CN104911251A - 焦磷酸测序法检测eml4-alk融合基因的引物对及试剂盒 - Google Patents

焦磷酸测序法检测eml4-alk融合基因的引物对及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对及包含所述引物对的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因。通过对EML4-ALK融合基因的mRNA设计引物，经过逆转录PCR后对产物进行测序分析，本试剂盒可以实现EML4-ALK融合基因的快速、准确、高通量的检测。

Description

焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。
背景技术
棘皮动物微管相关类蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like4，EML4)与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因与2007年被日本学者发现存在于部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，EML4-ALK融合基因在NSCLC中的阳性率约为3％-4％左右。EML4-ALK融合基因包括多种变异体(variants)，其中变异体1(variant 1或V1)和变异体3(variant 3或V3)的检出率最高。同时，EML4-ALK抑制剂为肺癌的个性化治疗提供了新的途径。
当前国内外广泛使用的分子生物学检测EML4-ALK融合基因的方法中，荧光原位杂交技术(FISH)操作复杂，而且不能区分不同的变异体；荧光定量PCR存在着检测通量的局限性和假阳性的缺点，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对以及含有所述引物对的试剂盒，可以同时检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：
(1)对于EML4-ALK variant 1基因，
扩增引物为： 
上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，
下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，
其中下游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物为： 
5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；
(2)对于EML4-ALK variant 3基因：
扩增引物为： 
上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，
下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，
其中上游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物： 
5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。
本发明进一步提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述试剂盒包含质控品和如下引物：
(1)对于EML4-ALK variant 1基因，
扩增引物为： 
上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，
下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，
其中下游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物为： 
5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；
(2)对于EML4-ALK variant 3基因：
扩增引物为： 
上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，
下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，
其中上游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物： 
5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。
其中，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为含有EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒溶液。
本发明还提出了上述引物对及包含上述引物对的试剂盒在制备检测EML4-ALK融合基因的试剂中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因，为制备用于检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因的试剂提供了理论基础。
具体实施方式
实验材料： 
引物由Invitrogen公司合成；Trizol购自Invitrogen公司；逆转录cDNA合成试剂盒购置于Fermentas公司；多重PCR试剂盒和焦磷酸测序试剂购置于QIAGEN公司。
一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，包括质控品和如下引物：
(1)对于EML4-ALK variant 1基因，
扩增引物为： 
上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，
下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，
其中下游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物为： 
5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；
(2)对于EML4-ALK variant 3基因：
扩增引物为： 
上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，
下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，
其中上游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物： 
5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。
其中，质控品(质控品DNA)包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为含有EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液；所述的阴性对照品作为阴性对照，与阳性对照品相比，阴性对照品为不含EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒溶液。
检测方法包括如下步骤：
(一)RNA提取：
取35个NSCLC患者的冰冻组织样本或石蜡包埋组织样本；1-35号患者的临床样本分别按照下面的步骤提取RNA：
(1)将冷冻组织样本在液氮中磨成粉末后，再以每50～100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％；
(2)研磨液室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
(3)取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，4℃下12,000g离心10分钟；
(4)弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下8,000g离心5分钟；
(5)小心弃去上清液，然后室温晾干或真空干燥5-10min；
(6)用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55～60℃，5～10min；
(7)测OD值定量RNA浓度。
按照上述步骤，分别获得1～35号样本的mRNA。
(二)多重逆转录PCR扩增：
按照如下方法对上述的1～35号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
(1)cDNA第一链的合成 
①取一RNase-free的离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
Total RNA              5～10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl)         1μl
RNase-free dH2O                     加至12μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
5×reaction buffer            4μl
RNase Inhibitor(20U/μl)      1μl
10mM dNTPs Mix                2μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
④离心管于37℃温育5分钟；
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；
⑥离心管于42℃反应60分钟；
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却。
如此，合成cDNA第一链，即模板cDNA(Template cDNA)。
(2)多重PCR
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下
其中，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix；10×Primer mix为包含上述两种融合基因引物对的混合物。
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
通过上述步骤，获得PCR产物。
(三)焦磷酸测序
首先，用微珠固定PCR产物，其主要是将生物素标记的PCR产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠(Streptavidin Sepharose High Performance)上，包括如下步骤：
(1)轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液；
(2)在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量(2μl/样品)与结合缓冲液(40μl/样品)，添加超纯水至一定体积，该体积与后续所要添加优化好的生物素标记的PCR产物的体积的总和为80μl/孔；
(3)将(2)中得到的一定体积的溶液添加至24孔PCR孔板中；
(4)根据孔板设置，添加5～20μl优化好的生物素标记的PCR产物至PCR孔板的每个孔槽，使其中每孔所含溶液为80μl；
(5)使用孔板条盖密封PCR孔板，确保孔槽之间没有泄漏；
(6)使用振荡混合器(1400rpm)不断振荡PCR孔板至少5～10分钟。
经过上述步骤，生物素标记的PCR产物被固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠上。
接着，开始真空工作站准备工作，包括如下步骤：
(1)准备以下试剂：大约50ml 70％(v/v)乙醇；大约40ml变性溶液(QIAGEN公司)；大约50ml 1×洗涤缓冲液(QIAGEN公司))；大约50ml超纯水；大约70ml超纯水；
(2)打开真空泵：打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作；
(3)每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性，将事先准备好的装好超纯水的离心管插在PCR装置上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用，反之则需更换过滤探针；
(4)取下振荡好的PCR孔板，将样品放入PCR装置中，小心降下过滤探针至PCR孔板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠；
(5)将真空装置移至含有70％(v/v)乙醇的第一试剂槽，冲洗过滤探针5秒；
(6)将真空装置移至含有变性溶液的第二试剂槽，冲洗过滤探针5秒；
(7)将真空装置移至含有洗涤缓冲液的第三试剂槽，冲洗过滤探针10秒；
(8)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；
(9)握持真空装置到Q24孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压散去；
(10)通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含3种测序引物的孔板中；
(11)在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的第四试剂槽，振荡10秒；
(12)降下探针至另一个含超纯水的第五试剂槽中并施加真空，清洗探针，用70ml超纯水冲洗过滤探针；
(13)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；
(14)关闭真空装置上的开关，并将其置于静止(P)位。
如此变完成了真空站的准备工作，接着开始分离DNA单链并将样品释放到PyroMark Q24孔板中，具体地包括如下步骤：
(1)将PyroMark Q24孔板放置在预热的孔板底座上80℃精确加热2分钟；
(2)从孔板底座上取下孔板，使样本在室温下至少冷却5分钟。
经过上述步骤，样品被杯释放到PyroMark Q24孔板中。接着准备PyroMark Q24试剂，按下述步骤进行：
(1)打开PyroMark Q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管；
(2)按照试剂盒说明书用超纯水溶解并分装酶和底物，所有试剂需恢复室温后再使用；
(3)依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的)。
准备好PyroMark Q24试剂后，在PyroMark Q24仪器上按下述步骤进行测试：
(1)打开PyroMark Q24软件，点击new assay(新测试)→new AQ assay(新AQ测试)→在sequence to analyze(待分析序列)中输入突变点序列，点击Generate Dispensation Order(产生分配顺序)，点击保存；
(2)点击new run(新运行)→Instrument method(仪器方法)→007，然后 点击要测序的格子，点击保存至U盘；
(3)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中；
(4)把加热好的孔板放到仪器上；
(5)将试剂仓(酶、底物和核苷酸)的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖；
(6)选择Run(运行)，并按OK；
(7)在进入Run(运行)后，按select(选择)选择要运行的文件；
(8)仪器运行结束并确认运行文件已保存至U盘后，按close，取出U盘；
(9)打开仪器，取出试剂仓，并对其进行反复清洗，废弃孔板；
(10)当仪器不运行时，从主菜单选择shutdown(关机)并按OK；
(11)当It is now safe to turn off the instrument(现在可以安全关机)出现时，即可关闭仪器，电源开关位于仪器后面。
(四)结果分析：
打开Pyromark Q24软件，分析EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因的类型，分析结果如下表：
结果表明，13、32号患者为EML4-ALK variant 1融合基因阳性；25号患者为EML4-ALK variant 3融合基因阳性。
综上，应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，其中包括引物的各种变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。

Claims (6)

1.一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的引物对，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：
(1)对于EML4-ALK variant 1基因，
扩增引物为：
上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，
下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，
其中下游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物为：
5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；
(2)对于EML4-ALK variant 3基因：
扩增引物为：
上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，
下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，
其中上游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物：
5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。
2.一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征在于，所述试剂盒包含如下所述的引物对：
(1)对于EML4-ALK variant 1基因，
扩增引物为：
上游引物：5′-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3′，
下游引物：5′-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3′，
其中下游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物为：
5′-TGGGAAAGGACCTAAA-3′；
(2)对于EML4-ALK variant 3基因：
扩增引物为：
上游引物：5′-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3′，
下游引物：5′-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3′，
其中上游引物的5′端进行生物素标记；
测序引物：
5′-GTGCTTCCGGCGGTA-3′。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括质控品，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒溶液。
5.权利要求1所述的引物对在制备检测EML4-ALK融合基因的试剂中的应用。
6.权利要求2所述的试剂盒在制备检测EML4-ALK融合基因的试剂中的应用。
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