CN117343989A - 一种检测基因融合的靶向建库方法 - Google Patents
一种检测基因融合的靶向建库方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117343989A CN117343989A CN202311663564.9A CN202311663564A CN117343989A CN 117343989 A CN117343989 A CN 117343989A CN 202311663564 A CN202311663564 A CN 202311663564A CN 117343989 A CN117343989 A CN 117343989A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fusion
- sequence
- library construction
- library
- random primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 2
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100023685 G protein-coupled receptor kinase 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 description 1
- 101000829476 Homo sapiens G protein-coupled receptor kinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 1
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种检测基因融合的靶向建库方法，包括如下步骤：逆转录：采用随机引物逆转录目标RNA，得到第一cDNA链；第二链合成：使用所述随机引物扩增所述第一cDNA链，得到第二cDNA链；建库：对第二cDNA链进行PCR得到DNA文库；其中，所述随机引物为含有测序接头片段的随机设计的引物。本申请采用在逆转录和cDNA第二条链的合成中采用了序列相同的带测序接头的随机引物，从而无需额外的链接反应接上测序接头，从而在简化建库的同时，能对已知或未知的基因融合进行检测。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种检测基因融合的靶向建库方法。
背景技术
基因融合是由于基因组重排导致两个相距较远的基因连接在一起，形成一个嵌合基因(也叫融合基因)。发生基因融合时，一个基因的启动子及其5’端（上游）的编码序列与另一个基因的3’端(下游)编码序列以及3’UTR组合在一起，导致下游基因的表达受其受其上游基因的启动子调控。
基因融合在肿瘤细胞中经常发生导致很多原本不表达或低表达的基因在异位启动子的调控下高表达，反之亦然。很多由于融合导致的异常基因表达可以作为药物的靶点。例如，在非小细胞肺癌中，ALK发生基因融合后的异常表达可指导阿来替尼的用药；而ROS1发生融合后的异常表达可指导克里佐替尼的用药。因此，确定是否存在特定的基因融合事件对肿瘤的靶向治疗具有重要的指导意义。
目前，在二代测序水平上，用于检测基因融合的方法可分为两类。一种是基于DNA的，衍生的方法包括全基因组测序（WGS）和靶向二代测序（NGS）。两者都是通过在测序后，寻找基因融合点两侧的read作为证据来识别融合的。另一种是基于RNA的，相应的方法包括转录组测序以及靶向RNA测序，通过寻找嵌合转录本来对融合事件进行识别。
我们的发明涉及使用RNA测序来检测基因融合。目前常用的方法有两种：方法1.根据已知融合形成的转录本进行成对引物设计，扩增潜在的融合RNA转录本，形成NGS文库，然后进行测序，如ThermoFisher的AmpliSeq 系列产品采用的就是这种方法。由于该方法是针对基因已知融合序列来设计双端PCR引物进行扩增子建库的，只能检测基因的已知融合形式，对于未知融合形式没有检测能力。方法2. 如图1左图的建库方法所示，对逆转录的cDNA使用链接酶添加测序接头，然后使用单端特异性的引物以及通用引物进行PCR扩增形成NGS文库，如ArcherDx的系列融合检测产品就是采用该方法来检测融合的。在该方法中，一端引物是基因特异性的，而另一端是通用引物，意味着任何其它基因，只要与该基因发生融合，理论上都可被该方法检测出，达到检测未知融合的目的。但是该方法的不足是使用链接酶建库，涉及步骤较多，操作繁琐，需要两天才能完成NGS文库构建。
为了克服此缺点，我们发明了一种新的方法，该方法既可以检测未知融合，又不依赖于连接酶进行建库。增强了检测能力的同时，又简化了建库流程。
发明内容
为了解决即可以检测融合基因，但又不依赖于连接酶的问题，本申请提供了一种检测未知基因融合的靶向建库方法。
第一方面，一种检测基因融合的靶向建库方法，包括如下步骤：
逆转录：采用随机引物逆转录目标RNA，得到第一cDNA链；
第二链合成：使用所述随机引物扩增所述第一cDNA链，得到第二cDNA链；
建库：对第二cDNA链进行PCR得到DNA文库；
其中，所述随机引物为含有测序接头片段的随机设计的引物。
在一些实施方式中，逆转录步骤中采用的RNA聚合酶可以为AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶或其他常用的逆转录酶中的任意一种；第二链合成的步骤中所采用的的DNA聚合酶可以为Bst3DNA聚合酶、Klenow，Taq或其他常用的DNA聚合酶中的任意一种。
通过采用上述技术方案，在逆转录以及第二条链合成这两个步骤中使用序列相同的带测序接头的随机引物进行转录，使得在第二条链合成后被测序的DNA双端就已经带上测序接头，本申请的建库方法无需通过传统方法中的连接酶进行DNA链接反应添加测序接头，从而大大地简化了实验的步骤和时间，提高了建库效率。
优选的，所述随机引物的序列为SEQ ID No.1。
优选的，所述建库步骤中，PCR为锚定PCR。
优选的，所述建库步骤中，PCR中所用的引物为单端特异性引物。
通过采用上述技术方案，普通PCR在引物设计过程中，必须知道模板序列，即序列必须已知，因此只能检测已知融合。而本申请采用一端为通用的测序接头引物，另一端非特异性引物作为PCR的引物，除了能检测已融合的基因外，还能检测未知的融合基因。
优选的，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换或修饰为高保真DNA聚合酶无法识别的碱基序列。
优选的，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换为碱基U。
优选的， 锚定PCR中使用高保真DNA聚合酶。
通过采用上述技术方案，随机引物中将至少两个碱基T替换为U，从而在PCR的过程中，抑制全基因组的扩增，提高靶向扩增产物的比率，大大提高在靶率。
第二方面，一种检测基因融合的靶向建库检测方法，对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列。
第三方面，一种用于检测基因融合的靶向建库产品，所述产品含有随机引物。
第四方面，一种检测基因融合的靶向建库检测方法，一种对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列的检测方法，或产品在融合基因检测中的应用。
综上所述，本申请具有如下有益效果：
1. 通过在逆转录以及第二条链合成两个步骤中使用同样的带接头的随机引物，本申请在第二条链合成后DNA双端就已经带上二代测序接头，而不需依赖额外的连接酶进行DNA链接反应后加上接头，大大简化实验步骤。
2. 本申请在融合基因检测中仅需要使用单端特异性引物，另一端是通用的接头引物，除可检测已知融合基因外，还可检测未知融合基因。
附图说明
图1是本申请与现有技术中常用的建库方法进行对比的示意图，其中，左图为现有技术中常用的建库方法，右图为本申请的建库方法。
图2是实施例1中融合转录本中的KIF5B-RET融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图3是实施例1中融合转录本中的SLC34A2-ROS1融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图4是实施例1中融合转录本中的ETV6-NTRK3融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图5是实施例1中融合转录本中的TPM3-NTRK1融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图6是实施例1中融合转录本中的CCDC6-RET融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图7是实施例1中融合转录本中的EML4-ALK融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图8是实施例1中融合转录本中的MET-MET融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图9是实施例1中融合转录本中的FGFR3-TACC3融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
图10是实施例1中融合转录本中的CD74-ROS1融合形式在IGV浏览器中的可视化展示。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更佳清晰，以下将对本申请进行详细说明。应当注意，本申请描述的各个方面、特征、实施方式、以及其优点可以相容和/或可以组合在一起。
如无特殊说明，本说明书中的科技术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同。
定义
随机引物：本文中的随机引物由测序平台特异性的接头序列和6-16bp的随机序列组成
单端特异性引物：在锚定PCR中，其中一条引物是固定不变的，为通用引物，而另一条引物则是序列特异性的，可根据靶序列的不同而不同，称之为单端特异性引物。
实施例1，一种检测基因融合的靶向建库方法，用于检测已知融合基因，采用如下步骤：
1. 逆转录
按下表1分别配制引物和酶混合物 (冰上配置)：
表1：
带测序接头的随机引物：SEQ ID No.1：
5’-AGATCGGAATCAGACGTGTGCTCTTCCGAUCUNNNNNNNNNNNN-3
其中，本实施例中N为A。
置于PCR仪中，按以下条件进行反应：
1个循环：(8℃，1分钟；23℃，5分钟；30℃，5分钟；55℃，10分钟，85℃，5分钟)；
2. 第二条链合成：
往上述反应产物中加入1µl BST3.0 DNA聚合酶（NEB），按以下条件在PCR中进行反应：8℃，1分钟；23℃，5分钟；30℃，5分钟；55℃，10分钟，85℃，5分钟；
3. 使用上述产物进行锚定PCR，得到NGS文库（反应组分及条件如下）
表2：
5’接头引物：SEQ ID No.2：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAGTCCTAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGA-3’
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAGGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
在PCR仪中，反应条件如下：
1个循环：98°C，30s；
25个循环：98°C，5s；65°C，5 min；72°C，30s；
1个循环：72°C 2 min。
反应完成后，产物用1倍体积的SPRIselect磁珠（Beckman Coulter）进行纯化，纯化产物在BGI2000测序仪上进行双端测序, 测序长度为100bp/端，测序量为0.3Gb。
4、结果分析：
测序完成后，使用STAR-Fusion 将所测序列与人基因组序列进行序列匹配，进行在靶率的计算，计算公式为：在靶率 = 匹配到靶目标的read数/总reads数。 对于未经U替代的随机引物，其在靶率为34.8%， 使用U取代的随机引物在靶率为78.9%。 寻找所投入RNA中得已知融合转录本，结果如图2-10所示，其结果表明可以发现11个已知融合基因中的9个（其中两个融合形式NPM1-ALK, BCR-ABL1为血液肿瘤中发现的融合形式，没有设计相应的引物），其发现的9个融合形式序列如下【使用下划线区分不同基因序列】：
KIF5B-RET：SEQ ID No.4：
TTGGTACGTGATAATGCAGATCTCCGCTGTGAACTTCCTAAGTTGGAAAAGCGACTTCGAGCTACAGCTGAGAGAGTGAAAGCTTTGGAATCAGCACTGAAAGAAGCTAAAGAAAATGCATCTCGTGATCGCAAACGCTATCAGCAAGAAGTAGATCGCATAAAGGAAGCAGTCAGGTCAAAGAATATGGCCAGAAGAGGGCATTCTGCACAGATTG
ATCCACTGTGCGACGAGCTGTGCCGCACGGTGATCGCAGCCGCTGTCCTCTTCTCCTTCATCGTCTCGG
TGCTGCTGTCTGCCTTCTGCATCCACTGCTACCACAAGTTTGCCCACAAGCCACCCATCTCCTCAGCTGAGATGACC
TTCCGGAGGCCCGCCCAGGCCTTCCCGGTCAGCTACTCCTCTTCCGGTGCCCGCCGGCCCTCGCTGGACTCCATGGA
GAACCAGGTCTCCGTGGATGCCTTCAAGATCCTG
SLC34A2-ROS1：SEQ ID No.5：
AGAGAGACACCAAAGGGAAGATTCTCTGTTTCTTCCAAGGGATTGGGAGATTGATTTTACTTCTCGGATTTCTCTACTTTTTCGTGTGCTCCCTGGATATTCTTAGTAGCGCCTTCCAGCTGGTTGGAG
ATGATTTTTGGATACCAGAAACAAGTTTCATACTTACTATTATAGTTGGAATATTTCTGGTTGTTACAA
TCCCACTGACCTTTG
ETV6-NTRK3：SEQ ID No.6
ATAACTGTGTCCAGAGGACCCCCAGGCCATCCGTGGATAATGTGCACCATAACCCTCCCACCATTGAACTGTTGCACCGCTCCAGGTCACCTATCACGACAAATCACCGGCCTTCTCCTGACCCCGAGCAGCGGCCCCTCCGGTCCCCCCTGGACAACATGATCCGCCGCCTCTCCCCGGCTGAGAGAGCTCAGGGACCCAGGCCGCACCAGGAGAACAACCACCAGGAGTCCTACCCTCTGTCAGTGTCTCCCATGGAGAATAATCACTGCCCAGCGTCCTCCGAGTCCCACCCGAAGCCATCCAGCCCCCGGCAGGAGAGCACACGCGTGATCCAGCTGATGCCCAGCCCCATCATGCACCCTCTGATCCTGAACCCCCGGCACTCCGTGGATTTCAAACAGTCCAGGCTCTCCGAGGACGGGCTGCATAGGGAAGGGAAGCCCATCAACCTCTCTCATCGGGAAGACCTGGCTTACATGAACCACATCATGGTCTCTGTCTCCCCGCCTGAAGAGCACGCCATGCCCATTGGGAGAATAGCAG
ATGTGCAGCACATTAAGAGGAGAGACATCGTGCTGAAGCGAGAACTGGGTGAGGGAGCCTTTGGAAAGG
TCTTCCTGGCCGAGTGCTACAACCTCAGCCCGACCAAGGACAAGATGCTTGTGGCTGTGAAG
TPM3-NTRK1：SEQ ID No.7
GCAGAGACCCGTGCTGAGTTTGCTGAGAGATCGGTAGCCAAGCTGGAAAAGACAATTGATGACCTGGAAG
ACACTAACAGCACATCTGGAGACCCGGTGGAGAAGAAGGACGAAACACCTTTTGGG
CCDC6-RET：SEQ ID No.8
AGTGCAATACTGCCCAAGCCCGGGCGGGGTCTCTGTTCTCTGGCAGAGGAGGTCCCTTGGCAGCGGGAAGCGCCCTCTCTTTCTCTCGCCGCCGCTCCGAGTCTGCGCCCTGGTGCCAGGCGCTCAGCTCGGCGCTCCCCTGTGCTCGCCCGGCGCCCACTCATTCGCAGCCCGGCCTTCGTCGCCGCCGCCTCCCTGCTGCTCCTCCTCCTTTCCCCAGCCCGCCGCGGCCATGGCGGACAGCGCCAGCGAGAGCGACACGGACGGGGCGGGGGGCAACAGCAGCAGCTCGGCCGCCATGCAGTCGTCCTGCTCGTCGACCTCGGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGGGGAGGCGGCGGCGGTGGGAAGTCGGGGGGCATTGTCATCTCGCCGTTCCGCCTGGAGGAGCTCACCAACCGCCTGGCCTCGCTGCAGCAAGAGAACAAGGTGCTGAAGATAGAGCTGGAGACCTACAAACTGAAGTGCAAGGCACTGCAGGAGGAGAACCGCGACCTGCGCAAAGCCAGCGTGACCATC
GAGGATCCAAAGTGGGAATTCCCTCGGAAGAACTTGGTTCTTGGAAAAACTCTAGGAGAAGGCGAATTT
GGAAAAGTGGTCAAGGCAACGGCCTTCCATCTGAAAGGCAGAGCAGGGTACACCACGGTGGCCGTGAAGATGCTGAA
AG
EML4-ALK：SEQ ID No.9
AAATATGAAAAGCCAAAATTTGTGCAGTGTTTAGCATTCTTGGGGAATGGAGATGTTCTTACTGGAGACTCAGGTGGAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACTACTGTAGAGCCCACACCTGGGAAAGGACCTAAAG
TGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCAGATGGAGCTGCAGAGCCCTGAGTACAAGCTGA
GCAAGCTCCGCACCTCGACCATCATGACCGACTACAACCCCAACTACTGCTTTGCTGGCAAGACCTCCTCCATCAGT
GACCTGAAGGAGGTGCCGCGGAAAAACATCACCCTCATTCG
MET-MET：SEQ ID No.10
TGGAAGCAAGCAATTTCTTCAACCGTCCTTGGAAAAGTAATAGTTCAACCAGATCAGAATTTCACAGGATTGATTGCTGGTGTTGTCTCAATATCAACAGCACTGTTATTACTACTTGGGTTTTTCCTGTGGCTGAAAAAGAGAAAGCAAATTAAAG
ATCAGTTTCCTAATTCATCTCAGAACGGTTCATGCCGACAAGTGCAGTATCCTCTGACAGACATGTCCC
CCATCCTAACTAGTGGGGACTCTGATATATCCAGTCCATTACTGCAAAATACTGTCCACATTGACCTCAGTGCTCTA
AATCCAGAGCTGGTCCAGGCAGTGCAGCATGTAGTGATTGGGCCCAGTAGCCTGATTGTGCATTTCAATGAAGTCAT
AGGAAGAG
FGFR3-TACC3：SEQ ID No.11
GTACATGATCATGCGGGAGTGCTGGCATGCCGCGCCCTCCCAGAGGCCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAGGACCTGGACCGTGTCCTTACCGTGACGTCCACCGAC
GTAAAGGCGACACAGGAGGAGAACCGGGAGCTGAGGAGCAGGTGTGAGGAGCTCCACGGGAAGAACCTG
GAACTGGG
CD74-ROS1：SEQ ID No.12
GTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAG
ATGATTTTTGGATACCAGAAACAAGTTTCATACTTACTATTATAGTTGGAATATTTCTGGTTGTTACAA
TCCCACTGACCTTTG
融合形式在IGV浏览中的图示如图2-10所示。
上述结果表明，使用本发明所述的反应体系构建的靶向NGS测序文库在极大简化操作步骤的同时，可以检测已知融合基因。
实施例2，一种检测基因融合的靶向建库方法，用于检测未知融合基因，与实施例1的区别在于，逆转录反应的步骤中，标准品RNA不同。本实施例采用了样本1：CD74-ROS1.C6R34.COSF1200融合阳性（SEQ ID No.12）；样本2：CCDC6-RET.C1R12.COSF1271融合阳性（SEQ ID No.8）。上述样本均已使用ThermoFisher Oncomine Focus试剂和其再带分析软件进行检测得到，结果如下表3：
表3：
采用本申请的方法进行检测，发现除了上述融合外，在每例样本中发现一个额外的融合形式：样本1：CD74-ROS1.C6R35 样本2：GRK5--RET.G1R12。对这两例融合进行sanger测序，发现额外的融合形式真实存在，序列如下：
CD74-ROS1.C6R35：(未划线部分为CD74第6号外显子序列，划线部分为ROS1第35号外显子序列)：
SEQ ID No.13：
TTTCCAAGAACCAAGTTCTTCCGAGGGAATTCCCACTTTGGATCCTCCTTCCCTGGCTTTCAGCAAGAC CGTGTTGG
GRK5--RET.G1R12(未划线部分为GRK5第1号外显子序列，划线部分为RET第12号外显子序列)：
SEQ ID No.14：
CCTAAAAAGCTCCACTGACGCTCCACCGAAAGAAGATTTTTGGATACCAGAAACAAGTTTCATACTTAC TATTATAGTTGGAATATTTCTGGTTGTTACAATCCCACTGACCTTTG
由上述结果表明，除检测已知融合外，本方法还可检测未知融合。
对比例1：
按以下步骤进行对比例的实施：
1. 逆转录
表4：
置于PCR仪中，按以下条件进行反应：
1个循环：(42℃，30分钟；85℃，5分钟)；
2. 扩增1
表5：
在PCR仪中，反应条件如下：
1个循环：99°C，2分钟；
30个循环：99°C，15s；64°C，4 分钟；
1个循环：10°C hold；
3. 引物消化
往扩增1产物中加入0.8微升的FuPa试剂（赛默飞世尔），在PCR仪在以下条件进行反应：
50°C， 10 分钟；55°C， 10分钟；60°C， 20分钟；
4. 链接反应
4.1 按下表6配制接头溶液：
表6：
4.2 按照下表7配制接头反应：
表7：
置于PCR仪中，按下述条件进行反应：
22°C，30 分钟；72°C，10分钟；
5. 产物纯化使用1.5倍体积的AMPure® XP磁珠（Beckman Coulter）对产物进行纯化，使用20微升无核酸酶水进行洗脱。纯化后的文库在Ion S5测序仪上进行测序，其自带软件自动分析测序数据后报告检测结果。
实验结果显示，本对比例的方法仅能检测已知融合，无法检测未知融合。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
逆转录：采用随机引物逆转录目标RNA，得到第一cDNA链；随机引物由测序平台特异性的接头序列和6-16 bp 的随机序列组成；
第二链合成：使用所述随机引物扩增所述第一cDNA链，得到第二cDNA链；
建库：对第二cDNA链进行PCR得到DNA文库；
其中，所述随机引物为含有测序接头片段的随机设计的引物；
所述建库步骤中，PCR为锚定PCR；
所述建库步骤中，PCR中所用的引物为单端特异性引物。
2. 根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物的序列为SEQ ID No.1。
3.根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换或修饰为高保真DNA聚合酶无法识别的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换为碱基U。
5.一种检测基因融合的建库检测方法，包含使用权利要求1-4任一项所述的检测基因融合的靶向建库方法，对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列。
6.一种检测基因融合的靶向建库检测方法，包含使用权利要求1-4任一项所述的检测基因融合的靶向建库方法，对未知融合基因检测文库进行测序，获得未知融合基因的序列。
7.一种用于检测基因融合的靶向建库产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1-4任一项中所述的随机引物。
8.权利要求1-4任一项所述的方法，权利要求5-6任一项所述的检测方法或权利要求7所述的产品在融合基因检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311663564.9A CN117343989B (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种检测基因融合的靶向建库方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311663564.9A CN117343989B (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种检测基因融合的靶向建库方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117343989A true CN117343989A (zh) | 2024-01-05 |
| CN117343989B CN117343989B (zh) | 2024-05-17 |
Family
ID=89367245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311663564.9A Active CN117343989B (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 一种检测基因融合的靶向建库方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117343989B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234681A (zh) * | 2010-04-20 | 2011-11-09 | 广东省人民医院 | 一种检测基因融合的方法 |
| CN107190329A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-22 | 领星生物科技（上海）有限公司 | 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 |
| CN107385042A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-24 | 广州永诺健康科技有限公司 | 一种锚定巢式多重 pcr 联合高通量测序检测基因融合的多重pcr引物和方法 |
| CN110820051A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-02-21 | 广州表观生物科技有限公司 | 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用 |
| CN112626206A (zh) * | 2019-09-24 | 2021-04-09 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种rna融合基因检测方法和试剂盒 |
| CN112795654A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-14 | 上海睿璟生物科技有限公司 | 用于生物体融合基因检测与融合丰度定量的方法及试剂盒 |
| CN113201793A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-08-03 | 探因医学科技(浙江)有限公司 | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 |
| CN113557300A (zh) * | 2019-03-22 | 2021-10-26 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 核酸序列、rna目标区域测序文库的构建方法及应用 |
| US20230104375A1 (en) * | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Sequmed Biotechnology, Inc. | Method for multiplexable strand-specific 3' end sequencing of mrna transcriptome primer set, kit and application thereof |
-
2023
- 2023-12-06 CN CN202311663564.9A patent/CN117343989B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234681A (zh) * | 2010-04-20 | 2011-11-09 | 广东省人民医院 | 一种检测基因融合的方法 |
| CN107190329A (zh) * | 2017-05-27 | 2017-09-22 | 领星生物科技（上海）有限公司 | 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用 |
| CN107385042A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-11-24 | 广州永诺健康科技有限公司 | 一种锚定巢式多重 pcr 联合高通量测序检测基因融合的多重pcr引物和方法 |
| CN110820051A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-02-21 | 广州表观生物科技有限公司 | 一种高灵敏度融合基因检测方法及其应用 |
| CN113557300A (zh) * | 2019-03-22 | 2021-10-26 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 核酸序列、rna目标区域测序文库的构建方法及应用 |
| CN112626206A (zh) * | 2019-09-24 | 2021-04-09 | 深圳华大智造科技有限公司 | 一种rna融合基因检测方法和试剂盒 |
| CN112795654A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-14 | 上海睿璟生物科技有限公司 | 用于生物体融合基因检测与融合丰度定量的方法及试剂盒 |
| CN113201793A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-08-03 | 探因医学科技(浙江)有限公司 | 一种rna文库的构建方法及试剂盒 |
| US20230104375A1 (en) * | 2021-10-01 | 2023-04-06 | Sequmed Biotechnology, Inc. | Method for multiplexable strand-specific 3' end sequencing of mrna transcriptome primer set, kit and application thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 易平勇 等: "重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用", 实用肿瘤杂志, vol. 17, no. 6, pages 401 - 403 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117343989B (zh) | 2024-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110734908B (zh) | 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒 | |
| WO2019114146A1 (zh) | 基因目标区域富集方法及建库试剂盒 | |
| US20230159984A1 (en) | Gene target region enrichment method and kit | |
| CN105986015B (zh) | 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒 | |
| US11761037B1 (en) | Probe and method of enriching target region applicable to high-throughput sequencing using the same | |
| WO2017054302A1 (zh) | 测序文库及其制备和应用 | |
| CN111471754B (zh) | 一种通用型高通量测序接头及其应用 | |
| EP3674413A1 (en) | Probe and method for high-throughput sequencing targeted capture target region used for detecting gene mutations as well as known and unknown gene fusion types | |
| CN106995836B (zh) | 二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒 | |
| WO2021051665A1 (zh) | 基因目标区域的富集方法及体系 | |
| CN109136217B (zh) | 一种测序文库构建的方法、建库试剂及其应用 | |
| KR20210111345A (ko) | Rna 및 dna로부터의 핵산 라이브러리의 제조 | |
| TW201321520A (zh) | 用於病毒檢測的方法和系統 | |
| CN112941635A (zh) | 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法 | |
| CN117343989B (zh) | 一种检测基因融合的靶向建库方法 | |
| WO2023116718A1 (zh) | 酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法 | |
| CN116497087A (zh) | 选择性扩增目标序列的方法及其应用 | |
| TWI771847B (zh) | 擴增和確定目標核苷酸序列的方法 | |
| CN112301432B (zh) | 一种构建全基因组高通量测序的文库的方法和试剂盒 | |
| CN110564745B (zh) | 一种肺癌稀有alk融合突变基因及其检测引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN112080555A (zh) | Dna甲基化检测试剂盒及检测方法 | |
| CN117343929B (zh) | 一种pcr随机引物及用其加强靶向富集的方法 | |
| CN108265047B (zh) | 用于dna片段的非特异性复制的方法及试剂盒 | |
| WO2021058145A1 (en) | Phage t7 promoters for boosting in vitro transcription | |
| CN108265048B (zh) | 用于孕妇血浆游离dna非特异复制的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |