JP2012100628A - Eml4−alk融合遺伝子の高感度検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検出方法は、(A)試料から鋳型DNAを調製する工程、(B)前記鋳型DNAに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程を含む。
【選択図】なし
Description
[1](A)試料から鋳型DNAを調製する工程、
(B)前記鋳型DNAに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号11と配列番号15の組合せ、配列番号20と配列番号18又は21の組合せ、配列番号23又は26と配列番号24の組合せ、配列番号32と配列番号33の組合せ、配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せ、配列番号41と配列番号45の組合せ、配列番号47と配列番号48の組合せ、配列番号50と配列番号51の組合せ、配列番号56と配列番号54の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、EML4−ALK融合遺伝子を検出する方法;
[2]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号11と配列番号15の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント1を検出する方法;
[3]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号20と配列番号18又は21の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント2を検出する方法;
[4]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号23又は26と配列番号24の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aを検出する方法;
[5]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号32と配列番号33の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3bを検出する方法;
[6]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント4を検出する方法;
[7]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号41と配列番号45の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5aを検出する方法;
[8]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号47と配列番号48の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5bを検出する方法;
[9]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号50と配列番号51の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント6を検出する方法;
[10]前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号56と配列番号54の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント7を検出する方法;
[11](a)融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号11と配列番号15の組合せ、配列番号20と配列番号18又は21の組合せ、配列番号23又は26と配列番号24の組合せ、配列番号32と配列番号33の組合せ、配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せ、配列番号41と配列番号45の組合せ、配列番号47と配列番号48の組合せ、配列番号50と配列番号51の組合せ、配列番号56と配列番号54の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
(b)前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、EML4−ALK融合遺伝子を検出する方法;
[12]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号11と配列番号15の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号13及び/又は配列番号16であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント1を検出する方法;
[13]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号20と配列番号18又は21の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号19及び/又は配列番号22であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント2を検出する方法;
[14]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号23又は26と配列番号24の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号25及び/又は配列番号28であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aを検出する方法;
[15]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号32と配列番号33の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号31及び/又は配列番号34であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3bを検出する方法;
[16]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号37及び/又は配列番号40であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント4を検出する方法;
[17]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号41と配列番号45の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号43及び/又は配列番号46であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5aを検出する方法;
[18]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号47と配列番号48の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号49であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5bを検出する方法;
[19]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号50と配列番号51の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号52であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント6を検出する方法;
[20]前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号56と配列番号54の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号55及び/又は配列番号58であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント7を検出する方法;
[21]配列番号11と12の組合せ、配列番号14と15の組合せ、配列番号17と18の組合せ、配列番号20と21の組合せ、配列番号23と24の組合せ、配列番号26と27の組合せ、配列番号29と30の組合せ、配列番号32と33の組合せ、配列番号35と36の組合せ、配列番号38と39の組合せ、配列番号41と42の組合せ、配列番号44と45の組合せ、配列番号47と48の組合せ、配列番号50と51の組合せ、配列番号53と54の組合せ、配列番号56と57の組合せから選択される、プライマーセット;
に関する。
・EML4遺伝子のエクソン1−13とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント1」(AB274722.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−20とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント2」(AB275889.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−6とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント3a」(AB374361.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−6とクリプティックエクソン(Additional cryptic exon)とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント3b」(AB374362.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−14と未知配列とALK遺伝子のエクソン20が逆の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント4」(AB374363.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−2とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント5a」(AB374364.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−2とALK遺伝子のイントロン19の一部とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント5b」(AB374365.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−13と未知配列とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント6」(AB462411.1:図11)、
・EML4遺伝子のエクソン1−14とALK遺伝子のエクソン20が正の向きで融合した「EML4−ALK融合遺伝子バリアント7」(AB462412.1:図11)
が含まれる。
1.鋳型DNAの構築
EML4−ALKバリアント1検出のための鋳型DNAとして、該バリアント1(配列番号1)全長を含むベクターであるpDNR-dual donor vector/EML4-ALKバリアント1を使用した(近畿大学医学部腫瘍内科より供与、pDNR-dual donor vectorはクロンテック社)。EML4−ALKバリアント3b(配列番号4)検出のための鋳型DNAとして、該バリアント3b全長を含むベクターであるpcDNA3.1(+)/EML4-ALKバリアント3bを使用した(近畿大学医学部腫瘍内科より供与)。EML4−ALKバリアント2(配列番号2)、EML4−ALKバリアント3a(配列番号3)、EML4−ALKバリアント4(配列番号5)、EML4−ALKバリアント5a(配列番号6)、EML4−ALKバリアント5b(配列番号7)、EML4−ALKバリアント6(配列番号8)、EML4−ALKバリアント7(配列番号9)の検出のための鋳型DNAは、In fusionシステム(クロンテック社)を用いて、各々融合ポイントを挟む約1,000bpのDNA配列をpcDNA3.1(+)(インビトロジェン社)に導入したプラスミドを作製、使用した。
細胞株における融合遺伝子発現株および非発現株として、ヒト肺がん細胞株であるNCI−H3122(EML4−ALK/バリアント1遺伝子発現株:近畿大学医学部腫瘍内科より入手)及びNCI−H2228(EML4−ALK/バリアント3a及び3b遺伝子発現株:近畿大学医学部腫瘍内科(あるいはATCC)より入手)、ヒト胃がん細胞株であるMKN1(野生型ALK発現株:JCRB細胞バンクより入手)を用いた。これらの細胞株は、定法に従って培養した。
EML4−ALK融合遺伝子及び野生型ALK遺伝子の検出は、MALDI−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型)質量分析装置を用いたMassARRAYシステム(シーケノム社)により行った。検出対象とする遺伝子は、9種の融合遺伝子(バリアント1、バリアント2、バリアント3a、バリアント3b、バリアント4、バリアント5a、バリアント6、及びバリアント7)並びにALKの10種である。各バリアントの融合ポイントを含む特定領域をPCRによって増幅した後、融合ポイントを含む領域に伸長用プライマーをハイブリダイズし、一塩基伸長反応を行った。一塩基伸長反応により生成されたDNA断片をマトリックスチップに塗布し、MALDI−TOF質量分析計によってDNA断片の質量数から解析し、検出塩基を決定することで、測定対象の遺伝子を同定した。なお、ALKの検出のためには、融合点を含まず、融合遺伝子が有していないエクソン上(エクソン19)にもプライマーを設計した。
実施例1で調製したプラスミドDNAの0.1ngを用いて、野生型ALK遺伝子およびEML4−ALK融合遺伝子が、実施例1に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は表5に示すとおりである。
実施例1で調製した鋳型cDNAの1ngを用いて、野生型ALK遺伝子およびEML4−ALK融合遺伝子が、実施例1に示した方法によって検出可能か検討した。検討した測定条件は、ヒト肺がん細胞株であるNCI−H3122(EML4−ALK/バリアント1遺伝子発現株)でEML4−ALK/バリアント1遺伝子が同定可能か、NCI−H2228(EML4−ALK/バリアント3a遺伝子及び3b遺伝子発現株)でEML4−ALK/バリアント3a遺伝子が同定可能か、及びヒト胃がん細胞株であるMKN1(野生型ALK遺伝子発現株)で野生型ALK遺伝子が同定可能かである。
実施例1に従って、肺がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片(FFPE)からmRNAを抽出し鋳型cDNAを調製した。そのcDNA 4ngを用いて、EML4−ALK融合遺伝子が、実施例1に示した方法によって検出可能か検討した。検討した条件は以下のように、EML4−ALK融合遺伝子バリアント1、バリアント2、バリアント3a、バリアント3b、バリアント4、バリアント5a、バリアント5b、バリアント6、バリアント7を検出可能な条件で行った。
実施例4で得られた、MassARRAYシステムの増幅反応で得られたPCR増幅産物の配列解析を行った。前記PCR増幅産物を、TOPO TA Cloning Kit(インビトロジェン社)によりサブクローニングし、得られた複数のシングルコロニーの挿入配列をダイレクトシークエンスにて解析した。その結果、EML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aと同一であった。このことから、使用した臨床検体は、EML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aを有することが確認できた。
実施例1に従ったMassARRAYシステムによるEML4−ALK融合遺伝子バリアント3aの検出感度を、PCR法と比較した。PCRの結果としてはMassARRAYシステムの増幅工程で得られた増幅産物を使用した。PCRによる増幅産物の確認はバイオアナライザー(アジレント・テクノロジー)で行った。
臨床検体では、多量の正常細胞中に微量の異常細胞が混合している状態で存在している。そのような共雑物が混合している場合でも、目的のEML4−ALK融合遺伝子が検出可能か検討した。
Claims (21)
- (A)試料から鋳型DNAを調製する工程、
(B)前記鋳型DNAに対し、融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号11と配列番号15の組合せ、配列番号20と配列番号18又は21の組合せ、配列番号23又は26と配列番号24の組合せ、配列番号32と配列番号33の組合せ、配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せ、配列番号41と配列番号45の組合せ、配列番号47と配列番号48の組合せ、配列番号50と配列番号51の組合せ、配列番号56と配列番号54の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程
を含む、EML4−ALK融合遺伝子を検出する方法。 - 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号11と配列番号15の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント1を検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号20と配列番号18又は21の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント2を検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号23又は26と配列番号24の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aを検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号32と配列番号33の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3bを検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント4を検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号41と配列番号45の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5aを検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号47と配列番号48の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5bを検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号50と配列番号51の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント6を検出する方法。
- 前記[1]の方法において、増幅用プライマーが配列番号56と配列番号54の組合せであるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント7を検出する方法。
- (a)融合点を含む領域を増幅する増幅用プライマーの組合せであって、配列番号11と配列番号15の組合せ、配列番号20と配列番号18又は21の組合せ、配列番号23又は26と配列番号24の組合せ、配列番号32と配列番号33の組合せ、配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せ、配列番号41と配列番号45の組合せ、配列番号47と配列番号48の組合せ、配列番号50と配列番号51の組合せ、配列番号56と配列番号54の組合せから選択される少なくとも一つの該増幅用プライマーの組合せを使用することによって増幅可能な塩基配列領域内を増幅する工程、
(b)前記増幅産物を鋳型として、該融合点を挟む領域に相補的な検出プライマーを使用して一塩基伸長反応を行う工程
を含む、EML4−ALK融合遺伝子を検出する方法。 - 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号11と配列番号15の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号13及び/又は配列番号16であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント1を検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号20と配列番号18又は21の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号19及び/又は配列番号22であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント2を検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号23又は26と配列番号24の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号25及び/又は配列番号28であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3aを検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号32と配列番号33の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号31及び/又は配列番号34であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント3bを検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号35又は38と配列番号36又は39の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号37及び/又は配列番号40であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント4を検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号41と配列番号45の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号43及び/又は配列番号46であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5aを検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号47と配列番号48の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号49であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント5bを検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号50と配列番号51の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号52であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント6を検出する方法。
- 前記[11]の方法において、増幅用プライマーが配列番号56と配列番号54の組合せであり、伸長用プライマーが配列番号55及び/又は配列番号58であるEML4−ALK融合遺伝子のバリアント7を検出する方法。
- 配列番号11と12の組合せ、配列番号14と15の組合せ、配列番号17と18の組合せ、配列番号20と21の組合せ、配列番号23と24の組合せ、配列番号26と27の組合せ、配列番号29と30の組合せ、配列番号32と33の組合せ、配列番号35と36の組合せ、配列番号38と39の組合せ、配列番号41と42の組合せ、配列番号44と45の組合せ、配列番号47と48の組合せ、配列番号50と51の組合せ、配列番号53と54の組合せ、配列番号56と57の組合せから選択される、プライマーセット。
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