CN110157806A - 一种检测eml4-alk的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测EML4‑ALK的试剂盒及其检测方法和应用,所述EML4‑ALK的引物如SEQ ID NO:1~4所示;所述EML4‑ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。本发明针对EML4‑ALK融合基因的突变类型V1、V2、V3a和V3b设计引物和探针,与内参基因GAPDH的引物和探针相互配合,对微量RNA进行一步法反转录扩增和检测,根据探针的荧光信号值进行数据分析,获得准确的EML4‑ALK融合信息,方法准确性好、检测周期短、特异性高、灵敏度高,为靶向用药提供了关键信息。
Description
技术领域
本发明属于医学和生物技术领域,涉及一种试剂盒及其检测方法和应用, 尤其涉及一种检测EML4-ALK的试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率居各肿瘤之首,包 括非小细胞肺癌和小细胞肺癌,其中,非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、 大细胞癌和类癌等,占肺癌的85%。ALK融合基因突变中的EML4-ALK融合 基因是非小细胞肺癌、特别是肺腺癌的一个驱动基因,其表达产物为一种嵌合 性酪氨酸激酶,可以通过激活ALK基因的膜内催化区域,激活相关信号通路, 促进细胞增殖、存活和迁移,最终导致细胞癌变。EML4-ALK融合基因在肺癌 中的发生率为5%,同时因其具有与EGFR和K-ras突变不共存的特点, EML4-ALK成为特异性较高的肺腺癌标记物,被NCCN指南列为非小细胞肺癌 分子的检测靶点。
目前,多种EML4-ALK的变异亚型被发现,主要为EML4的不同外显子与 ALK第20号外显子融合形成的结果,其中,常见的融合变体为亚型1(E13; A20)和亚型3(E6a/b;A20),经检测,这两种融合变体在EML4-ALK融合 基因非小细胞肺癌患者中的发生率分别为33%和29%。
ALK融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学 (IHC)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等,但这些方法的灵敏度相对较 低。
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)作为第三代PCR技术,是基 于传统PCR的一种全新的核酸分子定量方法,与实时荧光定量PCR相比,ddPCR 无需构建标准曲线,不受扩增效率的影响,结果具有较高的精确度、准确性和 灵敏度。微滴数字PCR技术的核心是将一份样品分成20,000个纳升级的微滴, 每个微滴中含有或不含一个至数个待检核酸靶分子,且每个微滴都作为一个独 立的PCR反应器。经PCR扩增后,采用微滴分析仪对每个微滴进行检测,有 荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,最终根据泊松分布原 理以及阳性微滴的比例,通过分析软件计算出待检靶分子的浓度和拷贝数,以 绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数。
CN108315429A公开了基于囊泡检测EML4-ALK融合基因的引物和试剂 盒,并利用所述引物和探针建立了一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的 EML4-ALK融合基因突变检测方法,所述方法检测灵敏度高,包含10个拷贝 的EML4-ALK突变即可稳定检出,可提供精确的用药指导。然而,该方法对于 不同的EML4-ALK融合变体,需要预先确定不同的阳性判读标准,显著增加了 检测工作量和检测成本。
因此,提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简便、成本较低的EML4-ALK 融合基因检测方法,在肺癌治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种检测EML4-ALK的试剂盒及其检 测方法和应用,所述试剂盒针对不同的EML4-ALK融合基因突变类型V1、V2、 V3a和V3b设计引物和探针,与内参基因GAPDH的引物和探针相互配合,简 化了检测方法,提高了检测的精确度、稳定性和灵敏度。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种检测EML4-ALK的引物探针组合物,所述 EML4-ALK的引物如SEQ ID NO:1~4所示;
所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示;
SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为:CAACACCTGGGAAAGGACC;
SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为:TATTCTACTTGTACCGCCGGA;
SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为:CTCGAAAATACCTTCAACACCCA;
SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为:TGCTCAGCTTGTACTCAGGG;
SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为:
5’-6-FAM-CAGCTCCATCTGCATGGCTTG-MGB-3’.
本发明中,针对EML4-ALK融合基因的突变类型V1、V2、V3a和V3b设 计引物和探针,对微量RNA进行一步法反转录扩增和检测,根据探针的荧光信 号值进行数据分析,获得准确的EML4-ALK融合信息。
优选地,所述EML4-ALK的探针的5’端修饰有荧光基团,3’端修饰有荧光 淬灭基团。
优选地,所述荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任 意一种。
优选地,所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意 一种。
第二方面,本发明提供了一种检测EML4-ALK的试剂盒,所述试剂盒包括 检测EML4-ALK的引物探针组合物。
优选地,所述EML4-ALK的引物如SEQ ID NO:1~4所示。
优选地,所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。
优选地,所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针。
优选地,所述内参基因包括GAPDH。
优选地,所述GAPDH的引物如SEQ ID NO:5~6所示;
SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为:CATCTTCCAGGAGCGAGATCCC;
SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为:ATGGTTCACACCCATGACGAACA.
优选地,所述GAPDH的探针如SEQ ID NO:8所示;
SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为:
5’-HEX-GAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTC-BHQ1-3’.
优选地,所述GAPDH的探针的5’端修饰有荧光基团,3’端修饰有荧光淬 灭基团。
优选地,所述EML4-ALK的探针的荧光基团与所述GAPDH的探针的荧光 基团不同。
本发明的试剂盒针对EML4-ALK融合基因突变类型V1、V2、V3a、V3b 和内参基因GAPDH设计了上下游引物和探针,所述引物组和探针组共同配合, 实现了对EML4-ALK融合基因突变进行准确检测,并能检测出低频突变。
第三方面,本发明提供了一种检测EML4-ALK的方法,所述方法包括:
采用如第一方面所述的引物探针组合物,或如第二方面所述的试剂盒,对 待测RNA进行数字PCR,根据荧光信号值进行数据分析,判断EML4-ALK的 突变类型。
优选地,所述RNA来源于石蜡包埋病理切片组织、外泌体或外周血中的任 意一种或至少两种的组合。
优选地,所述RNA的提取方法包括采用试剂盒提取RNA的步骤。
优选地,在外泌体RNA或外周血RNA的提取之前还包括分离外周血的步 骤。
本发明中,外周血样本在抽取之后4h内进行分离,分离条件为:外周血 第一次离心(1600g,10min)后分离为血细胞和血浆上清液,上清液进行第二 次离心(16000g,10min)后分离得到血浆。
优选地,所述数字PCR的反应条件为:45℃保持60min;95℃变性10min; 95℃变性30s,60℃退火1min,40个循环;98℃延伸10min;4℃保存。
优选地,所述数据分析包括根据荧光阈值和检测阈值进行结果判读的步骤。
优选地,所述荧光阈值根据空白对照组和阴性对照组进行确定。
优选地,所述检测阈值根据最低检测限的阳性对照组进行确定。
优选地,所述结果判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以 及强阳性对照组的数据判断检测结果的步骤。
本发明中,术语“强阳性对照组”指待测位点突变频率至少为10%的阳性 样本。
本发明中,所述EML4-ALK的检测方法通过对EML4-ALK融合基因的突 变状态进行检测,具有绝对定量、检测周期短、高特异性、高准确性和高灵敏 度的特点,为临床医生选择肿瘤靶向分子药物进行治疗和监测提供了参考。
第四方面,本发明提供了一种如第一方面所述的引物探针组合物、如第二 方面所述的试剂盒或如第三方面所述的方法在制备肿瘤治疗药物或构建检测设 备中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明将数字PCR与高特异性的引物探针组合物相结合,提出了一 种精准、快速的肿瘤EML4-ALK基因V1、V2、V3a、V3b位点突变的检测方 法,所述检测方法以石蜡包埋病理切片组织、外泌体或外周血样本为检测对象, 通过微滴乳化技术,降低了背景噪声,使得检测方法的灵敏度和准确性大幅度 提升,可以定量分析低至0.001%的突变频率;
(2)本发明通过检测EML4-ALK基因V1、V2、V3a、V3b位点的突变信 息,为靶向用药提供了关键的靶标突变信息,并根据患者的个体差异性,有利 于选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案,提高患者生活质量,延长患 者的生存时间;
(3)本发明的方法具有无可比拟的精确性,并且可以做到绝对定量,不再 需要标准曲线,检测周期短、特异性高、灵敏度高。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例对本发 明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释 本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或 条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可 通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明的检测方法主要包括从样本中提取RNA,以RNA为模板,利用 EML4-ALK基因V1、V2、V3a、V3b位点的荧光探针SEQ ID NO:7和内参基 因荧光探针SEQ ID NO:8以及相应的引物SEQ ID NO:1~6对RNA进行一步法 反转录扩增,并对扩增产物进行检测,最后对荧光信号数据进行分析,获得 EML4-ALK基因的变异信息。实际样本选自深圳海普洛斯医学检验实验室非小 细胞肺癌项目NGS检测为EML4-ALK融合阳性的样本,样本编号为20190111008-8(V1)、20190113001-a(V2)、20190113003-1(V3a)、20190114004-8 (V3b)。
实施例1石蜡包埋病理切片组织的RNA提取
本实施例采用RNeasy FFPE Kit(QIAGEN Cat No./ID:73504)进行石蜡包 埋病理切片组织的RNA提取,步骤如下:
(1)将样本放置于2mL离心管内,使用手术刀将石蜡组织切割成5-20μm 厚的小块;
(2)加入160μL脱蜡缓冲液(Deparaffinization Solution),剧烈涡旋10 秒,短暂离心使样品沉入管底;
(3)56℃孵育3分钟,随后在室温下冷却;
(4)加入150μL Buffer PKD,涡旋混合;
(5)以11000×g(10000rpm)离心1分钟;
(6)将10μL蛋白酶K加入到澄清相中,并轻轻混合;
(7)56℃孵育15分钟,随后在80℃孵育15分钟,每隔3-5分钟进行一次 震荡;
(8)将澄清相转移到新的2mL微量离心管中;
(9)在冰上孵育3分钟,随后以20000×g(13500rpm)离心15分钟;
(10)将上清液转移至新的1.5mL离心管,注意不要搅动沉淀,颗粒含有 不溶性组织碎片,包括交联的DNA;
(11)加入相当于总样品体积十分之一(约16μL)的DNase Booster Buffer 和10μLDNase I,翻转离心管混合,短暂离心收集离心管侧面的残余液体;
(12)室温下孵育15分钟;
(13)加入320μL Buffer RBC以调节结合条件,并彻底混合裂解物;
(14)向样本中加入720μL乙醇(100%),并通过移液器充分混合;
(15)将吸附柱放到2mL收集管上,吸取700μL样本加入到吸附柱中, 轻轻关上盖子,以≥8000×g(≥10000rpm)离心15秒,弃废液,直到整个样 品通过RNeasy MinElute吸附柱;
(16)将吸附柱放在新的收集管内,吸取500μL Buffer RPE加入到吸附柱 中,轻轻关上盖子,以≥8000×g(≥10000rpm)离心15秒,弃废液;
(17)再次吸取500μL Buffer RPE加入到吸附柱中,轻轻关上盖子,以 ≥8000×g(≥10000rpm)离心2min,丢弃收集管和废液,尽可能使吸附柱不 接触到废液,避免产生乙醇遗留;
(18)将吸附柱放在新的收集管上,开盖离心5min,使乙醇在开盖条件下 挥发,丢弃收集管;
(19)将吸附柱放在新的1.5mL收集管上,滴加14-30μL DEPC水到吸附 柱离心膜上,轻轻盖上盖子,全速离心1min,收集洗脱液,提取的RNA溶解 于洗脱液中。
采用Life Qubit 3.0测定提取的RNA的浓度,并采用Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的RNA的片段大小及完整性。
实施例2外泌体RNA的提取
本实施例采用exoEasy Maxi Kit(QIAGEN Cat No./ID:76064)同TRIzolTM试 剂(InvitrogenTMCat No./ID:7606415596026)进行外泌体RNA的提取,步骤如 下:
(1)血浆用Millex-AA(Millipore Cat No./ID:7SLAA033SB)过滤去除大 于0.8μm的组份;
(2)将1体积缓冲液XBP添加到1体积样品中,轻轻翻转管子5次,搅 拌均匀,把混合物加热到室温;
(3)将16mL样品/XBP混合物加到exoEasy自旋柱上,以500×g的速度 离心1分钟,弃去洗脱液,将柱放回到相同的收集管中,直到整个样本全部过 柱为止;
(4)加入10mL缓冲液XWP,以5000×g的速度离心5分钟,除去柱上残 留的缓冲液,将洗脱液连同收集管一起丢弃;
(5)将柱子转移到新的收集管中;
(6)添加400μL缓冲液XE至膜上,孵化1分钟,以500×g的速度离心5 分钟收集洗脱液;
(7)将洗脱液重新过柱,孵育1分钟,以5000×g的速度离心5分钟,收 集洗脱液并转移到1.5mL离心管中;
(8)加入5μg无RNA酶的糖原作为水相的载体;
(9)向水相中添加0.5mL异丙醇,和1mL TRIzolTM裂解试剂;
(10)孵育10分钟;
(11)4℃、12000×g离心10分钟;
(12)总RNA沉淀在管的底部形成一个白色的凝胶状颗粒;
(13)用移液管丢掉上清;
(14)每1mL TRIzolTM用于裂解的试剂中,用1mL 75%乙醇重悬沉淀;
(15)对样品进行短暂涡旋,然后在7500×g、4℃下离心5分钟;
(16)用移液管丢弃上清;
(17)空气干燥RNA沉淀5-10分钟;
(18)加入20~50μL无RNA酶水或0.1mM EDTA重悬沉淀;
(19)将模板在55~60℃孵育10-15分钟,得到外泌体RNA。
实施例3外周血RNA的提取
本实施例采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(QIAGEN Cat No./ID:217184) 进行外周血RNA的提取,步骤如下:
(1)准备血浆样本;
(2)转移600μL血浆至2mL离心管中;
(3)根据样本体积,添加180μL缓冲液RPL至样本管中,涡旋5次,室 温孵育3min;
(4)添加3.5μL miRNeasy Serum/Plasma spike-incontrol,充分混匀;
(5)添加60μL缓冲液RPP,充分混匀20s,室温孵育3min;
(6)室温12000×g离心3分钟;
(7)转移上清至新的离心管中,添加1体积异丙醇,充分涡旋混匀;
(8)将所有样本转移至离心柱(RNeasy UCP MinElute column)中,8000×g 离心15s,去除洗脱液;
(9)添加700μL缓冲液RWT至RNeasy UCP MinElute column中,8000×g 离心15s,去除洗脱液;
(10)添加500μL缓冲液RPE至RNeasy UCP MinElute column中,8000×g 离心15s,去除洗脱液;
(11)添加500μL缓冲液80%乙醇至RNeasy UCP MinElute column中,8000×g离心2分钟,去除洗脱液;
(12)将RNeasy UCP MinElute column放至新的离心管中,开盖全速离心 5分钟,去除洗脱液和收集管;
(13)将RNeasy UCP MinElute column放至新的离心管中,添加20μL无 RNA酶水,孵育1分钟,开盖全速离心1分钟收集RNA。
实施例4 EML4-ALK基因融合突变检测
本实施例采用如SEQ ID NO:1~8所示的引物探针组合物检测EML4-ALK 基因突变,其中,EML4-ALK-V1、EML4-ALK-V2、EML4-ALK-V3a和 EML4-ALK-V3b位点的探针为SEQ IDNO:7,内参基因GAPDH的探针为SEQ ID NO:8,EML4-ALK-V1、EML4-ALK-V2、EML4-ALK-V3a和EML4-ALK-V3b 位点的上游引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:3,下游引物为SEQ ID NO:4,内参基因GAPDH的上下游引物为SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6。本实施例采用的引物和探针由生工生物工程(上海)股份有 限公司合成。
示例性地,本实施例采用实施例1提取的石蜡包埋病理切片组织的RNA进 行检测,具体步骤为:
(1)配置反应体系:
按照表1配置PCR反应体系(先不加RNA模板),以15μL/管进行分装, 该阶段在试剂准备区完成,将配制好的反应体系转移至样本制备区;向分装好 的反应体系中加入RNA模板,反应体系共20μL,该阶段在样本制备区完成; 各体系涡旋仪混合不超过10s,于掌式离心机上离心,去除气泡,将反应体系 转移至数字PCR检测区;
表1一步法反转录扩增反应体系的配制
反应组分 | 体积(μL) | 工作浓度 |
预混液 | 5 | 1× |
反转录酶 | 2 | 20U/μL |
DTT(300mM) | 1 | 15mM |
EML4-ALK-V1-F1(SEQ ID NO:1) | 0.5 | 750nM |
EML4-ALK-V2-F1(SEQ ID NO:2) | 0.5 | 750nM |
EML4-ALK-V3-F1(SEQ ID NO:3) | 0.5 | 750nM |
EML4-ALK-R1(SEQ ID NO:4) | 1.5 | 750nM |
GAPDH-F(SEQ ID NO:5) | 1.5 | 750nM |
GAPDH-R(SEQ ID NO:6) | 1.5 | 750nM |
EML4-ALK-probe1(SEQ ID NO:7) | 0.5 | 250nM |
GAPDH-probe(SEQ ID NO:8) | 0.5 | 250nM |
RNA模板 | - | 100ng |
(2)数字PCR检测
制备微滴:
取出微滴生成卡,按照操作要求组装,在Oil加样孔中加入70μL油;在 Sample加样孔中加入20μL上述反应体系,盖上封条,于微滴生成器中反应; 由于微滴生成时,Oil加样孔与Sample加样孔不能为空,故空白的Oil加样孔 加入70μL油,Sample加样孔加入25μL水;
一步法反转录扩增:
用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内(吸取和转移 微滴时需缓慢操作,防止产生气泡,单次操作用时约5s),用预热好的PX1 热封仪对其进行封膜,推荐的运行程序为180℃保持5s;完成封膜后,将96 孔板置于梯度扩增仪(T100ThermalCycler)进行PCR反应,条件为:45℃保 持60min;95℃变性10min;95℃变性30s,60℃退火1min,40个循环;98℃ 延伸10min;4℃保存;
微滴检测:
将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪,设置反应参数, 编辑样品信息,对所有样本进行荧光检测;微滴读取结束后,保存数据,进行 下一步分析。
实施例5结果分析
EML4-ALK-V1、EML4-ALK-V2、EML4-ALK-V3a和EML4-ALK-V3b位 点的荧光信号的读取:
打开QuantaSoft软件,导入样本检测数据,选择Analyze模块对数据进行 分析:确认所有样本类型的微滴生成数在10000以上(只有在此范围内,检出 的数据的CV值保持在1.6%以内);选择1D Amplitude,确定融合基因探针和 内参基因探针的荧光阈值,以空白对照组和野生型对照组划定融合基因探针和 内参基因探针的阈值;QuantaSoft软件根据泊松分布计算每个样本20μL反应 体系所含的模板拷贝数,利用FAM拷贝数/(FAM拷贝数+HEX拷贝数),计 算出EML4-ALK的突变率。
本实施例对非小细胞肺癌项目样本编号为20190111008-8、20190113001-a、20190113003-1和20190114004-8的样本进行检测,结果如表2所示,4例样本 均含有EML4-ALK-V1、EML4-ALK-V2、EML4-ALK-V3a或EML4-ALK-V3b 位点中的其中一种突变,与NGS检测结果一致。
表2检测结果
综上所述,本发明针对不同的EML4-ALK融合基因突变类型V1、V2、V3a 和V3b设计引物和探针,配合数字PCR进行痕量RNA检测,检测过程无创伤, 具有灵敏度高的优势,实现了准确检测靶向药物相关的EML4-ALK融合突变, 有利于评估癌症发展变化,制定精准医疗方案,为个体化精准用药指导提供了 重要的参考依据。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明 并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳海普洛斯医学检验实验室
<120> 一种检测EML4-ALK的试剂盒及其检测方法和应用
<130> 20190529
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
caacacctgg gaaaggacc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tattctactt gtaccgccgg a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ctcgaaaata ccttcaacac cca 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgctcagctt gtactcaggg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
catcttccag gagcgagatc cc 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atggttcaca cccatgacga aca 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cagctccatc tgcatggctt g 21
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gagtacgtcg tggagtccac tggcgtc 27
Claims (10)
1.一种检测EML4-ALK的引物探针组合物,其特征在于,所述EML4-ALK的引物如SEQ IDNO:1~4所示;
所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物,其特征在于,所述EML4-ALK的探针的5’端修饰有荧光基团,3’端修饰有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合物,其特征在于,所述荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种;
优选地,所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。
4.一种检测EML4-ALK的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测EML4-ALK的引物探针组合物;
优选地,所述EML4-ALK的引物如SEQ ID NO:1~4所示;
优选地,所述EML4-ALK的探针如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针;
优选地,所述内参基因包括GAPDH;
优选地,所述GAPDH的引物如SEQ ID NO:5~6所示;
优选地,所述GAPDH的探针如SEQ ID NO:8所示;
优选地,所述GAPDH的探针的5’端修饰有荧光基团,3’端修饰有荧光淬灭基团;
优选地,所述EML4-ALK的探针的荧光基团与所述GAPDH的探针的荧光基团不同。
6.一种检测EML4-ALK的方法,其特征在于,所述方法包括:
采用如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合物,或如权利要求4或5所述的试剂盒,对待测RNA进行数字PCR,根据荧光信号值进行数据分析,判断EML4-ALK的突变类型。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述RNA来源于石蜡包埋病理切片组织、外泌体或外周血中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述RNA的提取方法包括采用试剂盒提取RNA的步骤;
优选地,在外泌体RNA或外周血RNA的提取之前还包括分离外周血的步骤。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述数字PCR的反应条件为:45℃保持60min;95℃变性10min;95℃变性30s,60℃退火1min,40个循环;98℃延伸10min;4℃保存。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法,其特征在于,所述数据分析包括根据荧光阈值和检测阈值进行结果判读的步骤;
优选地,所述荧光阈值根据空白对照组和阴性对照组进行确定;
优选地,所述检测阈值根据最低检测限的阳性对照组进行确定;
优选地,所述结果判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以及强阳性对照组的数据判断检测结果的步骤。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合物、如权利要求4或5所述的试剂盒或如权利要求6-9任一项所述的方法在制备肿瘤治疗药物或构建检测设备中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190823 |