CN110820051A - 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用 - Google Patents

一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用。相比于现有报道，本发明使用SMART技术，微量建库，同时获得高保真、高丰度的mRNA信息；使用的锚定多重PCR联合高通量测序检测方法，无需知晓与已知基因发生融合的基因，无需知晓融合方式，也可获得高准确率、高可信度、全面的发生融合基因的信息、转录组上的位点，这是现有的技术：RT‑PCR、IHC和FISH，都无法达到的。

Description

一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
本申请要求了2018年12月28日提交中国专利局的，申请号为201811621317.1，发明名称为“一种高灵敏度外泌体融合基因检测方法及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及高通量测序及文库构建领域，更具体地，涉及一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用。
背景技术
融合基因已经作为诊断肿瘤、检测肿瘤发展的分子标记以及治疗肿瘤的靶标，例如BCR-ABL融合基因上个世纪六十年代就被用于辅助诊断慢性粒细胞白血病，针对BCR-ABL融合的抑制剂Imatinib
(格列卫)是目前疗效良好的治疗慢性粒细胞白血病的靶向药物。又如针对融合基因EML4-ALK的靶向抑制药物Crizotinib成为临床治疗非小细胞肺癌的一线药物。2018年11月底美国FDA批准上市一款精准抗癌药———Vitrakvi，这是有史以来第一款TRK抑制药物，用于治疗携带NTRK基因融合的实体肿瘤病人，这是第一款与瘤种无关的“广谱”抗癌药，针对17种肿瘤治疗有75％的治疗有效率。
目前融合基因的检测，样本主要为瘤组织、循环肿瘤细胞或从全血中提取的mRNA。使用的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化化学方法(IHC)、荧光原位杂交技术(FISH)等方法。
RT-PCR存在以下局限性：1)必须知晓发生融合的两个基因的序列；2)必须知晓两基因发生融合的方式；3)不能或难以同时检测不同基因与一个已知基因的融合。利用该方法必须根据不同融合方式设计不同的引物来进行检测，且不能检测出未知的另一个融合基因以及未知的融合方式，这将直接导致融合基因检测困难及检出率的降低。
FISH法存在以下局限性：1)FISH操作方法复杂、耗时长；2)不能够确认参与融合的基因，也不能够区分不同的融合类型，可能会错失发生率低或者较为复杂的重排形式的融合基因；3)常规FISH方法需要计算不少于50个细胞，所以对于组织量少的标本(例如穿刺活检样本)，FISH不能操作；4)必须知晓发生融合的两个基因的序列来设计探针；5)两个发生融合的基因所在染色体的位置必须相距较近；6)不能同时检测不同基因与一个已知基因的融合。因此该方法须针对融合的两个基因的不同，设计不同的探针，且不能检测出未知的融合基因，这将影响到融合基因的检测率。
IHC法的局限性：1)结果是由人眼辨别切片的着色强度，并通过计分制判定结果，其中存在人为因素干扰，某些情况下，需要联合IHC和FISH两种方法做出判定结果；2)免疫组化利用的是抗原抗体特异性的原理，所以需要检测融合蛋白，并且需要针对该融合蛋白的特异性抗体，费用高，且可检测的蛋白极为有限。
肿瘤在发生发展过程中会连续不断地将外泌体释放到细胞微环境中，进一步进入体液循环中。目前，在许多体液中都可检测到外泌体的存在，如血液、恶性肿瘤形成的腹腔积液、尿液、羊水、乳汁和唾液等，这些临床样本收集方法简便，提高了使用外泌体作为临床检测的可行性。外泌体中含有来源于分泌细胞的多种蛋白质、信使RNA(mRNA)、小RNA(micoRNA)、DNA片段等信号分子，这些信号分子能够提供源细胞的相关信息，甚至包含细胞病变相关的特征信息，可以实时监测肿瘤细胞生理机能的变化，并且来源于肿瘤细胞的外泌体中的信号分子含量高于正常细胞。已有文章表明，肿瘤细胞分泌的外泌体中可以检测到肿瘤细胞来源的mRNA，并且外泌体中的mRNA可以反映肿瘤细胞mRNA的基因融合情况等生物学特性。Nilsson等分析11例前列腺癌患者尿液中外泌体的成分，发现外泌体融合基因TMPRSS2-ERG的表达高低与Gleason评分高低基本一致。
外泌体来源细胞可将特异的mRNA包裹进外泌体，然后分泌到体外，被受体细胞吸收，这些mRNA就包括发生了融合的基因。特别是当外泌体来源细胞是肿瘤细胞的时候，肿瘤mRNA往往发生存在于外泌体中。
在现有的检测方法方面，准确率、灵敏度、特异性最高的无疑是高通量测序。但是高通量测序分析外泌体的mRNA首先遇到的问题是极微量的外泌体mRNA起始样本量。单个外泌体的直径为30～100nm，而单个哺乳动物细胞直径为10μm，含有大约10pg总RNA，而根据经验，要获得足够进行常规转录组测序的总RNA量(2μg)，需要从100mL细胞培养基上清超速离心分离提纯外泌体！常规转录组测序所需的外泌体需求量过大，会影响研究工作进展，降低测序可行性。但目前市场上也缺乏特别针对外泌体mRNA进行高通量检测的专利技术。不经过逆转录与扩增进行外泌体mRNA高通量测序，结果错误率也较高。
因此，提供一种通过患者血清外泌体进行无创取样，且在只知晓发生融合的其中一个基因、而融合方式未知的情况下，能准确、特异性地检测融合基因的方法，能弥补现有技术的不足。
发明内容
本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
1)获取样品中的总RNA，在含Mg2+的第一缓冲体系中，在90-105℃条件下反应，获得片段化处理后的产物；
2)将1)所得产物加入cDNA第一链合成体系中，反应获得含有cDNA第一链的产物，所述cDNA第一链合成体系中包括逆转录引物、TSO引物；其中：
所述逆转录引物的序列包括：
第一接头序列和poly(N)区，N选自ATCG中的任一种，poly(N)区位于引物3’端；
所述TSO引物的序列包括：
第二接头序列和poly(G)区，poly(G)区位于引物3’端；
3)将2)所得产物加入第一轮PCR体系中，扩增获得第一轮PCR扩增产物，其中，所述第一轮PCR体系中，采用的扩增引物包括如下引物组：
引物组一：引物1、引物2，
其中，引物1的序列包括：TSO引物的第二接头序列；引物2的序列包括：逆转录引物的第一接头序列；
4)将3)所得第一轮PCR扩增产物进行第二轮多重PCR扩增，获得融合基因检测文库；其中，所述第二轮多重PCR扩增中，采用的扩增引物包括如下引物组：
引物组二：引物3、引物4、特异性引物，
其中，引物3的序列包括：测序通用接头序列-TSO引物的第二接头序列；
引物4的序列包括：测序通用接头序列-第三接头序列；
特异性引物的序列包括：第三接头序列，其中第三接头序列位于引物5’端。
优选地，所述步骤1)中，所述第一缓冲体系为：
Figure BDA0002343368740000031
优选地，所述步骤1)中，在94℃条件下反应5-8分钟。
优选地，所述步骤1)中，获得片段化处理后的RNA长度为250-350bp。
优选地，所述步骤2)中，所述第一链合成体系为：
Figure BDA0002343368740000032
优选地，所述步骤2)中，所述第一链合成体系反应条件为：
Figure BDA0002343368740000041
优选地，所述逆转录引物序列为
GGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACCTGCTTCCNNNNNN。
本领域技术人员可知的，所述TSO引物的poly(G)区包括：有两个核糖鸟苷(rG)和一个LNA-修饰的鸟苷(+G)。
优选地，所述TSO引物序列为TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTrGrG+G。
优选地，所述步骤3)中，所述引物1的序列为TCTTTCCCTACACGACGCTCTTC。
优选地，所述步骤3)中，所述引物2的序列为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。
优选地，所述步骤3)中，所述特异性引物的序列为表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一种或多种。
优选地，所述步骤3)中，所述第一轮PCR扩增的条件为：
Figure BDA0002343368740000042
优选地，所述步骤4)中，所述引物3序列为
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
优选地，所述步骤4)中，所述引物4序列为
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
优选地，所述步骤4)中，所述第二轮PCR的扩增条件为：
Figure BDA0002343368740000051
第二方面，本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测方法，包括将第一方面所得的高灵敏度融合基因检测文库用于高通量测序并进行生物信息学分析，获得高灵敏度融合基因检测结果。
第三方面，本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测试剂盒，包括表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一种或多种；以及引物1、引物2、引物3、引物4。
优选地，所述包括转录组测序文库快速构建试剂盒还包括第一方面所述的第一缓冲体系、第一链合成体系。
第四方面，本发明提供了如第一方面所述的一种高灵敏度融合基因检测文库构建方法或如第二方面所述的高灵敏度融合基因检测方法、或如第三方面所述的高灵敏度融合基因检测文库构建试剂盒在高灵敏度融合基因检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
综上，本发明使用SMART技术，微量建库，同时获得高保真、高丰度的mRNA信息；使用的锚定多重PCR联合高通量测序检测方法，无需知晓与已知基因发生融合的基因，无需知晓融合方式，也可获得高准确率、高可信度、全面的发生融合基因的信息、转录组上的位点，这是现有的技术：RT-PCR、IHC和FISH，都无法达到的。
附图说明
图1为本发明实施例提供的高灵敏度融合基因检测流程示意图，其中，P5锚定引物2为引物3；P7引物为引物4。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
在本发明一具体实施例中，结合图1所示的高灵敏度融合基因检测流程示意图，本发明提供了一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用。
本发明提供的一种高灵敏度融合基因检测方法，采用了本发明提供的高灵敏度融合基因检测试剂盒，所述方法包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：
1)使用明确发生ALK融合阳性细胞株：NCI-H2228为检测样本，提取总RNA。
2)总RNA Mg2+高温94℃打断5-8min，使RNA片段主峰在250-350bp范围内。
2.1按照下表配置反应体系：
2.2轻弹管壁混匀，短暂离心收集后置于冰上
2.3按照以下程序反应，热盖105℃：
Figure BDA0002343368740000062
3)第一链cDNA合成
3.1按照下表配制反应体系：
Figure BDA0002343368740000063
3.2配置完成后，轻弹管壁混匀，短暂离心收集样本。
3.3按照以下程序反应：
Figure BDA0002343368740000064
反应产物可储存在4℃过夜，放置时间请勿超过12小时。
第一链cDNA产物用1X磁珠纯化，13μl水洗脱。
第一轮PCR扩增
5.1按照下表配置反应体系：
5.2配置完成后，震荡混匀，短暂离心收集样本。
5.3按照以下程序反应：
Figure BDA0002343368740000072
第一轮PCR产物用1X磁珠纯化，23μl水洗脱。
第二轮锚定多重PCR
7.1按照下表配置反应体系：
7.2配置完成后，震荡混匀，短暂离心收集样本。
7.3按照以下程序反应：
Figure BDA0002343368740000081
第二轮PCR产物用1X磁珠纯化，23μl水洗脱。
Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测文库主峰大小。
上述步骤所用引物序列如表1所示：
Figure BDA0002343368740000082
Figure BDA0002343368740000091
本发明提供的技术方案用到的index序列如下表所示：
序号 序列 序号 序列
S502 CTCTCTAT N701 TAAGGCGA
S503 TATCCTCT N702 CGTACTAG
S505 GTAAGGAG N703 AGGCAGAA
S506 ACTGCATA N704 TCCTGAGC
S507 AAGGAGTA N705 GGACTCCT
S508 CTAAGCCT N706 TAGGCATG
S510 CGTCTAAT N707 CTCTCTAC
S511 TCTCTCCG N710 CGAGGCTG
S513 TCGACTAG N711 AAGAGGCA
S515 TTCTAGCT N712 GTAGAGGA
S516 CCTAGAGT N714 GCTCATGA
S517 GCGTAAGA N715 ATCTCAGG
S518 CTATTAAG N716 ACTCGCTA
S520 AAGGCTAT N718 GGAGCTAC
S521 GAGCCTTA N719 GCGTAGTA
S522 TTATGCGA N720 CGGAGCCT
N721 TACGCTGC
N722 ATGCGCAG
N723 TAGCGCTC
N724 ACTGAGCG
N726 CCTAAGAC
N727 CGATCAGT
N728 TGCAGCTA
N729 TCGACGTC
具体实验结果:
利用STAR-Fusion工具检测结果的融合基因。
生信分析参考文献：Haas,B.J.,Dobin,A.,Li,B.et al.Accuracy assessment offusion transcript detection via read-mapping and de novo fusion transcriptassembly-based methods.Genome Biol 20,213(2019)doi:10.1186/s13059-019-1842-9。
使用该方法检测ALK融合基因，在所述的包含EML4-ALK融合基因的NCI-H2228细胞系中，检测结果有EML4-ALK融合基因。测序结果如表2所示：
The JunctionReads：代表比对到fusion junction位置的数目
SpliceType：代表其是否是已知剪接还是新剪接
LeftGene:代表左侧的融合基因
FFPM:为每100万融合片段数，表达度量
The'LargeAnchorSupport':代表支持置信度，YES_LDAS代表可信
LeftBreakDinuc:代表左侧剪接位点
LeftBreakpoint:代表左侧基因融合位置
RightGene:代表右侧融合基因
RightBreakpoint:代表右侧基因融合位置
LeftBreakEntropy:代表左侧信息熵，取值0-2，值越大越可信
RightBreakEntropy:代表左侧信息熵，取值0-2，值越大越可信
RightBreakDinuc:代表右侧剪接位点
annots:代表融合基因已知的数据库来源
本方法的锚定多重PCR联合高通量测序检测融合基因方法的建立是基于ALK、RET、ROS1、NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因的特点，即其所有的融合基因包括并开始于的外显子位置；RET、ROS1、NTRK1、NTRK2、NTRK3融合基因的检测具有类似的效果。在部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，能够准确灵敏地检测方法来检测融合基因。
使用的锚定多重PCR联合高通量测序检测方法，无需知晓与已知基因发生融合的基因，无需知晓融合方式，也可获得高准确率、高可信度、全面的发生融合基因的信息、转录组上的位点，这是现有的技术：RT-PCR、IHC和FISH，都无法达到的。
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
序列表
<110> 广州表观生物科技有限公司
<120> 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagcagtg gtatcaacgc agagtacctg cttccnnnnn n 41
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttcccta cacgacgctc ttccgatctg gg 32
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctttcccta cacgacgctc ttc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcagacgt gtgctcttcc gatctgtcac cacagagagg atcagcgaga gtg 53
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttcagacgt gtgctcttcc gatctagctc catctgcatg gcttgcagct cct 53
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttcagacgt gtgctcttcc gatcttccct tctagtaatt tgggaatgcc tgg 53
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttcagacgt gtgctcttcc gatctcaaag gtcagtggga ttgtaacaac cag 53
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttcagacgt gtgctcttcc gatctagcac tgtcacccct tccttggcac tt 52
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttcagacgt gtgctcttcc gatctggaag attttcaatc tcctcttggg ttg 53
<210> 14
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcagacgt gtgctcttcc gatcttccag ccgtctcttg ctgactgcac ag 52
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gttcagacgt gtgctcttcc gatctaagag gacagcggct gcgatcaccg tg 52
<210> 16
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttcagacgt gtgctcttcc gatctaagaa ccaagttctt ccgagggaat tcc 53
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttcagacgt gtgctcttcc gatctagtcc tcctcaccac tgatgacagc 50
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttcagacgt gtgctcttcc gatctttcag cacgatgtct ctcctcttaa tg 52

Claims (10)

1.一种高灵敏度融合基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
1)获取样品中的总RNA，在含Mg2+的第一缓冲体系中，在90-105℃条件下反应，获得片段化处理后的产物；
2)将1)所得产物加入cDNA第一链合成体系中，反应获得含有cDNA第一链的产物，所述cDNA第一链合成体系中包括逆转录引物、TSO引物；其中：
所述逆转录引物的序列包括：
第一接头序列和poly(N)区，N选自ATCG中的任一种，poly(N)区位于引物3’端；
所述TSO引物的序列包括：
第二接头序列和poly(G)区，poly(G)区位于引物3’端；
3)将2)所得产物加入第一轮PCR体系中，扩增获得第一轮PCR扩增产物，其中，所述第一轮PCR体系中，采用的扩增引物包括如下引物组：
引物组一：引物1、引物2，
其中，引物1的序列包括：TSO引物的第二接头序列；引物2的序列包括：逆转录引物的第一接头序列；
4)将3)所得第一轮PCR扩增产物进行第二轮多重PCR扩增，获得融合基因检测文库；其中，所述第二轮多重PCR扩增中，采用的扩增引物包括如下引物组：
引物组二：引物3、引物4、特异性引物，
其中，引物3的序列包括：测序通用接头序列-TSO引物的第二接头序列；
引物4的序列包括：测序通用接头序列-第三接头序列；
特异性引物的序列包括：第三接头序列，其中第三接头序列位于引物5’端。
2.如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法，其特征在于，所述引物1、引物2、引物3、引物4的序列如表1所示。
3.如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，在94℃条件下片段化处理4分钟获得片段化处理后的RNA。
4.如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，获得片段化处理后的RNA长度为250-350bp。
5.如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述第一轮多重PCR的扩增条件为：
Figure FDA0002343368730000021
7.一种高灵敏度融合基因检测方法，其特征在于，将如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库用于高通量测序，获得高灵敏度融合基因检测结果。
8.一种高灵敏度融合基因检测文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表1中ALK_19_GSP，ALK_20_GSP，ROS1_32_GSP，ROS1_34_GSP，ROS1_35_GSP，ROS1_36_GSP，RET_8_GSP，RET_11_GSP，RET_12_GSP，NTRK3-14-GSP，NTRK3-15-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK2-13-GSP，NTRK1-9-GSP，NTRK1-10-GSP中的一种或多种；以及引物1、引物2、引物3、引物4。
9.如权利要求8所述的高灵敏度融合基因检测文库构建试剂盒，其特征在于，所述高灵敏度融合基因检测文库构建试剂盒还包括第一缓冲体系、第一链合成体系。
10.一种如权利要求1所述的高灵敏度融合基因检测文库构建方法或如权利要求7所述的高灵敏度融合基因检测方法、或如权利要求7所述的高灵敏度融合基因检测文库构建试剂盒在高灵敏度融合基因检测中的应用。
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