CN108315429A - 基于囊泡检测eml4-alk融合基因的引物和试剂盒 - Google Patents

基于囊泡检测eml4-alk融合基因的引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一套基于囊泡无创检测EML4‑ALK融合基因的引物。本发明还提供用于qPCR或数字PCR检测EML4‑ALK融合基因的引物和探针，序列如SEQ ID NO:1‑5所示。利用所述引物和探针建立了一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的EML4‑ALK融合基因突变检测方法。本检测方法针对体液标本(包括血液、胸腔积液、腹水及脑脊液等)，临床样本易获取。本方法检测灵敏度高，包含10个拷贝的EML4‑ALK突变即可稳定检出，可提供精确的用药指导。

Description

基于囊泡检测EML4-ALK融合基因的引物和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种基于囊泡无创检测 EML4-ALK融合基因的引物和试剂盒。
背景技术
《2017中国肿瘤登记年报》数据显示，我国肺癌发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中均排在第一位。初诊患者中，I期肺癌患者比例仅为15-20％，多数病人不具备手术条件，药物治疗依旧是肺癌的主要治疗手段。近年来，分子靶向药物因特异性高，毒副作用低，正逐渐替代传统化疗药物成为肺癌治疗的首选方案。以非小细胞肺癌 (NSCLC，约占肺癌总数85％)为例，根据流行病学研究结果，约3-5％的NSCLC患者携带有EML4-ALK融合突变。其中，EML4是棘皮动物微管蛋白4，ALK是间变性淋巴瘤激酶。当这两个基因发生倒位融合后，会表达EML4-ALK融合蛋白，该蛋白可以形成二聚体并持续激活ALK信号通路。2011年8月，距离这一治疗靶点被发现后仅4年，FDA就批准通过了首个ALK抑制剂药物(Crizotinib)。III期临床试验结果显示，受试者有着65％的总体响应率以及7.7个月的无进展生存期。当Crizotinib产生耐药性后，新一代ALK抑制剂，如Ceritinib和Alectinib，被证实可以让患者疾病得到有效控制。目前，已经发现的ALK融合变体不少于15种，在以ALK重排为靶点的治疗方案不断推陈出新的同时，如何精准地找到适用患者，对于提高治疗效果尤为重要。
胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，其主要类型包括外泌体(Exosome,粒径50-100nm)、微泡(Microvesicle，粒径20-1000nm)以及凋亡小体(Apoptotic blebs，粒径1000-5000nm)。胞外囊泡作为细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中均发挥着重要作用。此外，因其在体液中分布广泛(如血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等)，且包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，为我们从分子水平对患者病情进行实时动态地监测提供了机会，因而在精准医疗领域有着巨大的应用前景。
目前，临床上使用的EML4-ALK融合检测方法包括，荧光原位杂交FISH(Vysis ALKBreak Apart FISH Probe Kit，雅培)、免疫组化IHC(VENTANA ALK(D5F3)CDx Assay，罗氏)以及RT-PCR(EML4-ALK融合基因检测试剂盒，厦门艾德)。 FISH是利用荧光探针对ALK序列上可能发生断点的位置进行标记，并根据存在断点异常的肿瘤细胞比例来判断是否为融合阳性，其优点在于能涵盖多种融合类型，然而根据杂交荧光探针的间距来判断阴/阳性细胞难免会有主观因素的干扰，此外昂贵的设备及试剂成本偏高也限制了该方法在临床中的推广。IHC同样不局限于融合类型，而且相比FISH不仅操作简单更具有价格优势，但包括冷缺血、样本固定方式、保存时间，甚至抗体选择等因素都能够对检测结果造成不同程度的影响。此外，上述两种方法还存在一个共同的问题，无法确认具体的融合类型。基于组织的RT-PCR 检测具有较高的灵敏度和特异性，能够检测已有引物序列所对应的融合类型，但因为检测的是RNA，因此对组织的新鲜程度和保存方式也存在较高要求。总体来说，上述三种方法都是依赖活检组织的有创检测，对于样本的采集和保存有着不同程度的要求。对于某些难以得到活检组织的患者，这些方法均无法提供有效的检测。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测EML4-ALK融合基因的引物。
本发明的另一目的是提供一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的EML4-ALK 融合基因突变检测方法及试剂盒。该检测结果既能够提供用药指导，还可以用于疗效监控。
为了实现本发明目的，本发明提供用于检测EML4-ALK融合基因的引物，所述引物的序列如下(SEQ ID NO:1-4)：
EML4-ALK-V1F:5′-GAGCCCACACCTGGGAAAG-3′
EML4-ALK-V2F:5′-GACTGGTCCCCAGACAACAAGTA-3′
EML4-ALK-V3F:5′-GCATAAAGATGTCATCATCAACCAA-3′
EML4-ALK-R:5′-AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3′
本发明还提供用于qPCR或数字PCR检测EML4-ALK融合基因的引物和探针，所述引物为EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F和EML4-ALK-R，所述探针的序列如下(SEQID NO:5)：
EML4-ALK-Probe:5′-CCGGAAGCACCAGGAGCTGC-3′
本发明还提供含有所述引物、或所述引物和探针的用于检测EML4-ALK融合基因的检测试剂或试剂盒。
优选地，所述试剂盒用于囊泡中EML4-ALK融合基因的检测。所述囊泡可提取自包括血液、胸腔积液、腹水在内的体液样本。
本发明中的囊泡提取方法包括但不限于超速离心、密度梯度离心、聚合物沉淀、免疫捕获、膜特异性捕获。将囊泡中的RNA逆转录成cDNA后，采用PCR、数字PCR 和/或测序的方法对ALK融合基因进行检测。本检测方法可以一次检测三种最常见的 EML4-ALK融合基因，分别是EML4-ALK V1、EML4-ALK V2以及EML4-ALK V3a/V3b，这三种融合类型占所有EML4-ALK融合基因的85％以上。
本发明还提供一种体液囊泡mRNA的反转录方法，反转录反应体系和反应条件如下：
本发明中所用反转录试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW2582M。
反应条件：42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟。
反应结束后，短暂离心后置于冰上，用ddH2O稀释一倍，进行后续PCR或荧光定量PCR反应。若长时间不用，应保存在-20℃。
本发明还提供一种用于qPCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，所述反应体系按50μL计为：2×PCR Master Mix 25μL，引物EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、 EML4-ALK-V3F、EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM，DNA模板或反转录产物15μL，补ddH2O至50μL。
本发明中所用PCR Master Mix购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0932。
所述PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃30s，15个循环； 95℃15s，60℃30s收集荧光，35个循环。
本发明还提供一种用于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，所述反应体系按15μL计为：Quantstudio 3D Master Mix 7.5μL，引物EML4-ALK-V1F、 EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F、EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM， DNA模板或反转录产物3μL，补ddH2O至15μL。
本发明中所用Quantstudio 3D Master Mix购自Theromfisher公司，货号A29154。
所述PCR反应程序为：96℃预变性10min；60℃30s，98℃30s，50个循环；60℃ 2min。
本发明进一步提供一种用于检测EML4-ALK基因融合突变的方法，包括如下步骤：
(1)根据人类基因组数据和已发表文献资料，针对3种EML4-ALK基因融合突变，设计特异性引物和探针，3种EML4-ALK基因融合突变分别为EML4-ALK-V1, EML4-ALK-V2,EML4-ALK-V3a/3b；
(2)采用超速离心、密度梯度离心、聚合物沉淀、免疫捕获或膜特异性捕获方法，分离得到体液中的囊泡；
(3)提取囊泡总mRNA并反转录得到cDNA模板；
(4)配制实时荧光PCR或者数字PCR扩增反应体系；
(5)根据实时荧光PCR扩增仪给出的Ct值判断检测结果，以荧光信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴性/阳性判断标准；
(6)为满足更高的检测灵敏度要求，可配制数字PCR扩增反应体系，根据数字 PCR仪得到的拷贝数对检测结果进行判断；
(7)为兼顾后续治疗需求，可以对荧光定量PCR阳性的样品进行一代测序，确定EML4-ALK融合基因的类型。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供了一种无创、快速、高灵敏度的EML4-ALK融合基因突变检测方法。
(二)首次以体液囊泡RNA为检测对象，无需获取患者实体瘤样本；样本来源可以是包括血液、胸腔积液、腹水以及脑脊液在内的体液样本，取样方便，能够更大程度上减轻患者痛苦。
(三)建立了实时荧光PCR和数字PCR扩增体系，一次可检测三种EML4-ALK主要融合突变。
(四)本方法检测灵敏度高，包含10个拷贝的EML4-ALK突变即可稳定检出。
附图说明
图1为本发明实施例1中EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测体系对 EML4-ALK-V1的检测结果，A图为pTOPO-EML4-ALK-V1质粒不同拷贝数的扩增曲线，B图为相应的Ct值和PCR技术重复结果。
图2为本发明实施例2中EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测体系对EML4-ALK-V2的检测结果，A图为pTOPO-EML4-ALK-V2质粒不同拷贝数的扩增曲线，B图为相应的Ct值和PCR技术重复结果。
图3为本发明实施例3中EML4-ALK融合基因荧光定量PCR检测体系对EML4-ALK-V3b的检测结果，A图为pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒不同拷贝数的扩增曲线，B图为相应的Ct值和PCR技术重复结果。
图4为本发明实施例4中EML4-ALK-V3b阳性细胞系H2228外泌体总RNA检测结果。扩增曲线从右到左分别为0.5ng,1ng,2ng和4ng总RNA反转录为cDNA的扩增结果。
图5为本发明实施例5中PCR测序结果与EML4-ALK-V1,ALK和EML4序列比对结果和测序峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1-3中，以基因工程构建的突变质粒作为模板，建立EML4-ALK融合基因实时荧光PCR扩增反应体系。针对EML4-ALK融合基因突变中最常见的3种类型设计特异性引物和探针，实现高灵敏、高特异性的检测。本发明中，检测EML4-ALK融合基因突变的方法包括如下步骤：
1、根据NCBI数据库公布的EML4-ALK融合基因序列[EML4-ALK V1(GenBank IDAB274722)、EML4-ALK V2(GenBank ID AB275889)以及EML4-ALK V3a/3b (GenBank IDAB374361和AB374362)]，设计特异性的扩增引物和检测探针(SEQ ID NO:1-5)；
2、样本处理及RNA提取：适用样本范围包括血液(10mL)、胸腔积水(≥20mL) 以及腹水(≥20mL)。低速离心除去体液样本中的细胞及细胞残骸后，用超速离心、密度梯度离心、或者Exoquick和ExoEasy等商业试剂盒进行囊泡的分离。得到囊泡后使用TRIzolReagent裂解囊泡并释放核酸。然后，使用Ultrapure RNA Kit、miRNeasy Mini Kit等RNA提取试剂盒提取总RNA。将提取的RNA溶解于DEPC处理的ddH2O，用于进行反转录操作；
3、荧光定量PCR检测：取上述cDNA模板15μL，分别加入0.2μM的正向引物和反向引物和0.2μM探针，加入2×PCR Master Mix 25μL，补DEPC水至50μL；PCR扩增条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃15s，60℃30s，15个循环；95℃ 15s，60℃30s收集荧光，35个循环；
4、数字PCR检测：取cDNA模板3μL，加入0.2μM的正向引物和反向引物和0.2μM 探针，加入Quantstudio 3D Master Mix 7.5μL，补DEPC水至15μL；扩增条件为：96℃预变性10min，1个循环；60℃30s，98℃30s，50个循环；60℃2min，1个循环。
实施例1检测含有EML4-ALK-V1融合基因片段的质粒
实验用质粒DNA模板为pTOPO-EML4-ALK-V1(pTOPO为克隆质粒名称)，利用实时荧光定量PCR技术检测EML4-ALK-V1融合基因突变的具体方法如下：
1、包含EML4-ALK-V1融合基因片段质粒的合成和实时荧光定量PCR检测方法
(1)采用全基因合成的方法，合成EML4-ALK-V1融合基因片段，该片段包含 EML4-ALK-V1融合位点上游EML4基因片段200bp，融合位点下游ALK基因片段 200bp。
(2)将合成后的基因片段克隆到pTOPO克隆载体上，形成 pTOPO-EML4-ALK-V1克隆质粒，转化大肠杆菌，提取pTOPO-EML4-ALK-V1质粒，同时进行一代测序验证合成基因片段的正确性。
(3)根据pTOPO-EML4-ALK-V1质粒序列和碱基构成，计算 pTOPO-EML4-ALK-V1质粒的分子摩尔质量，利用NanoDrop2000测量质粒的浓度，从而计算该质粒的摩尔浓度。
(4)根据pTOPO-EML4-ALK-V1质粒的摩尔浓度，将质粒稀释到12.5,5,2.5和 1.25拷贝/μL。
(5)在PCR反应体系中，分别加入2μL上述稀释后的质粒，使PCR体系中的拷贝数分别为25,10,5和2.5拷贝，每个拷贝数进行10次重复。
(6)实时荧光定量PCR结果显示，25拷贝和10拷贝的10次PCR重复中都能够检测到EML4-ALK-V1的存在，Ct值分别为25.15±1.00和27.00±1.21；5拷贝的10次PCR 重复中有9个能够检测到EML4-ALK-V1的存在，Ct值为28.47±0.85；2.5拷贝的10次 PCR重复中有4个能够检测到EML4-ALK-V1的存在，Ct值为28.37±1.01；同时阴性对照没有扩增信号。(图1)
2、重复性试验
对25、10、5和2.5拷贝的pTOPO-EML4-ALK-V1质粒进行3次独立重复的实时荧光定量PCR检测，每次每个质粒浓度进行10次PCR重复，3次重复结果一致性极高，结果如下：
25拷贝(25C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为25.40；
10拷贝(10C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为27.11；
5拷贝(5C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复中分别有10、9和10次重复检出，总体平均Ct值为28.31；
2.5拷贝(2.5C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复中分别有5、4和4次重复检出，总体平均Ct值为28.40；
上述所有检测过程中，阴性对照均没有扩增信号。
3、EML4-ALK-V1阳性判读标准
根据EML4-ALK-V1的重复性实验结果，将EML4-ALK-V1阳性的Ct值设定为 28.41。
4、检测灵敏度分析
根据EML4-ALK-V1的重复性实验结果，将EML4-ALK-V1的PCR检测灵敏度设定为10个拷贝，即在PCR反应体系中存在10个拷贝，即可稳定检出。
实施例2检测含有EML4-ALK-V2融合基因片段的质粒
实验用质粒DNA模板为pTOPO-EML4-ALK-V2(pTOPO为克隆质粒名称)，利用实时荧光定量PCR技术检测EML4-ALK-V2融合基因突变的具体方法如下：
1、包含EML4-ALK-V2融合基因片段质粒的合成和实时荧光定量PCR检测方法
(1)采用全基因合成的方法，合成EML4-ALK-V2融合基因片段，该片段包含 EML4-ALK-V2融合位点上游EML4基因片段200bp，融合位点下游ALK基因片段 200bp。
(2)将合成后的基因片段克隆到pTOPO克隆载体上，形成 pTOPO-EML4-ALK-V2克隆质粒，转化大肠杆菌，提取pTOPO-EML4-ALK-V2质粒，同时进行一代测序验证合成基因的正确性。
(3)根据pTOPO-EML4-ALK-V2质粒序列和碱基构成，计算 pTOPO-EML4-ALK-V1质粒的分子摩尔质量，利用NanoDrop2000测量质粒的浓度，从而计算该质粒的摩尔浓度。
(4)根据pTOPO-EML4-ALK-V2质粒的摩尔浓度，将质粒稀释到12.5,5,2.5和 1.25拷贝/μL。
(5)在PCR反应体系中，分别加入2μL上述稀释后的质粒，使PCR体系中的拷贝数分别为25,10,5和2.5拷贝，每个拷贝数进行10次重复。
(6)实时荧光定量PCR结果显示，25拷贝和10拷贝的10次PCR重复中都能够检测到EML4-ALK-V2的存在，Ct值分别为24.23±0.89和26.59±1.36；5拷贝的1010次PCR 重复中有8个能够检测到EML4-ALK-V2的存在，Ct值为27.93±0.67；2.5拷贝的1010 次PCR重复中有6个能够检测到EML4-ALK-V2的存在，Ct值为27.35±1.49；同时阴性对照没有扩增信号。(图2)
2、重复性试验
对25、10、5和2.5拷贝的pTOPO-EML4-ALK-V2质粒进行3次独立重复的实时荧光定量PCR检测，每次每个质粒浓度进行10个PCR技术重复，3次重复结果一致性极高，结果如下：
25拷贝(25C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为24.41；
10拷贝(10C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为26.31；
5拷贝(5C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复中分别有10、9和10次重复检出，总体平均Ct值为27.35；
2.5拷贝(2.5C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复中分别有5、4和4次重复检出，总体平均Ct值为27.60；
上述所有检测过程中，阴性对照均没有扩增信号。
3、EML4-ALK-V2阳性判读标准
根据EML4-ALK-V2的重复性实验结果，将EML4-ALK-V2阳性的Ct值设定为 27.60。
4、检测灵敏度分析
根据EML4-ALK-V2的重复性实验结果，将EML4-ALK-V2的PCR检测灵敏度设定为10个拷贝，即在PCR反应体系中存在10个拷贝，即可稳定检出。
实施例3检测含有EML4-ALK-V3融合基因片段的质粒
实验用质粒DNA模板为pTOPO-EML4-ALK-V3b(pTOPO为克隆质粒名称)，利用实时荧光定量PCR技术检测EML4-ALK-V3b融合基因突变的具体方法如下：
1、包含EML4-ALK-V3b融合基因片段质粒的合成和实时荧光定量PCR检测方法 (1)采用全基因合成的方法，合成EML4-ALK-V3b融合基因片段，该片段包含 EML4-ALK-V3b融合位点上游EML4基因片段200bp，融合位点下游ALK基因片段 200bp。
(2)将合成后的基因片段克隆到pTOPO克隆载体上，形成 pTOPO-EML4-ALK-V3b克隆质粒，转化大肠杆菌，提取pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒，同时进行一代测序验证合成基因的正确性。
(3)根据pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒序列和碱基构成，计算 pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒的分子摩尔质量，利用NanoDrop2000测量质粒的浓度，从而计算该质粒的摩尔浓度。
(4)根据pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒的摩尔浓度，将质粒稀释到12.5,5,2.5和1.25Copy/μL。
(5)在PCR反应体系中，分别加入2μL pTOPO-EML4-ALK-V3b稀释后的质粒，使PCR体系中的拷贝数分别为25,10,5和2.5拷贝，每个拷贝数进行10次重复。
(6)实时荧光定量PCR结果显示，25拷贝和10拷贝的10次PCR重复中都能够检测到EML4-ALK-V3b的存在，Ct值分别为23.60±1.12和26.11±1.06；5拷贝的10次PCR 重复中有6个能够检测到EML4-ALK-V2的存在，Ct值为26.94±1.53；2.5拷贝的10次 PCR重复中有4个能够检测到EML4-ALK-V2的存在，Ct值为27.78±0.49；同时阴性对照没有扩增信号。(图3)
2、重复性试验
对25、10、5和2.5拷贝的pTOPO-EML4-ALK-V3b质粒进行3次独立重复的实时荧光定量PCR检测，每次每个质粒浓度进行10次PCR重复，3次重复结果一致极高性高，结果如下：
25拷贝(25C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为24.40；
10拷贝(10C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复均能稳定检出，总体平均 Ct值为26.21；
5拷贝(5C)：3次独立重复，每个重复的10次PCR重复中分别有8、9和7次重复检出，总体平均Ct值为27.14；
2.5拷贝(2.5C)：3次独立重复，每个重复的10个PCR技术重复中分别有5、4和5 次重复检出，总体平均Ct值为28.09；
上述所有检测过程中，阴性对照均没有扩增信号。
3、EML4-ALK-V3b阳性判读标准
根据EML4-ALK-V3b的重复性实验结果，将EML4-ALK-V2阳性的Ct值设定为 28.09。
4、检测灵敏度分析
根据EML4-ALK-V3b的重复性实验结果，将EML4-ALK-V3b的PCR检测灵敏度设定为10个拷贝，即在PCR反应体系中存在10个拷贝，即可稳定检出。
实施例4检测EML4-ALK-V3b阳性细胞系H2228
利用本发明方法检测EML4-ALK-V3b阳性细胞系H2228上清囊泡中 EML4-ALK-V3b融合基因的表达，利用上述荧光PCR检测EML4-ALK基因融合突变的方法如下：
1、H2228细胞培养液样本处理和囊泡总RNA提取
(1)收集H2228细胞培养液，加入适量蛋白酶抑制剂(Complete Mini,Roche)，防止蛋白降解。
(2)将收集的H2228细胞培养液3000g室温离心15min，取上清。
(3)将上清液4℃下离心17,000g/30min，去除沉淀细胞碎片。
(4)将上清经0.45μM滤膜过滤后，在4℃下超速离心，最大离心力150,000g，4 h，弃上清。
(5)Pellet用低温PBS 1mL重悬至小超离管中，4℃下再次超速离心最大离心力150,000g，2h，弃上清。
(6)将得到的外泌体pellet用100μL PBS重悬，提取外泌体RNA或者-80℃保存待用。
2、cDNA合成和PCR扩增
按照下述体系配制反转录反应体系：
共进行4个H2228细胞系外泌体RNA反转录反应，RNA用量分别为0.5ng,1ng,2 ng,和4ng。
反转录反应条件：42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟。
反应结束后，短暂离心后置于冰上，用ddH2O稀释一倍，进行后续PCR或荧光定量PCR反应。
取4μL反转录产物作为扩增模板，进行PCR扩增，PCR反应体系如下：2×PCR MasterMix 25μL，引物EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F、 EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM，反转录产物4μL，补ddH2O至50μL。
PCR扩增条件如下：95°10min；95°15s，60°30s，15个循环；95°15s 60°30s收集荧光信号，35个循环。
3、H2228细胞系外泌体EML4-ALK-V3b检测结果
共设置了4个总RNA浓度梯度，分别为0.5ng,1ng,2ng,和4ng。4个总RNA浓度梯度对应的cDNA均有良好的扩增，对应的扩增Ct值分别为21.83,22.53,23.93和 25.25。检测结果表明，该荧光定量PCR方法体系可用于细胞系外泌体EML4-ALK融合基因的检测。(图4)
实施例5检测临床样本
待测的IHC ALK阳性的临床患者外周血样本5例。利用本发明方法检测5例临床样本的EML4-ALK融合基因突变的步骤如下：
1、样本处理和囊泡RNA提取
(1)用EDTA抗凝管采集患者血液，若不能第一时间处理，应于4℃临时保存(不得超过8小时)。
(2)将采集到的血液在4℃下离心3000×g,15分钟，去除血液中的细胞。
(3)将上清转移到新的离心管中，并于4℃下离心3000×g,15分钟，取上清(血浆)。
(4)将所得血浆与PBS以1:18比例混匀，配平后在4℃下离心13000×g 30分钟。
(5)将上清用0.22μM滤膜过滤后转移至另一支离心管，配平后在4℃下离心150000×g 4小时，弃掉上清。
(6)将pellet重悬至1mL PBS中，转移至1mL离心管，配平后在4℃下离心150000 ×g 2小时，弃掉上清。
(7)将pellet重悬至100μL PBS中,提取总RNA。
2、cDNA合成和PCR扩增。
按照下述体系配制反转录反应体系：
反应条件：42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟。
反应结束后，短暂离心后置于冰上，用ddH2O稀释一倍，在进行后续荧光定量PCR反应。
PCR反应体系如下：2×PCR Master Mix 25μL，引物EML4-ALK-V1F、 EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F、EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM，反转录产物15μL，补ddH2O至50μL。
PCR扩增条件如下：95°10min；95°15s，60°30s，15个循环；95°15s 60°30s 收集荧光信号，35个循环。
3、病例EML4-ALK检测结果
共检测5例IHC阳性病例，病例信息如表1所示。检测结果表明，5病例均为 EML4-ALK阳性，具体结果如下表所示。
表1病例信息和病例样品提取及荧光定量PCR检测结果
编号 ALK IHC 病情描述 RNA提取量(pg/μL) Q-PCR
YF1-04 阳性 初诊 917和1128 EML4-ALK阳性
YF1-05 阳性 初诊 1170 EML4-ALK阳性
YF1-02 阳性 耐药 611 EML4-ALK阳性
YF1-06 阳性 初诊 908 EML4-ALK阳性
YF1-12 阳性 初诊 233 EML4-ALK阳性
为验证检测结果的准确性，对YF1-12样品的荧光定量PCR产物进行了一代测序。测序结果分别与EML4-ALK-V1,V2,V3a和V3b进行序列比对，发现YF1-12PCR产物序列与EML4-ALK-V1完全匹配，说明YF1-12病例为EML4-ALK-V1融合类型(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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序列表
<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司
<120> 基于囊泡检测EML4-ALK融合基因的引物和试剂盒
<130> KHP181112188.1
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcccacac ctgggaaag 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactggtccc cagacaacaa gta 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcataaagat gtcatcatca accaa 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcttgctca gcttgtactc agg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaagcac caggagctgc 20

Claims (8)

1.用于检测EML4-ALK融合基因的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
EML4-ALK-V1F:5′-GAGCCCACACCTGGGAAAG-3′
EML4-ALK-V2F:5′-GACTGGTCCCCAGACAACAAGTA-3′
EML4-ALK-V3F:5′-GCATAAAGATGTCATCATCAACCAA-3′
EML4-ALK-R:5′-AGCTTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3′。
2.用于qPCR或数字PCR检测EML4-ALK融合基因的引物和探针，其特征在于，所述引物为EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F和EML4-ALK-R，它们的定义同权利要求1所述；所述探针的序列如下：
EML4-ALK-Probe:5′-CCGGAAGCACCAGGAGCTGC-3′。
3.含有权利要求1所述引物、或权利要求2所述引物和探针的用于检测EML4-ALK融合基因的检测试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于囊泡中EML4-ALK融合基因的检测，所述囊泡提取自血液、胸腔积液、腹水或脑脊液。
5.一种用于qPCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系按50μL计为：2×PCR Master Mix 25μL，引物EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F、EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM，DNA模板或反转录产物15μL，补ddH2O至50μL；
其中，所述引物和探针的定义同权利要求2所述。
6.与权利要求5所述反应体系配套的PCR反应程序，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃30s，15个循环；95℃15s，60℃30s收集荧光，35个循环。
7.一种用于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系按15μL计为：Quantstudio 3D Master Mix 7.5μL，引物EML4-ALK-V1F、EML4-ALK-V2F、EML4-ALK-V3F、EML4-ALK-R和探针EML4-ALK-Probe各0.2μM，DNA模板或反转录产物3μL，补ddH2O至15μL；
其中，所述引物和探针的定义同权利要求2所述。
8.与权利要求7所述反应体系配套的PCR反应程序，其特征在于，所述PCR反应程序为：96℃预变性10min；60℃30s，98℃30s，50个循环；60℃2min。
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