CN102234681A - 一种检测基因融合的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测基因融合的方法。具体地，本发明提供了一种RACE-like PCR联合测序的检测方法(简称为“RCAE样PCR联合测序法”)，对ALK融合基因之类的融合基因进行检测。本发明方法不仅可同时检测多种不同的ALK融合基因，而且在不必事先知道与ALK发生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式的情况下，检测出未知的ALK融合基因，从而提高了检测方法的灵敏性、实用性以及通用性。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域，更具体地涉及一种检测基因融合的方法、试剂以及试剂盒。
背景技术
研究表明，在哺乳动物(如人)中，基因融合是导致某些疾病(如癌症)的原因之一。
以间变性淋巴瘤激酶基因(Anaplastic lymphoma kinase，简称为“ALK”)为例，该基因编码一蛋白激酶受体[1]。活化的ALK基因通过PIK3CA/AKT以及MAPK通路对细胞的抗凋亡和增殖发挥作用[2]。ALK基因的异位多发在间变性淋巴瘤，神经性母细胞瘤以及肌纤维瘤中[3]。
ALK异位产生的融合蛋白发挥着致癌基因的作用，这种融合蛋白保留了ALK的胞内激酶部分并融合了与其融合的蛋白的N端部分。目前已报道的与ALK发生融合的基因有11种之多，如NPM[4]，EML4[1]，MSN[5]，TPM3[6，7]，ATIC，TFG，CARS，以及CLTC[8，9，10]等。
在诸多的ALK融合基因中，对于非小细胞肺癌，一种棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)/间变淋巴瘤激酶(ALK)的融合基因(EML4-ALK)于2007年开始见诸于NSCLC相关研究当中[1，11，12]。
间变淋巴瘤激酶(ALK)/棘皮动物微管相关蛋白样4(EML4)融合基因(EML4-ALK)在非小细胞肺癌中占有一定的比例，且研究表明其与肿瘤的发生发展有着密切的联系。EML4-ALK融合由第二号染色体短臂异位引起，目前已发现有6种不同的融合类型。对这些融合基因的结构分析发现，其ALK部分均包括开始于第20外显子的编码细胞内酪氨酸激酶结构域的基因片段，而EML4部分则包括长短不一的编码蛋白N端部分的基因片段。
将ALK融合基因转入3T3细胞以及Ba/F3动物模型的研究表明，所有这些融合基因均能二聚化并组成型活化。ALK融合基因的表达产物作为一种嵌合酪氨酸激酶，对肺癌的发生发展起着重要作用[13，14]。因此，对ALK融合基因的检测具有重要意义。
目前，对ALK融合基因的研究大部分的采用RT-PCR的方法，小部分研究采用免疫组化、FISH的方法进行检测。
RT-PCR的方法是针对已知的ALK融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA之后，通过PCR扩增目的片断的方式来进行检测。该方法的局限性：1)必须知晓与ALK基因发生融合的基因；2)必须知晓两基因发生融合的方式；3)不能或难以同时检测不同基因与ALK发生的融合。因此利用该方法须针对与ALK发生融合的不同基因，必须根据不同融合方式设计不同的引物来进行检测，且不能检测出未知的ALK融合基因以及未知的融合方式，这将直接导致ALK融合基因检测困难及检出率的降低。例如，目前已报道的EML4-ALK的基因融合在肺癌中的检出频率在0.5％-7.5％之间[15]
非放射性原位杂交技术FISH法的原理是设计与被检测的EML4-ALK同源互补的核酸探针，二者经变性-退火-复性，即可形EML4-ALK融合基因的DNA与核酸探针的杂交体。用报告分子(如生物素、地高辛)标记核酸探针的某一种核苷酸，可利用该报告分子与荧光素标记的特异性配基(如特异性与生物素结合的亲和素)之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性以及相对定位分析。然而，该方法局限性：1)必须知晓与ALK基因发生融合的基因；2)与ALK发生融合的基因所在染色体的位置必须与ALK相距较近的距离；3)不能同时检测不同基因与ALK发生的融合。因此该方法须针对与ALK基因发生融合的不同基因设计不同的探针，且不能检测出未知的ALK融合基因，这将影响到ALK基因的检测率。
鉴于各种融合基因(如ALK融合基因)的表达产物对癌症等疾病的发生发展起着重要作用，因此，本领域迫切需要开发更为通用的融合基因检测方法。
此外，本发明还迫切需要开发，在部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，能够准确灵敏地检测方法来检测融合基因(如ALK融合基因)的方法。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种通用性更高的检测融合基因的方法。
本发明的另一目的是提供一种能够在仅部分知晓或未知晓融合基因结构的情况下，准确灵敏地检测方法来检测融合基因(如ALK融合基因)的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种非诊断性的、体外检测样本中的多核苷酸是否存在基因融合的方法，其中所述的融合基因是第一基因与第二基因融合形成的，其中，包括步骤：
1)以检测样本的mRNA为模板，在特异性扩增条件下，利用基因特异性引物1进行反转录，从而扩增得到cDNA链，其中所述的扩增的cDNA链的序列跨越了第一基因以及与其发生融合的第二基因的融合区；
其中，所述的基因特异性引物1位于第一基因以及与其发生融合的第二基因的远端，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
2)在cDNA的3’端添加多聚C(polyC)的尾巴；
3)以添加了polyC尾的cDNA链为模板，在特异性扩增条件下，用与多聚C锚定引物与基因特异性引物2进行第一轮PCR反应，从而获得第一PCR产物；
其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与多聚C尾互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
所述的基因特异性引物2位于第一基因以及与其发生融合的基因的远端，且不超过基因特异性引物1，从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
4)以第一PCR扩增产物为模板，在特异性扩增条件下，用锚定引物与基因特异性引物3进行第二轮PCR反应，从而获得第二PCR产物；
其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、与多聚C锚定引物的锚定区相同或互补的锚定区，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
其中，所述的锚定区不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补，即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合；
所述的基因特异性引物3位于基因特异性引物2和基因特异性引物1的内侧，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、基因特异性引物3、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
5)对得到的长度大于阴性对照的第二PCR产物进行测序，以得到与第一基因发生融合的基因序列，从而确定所述的多核苷酸是否存在基因融合。
在另一优选例中，在步骤1)和2)之间，还包括步骤：步骤1)获得的cDNA链为模板，用内部质控引物对进行扩增验证。
在另一优选例中，所述的内部质控引物是特异性扩增出第一基因(或其部分片段)的引物对。
在另一优选例中，所述的第一基因选自下组：ALK基因。
在另一优选例中，所述的第二基因是选自下组的一种或多种基因：NPM，EML4，MSN，TPM3，ATIC，TFG，CARS，以及CLTC。
在另一优选例中，所述的polyC尾的长度为8-20bp；和/或
所述的polyG结合区的长度为8-20bp；和/或
所述的多聚C锚定引物的锚定区的长度为15-30bp；和/或
所述的锚定引物的锚定区的长度为15-30bp。
在另一优选例中，所述的锚定引物是序列完全与多聚C锚定引物的锚定区完全相同(或完全互补)的多聚核苷酸。
在另一优选例中，所述的基因特异性引物1和/或基因特异性引物2和基因特异性引物3特异性结合于第一基因的外侧、结合于第一基因的外侧和第一基因本身、或者仅结合于第一基因本身。
在另一优选例中，所述的方法使用选自下组的一种或多种引物：
序列如SEQ ID NO：1所示的基因特异性引物1；
序列如SEQ ID NO：2所示的多聚C锚定引物；
序列如SEQ ID NO：3所示的基因特异性引物2；
序列如SEQ ID NO：4所示的锚定引物；
序列如SEQ ID NO：5所示的基因特异性引物3。
在另一优选例中，所述的方法还使用序列如SEQ ID NO：6和7所示的内部质控引物对。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测基因融合的试剂盒，其中所述的融合基因是第一基因与第二基因融合形成的，所述的试剂盒包括以下组件：
1)位于容器a中基因特异性引物1，其中，所述的基因特异性引物1位于第一基因以及与其发生融合的第二基因的远端，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
2)位于容器b中的多聚C锚定引物；其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与polyC互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与polyC互补，也不与polyG结合区互补；
3)位于容器c中的基因特异性引物2，所述的基因特异性引物2对应于第一基因以及与其发生融合的基因的远端，且不超过基因特异性引物1，从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
4)位于容器d的锚定引物，其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、与多聚C锚定引物的锚定区相同或互补的锚定区，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
5)位于容器e中的基因特异性引物3，其中，所述的基因特异性引物3位于基因特异性引物2和基因特异性引物1的内侧，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、基因特异性引物3、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
并且，所述的多聚C锚定引物的锚定区和锚定引物锚定区都不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补，即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括选自下组的一种或多种引物：
序列如SEQ ID NO：1所示的基因特异性引物1；
序列如SEQ ID NO：2所示的多聚C锚定引物；
序列如SEQ ID NO：3所示的基因特异性引物2；
序列如SEQ ID NO：4所示的锚定引物；
序列如SEQ ID NO：5所示的基因特异性引物3。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有内部质控引物对。更佳地，所述试剂盒含有序列如SEQ ID NO：6和7所示的内部质控引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有以下一种或多种任选组分：
(a)装于一容器中的反转录酶；
(b)装于一容器中的PCR聚合酶；
(c)装于一容器中的末端脱氧核苷酸转移酶。
应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合，以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。
附图说明
图1显示了本发明一个实例中的检测结果。图中，M表示200bp的分子量标准物；P表示阳性标准品。NTC表示阴性标准品。其他表示编号为1至45的检测样本。
图1a是第一轮PCR的扩增产物电泳图，其中，ALK E20表示ALK基因的外显子20。
图1b表示第二轮PCR的扩增产物的电泳图；其中，ALK E19+EML4 E6表示ALK基因的外显子19与EML4的外显子6形成的融合基因。
图1c显示了一种EML4-ALK融合产物的测序图。
图2显示了本发明“RCAE样PCR联合测序法”的示意图。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，首次开发了一种新的检测方法：RACE-like PCR联合测序的检测方法(简称为“RCAE样PCR联合测序法”)，对ALK融合基因之类的融合基因进行检测。以ALK融合基因为例，该方法不仅可同时检测多种不同的ALK融合基因，而且在不必事先知道与ALK发生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式的情况下，检测出未知的ALK融合基因。这不仅提高了检测方法的通用性，而且大大提高ALK融合基因的检出率。用本发明方法获得的ALK融合基因的发生频率，可用于辅助判断ALK融合基因在肺癌中所起的作用。这种方法在灵敏性、实用性以及通用方面具有优势。再此基础上完成了本发明。
具体地，用本发明人所开发的RACE-like PCR联合测序的检测方法，在103例非小细胞肺癌的病例样本中进行了检测，结果得到了11.6％(12/103)的检出率，其中包括了已报道的6种融合形式中的其中5种。与目前报道的数据相比，在没有特殊筛选的样本中，此研究的阳性率是最高的，比本发明之前最高的阳性率(7.5％)提高了约50％。与现有的RT-PCR以及FISH两种方法相比，本发明方法在敏感度上具有的优势，并且实验设计上不必事先知道与ALK发生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式，因此该方法不局限于EML4-ALK融合基因的检测，可扩展到其他有ALK参与的融合基因的检测。
检测方法
如本文所用，术语“本发明方法”、“RACE-like PCR联合测序的检测方法”或“RCAE样PCR联合测序法”可互换使用。
为了便于理解本发明，本发明人提供了如图2所示的本发明方法的原理。应理解，本发明的保护范围并不受所述原理的限制。
如图2所示，以ALK融合基因为例，本发明方法分为五个步骤：
1)以检测样本的mRNA为模板，在特异性扩增条件下，利用ALK基因特异性引物1进行反转录，从而扩增得到cDNA链，其中所述的扩增的cDNA链的序列跨越(或涵盖)了ALK以及与其发生融合的基因的融合区；
其中，所述的ALK基因特异性引物1位于ALK以及与其发生融合的基因的远端，即从ALK基因特异性引物1的扩增方向看，依次为ALK基因特异性引物1、ALK基因(或其部分)以及与ALK基因发生融合的基因(如EML4基因)；
2)在cDNA的3’端添加多聚C(polyC)的尾巴；其中，polyC尾的长度没有特别限制，通常为8-20bp，较佳地为10-15bp。
3)以添加了polyC尾的cDNA链为模板，在特异性扩增条件下，用与多聚C锚定引物与基因特异性引物2进行第一轮PCR反应，从而获得第一PCR产物；
其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与多聚C尾互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补。
一般，polyG结合区的长度与polyC尾的长度相对应，通常为8-20bp，较佳地为10-15bp。
多聚C锚定引物的锚定区的长度没有特别限制，通常为15-30bp，较佳地为15-20bp。
所述的ALK基因特异性引物2也位于ALK以及与其发生融合的基因的远端，但最远不超过ALK基因特异性引物1。虽然ALK基因特异性引物2和ALK基因特异性引物1可以重叠，但是优选地ALK基因特异性引物2位于ALK基因特异性引物1的内侧，即从ALK基因特异性引物1的扩增方向看，依次为ALK基因特异性引物1、ALK基因特异性引物2、ALK基因(或其部分)以及与ALK基因发生融合的基因(如EML4基因)；应理解，ALK基因特异性引物1和/或ALK基因特异性引物2都可以是特异性结合于ALK基因的外侧、结合于ALK基因的外侧和ALK基因本身、或者仅合于ALK基因本身。
由于本发明采用了特定结构的多聚C锚定引物与基因特异性引物2，因此获得的第一PCR扩增产物包括了：基因特异性引物2结合区、ALK基因(或其部分)、与ALK基因发生融合的基因(如EML4基因)、polyC区(来自多聚C锚定引物)、和锚定区(来自多聚C锚定引物)。
4)以第一PCR扩增产物为模板，在特异性扩增条件下，用锚定引物与基因特异性引物3进行第二轮PCR反应，从而获得第二PCR产物；
其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、多聚C锚定引物的锚定区相同(或互补)的锚定区。同样，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补。
锚定引物的锚定区的长度没有特别限制，通常为15-30bp，较佳地为15-20bp。此外，在锚定引物的5’端可以含有或不含有额外的辅助区，该辅助区可以提供辅助的可检测信号等。
一种优选的锚定引物是序列完全与多聚C锚定引物的锚定区完全相同(或完全互补)的多聚核苷酸。
应理解，所述的锚定区应不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补(即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合)。
所述的ALK基因特异性引物3也位于ALK以及与其发生融合的基因的远端，但最远不超过ALK基因特异性引物2，也不超过ALK基因特异性引物1。虽然ALK基因特异性引物3和ALK基因特异性引物1或2可以重叠，但是优选地ALK基因特异性引物3位于ALK基因特异性引物2和ALK基因特异性引物1的内侧，即从ALK基因特异性引物1的扩增方向看，依次为ALK基因特异性引物1、ALK基因特异性引物2、ALK基因特异性引物3、ALK基因(或其部分)以及与ALK基因发生融合的基因(如EML4基因)；应理解，ALK基因特异性引物1和/或ALK基因特异性引物2和ALK基因特异性引物3都可以是特异性结合于ALK基因的外侧、结合于ALK基因的外侧和ALK基因本身、或者仅合于ALK基因本身。
5)对得到的长度大于阴性对照的第二PCR产物进行测序，以得到与ALK基因发生融合的基因序列。
在本发明的一个优选例中，为了检测cDNA是否成功逆转，可以以纯化后的cDNA为模板，用内部质控引物进行扩增，进行验证。所述的内部质控引物可特异性扩增出ALK基因(或其部分片段)的引物。通常，内部质控引物特异性结合于ALK基因的外侧和/或ALK基因。从ALK基因特异性引物1的扩增方向看，依次为ALK基因特异性引物1、5’端的内部质控引物、ALK基因(或其部分)以及3’端的内部质控引物。
在ALK融合基因中，其一端基因相对固定(即ALK基因相对固定)，而另一端基因相对多变(如NMP、EML4)。因此，本发明方法特别适用于ALK融合基因。然而，应理解，除了ALK基因之外，目前还发现其他一些融合基因也存在一端基因相对固定，而另一端基因相对多变。本发明方法不仅可以用于检测ALK融合基因，还可以用于其他类型的融合基因。
试剂盒
本发明还提供了相应的检测试剂和试剂盒。
通常，本发明的试剂盒可用于检测基因融合，其中所述的融合基因是第一基因与第二基因融合形成的，所述的试剂盒包括以下组件：
1)位于容器a中基因特异性引物1，其中，所述的基因特异性引物1位于第一基因以及与其发生融合的第二基因的远端，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
2)位于容器b中的多聚C锚定引物；其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与polyC互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与polyC互补，也不与polyG结合区互补；
3)位于容器c中的基因特异性引物2，所述的基因特异性引物2对应于第一基因以及与其发生融合的基因的远端，且不超过基因特异性引物1，从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
4)位于容器d的锚定引物，其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、与多聚C锚定引物的锚定区相同或互补的锚定区，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
5)位于容器e中的基因特异性引物3，其中，所述的基因特异性引物3位于基因特异性引物2和基因特异性引物1的内侧，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、基因特异性引物3、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
并且，所述的多聚C锚定引物的锚定区和锚定引物锚定区都不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补，即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合。
本发明的引物可用常规方法制备和合成。
可用于本发明方法和试剂盒的反转录酶、PCR聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶等酶没有特别限制，可以采用本领域中已知的和常用的各类反转录酶、PCR聚合酶和末端脱氧核苷酸转移酶。此外，这些酶不仅可以通过商业途径购得，也可以用常规方法进行制备。
此外，使用各种反转录酶以及PCR聚合酶进行特异性的扩增、以及使用末端脱氧核苷酸转移酶在末端添加PolyC尾等都是本领域中熟知的，在例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)等文献中有详细描述。
通常，特异性扩增条件包括：第一轮反应的程序为94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 3min；72℃ 10min 35个循环，第二轮反应的程序为94℃ 30S，68℃ 30S，72℃ 3min 40个循环。第二轮PCR反应产物将用于测序，得到的产物序列将用于判断基因融合的方式。
本发明的主要优点在于：
(a)灵敏度高：与现有的RT-PCR以及FISH两种方法相比，本发明方法在敏感度上具有的优势。
(b)通用性强：不必事先知道与ALK发生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式，因此该方法不局限于EML4-ALK融合基因的检测，可扩展到其他有ALK参与的融合基因的检测。
(d)实用性好：适用于能够提取到RNA的各种肿瘤组织标本检测ALK融合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本
本实施例的样本来自广东省人民医院的103例经过手术的非小细胞肺癌病人，获得的样本用于ALK融合基因的检测。这些样本收集于2004年到2006年之间，其中包括62例腺癌，29例鳞癌，11例大细胞癌，1例平滑肌肉瘤。知情同意书发放给每一位患者并得到患者的同意。该研究获得了广东省人民医院伦理委员会的批准。所有103例样本均为合格样本可用于ALK融合基因的检测。
RNA抽提
使用市售的RNeasy试剂盒(购自QIAGEN公司，Valencia，CA)提取总RNA。所有的样本均经过病理评估且保证肿瘤所占的比例均不少于80％。
引物
用人工合成法，合成以下各引物。
表1.引物信息
| 引物 | 引物序列 | SEQ ID NO： |
| 用于逆转录的基因特异性引物1 | TTCAGGCAGCGTCTTCACAGCCAC | 1 |
| 多聚C锚定引物(第一轮RCR正向引物) | GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG | 2 |
| 基因特异性引物2(第一轮PCR反向引物) | GGCACCTCCTTCAGGTCACTGATG | 3 |
| 锚定引物(第二轮PCR正向引物) | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | 4 |
| 基因特异性引物3(第二轮PCR反向引物) | GGTCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTG | 5 |
| 内部质控正向引物 | TACCAGTGCTGTCTCAATTGCAGG | 6 |
| 内部质控反向引物 | TCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTGG | 7 |
RACE-like PCR联合测序的检测方法检测ALK融合基因
简而言之，整个方法分为五个步骤(见图2)：
1)对检测样本的mRNA利用ALK基因特异性引物1进行反转录得到cDNA；
2)在cDNA的3’端添加多聚C的尾巴；
3)利用与多聚C锚定引物与基因特异性引物2，进行第一轮PCR反应；
4)利用锚定引物与另一基因特异性引物3，进行第二轮PCR反应；
5)对得到的产物进行测序，以得到与ALK基因发生融合的基因序列。
具体的检测方法如下：
步骤一、从组织中提取总RNA后。以RNA为模板，使用TaKaRa AMV试剂盒(购自TaKaRa公司，DRR019A)以及基因特异性引物1，进行逆转反应，从而制得cDNA。逆转的程序为42℃，30分钟→99℃，5分钟→5℃，5分钟。
逆转后使用Roche High Pure试剂盒(购自Roche公司，11732668001)纯化cDNA。
纯化后的cDNA将通过一轮内部质控正向引物和反向引物的扩增，来检测cDNA是否成功逆转。
步骤二、通过末端脱氧核苷酸转移酶(购自TaKaRa，D2230)将多聚C(C10)的尾巴加至cDNA的3’末端，程序为37℃孵育30分钟。
步骤三、用多聚C锚定引物(第一轮PCR正向引物)和基因特异性引物2(第一轮PCR反向引物)进行第一轮特异性的PCR扩增，从而获得第一PCR产物。第一轮反应的程序为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 3分钟，35个循环，72℃ 10分钟；
步骤四、用锚定引物(第二轮PCR正向引物)和基因特异性引物3(第二轮PCR反向引物)进行第二轮特异性的PCR扩增，从而获得第二PCR产物。第二轮反应的程序为94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 3分钟40个循环。
步骤五、对第二PCR反应产物进行测序，得到的产物序列将用于判断基因融合的方式。
本实施例中，阳性样品P为已知带有ALK融合基因的样本，阴性样品NTC为未加cDNA模板的PCR反应。
实验结果
使用该方法检测ALK融合基因，在这些非小细胞肺癌的病人的手术样本中，12个样本检测结果为阳性且均为EML4-ALK融合基因，发生率(或检出率)为11.6％(12/103)。图片1.a.第一轮PCR胶图。M表示marker 200bp。b，表示第二轮产物胶图。P表示阳性标准品。NTC表示阴性标准品。其他表示1至45样本。c，EML4-ALK融合产物的测序图。
在已报道的6种融合形式中，本实施例检测出5种融合形式，其中4例为EML4E13-ALK E20(即EML4的外显子1至13与ALK外显子的20至29融合)，3例为EML4 E6-ALK E20，3例为EML4 E18-ALK E20，1例为EML4 E20-ALK E20以及1例为EML4 E2-ALK E20(见表2)。
表2.12个阳性样本中不同EML4-ALK融合方式
讨论
目前最常用的检测EML4-ALK融合基因的方法是RT-PCR和FISH的方法。
本发明的RCAE-like PCR联合测序检测方法的建立是基于ALK融合基因的特点，即其所有的融合基因ALK部分均包括并开始于第20外显子。利用已知的ALK第20外显子之后的基因序列设计RACE引物，通过逆转录步行至ALK融合基因的上游，获得跨越ALK融合基因的融合点的产物后，通过测序的方法确定与ALK发生融合的基因以及融合的方式。
使用RACE-like PCR联合测序的检测方法，检测到的阳性产物的比例为11.6％(12/103)。与之前报道的数据相比，在没有特殊筛选过的人群中，这个比例是最高的。
本发明以及已报道的EML4-ALK在非小细胞肺癌中的数据总结见表3。
表3.本发明以及已报道的EML4-ALK在非小细胞肺癌中的数据总结
总结以往发表的数据，Manabu Soda通过RT-PCR的方法于2007年报道了在日本人群中6.7％(5/75)的EML4-ALK融合基因的发生率。Kengo Tahechi等同样通过RT-PCR的方法于2008年在日本人群中发现了4.35％(11/235)的发生率[16]。2009年，Maria Paola Martelli[17]等在意大利和西班牙人群中发现了7.5％(1/120)的发生率，是目前已报道的使用RT-PCR方法发现比例最高的一项研究[17]。Perner S等人于2008年使用FISH结合RT-PCR的方法在高加索人群中得到了0.5％(3/603)的检出率[18]。
使用RACE-like PCR联合测序的检测方法不仅得到了11.6％(12/103)高检出率，并且在已报道的6种融合方式中发现了其中的5种，这显示该方法的灵敏性与实用性。与以上两种方法相比，其优势在于该方法可同时检测不同的ALK融合基因，即不必事先知道与ALK发生融合的基因以及ALK融合基因的融合方式，检测出未知的ALK融合基因。这将大大提高ALK融合基因的检出率，并能在肺癌样本中捕捉到除ALK-EML4外的融合基因，该方法也可扩展到除非小细胞肺癌样本之外的检测样本。
实施例2
检测ALK融合基因的试剂盒
制备一可用于检测ALK融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括五个容器，以及分别位于各引物中的以下引物：
| 引物 | 引物序列 | SEQ IDNO： |
| 用于逆转录的基因特异性引物1 | TTCAGGCAGCGTCTTCACAGCCAC | 1 |
| 多聚C锚定引物(第一轮PCR正向引物) | GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG | 2 |
| 基因特异性引物2(第一轮PCR反向引物) | GGCACCTCCTTCAGGTCACTGATG | 3 |
| 锚定引物(第二轮PCR正向引物) | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | 4 |
| 基因特异性引物3(第二轮PCR反向引物) | GGTCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTG | 5 |
此外，所述的试剂盒还包括一说明RACE样PCR联合测序法检测ALK融合基因的操作方法的说明书。
另外，在所述的试剂盒中还可包括以下一种或多种任选组分：
(a)装于一容器中的反转录酶；
(b)装于一容器中的PCR聚合酶；
(c)装于一容器中的末端脱氧核苷酸转移酶；
(d)装于一容器中的反转录缓冲液；
(e)装于一容器中的PCR反应缓冲液；
(f)装于一容器中的内部质控正向引物TACCAGTGCTGTCTCAATTGCAGG(SEQ ID NO：6)以及装于另一容器中的内部质控反向引物TCTTGCCAGCAAAGCAGTAGTTGG(SEQ ID NO：7)。
实施例3
检测实例
使用实施例2中所述的试剂盒对前述103例样本进行ALK融合基因检测，12个样本检测结果为EML4-ALK融合基因阳性，检出率为11.6％(12/103)，且每例结果均与先前检测结果一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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序列表
<110>广东省人民医院
阿斯利康投资(中国)有限公司
<120>一种检测基因融合的方法
<130>100773
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>1
ttcaggcagc gtcttcacag ccac 24
<210>2
<211>30
<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
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<400>2
ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg 30
<210>3
<211>24
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<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
ggccacgcgt cgactagtac 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggtcttgcca gcaaagcagt agttg 25
<210>6
<211>24
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<400>6
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<210>7
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<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
tcttgccagc aaagcagtag ttgg 24
Claims (10)
1.一种非诊断性的、体外检测样本中的多核苷酸是否存在基因融合的方法，其中所述的融合基因是第一基因与第二基因融合形成的，其特征在于，包括步骤：
1)以检测样本的mRNA为模板，在特异性扩增条件下，利用基因特异性引物1进行反转录，从而扩增得到cDNA链，其中所述的扩增的cDNA链的序列跨越了第一基因以及与其发生融合的第二基因的融合区；
其中，所述的基因特异性引物1位于第一基因以及与其发生融合的第二基因的远端，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
2)在cDNA的3’端添加多聚C(polyC)的尾巴；
3)以添加了polyC尾的cDNA链为模板，在特异性扩增条件下，用与多聚C锚定引物与基因特异性引物2进行第一轮PCR反应，从而获得第一PCR产物；
其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与多聚C尾互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
所述的基因特异性引物2位于第一基因以及与其发生融合的基因的远端，且不超过基因特异性引物1，从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
4)以第一PCR扩增产物为模板，在特异性扩增条件下，用锚定引物与基因特异性引物3进行第二轮PCR反应，从而获得第二PCR产物；
其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、与多聚C锚定引物的锚定区相同或互补的锚定区，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
其中，所述的锚定区不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补，即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合；
所述的基因特异性引物3位于基因特异性引物2和基因特异性引物1的内侧，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、基因特异性引物3、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
5)对得到的长度大于阴性对照的第二PCR产物进行测序，以得到与第一基因发生融合的基因序列，从而确定所述的多核苷酸是否存在基因融合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)和2)之间，还包括步骤：步骤1)获得的cDNA链为模板，用内部质控引物对进行扩增验证。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内部质控引物是特异性扩增出第一基因(或其部分片段)的引物对。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一基因选自下组：ALK基因。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二基因是选自下组的一种或多种基因：NPM，EML4，MSN，TPM3，ATIC，TFG，CARS，以及CLTC。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的polyC尾的长度为8-20bp；和/或
所述的polyG结合区的长度为8-20bp；和/或
所述的多聚C锚定引物的锚定区的长度为15-30bp；和/或
所述的锚定引物的锚定区的长度为15-30bp。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物1和/或基因特异性引物2和基因特异性引物3特异性结合于第一基因的外侧、结合于第一基因的外侧和第一基因本身、或者仅结合于第一基因本身。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法使用选自下组的一种或多种引物：
序列如SEQ ID NO：1所示的基因特异性引物1；
序列如SEQ ID NO：2所示的多聚C锚定引物；
序列如SEQ ID NO：3所示的基因特异性引物2；
序列如SEQ ID NO：4所示的锚定引物；
序列如SEQ ID NO：5所示的基因特异性引物3。
9.一种用于检测基因融合的试剂盒，其中所述的融合基因是第一基因与第二基因融合形成的，其特征在于，所述的试剂盒包括以下组件：
1)位于容器a中基因特异性引物1，其中，所述的基因特异性引物1位于第一基因以及与其发生融合的第二基因的远端，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
2)位于容器b中的多聚C锚定引物；其中所述的多聚C锚定引物包括(a)位于引物3’端的、与polyC互补的polyG结合区，以及(b)位于引物5’端的锚定区，其中所述的锚定区既不与polyC互补，也不与polyG结合区互补；
3)位于容器c中的基因特异性引物2，所述的基因特异性引物2对应于第一基因以及与其发生融合的基因的远端，且不超过基因特异性引物1，从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
4)位于容器d的锚定引物，其中所述的锚定引物包括位于引物3’端的、与多聚C锚定引物的锚定区相同或互补的锚定区，所述的锚定区既不与多聚C尾互补，也不与polyG结合区互补；
5)位于容器e中的基因特异性引物3，其中，所述的基因特异性引物3位于基因特异性引物2和基因特异性引物1的内侧，即从基因特异性引物1的扩增方向看，依次为基因特异性引物1、基因特异性引物2、基因特异性引物3、第一基因(或其部分)以及与第一基因发生融合的第二基因；
并且，所述的多聚C锚定引物的锚定区和锚定引物锚定区都不与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3相同或互补，即不会与特异性引物1、特异性引物2或特异性引物3发生特异性结合。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括选自下组的一种或多种引物：
序列如SEQ ID NO：1所示的基因特异性引物1；
序列如SEQ ID NO：2所示的多聚C锚定引物；
序列如SEQ ID NO：3所示的基因特异性引物2；
序列如SEQ ID NO：4所示的锚定引物；
序列如SEQ ID NO：5所示的基因特异性引物3。
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