CN108315431A - 数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法 - Google Patents

数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测c‑MET基因扩增的方法。该检测方法首先针对c‑MET基因设计合成用于检测c‑MET基因扩增的上下游引物、c‑MET基因扩增的检测探针，然后设计数字PCR检测参数，通过数字PCR技术判断待测样品中是否含有c‑MET基因扩增。本发明设计的引物和探针特异性强，应用于数字PCR检测非肿瘤组织中c‑MET基因扩增准确度高、灵敏度可达0.01％；且本发明设计合成的引物扩增片段长度不到100bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，从cfDNA中检测到极低丰度的c‑MET扩增变异，从而在肿瘤早期从患者血循环中检测出肿瘤DNA，并且克服了侵入性取样检测存在风险的技术问题，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

Description

数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法。
背景技术
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，尽管手术和化疗技术不点提高，但患者的预后仍较差，5年存活率小于20％。目前，以人表皮生长因子受体(epithelium growth factor receptor,EGFR)为靶点的分子靶向治疗已成为治疗NSCLC最重要的方式。目前临床上使用的针对EGFR的靶向药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，EGFR-TKI通过抑制EGFR自身磷酸化而阻断EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖分化，实现靶向治疗。
c-MET原癌基因存在于人类7号染色体的长臂，蛋白产物是c-MET酪氨酸激酶受体，c-MET基因在胚胎期和成人期均有表达。C-MET的配体是肝细胞生长因子(HGF)，是由间质细胞分泌，HGF和c-MET的结合能够促进细胞的增殖、迁移、分化和形态改变。HGF/c-MET信号通路受到复杂的、高度的调节，在细胞增殖、分化和运动扮演重要作用。研究显示MET基因扩增能激活ErbB3/PI3K/AKT信号途径，引发对EGFR激酶抑制剂的耐药，c-MET基因高表达则预后不佳。c-MET基因扩增导致的EGFR-TKI耐药约占全部EGFR-TKI耐药的9.8-20.0％。因此，c-MET基因扩增检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，对指导临床开展NSCLC的个体化靶向治疗具有重要意义。
目前临床实验室主要采用荧光原位杂交(FISH)和荧光定量PCR技术来检测手术切除标本c-MET扩增状态。利用FISH技术从基因水平上进行检测是c-MET阳性检测的“金标准”。通过计算c-MET基因探针与7号染色体着丝粒(CEP7)探针杂交信号之比来判断c-MET基因是否有扩增，将检测结果小于1.8定义为c-MET阴性，检测结果大于2.2定为阳性，而检测结果为1.8-2.2之间的则无法准确界定，为疑似阳性。然而，FISH检测c-MET基因扩增的错误率较高。荧光定量PCR虽然具有重复性好、特异性强等优点，但由于其依赖于标准曲线和Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。
血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便、无创、可重复检测。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极低，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、ARMS-PCR)，仍难以准确、可靠地检测出肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织、高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关基因突变的方法。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的是针对利用荧光原位杂交、荧光定量PCR技术检测患者非肿瘤组织中c-MET基因扩增的灵敏度低、准确度低的缺陷，提出一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的方法。该方法以数字PCR为检测平台，针对c-MET基因设计合成用于检测c-MET基因扩增的上下游引物、c-MET基因扩增的检测探针，通过数字PCR技术判断待测样品中是否含有c-MET基因扩增。该方法用于检测非肿瘤组织中c-MET基因扩增灵敏度高、准确度高，能够在肿瘤早期从患者血循环中检测出肿瘤DNA，并且克服了侵入性取样检测存在风险的技术问题。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针，其中用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示，内参基因的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步地，所述c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，该方法包含以下步骤：
1)提取受试者待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；
2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测c-MET基因扩增的上下游引物、c-MET基因扩增的检测探针、内参基因及其上下游引物、内参基因的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；
所述用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示，内参基因的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；
3)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有c-MET基因扩增。
进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为0.3～2ng/μL。
更进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为1ng/μL。
进一步地，ddPCR混合液中用于检测c-MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测c-MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为400～700nM。
进一步地，ddPCR混合液中c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针含量均为200～400nM。
进一步地，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。
进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。
更进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于数字PCR检测c-MET基因扩增时灵敏度可达到0.01％(即可以从1万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)；
(2)本发明的检测方法灵敏度高、检测结果稳定，针对FISH检测结果呈疑似阳性的情况(待测基因拷贝数/内参基因拷贝数1.8-2.2之间)，本发明的方法可以进行定性检测；
(3)本发明设计合成的引物扩增片段长度不到94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，因此可以从cfDNA中检测到极低丰度的c-MET扩增变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用；
(4)本方法不需要采集组织标本，仅使用外周血即可完成检测，减少了病人的痛苦，特别适合对组织取样不耐受的患者；
(5)本方法操作简便，大大减少了临床检测成本及工作量。
附图说明
图1为实施例2中5个样本中，每个样本的c-MET基因拷贝数结果显示。图中纵坐标为目的基因拷贝数浓度(copies/μL)，横坐标为对应的样品编号，每个点的误差线表示95％置信区间。
图2为实施例2中5个样本中，不同样本c-MET基因不同扩增程度的CNV计算结果。图中纵坐标为内参基因拷贝数浓度(copies/μL)，横坐标为对应的样品编号，每个点的误差线表示95％置信区间。图中结果表示1-1和1-2为c-MET阳性样本，1-3、1-4和1-5为c-MET阴性样本。每个样本的内参基因拷贝数结果显示。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。
本发明提供了数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针，其中用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示，内参基因的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示。其中c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。
其于上述数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针，本发明提供了一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，该方法包含以下步骤：
1)提取受试者待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；
2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测c-MET基因扩增的上下游引物、c-MET基因扩增的检测探针、内参基因RPP30及其上下游引物、内参基因的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；其中用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ IDNO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示，内参基因RPP30的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；其中cfDNA模板和内参基因RPP30的含量为0.3～2ng/μL，优选为1ng/μL；用于检测c-MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测c-MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为400～700nM，优选为500nM；c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针含量均为200～400nM，优选为250nM。
3)将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴，再进行PCR扩增反应。PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应；优选的PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。
4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有c-MET基因扩增。用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，计算样品中待测基因和内参基因RPP30的拷贝数，然后用c-MET基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到拷贝数比值结果。若比值小于3则判定该患者为c-MET阴性，若比值大于3，则为c-MET阳性。
实施例1：ddPCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针的设计与合成
基于基因组分析数据，对c-MET基因进行分析，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：
c-MET基因上、下游引物：
c-MET上游引物SEQ NO1：5’-AGTTCGCTACGATGCAAGAGT-3’
c-MET下游引物SEQ NO2：5’-AGTTGGGCTTACACTTCGGG-3‘
利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为73bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
c-MET基因检测探针：SEQ NO5：5’-FAM-TCCTCATTTGGATAGGCTTGTA-MGB-3’
选用能够稳定扩增、且经过测试扩增效果跟c-MET保持一致的基因为内参基因，本实施例中选用的内参基因为Rpp30，内参基因Rpp30上、下游引物：
上游引物SEQ NO3：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物SEQ NO4：5’-GCTGTCTCCACAAGTCCGC-3‘
利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为60bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。
内参基因Rpp30检测探针：SEQ NO6：5’-HEX-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’
本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达0.01％；且利用此套引物进行PCR扩增，扩增出来的片段不到100bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，能从cfDNA中检测到极低丰度的c-MET基因扩增变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。
实施例2：全血样本中c-MET基因扩增的检测
1.本实施例的待检样品是从武汉良培基因生物科技有限公司收集的5例人外周血的全血样本，编号分别为1-1、1-2、1-3、1-4、1-5，其中IHC结果显示1-1和1-2为c-MET阳性样本，1-3、1-4和1-5为c-MET阴性样本。
2.cfDNA的提取：采用试剂盒提取全血样本中的cfDNA，具体的操作参见QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒说明书，并且以提取出的cfDNA作为PCR检测的模板。
3.在PCR板中按照表1所示配比制备PCR反应液：其中cfDNA模板和内参基因的浓度均为1ng/μL。
表1PCR反应液配置
试剂 用量
2×数字PCR预混液 10μL
各条引物 各500nM
各探针 各250mM
cfDNA模板 2μL
补DEPC水至 20μL
4.将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器，用于制备PCR微反应微滴。
5.将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
6.将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。
7.PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有c-MET基因扩增。可用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，计算样品中两个基因的拷贝数，然后用c-MET基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到拷贝数比值结果。
表2不同样品ddPCR检测结果与HIC结果比对
样品编号 IHC结果 ddPCR结果(拷贝数比值)
1-1 +++ 31.6
1-2 +++ 19
1-3 ++ 2.81
1-4 + 2.46
1-5 - 1.82
根据本发明的判断依据，结合ddPCR检测结果，样本1-1和1-2中两种基因拷贝数比值均大于3，为c-MET阳性；而样本1-3、1-4和1-5中，两种基因拷贝数比值均小于3，为c-MET阴性。结果表明本发明的检测结果与IHC结果完全一致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司
<120> 数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttcgctac gatgcaagag t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agttgggctt acacttcggg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgtctcca caagtccgc 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctcatttg gataggcttg ta 22
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgacctgaa ggctct 16

Claims (10)

1.数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针，其特征在于，用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ IDNO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示，内参基因的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物和探针，其特征在于，所述c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。
3.一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)提取受试者待测样本的cfDNA，所述待测样本为全血样本；
2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测c-MET基因扩增的上下游引物、c-MET基因扩增的检测探针、内参基因及其上下游引物、内参基因的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；
所述用于检测c-MET基因扩增的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测c-MET基因扩增的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，c-MET基因扩增的检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，内参基因的下游引物序列如SEQ IDNO：5所示，内参基因的检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；
3)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有c-MET基因扩增。
4.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为0.3～2ng/μL。
5.根据权利要求4所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为1ng/μL。
6.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，ddPCR混合液中用于检测c-MET基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测c-MET基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为400～700nM。
7.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，ddPCR混合液中c-MET基因扩增的检测探针、内参基因的检测探针含量均为200～400nM。
8.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的方法，其特征在于，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。
9.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，步骤3)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。
10.根据权利要求9所述的一种利用数字PCR技术检测c-MET基因扩增的的方法，其特征在于，步骤3)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。
CN201810420643.XA 2018-05-04 2018-05-04 数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法 Pending CN108315431A (zh)

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