静置2分钟；
37±1℃恒温水浴锅低渗20分钟；
加卡诺氏固定液1ml，吹打混匀，室温预固定10分钟；
吹打混匀，2000rpm离心5分钟；
去上清，沉淀加固定液10ml，吹打混匀，-20℃静置30分钟；
2000rpm离心5分钟，去上清；
加入适量固定液重悬细胞，取3μl悬液滴加到干净的样本片孔圈内；
2)预处理/变性杂交
将滴好的玻片置于室温2×SSC溶液中浸泡2分钟；
依次在室温70％、90％、100％的乙醇中浸泡2分钟脱水；然后取出玻片，室温晾干；
处理好的样本片待用。
取出探针片，平衡至室温；
杂交液滴至探针区，然后将样本片反转，对齐后轻合。轻压使探针均匀分布，避免产生气泡；
湿润原位杂交仪湿度条，将玻片置于原位杂交仪上，关闭原位杂交仪盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性78±1℃2分钟，杂交37±1℃1～16小时(若无杂交仪，可使用替代仪器，如恒温热台进行变性，电热烘箱/或水浴锅进行杂交，需注意温度准确及保持杂交湿度)。
3)洗涤复染
关闭杂交仪电源，取出玻片，轻轻分离样本片和探针片(探针片为一次性使用)；
样本片放入72±1℃0.3％NP-40/SSC中2分钟；
取出，将其放入室温0.1％NP-40/2×SSC中30秒；
取出，再将其放入室温70％、90％、100％乙醇中各2分钟脱水；
取出，暗处自然干燥样本(玻)片；
室温，滴加10μlDAPI复染剂，暗处存放，待观察。
4)结果观察
采用荧光显微镜，适合DAPI(367/452)、Green(496/520)及Orange(552/576)观察的滤块，观察样本片。信号判读结果参见表16。
表16探针杂交后的信号判读
Ph-like ALL的特点是Ph染色体(BCR/ABL1)阴性，但基因表达谱与Ph阳性ALL类似，且与不良预后相关。本实施例检测结果参见表16，检测出1例CRLF2重排阳性伴JAK2重排，2例JAK2重排，未检测出其他易位类型，阳性率15％。CRLF2基因位于Xp22.3/Yp11.3，编码蛋白形成异源二聚体活化启动JAK-STAT信号通路，参与调控细胞的发育和增殖。有研究表明[8]29.5％的Ph-like ALL在存在CRLF2重排，但并非该亚型特有。CRLF2重排有时伴JAK2重排同时发生，提示两基因在JAK-STAT通路中的协同作用。
本实施例的数据提示本发明的探针芯片可以用于患儿基因异常筛选。目前国外已经逐步在开展Ph-like ALL筛查及研究，同时发现酪氨酸激酶能够抑制这些畸变的发生，应用于临床将有助于改善临床预后。且随着诊断方法的逐步使用，能够进一步探索Ph-likeALL临床相关特征，帮助临床进行更精确的治疗方案，提高患者生存率。
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最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针组，其特征在于，所述探针组包括BCR/ABL1融合探针、PDGFRB断裂探针、ABL1断裂探针、CRLF2断裂探针、ABL2断裂探针、JAK2断裂探针、CSF1R断裂探针和EPOR断裂探针，所述探针组分别采用phi29 DNA聚合酶进行探针标记。
2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组进行探针标记时，采用随机六聚体引物进行扩增。
3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述探针组进行探针标记时，扩增温度为30℃，扩增时间为12小时。
4.用于检测Ph-like ALL相关基因重排的探针芯片，其特征在于，所述探针芯片包括固相载体，权利要求1～3任一项所述的探针组设于所述固相载体上。
5.根据权利要求4所述的探针芯片，其特征在于，所述固相载体上的探针周围均设有隔离圈。
6.根据权利要求5所述的探针芯片，其特征在于，所述隔离圈为至少20μm厚的涂层，所述涂层采用丝印蚀刻方法实现，且所述涂层采用硅烷化进行防脱处理。
7.用于检测Ph-like ALL相关基因重排的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4～6任一项所述的探针芯片。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本玻片、杂交缓冲液和/或胃蛋白酶。
9.权利要求1～3任一项的探针组、权利要求4～6任一项的探针芯片、权利要求7或8所述的试剂盒在制备费城染色体样急性淋巴细胞白血病患者的诊断剂、分子分型试剂、预后判断辅助试剂或治疗方案选择的辅助试剂中的应用。
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