JP2022528182A - 神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、及びそれに係わる情報を提供する方法 - Google Patents

神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、及びそれに係わる情報を提供する方法 Download PDF

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Abstract

ターゲット遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、バイオマーカーパネル及びキット、神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法、並びに神経膠腫に係わる個人誂え型医療のためのバイオマーカーパネル及び個人誂え型治療のための情報を提供する方法に係り、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子における遺伝子変異またはタンパク質変異を検出する場合、神経膠腫診断に対する診断の正確度が高く、敏感度も高く、効果的な神経膠腫の診断が可能であり、該ターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する製剤を利用すれば、神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、キット、情報提供方法、及び個人誂え型治療のための情報を提供する方法に有用に利用されうる。【選択図】図４ｃ

Description

ターゲット遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫（glioma）の診断用または予後予測用の組成物、バイオマーカーパネル及びキット、神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法、並びに神経膠腫に係わる個人誂え型医療のためのバイオマーカーパネル及び個人誂え型治療のための情報を提供する方法に関する。
腫瘍（tumor）は、異常な細胞の過剰によって発生する比制御的であって無秩序な細胞増殖の産物であり、そのような腫瘍が、破壊的な増殖性、浸潤及び転移性を有することになれば、悪性腫瘍（malignant tumor）に分類することになる。特に、分子生物学的な観点から見るとき、遺伝子の変異によって生じる遺伝的疾患であると言える。
そのうち、神経膠腫（glioma）は、神経源、神経膠細胞に起源し、ほとんど周囲の正常組織内に侵透して成長し、細胞の成長制御が損失され、逸早い成長を示し、手術で完全に除去し難い特性を示している。特に、神経膠腫は、組織学及び分子的にさまざまな分類に区分されるが、それを正確に診断するために、現在まで、ＩＤＨ１／２の体細胞突然変異、ＥＧＦＲのゲノム増幅、染色体１ｐアーム（arm）及び染色体１９ｑアームの共欠失を確認している。ただし、ＩＤＨ１／２突然変異は、主に、低級神経膠腫及び二次膠芽細胞腫で頻繁に確認され、患者の臓器生存と関連性が深いと周知されている。また、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の局所増幅は、膠芽細胞腫の約５０％において確認される。また、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、細胞増殖を促進させると知られているので、癌治療のために、ＥＧＦＲ抑制剤に係わる臨床試験が頻繁に行われている。
従って、神経膠腫を効果的に診断するために、前記神経膠腫の増殖に重要な遺伝子と見られるＩＤＨ１のターゲット突然変異と、ＥＧＦＲの局所的増幅に対する病理学的診断を行うために、免疫組織化学法（ＩＨＣ）と蛍光インサイチュ（in situ）ハイブリデーション（ＦＩＳＨ）とを通常使用しているが、さらに簡便な方法でもって、前記神経膠腫を効果的に診断するための必要性が提起されている。
一様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫（glioma）の診断用または予後予測用の組成物及びバイオマーカーパネルに係わるものである。
一様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含むキットに係わるものである。
他の様態は、個体の生物学的試料から核酸試料を得る段階と、得られた試料から、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階と、を含む神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法に係わるものである。
さらに他の様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫に係わる個人誂え型医療のためのバイオマーカーパネルに係わるものである。
さらに他の様態は、個体から分離された生物学的試料において、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、前記検出結果において、遺伝子変異が検出される前記個体を、治療ターゲットとして設定する段階と、を含む個人誂え型治療のための情報を提供する方法に係わるものである。
一様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫（glioma）の診断用または予後予測用の組成物及びバイオマーカーパネルを提供する。
神経膠腫は、脳と脊髄との内部にある神経膠細胞に起源する腫瘍（tumor）であり、該神経膠腫は、腫瘍を構成する主な細胞により、星状細胞腫（astrocytic tumors）、乏突起膠細胞腫（oligodendroglial tumors）、上衣細胞腫（ependymal tumors）などに分類され、一様態の組成物を介して診断または予後予測が可能な組成物は、例えば、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、混合神経膠腫（mixedgliomas）及び上衣細胞腫からなる群のうちから選択された１種以上でもある。
用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。それは、目的上、神経膠腫の発病いかんを確認するものである。用語「予後」とは、神経膠腫の、例えば、追っての当該個体の生存率、治療後、当該個体の再発、転移、薬物反応性、耐性などのいかんを判断することを意味する。個体の試料から、一様態のＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異レベルを確認することにより、当該個体の神経膠腫の発病いかんだけではなく、追っての当該個体の生存予後が良好であるか否かということについてまで予測であることを意味する。
神経膠腫を有した個体は、染色体１番の短腕（１ｐ）と、１９番の長腕（１９ｑ）との共欠失と関連が深いということが知られており、該神経膠腫を有した個体において、１ｐ及び１９ｑの共欠失を有する個体の場合、抗癌剤感受性と生存率上昇とが関連が深いということが周知されており、１ｐと１９ｑとの共欠失により、個体の追っての予後まで効果的に予測することができるということが知られている。それにより、一様態の製剤は、前記１ｐと前記１９ｑとの共欠失を効果的に検出し、神経膠腫を正確に診断し、予後を予測するためのターゲット遺伝子２０種を確認し、前記２０種遺伝子の変異レベルを検出する場合を介し、神経膠腫を有した個体、及びその予後を高い正確度と敏感度で予測することができることを確認した。
前記一様態で確認したターゲット遺伝子２０種の変異は、正常人と比較したとき、神経膠腫患者の血液で高く発現されるので、特に、臨床的に診断が困難である神経膠腫を有した個体の診断にも活用される。
前記ＳＡＭＤ１１は、染色体内ｃｈｒ１：８６０２３５－８７９５５８に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１８７６３４である。ＫＬＨＬ２１は、染色体内ｃｈｒ１：６６５３４００－６６７４６９２に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１６２４１３である。ＦＡＭ１６７Ｂは、染色体内ｃｈｒ１：３２７１２７９３－３２７１４２２７に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１８３６１５である。ＨＰＣＡＬ４は、染色体内ｃｈｒ１：４０１４８１８３－４０１５７４０７に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１１６９８３である。ＧＰＢＰ１Ｌ１は、染色体内ｃｈｒ１：４６０９３９０３－４６１５２３２７に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１５９５９２である。ＬＰＨＮ２は、染色体内ｃｈｒ１：８１７７１８２０－８２４５８１４５に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１１７１１４である。ＧＰＲ８８は、染色体内ｃｈｒ１：１０１００３６６８－１０１００７６０８に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１８１６５６である。ＺＮＦ５９９は、染色体内ｃｈｒ１９：３５２４９９１４－３５２６４１５９に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１５３８９６である。Ｃ１９ＯＲＦ３３は、染色体内ｃｈｒ１９：３８７９４７７６－３８７９５６７１に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１６７６４４である。Ｂ９Ｄ２は、染色体内ｃｈｒ１９：４１８６０５８０－４１８７０１０３に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１２３８１０である。ＢＣＡＭは、染色体内ｃｈｒ１９：４５３１２２９１－４５３２４６９８に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１８７２４４である。ＣＡＢＰ５は、染色体内ｃｈｒ１９：４８５３３７８９－４８５４７３３６に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１０５５０７である。ＳＩＧＬＥＣ１１は、染色体内ｃｈｒ１９：５０４５３２０２－５０４６４４５４に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１６１６４０である。ＥＲＶＶ－２は、染色体内ｃｈｒ１９：５３５４７９６６－５３５５４４０５に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００２６８９６４である。ＺＮＦ８６５は、染色体内ｃｈｒ１９：５６１１６７４６－５６１２９９３２に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００２６１２２１である。ＭＺＦ１は、染色体内ｃｈｒ１９：５９０７３４１４－５９０８４９６７に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ００００００９９３２６である。ＭＲＴＯ４は、染色体内ｃｈｒ１：１９５７８００８－１９５８５３４９に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ００００００５３３７２である。ＬＲＩＧ２は、染色体内ｃｈｒ１：１１３６１５７６７－１１３６６９８４７に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１９８７９９である。ＢＳＮＤは、染色体内ｃｈｒ１：５５４６４５８１－５５４７４３２６に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１６２３９９である。ＳＬＣ３０Ａ２は、染色体内ｃｈｒ１：２６３６５６２６－２６３７２６５４に存在すると知られており、Ensembl ＩＤ numberは、ＥＮＳＧ０００００１５８０１４である。
一様態において、組成物に含まれている製剤は、１）単一塩基配列変異、２）１個ないし５０個のヌクレオチドの塩基配列部位の欠失または挿入、３）コピー数変異（copy number variant）、あるいは４）前記１）ないし前記３）のうちから選択された２種以上の組み合わせでもある。
前記「変異」は、誘電体において、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の変更（alteration）を意味する。該変異は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸の、置き換え（substitution）、挿入（insertion）、欠失（deletion）（挿入、欠失を、ＩｎＤｅｌ：insertion，deletionともいう）などを含むものでもある。置換は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が、他の塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸に変わる変更を意味する。挿入は、他の塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が追加される変更を意味する。欠失は、塩基、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸が除去される変更を意味する。
単一塩基配列変異または単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ：single nucleotide variant）は、遺伝体上において、１つの塩基またはヌクレオチドの違いを示す配列の変更または変異を意味する。該単一塩基変異は、単一塩基多形成（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism）とも混用される。該ＳＮＰは、遺伝体上において、単一塩基またはヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ；ヌクレオチドＡは、アデニン、ヌクレオチドＴは、チミン、ヌクレオチドＣは、シトシン、ヌクレオチドＧは、グアニンを意味する）が、種のメンバー間、または一個体（individual）の対染色体間において異なる場合に生じる塩基配列またはヌクレオチド配列の多様性を意味する。該ＳＮＰは、一集団（population）において、少数、１％以上または５％以上の頻度で存在する２個以上の対立する塩基配列またはヌクレオチド配列でもある。該ＳＮＰは、ヒト遺伝体上に最も多く存在する遺伝的多形成であり、遺伝学的に、該ＳＮＰ位置により、各個体に大きな違いを引き起こしうる。例えば、該ＳＮＰが、タンパク質を暗号化している位置に存在する場合、タンパク質構造に影響を及ぼし、タンパク質機能が異なりもし、疾病を誘発しうる。該ＳＮＰが、タンパク質を暗号化しない非暗号化領域に存在する場合、すなわち、プローモーター（promoter）またはイントロン（intron）に存在する場合、それぞれにつき、タンパク質の発現レベルに違いをもたらし、そのタンパク質の全体的な活性が上昇したり低下したりし、選択的スプライシング（alternative splicing）を介し、異常タンパク質が発現されうる。
前記コピー数変異は、参照配列と比較したとき、コピー数が異なる１ｋｂ以上長さの変異区間を言い、前記コピー数変異を測定することができる方法は、例えば、蛍光核酸混成化（ＦＩＳＨ：fluorescence in situ hybridization）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：chromatin immuno precipitation）及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）でもあるが、それらに制限されるものではない。具体的な一実施様態において、ＳＡＭＤ１１，ＫＬＨＬ２１，ＦＡＭ１６７Ｂ，ＨＰＣＡＬ４，ＧＰＢＰ１Ｌ１，ＬＰＨＮ２，ＧＰＲ８８，ＺＮＦ５９９，Ｃ１９ＯＲＦ３３，Ｂ９Ｄ２，ＢＣＡＭ，ＣＡＢＰ５，ＳＩＧＬＥＣ１１，ＥＲＶＶ－２，ＺＮＦ８６５，ＭＺＦ１，ＭＲＴＯ４，ＬＲＩＧ２，ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２遺伝子のコピー数変異を検出する場合、個体の染色体１と染色体１９の１ｐと１９ｑとの共欠失が示され、神経膠腫を効果的に検出することができる。
用語「バイオマーカーパネル」は、神経膠腫診断のためのバイオマーカーの任意の組み合わせを使用して構成されたものであり、前記組み合わせは、全体セット、またはその任意のサブセットまたはサブ組み合わせを意味しうる。すなわち、該バイオマーカーパネルは、バイオマーカー１セットを意味し、測定される任意形態のバイオマーカーを意味しうる。従って、ＲＰＬ２３がバイオマーカーパネルの一部である場合、例えば、ＲＰＬ２３ｍＲＮＡまたはＲＰＬ２３タンパク質が、前記パネルの一部であると見なすことができる。個別バイオマーカーが診断剤として有用である一方、時には、特定状態決定において、単独で単一のバイオマーカーよりは、バイオマーカー組み合わせがさらに大きい値を提供することができる。具体的には、試料において、複数個のバイオマーカー検が、試験の感度及び／または特異性を増大させることができる。従って、一具体例において、バイオマーカーパネルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のバイオマーカー類型を含んでもよい。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、最小個数のバイオマーカーで構成され、最大量の情報を生成する。従って、多様な具体例において、該バイオマーカーパネルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のバイオマーカー類型によって構成される。該バイオマーカーパネルが、「バイオマーカー１セット」で構成される場合、前記セットをなすもの以外には、いかなるバイオマーカーも存在しない。一具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された２個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された３個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された４個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された５個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された６個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された７個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された８個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された９個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１０個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１１個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１２個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１３個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１４個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１５個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１６個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１７個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１８個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された１９個のバイオマーカーで構成される。他の具体例において、該バイオマーカーパネルは、本願に開示された２０個のバイオマーカーで構成される。本発明のバイオマーカーは、神経膠腫診断及びその予後予測において、統計学上有意な違いを示す。一具体例において、そのようなバイオマーカーを、単独または組み合わせて使用する診断試験は、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上及び約１００％の感度及び特異性を示す。
前記バイオマーカーは、細胞の転写体データから獲得されたものでもある。
一様態の前記遺伝子の変異を検出する製剤は、プライマー対、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含んでもよい。具体的には、前記バイオマーカー遺伝子の変異レベルを測定するための製剤でもあり、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー対、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドでもある。一具体例において、前記バイオパネルは、少なくとも２種のプライマー対、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含み、前記それぞれのプライマー対、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドは、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２に特異的に結合することができる。
特に、前記プライマーは、増幅されたＰＣＲ産物が、次世代シーケンサ（ＮＧＳ）を利用し、神経膠腫を効果的に診断し、予後を予測するために、最適サイズの比較配列を得ることができるように、配列を増幅することを特徴とする。
前記プライマー、前記プローブまたは前記アンチセンスヌクレオチドは、検出可能な標識によって標識されたものであるポリヌクレオチドでもある。検出可能な標識は、検出可能な信号を発生させることができる標識物質であり、蛍光物質、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５のような物質を含む検出可能な信号を発生させることができる標識物質でもある。前記検出可能な標識は、核酸の混成化結果を確認することができる。
用語プライマー（primer）は、重合酵素によるヌクレオチドの重合反応において、開始点として作用することができる一本鎖のオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、前記プライマーは、適する温度及び適する緩衝液内において、適する条件、すなわち、４種の異なるヌクレオシド三リン酸及び重合酵素の存在下で、テンプレート指示（template-directed）ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖のオリゴヌクレオチドでもある。プライマーの適する長さは、多様な因子、例えば、温度と、プライマーの用途とによっても異なる。前記プライマーは、長さが、５ないし１００ｎｔ、５ないし７０ｎｔ、１０ないし５０ｎｔ、または１５ないし３０ｎｔでもある。例えば、プライマーの長さが短いほど、低いアニーリング（annealing）温度で、テンプレートと十分に安定した混成化複合体を形成することができる。
前記プライマーは、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、アルキルホスホロチオエートのようなヌクレオチド類似体（analogue）、ペプチド核酸（peptide nucleic acid）または挿入物質（intercalating agent）をさらに含んでもよい。また、蛍光、リン光または放射性を発する標識物質をさらに含んでもよい。前記蛍光標識物質は、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＦＡＭ、ＰＥＴ、またはそれらの組み合わせでもある。前記標識物質は、前記ポリヌクレオチドの５’末端にも標識される。また、該放射性標識物質は、３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性同位元素が添加された重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）反応液を利用したＰＣＲ反応を介し、増幅産物にも混入される。
用語プローブ（probe）は、相補的なポリヌクレオチド鎖に配列特異的に結合することができるポリヌクレオチドを言う。前記プローブは、長さが５ないし１００ｎｔ、１０ないし９０ｎｔ、１５ないし８０ｎｔ、２０ないし７０ｎｔ、または３０ないし５０ｎｔでもある。前記プローブは、混成化方法、例えば、マイクロアレイ（microarray）、サザンブロッティング、ダイナミック対立遺伝子混成化（dynamic allele-specific hybridization）及びＤＮＡチップなどを利用した方法にも利用される。該マイクロアレイは、当業界に知られた意味で使用され、例えば、基板上の複数個の区分された領域に、プローブ、またはプローブの集団が固定化されているものでもある。前記基板は、適する堅固性または半堅固性の支持体であり、例えば、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウェーハ、ファイバ、磁気性ビードまたは非磁気性ビード、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子及び毛細管を含んでもよい。前記プローブ、またはそれに相補的なプローブは、個体から得られた核酸と混成化され、そこから得られる混成化程度を測定することができる方法にも利用される。
一様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子変異を検出する製剤を含むキット（kit）を提供する。
前記キットは、ターゲット遺伝子の遺伝子変異を予測するためのキットでもある。該キットは、当業界に知られた意味にも使用される。前記キットは、例えば、前述のようなポリヌクレオチドと、その特定用途に必要な項目と、を含むものでもある。前述のようなポリヌクレオチドと共に、その使用方法に必要な試薬を含むものでもある。
一様態のキットは、増幅反応を行うための試薬を含み、耐熱性ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰｓ、バッファなどを含んでもよい。また、本発明のキットは、最適の反応遂行条件を記載したユーザ案内書を追加して含んでもよい。該案内は、キット使用法、例えば、ＰＣＲ緩衝液製造方法、提示される反応条件などを説明する印刷物である。該案内は、パンフレット形態またはプリント形態の案内パンフレット、キットに付着されたラベル、及びキットを含むパッケージ表面上の説明を含む。また、該案内は、インターネットのように、電気媒体を介して公開されたり提供されたりする情報を含む。
他の様態は、個体の生物学的試料から核酸試料を得る段階と、得られた試料から、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階と、を含む神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法を提供する。
前記方法は、個体の生物学的試料から核酸試料を得る段階を含む。
前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。
前記生物学的試料は、生物から得られた試料を言う。前記生物学的試料は、例えば、患者の血液、血漿、血清、小便及び唾液からなる群のうちから選択された１種以上でもある。
前記生物学的試料から、ターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する通常のＤＮＡ分離方法をさらに含んでも遂行される。例えば、前記分離方法は、標的核酸を、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）、転写増幅（transcription amplification）またはリアルタイム核酸配列基礎増幅（ＮＡＳＢＡ：realtime-nucleic acid sequence based amplification）を介して増幅し、それを精製して得ることができる。
前記遺伝子変異を分析する段階は、前記ターゲット遺伝子における特定変異の有無に基づき、個体または被検体が神経膠腫にかかる危険性、または神経膠腫を示す患者であるか否かということを判別することができる。
ターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階は、例えば、次世代シーケンサプラットホームにもより、前記次世代シーケンサプラットホームは、全体ゲノムシーケンシング（whole-genome sequencing）、全体エキソームシーケンシング（whole-exomes sequencing）、またはターゲット遺伝子パネルシーケンシング（target gene panel sequencing）でもあるが、それらに制限されるものではない。
また、検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階において、遺伝子の変異レベル分析は、遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失（co-deletion）いかんを確認するものでもある。
前記個体の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報提供は、神経膠腫の発現と関連性が高い遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失に対する相対的な危険性を予測し、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子変異レベルを測定することにより、神経膠腫に対する相対的な危険性を予測したり診断したりするためのものでもある。例えば、前記危険性は、参照遺伝体配列を有している群に比べ、ターゲット遺伝子の変異レベルが高ければ、神経膠腫の発病可能性が上昇しているか否かということを予測したり診断したりするためのものでもある。前記ターゲット遺伝子において変異が、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上である場合、遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失の可能性が高く、それと関連性が高い神経膠腫の発病危険性が高いと判断することができ、それを介し、神経膠腫の診断または予後の予測に係わる正確度が高くもなる。一具体例において、前記ターゲット遺伝子２０種のいずれにもｌコピー数変異が測定される場合、遺伝体１ｐ染色体及び遺伝体１９ｑ染色体の共欠失が示されることを確認し、神経膠腫を効果的に診断することができるということを確認した。
一様態において、前記検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階は、ターゲット遺伝子２０種のいずれにもコピー数変異が測定される場合、遺伝体１ｐ染色体及び遺伝体１９ｑ染色体の共欠失が示される個体を、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される神経膠腫を有した個体と決定する段階を含んでもよい。また、該個体が、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される場合、神経膠腫患者は、生存率が高いか否かということを決定することができるので、前記検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階は、前記ターゲット遺伝子２０種のいずれにもコピー数変異が示され、前記個体が、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される神経膠腫を有した個体と決定される場合、該神経膠腫患者は、生存率が高く、神経膠腫患者の予後が良好であるか否かということを予測する段階をさらに含んでもよい。
前記方法において、前記遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階は、ヌクレオチド配列または塩基配列を決定する方法であり、シーケンシング、例えば、全体ゲノムシーケンシング、全体エキソームシーケンシングまたはターゲット遺伝子パネルシーケンシングでもあり、マイクロアレイによる混成化、対立遺伝子特異的なＰＣＲ（allele-specific ＰＣＲ）、ダイナミック対立遺伝子混成化、ＰＣＲ延長分析、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ＰＣＲ－single strand conformation polymorphism）及びＴａｑＭａｎの方法からなる群から選択された１以上の技法によって遂行されるものでもある。前記遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階は、前記組成物またはキットを利用することができる。
さらに他の様態は、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫に係わる個人誂え型医療のためのバイオマーカーパネルを提供する。
さらに他の様態は、個体から分離された生物学的試料において、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、前記検出結果において、遺伝子変異が検出される前記個体を、治療ターゲットとして設定する段階と、を含む個人誂え型治療のための情報を提供する方法を提供する。
前述のように、一具体例によるバイオマーカー遺伝子パネルは、患者個人別腫瘍遺伝子に基づくが、誂え型遺伝子治療を介し、神経膠腫の治療効果を増進させることができる。また、前記遺伝子パネルは、コピー数変異がその標的対象になるので、前記遺伝子変異によって生じる多様な疾患である神経膠腫に対し、効果的に標的治療を行うことができる。
一具体例において、前記ターゲット遺伝子２０種のいずれにもコピー数変異が測定される場合、遺伝体１ｐ染色体及び遺伝体１９ｑ染色体の共欠失が示されることを確認し、神経膠腫を効果的に診断することができるということを確認した。１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される場合、神経膠腫患者は、生存率が高いので、前記ターゲット遺伝子２０種のいずれにもコピー数変異が示される場合、神経膠腫患者の予後が良好であるか否かということを予測することができる。
１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示されれば、特定抗癌剤療法に対する抗癌剤感受性（chemosensitivity）と生存率とが異なりうるということが当業界に知られている。例えば、乏突起膠腫において、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される患者は、化学療法に対する反応が異なって示されることが知られており、また、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される患者において、単独放射線療法対比で、放射線療法とプロカルバジン（procarbazine）／ロムスチン（lomustine）／ビンクリスチン（vincristine）化学療法（ＰＣＶ）を併用する場合、生存率上昇が知られており、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される希少突起神経膠腫患者は、抗癌剤感受性が示され、予後にすぐれるという事実が知られているので、一様態によるターゲット遺伝子２０種に対する遺伝子変異が示される個体において、１ｐ染色体及び１９ｑ染色体の共欠失が示される個体、またはそうではない個体につき、個人誂え型治療を行うことができ、また標的治療が可能である。
一具体例の情報を提供する方法は、個体から分離された生物学的試料で定義された遺伝子パネルの突然変異を検出する段階を含む。具体的には、前記個体は、遺伝子変異による神経膠腫の発病危険性を予測するための対象を意味する。前記個体は、脊椎動物、哺乳動物またはヒト（Homo sapiens）を含んでもよい。例えば、前記ヒトは、韓国人でもある。また、前記生物学的試料は、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿でもある。前記定義された遺伝子パネルの突然変異検出は、前記生物学的試料から核酸を分離した後、コピー数変異を測定することによっても遂行され、前記核酸を分離する方法、及び前記コピー数変異を測定する方法は、当該技術分野に知られている。前記核酸を分離する方法は、例えば、前記生物学的試料からＤＮＡを直接分離するか、あるいはＰＣＲのような核酸増幅方法により、特定領域を増幅することによって分離することができる。前記分離された核酸試料には、純粋に分離された核酸だけではなく、粗分離の核酸、例えば、核酸を含む細胞破砕物も含む。前記核酸増幅方法には、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自己維持配列複製、及び核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。前記分離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでもある。前記ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは組み換えＤＮＡでもある。前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡでもある。また、前記突然変異位置を決定する方法は、例えば、知られた核酸のヌクレオチドシーケンシング方法（sequencing method）により、突然変異位置のヌクレオチドを直接決定することができる。該ヌクレオチド配列決定方法には、サンガー（または、ジデオキシ）シーケンシング方法、またはマクサム・ギルバート（化学切断）方法が含まれうる。また、突然変異位置の配列を含むプローブを、対象ポリヌクレオチドと混成化させ、混成化結果を分析することにより、突然変異位置のヌクレオチドを決定することができる。混成化程度は、例えば、検出可能な標識を対象核酸に標識し、混成化された対象核酸を検出することによって確認されるか、あるいは電気的方法などによっても確認される。また、単一塩基延長（ＳＢＥ：single base primer extension）方法が利用されうる。
本発明で使用される全ての技術用語は、異なって定義されない以上、本発明の関連分野において、通常の当業者が一般的に理解するような意味に使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それらと類似していたり、同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に全体が参照として統合される。
一様態によるＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子における遺伝子変異またはタンパク質変異を検出する場合、神経膠腫診断に対する診断の正確度が高く、敏感度も高く、効果的な神経膠腫の診断が可能である。従って、前記ターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する製剤を利用すれば、神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、キット、情報提供方法、及び個人誂え型治療のための情報を提供する方法に有用に利用されうる。
GliomaＳＣＡＮの敏感度をＷＥＳデータと比較して評価した結果を示した図である。 治療ターゲット遺伝子の変異プロファイルを４６個の標本から確認した結果を示した図である。 個々人の神経膠腫に影響を及ぼす神経膠腫で頻繁に発見される変異に係わる情報を確認した図である。 選別された２０個のターゲット遺伝子に係わる、１ｐ及び１９ｑのコピー数喪失の検出正確度を確認した図である。 GliomaＳＣＡＮを介するＦＩＳＨデータを比較し、前記選別された２０個のターゲット遺伝子に係わる有効性を検証した結果を示した図である。 １ｐ及び１９ｑの共欠失と、１ｐ及び１９ｑの野生型との標本から、染色体レベルにおけるＣＮＡの比較を確認した結果を示した図である。
以下、実験例及び実施例を介し、本発明について詳細に説明する。下記実施例は、ただ、本発明についてさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲が、それら実施例によって制限されるものではないということは、本発明が属する技術分野で当業者において自明であろう。
実験例－神経膠腫を診断するためのバイオマーカーを選定するための突然変異の選定
＜実験例１＞神経膠腫を診断するための被験者の腫瘍標本収集及びその分析
神経膠腫を正確に診断するための癌患者標本を、２０１４年１月から２０１７年８月まで三星ソウル病院に来院した一部患者から同意を受け、生命倫理委員会の承認下で腫瘍標本を収集した。三星ソウル病院のＩＲＢ（ＩＲＣ＃：２０１０－０４－００４）が本研究を承認した。前記腫瘍標本を診断した。前記診断のための癌患者の標本から選択するための基準は、（ｉ）実行可能な突然変異が発見されれば、患者が臨床試験に登録することができる可能性、（ｉｉ）患者の検体が病理学部署に十分な量の腫瘍分画に保管されうることを重点にして選定した。前記腫瘍標本を正常組織と共にまとめずに処理した。
前記方法によって収集された腫瘍標本を三星医療院でデザインした標的シーケンシングパネルであるGliomaＳＣＡＮでシーケンシングした。前記パネルを介し、韓国ＭＦＤＳ及び米国ＦＤＡの承認で承認されるか、あるいは公共データベースであるＣＯＳＭＩＣ（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）及び文献から癌治療法に活用されうるという関連性が報告された標的癌である神経膠腫治療法と係わる標的遺伝子２３２個を選定し、標本において、前記遺伝子を、パネルを介して分析した。
ＨＤ７５３（Horizon，Ｉｎｃ．米国）、ＮＡ１２８７８、及び１０個の細胞株（ＮＡ０７０１４、ＮＡ１０８４０、ＮＡ１８４８８、ＮＡ１８５１１、ＮＡ１８５９５、ＮＡ１８８６７、ＮＡ１８９２４、ＮＡ１８９５７、ＮＡ１９１０８及びＮＡ１９１１４）からなる遺伝子フルセットから、特異性、検出限界、ＰＰＶ及びＮＰＶを基準にし、パネルにおいて、前記癌標本を分析した。ＨＤ７５３細胞株は、パネルで測定された知られた変異及び変異対立遺伝子型の頻度（ＶＡＦ）と、単一塩基配列変異（ＳＮＶ）、挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）及び遺伝子複製数変異（ＣＮＶ）の予想値とを比較し、敏感度を計算した。ＮＡ１２８７８の細胞株の場合、敏感度、特異度、ＰＰＶ及びＮＰＶを計算するために、パネルにおけるＳＮＶの遺伝子型を、コーディング領域内ＮＡ１２８７８と比較した。また、検出及び敏感度の限界を予測するために、パネルにおいて、ＳＮＶの測定されたＶＡＦは、前記遺伝子フルセットで予想されたＶＡＦと比較した。
＜実験例２＞収集された神経膠腫標本交差検証のための全体エキソームシーケンシングとの比較
三星医療院、カトリック大学及びソウル大学病院の機関検討委員会で承認された研究から、腫瘍標本と臨床情報とを、前記機関において、腫瘍除去手術を受けた脳腫瘍患者から得て、全ての患者から、情報提供同意を得た後、腫瘍の組織学的診断を行った。遺伝子分析のために、腫瘍標本一部をスナップ凍結させ、使用するまで液体窒素で保存した。ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙキット（Qiagen）を使用して抽出した。４６個の標本において、標的シーケンシングを行い、それらのうち、２８個標本を同時に全長エキソーム分析（ＷＥＳ：whole-exome sequencing）を行った。染色体１ｐと染色体１９ｑとを確認するために、５２個標本と４５個標本とに対し、ＷＥＳと標的配列分析とを行った。
＜実験例３＞標的配列分析の遂行
ＦＡＳＴＱファイルのシーケンス遺伝子リードは、Burrows-Wheeler Alignerバージョン０．６．２またはmutation callingを使用し、ヒトゲノムアセンブリ（ｈｇ１９：human genome assembly）にマッピングされた。ＭｕＴｅｃｔ及びＳｏｍａｔｉｃＩｎｄｅｌＤｅｔｅｃｔｏｒは、腫瘍と正常組織との対から、体細胞突然変異に対する高い信頼度の予測を行うために使用した。ＶＥＰ（Variant Effect Predictor）バージョンを、予測された体細胞突然変異に潜在的に機能的な結果、及びその他関連情報を注釈として追加するのに使用した。総遺伝子リードが２０以上であるか、あるいはＶＡＦが０．０５超過である場合により、有意の突然変異を選択した。
また、ｎｇＣＧＨ ｐｙｔｈｏｎパッケージ０．４．４バージョンを使用し、遺伝子コピー数を測定した。患者とマッチされた正常ＷＥＳデータを、腫瘍のコピー数の倍数変化を予測する基準として使用した。ゲノムの増幅と削除とを、それぞれ０．５８５以上のｌｏｇ２スケールと、－０．５以下のｌｏｇ２スケールと決定した。
＜実験例４＞標的シーケンシングの統計学的分析の遂行
ＷＥＳと標的配列とのＶＡＦ相関関係は、Pearsonで計算した。標的塩基配列分析を使用し、１ｐ／１９ｑ状態を評価するために、染色体１ｐ及び染色体１９ｑに位置した遺伝子のコピー数状態を使用し、受信機作動特性曲線（ＲＯＣ：receiver operating characteristic curve）を使用して調査し、台形に測定した。視覚化変更のために、Ｒパッケージ及び複合ヒートマップを使用し、Ｏｎｃｏｐｒｉｎｔプロットを使用した。ＩＤＨ１の体細胞突然変異と、GliomaＳＣＡＮと、ＦＩＳＨまたはＩＨＣとのＥＧＦＲの局所増幅とを比較するために、two-sidedフィッシャーのｅｘａｃｔ検査を使用した。
実施例１．腫瘍細胞株からのパネル有効性確認
１．１．ＨＤ７５３細胞株からのパネル有効性確認
GliomaＳＣＡＮを利用した分析で、ターゲット領域から、１８個変異のうち、総１５種変異が確認された。突然変異測定パネルから確認された変異体と比較し、３個のＳＮＶ、ＧＣ含量が高い２個のＳＮＶ、ＧＣ含量が低い１ ＳＮＶ、１個の長い挿入と、１個の長い欠失と、３個の短い欠失とを含む１５個の全ての変異が検出された。予想されて測定された対立形質頻度間の高相関関係が示された（ｒ２＝０．９３５６）。その結果、ＳＮＶ、ＩｎＤｅｌ及びＣＮＶの敏感度が１００％と示された。
１．２．ＮＡ１２８７８細胞株からの参照配列の決定
前記パネルにおいて、４，３３０個の標的化領域（１，２６９ｋｂ）に係わるＳＮＶの敏感度と特異度とを算定するために、遺伝子型を完全に分析し、参照配列として、ＮＡ１２８７８細胞株を使用した。パネルで確認されたＳＮＶとＮＡ１２８７８との遺伝子型（ftp://ftptrace.ncbi.nlm.nih.gov/giab/ftp/release/NA12878_HG001/latest/GRCh37/）を比較したとき、両者間で確認されたＳＮＶは、いずれも一致した。また、標的地域の８４６，０５８個の参照遺伝子型を比較した結果パネルで確認された遺伝子型と一致した。
１．３．遺伝子変異検出限界及び敏感度測定を介するパネルの有効性検証
遺伝子フルセット（予想変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ：variant allelic frequency）範囲：４％～１００％、パネル検証のための遺伝子セットの変異数：６８９）を使用し、検出限界（ＬＯＤ）と検出敏感度とを測定した。前記パネルを活用し、パネル有効性を評価したとき、感度及び相関の比率（ｒ２）は、それぞれ９９．２％及び０．９８５６と、遺伝子セットの変異を非常に正確に測定することができるということを確認した。低い予想ＶＡＦ（４．１％～５％）の範囲において、１３６個の変異のうち１３５個の検出を確認し（９９．２６％）、総合すれば、パネルによる遺伝子変異の検出限界は、５％以上であることを確認した。
実施例２．標的シーケンシングパネルと全体エキソームシーケンシングとの変異対立遺伝子頻度の比較を介するパネルの有効性確認
標的シーケンシングパネルの正確性を確認するために、標的パネルで得た体細胞突然変異の可変対立遺伝子頻度を、ＷＥＳと比較する実験を行った。正常血液から抽出したＤＮＡとマッチされた腫瘍組織標本２８名を、ＷＥＳと標的シーケンシングパネルとに露出させた。ＳＮＶ、挿入または欠失からの有意の突然変異の臨界値を深さ（depth）範囲が２０以上であり、ＶＡＦが５％以上と設定した。ＷＥＳ及び標的配列の分析で測定された全ての体細胞突然変異のＶＡＦを比較し、それを図１に示した。
図１で確認した結果、全体１１８個のゲノム変異が、２つのシーケンシングパネルで検出され、ＷＥＳまたは標的配列の分析で、それぞれ２４個または９個の変異をそれぞれ検出することができた。相対的に低いＶＡＦを有した個人突然変異（private mutation）が測定されたのは、標的配列化パネルに適用されたＤＮＡサンプルが、ＷＥＳに適用された腫瘍断片と比較する場合、同一腫瘍の他の部位に由来するために、膠芽細胞腫は、過度なほどの腫瘍内異質性（intratumoral heterogeneity）が示されるために、前述のような結果が示されたと判断される。低いＶＡＦから、腫瘍細胞が増殖するときと同じ下位クローン性（sub-clonal）突然変異の存在が確認され、多様な個人突然変異を獲得することができるということを確認した。反対に、ＷＥＳプラットホームにおいては、相対的に高いＶＡＦを有する少数の個人突然変異を確認することができた。それぞれの個人突然変異を分析し、前記遺伝子変異がマッチされた正常血液から同時に検出されることにより、標的シーケンシングパネルで示されないということを介し、それらが、実際の生殖細胞突然変異であるということを確認することができた。ＷＥＳ血液パネルの不在は、主に、ＷＥＳと標的シーケンシングパネルとのシーケンシング深さの有意差によって示される。特に、GliomaＳＣＡＮの範囲は、約８００Ｘで測定され、それは、標準ＷＥＳの２００Ｘよりはるかに高いが、ＷＥＳと標的配列化パネルは、体細胞突然変異頻度（ｒ＝０．８１４、Ｐ値＝４．７７ｅ－３７；フィッシャーの正確確率検定（Fisher exact test））の側面において、高い相関関係が示されるということを確認した。従って、前記実験例において確認された標的配列化パネルが、高い信頼レベルにおいて、以前に確立されたＷＥＳプラットホームに比べ、潜在的な体細胞変異を正確に識別して測定することができるということを確認した。
実施例３．膠芽細胞腫を診断することができるバイオマーカー遺伝子における遺伝子変異の確認
従来の臨床的な判断を介してのみ確認することができた膠芽細胞腫を、簡単に診断することができるバイオマーカーとしての遺伝子変異を確認するための実験を行った。前記実験例において確認されたように、前記実験例において確認した治療効果を確認することができると知られている９４個遺伝子のうち、遺伝子全般にわたり、膠芽細胞腫を効果的に検出することができる、臨床的に活用することができる突然変異を体系的に評価し、評価の結果を図２に示した。
図２で確認されているように、４６人の患者のうち３２人（６９．６％）において、臨床的に実行可能な前記遺伝子において、少なくとも１以上の体細胞突然変異を有していることを確認した。また、前記４６人の患者のうち１１人（２３．９％）が、以前にＣＯＳＭＩＣで確認することができる変異を有していることを確認することができ、そのうち、ＮＦ１遺伝子における突然変異が最も一般的である突然変異（３１．３％）であり、ＰＴＥＮ遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子及びＰＴＰＮ１１遺伝子における突然変異が、それぞれ２８．１％、１５．６％及び１２．５％と示され、前記遺伝子の次に変異が多く示されることを確認した。また、図２で確認されているように、少なくとも２名以上の患者において、１９個の遺伝子の突然変異が示されることを確認した。反復して確認された突然変異は、遺伝子の体細胞突然変異数は、３２個の標本において、２個から８１個まで多様であった。総合的には、標本の９３．５％である４６名患者のうち４３人で確認された潜在的な治療反応の予測可能な指標として活用されうる遺伝子は、少なくとも１つの遺伝的変異が示されうるということを確認することができた。
実施例４．神経膠腫で頻繁に確認される体細胞変異の確認
標的配列化パネルを使用して進められた神経膠腫において頻繁に確認される突然変異を介すれば、神経膠腫を効果的に診断することができるので、前記突然変異を分析する実験を行った。１０個の低級神経膠腫（ＬＧＧ：low-grade gliomas）と、３６個の膠芽細胞腫（ＧＢＭ）との標本において、単一塩基変異、短い挿入、及び欠失を分析した。前記遺伝子変異が膠芽細胞腫で折々調節されない核心発癌経路を調節するために、神経膠腫において、前述のような変異が示されるか否かということを確認することが重要であり、従来の研究によれば、ＴＰ５３突然変異は、さまざまな腫瘍類型にわたる腫瘍進行の初期段階で生じることが知られている。そのために、ＷＨＯ再分類においては、神経膠腫診断のために、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２の変異だけではなく、ＴＰ５３の変異も考慮しなければならないとのことであり、特に、染色体１ｐと染色体１９ｑとのアーム（arm）の共欠失は、ＴＰ５３突然変異と一致しないので、ＴＰ５３変異を確認することが重要である。また、膠芽細胞腫は、転写体の発現に伴う遺伝子変異により、４個の別途の分子サブタイプに分類されるが、前記分子のサブタイプは、ＣＮＡ、並びにＥＧＦＲ、ＮＦ１及びＰＤＧＦＲＡのような癌誘導遺伝子の体細胞変異に基づいても分類されると知られている。前記遺伝子内の頻繁に確認される突然変異は、明らかな生物学的特性を有した分子サブタイプ間において相当に異なるので、神経膠腫を正確に診断するためのバイオマーカーとして活用することができるターゲット遺伝者候補群の選定が重要である。前記ターゲット遺伝子候補群のうち９個の遺伝子（ＴＰ５３、ＡＴＲＸ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＢ１、ＮＦ１、ＭＤＭ２及びＣＤＫＮ２Ａ）においてＣＮＡの出現率を確認し、それを図３に示した。
前記図３で確認されているように、ＩＤＨ１遺伝子とＡＴＲＸ遺伝子とにおける突然変異は、発現率が顕著である一方、ＥＧＦＲの局所増幅と、ＰＴＥＮの遺伝子欠失とを含むいくつかの重要な遺伝子変異を神経膠腫で確認し、染色体７の増加と、染色体１０の欠失とが膠芽細胞腫の重要な腫瘍誘発を誘導するという従来の知られた事実と一致することを確認した。また、前記低級神経膠腫においては、１０個の変異のうち、８個及び４個の頻度で、ＩＤＨ１遺伝子とＡＴＲＸ遺伝子との変異が示されることを確認することができた。このうち、ＩＤＨ遺伝子突然変異において、ＩＤＨ１タンパク質において、Ｒ２０＊として終結コドンを獲得する変異を除いては、Ｒ１３２Ｈにアミノ酸が変更される変異であることを確認した。
実施例５．神経膠腫の予後及び診断のためのバイオマーカーの決定
神経膠腫を診断し、その予後までさらに正確に予測するための染色体１ｐ／１９ｑの共欠失を測定するためのバイオマーカーを決定するための実験を行った。前記実験例において、その有効性を確認したGliomaＳＣＡＮにおいて、ターゲット配列分析データを遂行し、前記ターゲット配列分析データが、現在の標準方法と比較し、有効であるか否かということ１回検証し、それにより、有効性を有している遺伝子１ｐ／１９ｑの共欠失を測定することができるバイオマーカーを決定する実験を共に行った。
実験例において確認したGliomaＳＣＡＮによるターゲット配列分析が独立して確認したＦＩＳＨ実験を介して行ったＥＧＦＲ増幅のフィッシャーの正確確立検定の結果と、Ｐ値が２．０６ｅ－０４と一致したことを確認し、神経膠腫において、ＩＤＨ１突然変異を検出する現在の標準測定法であるＩＨＣ方法と比較しても、高い一致率が示されることが確認された（Ｐ値は、６．６８ｅ－０７である）。
それにより、前述のように有効性が確認された染色体１ｐ／１９ｑ共欠失を効果的に確認するためのバイオマーカーを決定するための前記実験例１の２３２個のターゲット遺伝子から、染色体１ｐ／１９ｑ共欠失を効果的に確認することができる２０個の遺伝子を選択し、遺伝子を下記表１に示した。
Figure 2022528182000002
前記遺伝子を介すれば、実際の染色体共欠失状態を反映させることができるか否かということ評価するために、ＷＥＳを使用し、１ｐと１９ｑとの分節染色体レベルを比較した。１ｐと１９の染色体アームにおいて、それぞれ１１個の遺伝子のうち９個の遺伝子と、９個の遺伝子のうち８個の遺伝子とが同時に除去されたとき、それぞれの腫瘍において、１ｐと１９ｑとの染色体レベル喪失を確認した。ＲＯＣ曲線を、１ｐ／１９ｑ共欠失状態を確認するためのバイオマーカーとして選択された遺伝子の正確性を評価するために、５２個の標本を使用して確認し、それを図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃに示した。
図４Ａから確認されるように、遺伝子セットとＷＥＳ結果とを統合した場合、前記２０個のバイオマーカー遺伝子は、１ｐと１９ｑとの染色体共欠失を、ＡＵＣ値が０．９２９であり、９５％ＣＩ値が０．８８６２－１であるというように、高い程度に正確に予測することができることを確認することができた。
ターゲット配列決定パネルが、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（in situ hybridization）のように、従来知られた診断方法と比較し、正確に１ｐ／１９ｑの同時喪失状態を予測することができるか否かということを評価した結果においては、図４Ｂで確認されているように、ＲＯＣ曲線分析を介し、ＡＵＣ値が０．９１７、９５％ＣＩ値が０．８５９６－０．９７３７と、一貫した高い一致率が示されることを確認することができた。
図４Ｃで確認されているように、ＷＥＳに由来する１ｐと１９ｑとの染色体共欠失を、標的配列化パネルから予測された染色体欠失と比較した結果を介し、パネルのいずれおいても、非常に類似した染色体プロファイルが示されることを確認することができた。
従って、総合的には、前記２０個の遺伝子バイオマーカーを介すれば、神経膠腫診断または予後を正確に予測することができる１ｐ及び１９ｑの共欠失を高い程度の正確度及び敏感度で確認することができた。

Claims (16)

  1. ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む、神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物。
  2. 前記神経膠腫は、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、混合神経膠腫及び上衣細胞腫からなる群のうちから選択された１種以上である、請求項１に記載の神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物。
  3. 前記製剤は、遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失を検出する、請求項１に記載の神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物。
  4. 前記遺伝子の変異は、塩基配列内の
    １）単一塩基配列変異、
    ２）１個ないし５０個のヌクレオチドの塩基配列部位の欠失または挿入、
    ３）コピー数変異または
    ４）前記１）ないし前記３）のうちから選択された２種以上の組み合わせである、請求項１に記載の神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物。
  5. 前記製剤は、プライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項１に記載の神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物。
  6. ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を測定する製剤を含む、神経膠腫の診断用または予後予測用のバイオマーカーパネル。
  7. ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む、キット。
  8. １）個体の生物学的試料から核酸試料を得る段階と、
    ２）得られた試料から、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、
    ３）検出された遺伝子の変異レベルを、正常試料のレベルと比較して分析する段階と、を含む、神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  9. 前記生物学的試料は、患者の血液、血漿、血清、小便及び唾液からなる群のうちから選択された１種以上であることを特徴とする請求項８に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  10. 前記段階２）の遺伝子変異は、
    １）単一塩基配列変異、
    ２）１個ないし５０個のヌクレオチドの塩基配列部位の欠失または挿入、
    ３）コピー数変異または
    ４）１ないし３）のうちから選択された２種以上の組み合わせである、請求項８に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  11. 前記段階２）の検出は、次世代シーケンサ（ＮＧＳ）プラットホームによる、請求項８に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  12. 前記次世代シーケンサプラットホームは、全体ゲノムシーケンシング、全体エキソームシーケンシングまたはターゲット遺伝子パネルシーケンシングである、請求項１１に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  13. 前記段階３）の分析は、遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失いかんを確認する、請求項８に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  14. 前記遺伝子１ｐ染色体及び遺伝子１９ｑ染色体の共欠失いかんを、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子において、コピー数変異の検出によって決定する、請求項１３に記載の神経膠腫の診断または予後予測に係わる情報を提供する方法。
  15. ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上の遺伝子の変異を検出する製剤を含む神経膠腫に係わる、個人誂え型医療のためのバイオマーカーパネル。
  16. １）個体から分離された生物学的試料において、ＳＡＭＤ１１、ＫＬＨＬ２１、ＦＡＭ１６７Ｂ、ＨＰＣＡＬ４、ＧＰＢＰ１Ｌ１、ＬＰＨＮ２、ＧＰＲ８８、ＺＮＦ５９９、Ｃ１９ＯＲＦ３３、Ｂ９Ｄ２、ＢＣＡＭ、ＣＡＢＰ５、ＳＩＧＬＥＣ１１、ＥＲＶＶ－２、ＺＮＦ８６５、ＭＺＦ１、ＭＲＴＯ４、ＬＲＩＧ２、ＢＳＮＤ及びＳＬＣ３０Ａ２からなる群のうちから選択された１種以上のターゲット遺伝子内において、遺伝子変異を検出する段階と、
    ２）前記検出結果において、遺伝子変異が検出される前記個体を、治療ターゲットとして設定する段階と、を含む、個人誂え型治療のための情報を提供する方法。
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