CN107058305A

CN107058305A - 一组核苷酸序列及在eml4‑alk融合基因快速检测中的应用

Info

Publication number: CN107058305A
Application number: CN201710154768.8A
Authority: CN
Inventors: 刘阳; 王友亮; 易绍琼
Original assignee: Chinese PLA General Hospital; Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Chinese PLA General Hospital; Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明公开了一组用于PCR扩增的核苷酸序列组合及其在EML4‑ALK融合基因快速检测中的应用，以及一种EML4‑ALK融合基因的检测方法。所述方法可实现EML4‑ALK融合基因的无创检测，既可为肺癌的分子分型提供参考依据，也可用于EML4‑ALK融合基因的筛查，为肺癌的早期诊断提供参考依据，适用于大规模临床推广应用。

Description

一组核苷酸序列及在EML4-ALK融合基因快速检测中的应用

技术领域

本发明公开了一组核苷酸序列及应用，属于基因检测技术领域。

背景技术

肺癌是世界范围内也是中国最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位。肺癌是肺部肿瘤的统称，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，占肺癌的85％左右。肿瘤的发生，是一系列肿瘤相关基因突变的结果，这些基因在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。肿瘤研究者已经研发出多种针对肿瘤基因的靶向治疗药物，如针对EGFR基因突变肺腺癌的厄诺替尼和吉非替尼；针对肺癌中ALK融合基因突变的克唑替尼等。ALK融合基因突变中EML4-ALK融合基因是非小细胞肺癌，特别是肺腺癌的一个新的驱动基因，在肺癌中的发生率约为5％。目前，至少已有14种EML4-ALK的变异亚型被发现，这些变异亚型均为EML4的不同外显子与ALK的第20外显子相融合。亚型1(V1)，为EML4的第13外显子与ALK的第20外显子相连；亚型2(V2)，为EML4的第20外显子与ALK的第20外显子相连；亚型3(V3)，有两个亚亚型(V3a/b)，V3a为EML4的第6外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第6外显子加上一个33bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型4(V4)，为EML4的第14外显子加上一个11bp的小片段再与前面缺失49bp的ALK的第20外显子相连；亚型5(V5)，有两个亚亚型(V5a/b)，V5a为EML4的第2外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第2外显子加上一个117bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型6(V6)，为EML4的第13外显子加上一个49bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型7(V7)，为EML4的第14外显子与前面缺失12bp的ALK的第20外显子相连；亚型8(“V4”)，为EML4的第15外显子缺失了后面19bp再与前面缺失20bp的ALK的第20外显子相连；亚型9(“V5”)，为EML4的第18外显子与ALK的第20外显子相连。最常见的融合基因为亚型1，其次为亚型3。所有这些融合基因均具有生物学功能，其表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶，可激活ALK基因的膜内催化区域，激活相关信号通路，促进细胞增殖、存活、迁移，最终导致细胞癌变。目前用于ALK融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应等。但所有这些方法都是针对手术或者活检取材后的肿瘤组织进行的，对患者创伤性较大，难以用于常规检查，并且由于肺癌异质性的影响，所检测的肿瘤组织并不能反应肿瘤整体的情况。

外泌体由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-100nm。外泌体广泛存在于各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、脑脊液、乳汁、腹水、羊水、眼泪、鼻腔粘液和支气管肺泡灌洗液)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞增殖、细胞迁移、细胞分化、血管新生和免疫调节等过程。肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到周围环境中去，存在于患者的血液中，也可经血液循环到达腹水和胸膜积液等恶性病变体液中，使得通过血液等更易获得临床标本进行肿瘤相关的标志物检测成为可能。且外泌体能在4℃保存96h，或是在-80℃下保存更长时间，这些特点使得外泌体比其他样品更适用于肿瘤的早期诊断和预后判断。

为了克服现有技术检测对患者损伤较大的不足，本发明旨在提供一种能够快速检测生物样本中EML4-ALK融合基因的方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一组用于PCR扩增的核苷酸序列组合，所述序列组合选自由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，所述序列组合由由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列组成。

其次，本发明提供了所述的序列组合在EML4-ALK融合基因快速检测中的应用。

最后，本发明提供了一种快速检测EML4-ALK融合基因的方法，所述方法包括：

(1)提取生物样本的总RNA；

(2)以步骤(1)获得的RNA为模板，反转录获得cDNA；

(3)以步骤(2)获得的cDNA为板，进行PCR扩增，所述引物为由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种；

(4)对步骤(3)获得的扩增引物进行分析。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述生物样本来源于体液。

更为优选地，所述体液为血清。

在一个优选的实施方案中，步骤(3)所述引物由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的组合而成。

在一个优选的实施方案中，步骤(4)所述的分析为电泳法。

在另一个优选的实施方案中，步骤(4)所述的分析为DNA测序法。

更为优选地，步骤(4)所述DNA测序法中以SEQ ID NO.1所示的核苷酸为测序引物。

本发明所提供的引物组合用于PCR扩增时能够特异性地识别EML4-ALK融合基因的序列并扩增，具有高度特异性，只需一次扩增，就能检测出9种肺癌EML4-ALK变异亚型。

本发明所提供的方法涉及的样本取材方便，能全面反应肿瘤遗传信息，其所采用的生物样本获取比肿瘤组织样本的获取操作更为简单；包含的肿瘤基因信息丰富；特别适用于肿瘤组织样本不易得到的晚期肺癌患者；可实现EML4-ALK融合基因的无创检测。

本发明所提供的方法操作简单，降低了实验成本、简化了实验步骤，并具有良好的可重复性，特异性和敏感性高，而且其DNA测序法可以通过DNA一代测序即可完成，大大减低了测序成本，测序周期明显缩短，在更短的时间内即可获得检测报告，可以快速、准确、直观地检测出肺癌相关的EML4-ALK融合基因，检测结果准确可靠，为肺癌的早期诊断和分子分型提供参考依据，也可用于EML4-ALK融合基因的筛查。

附图说明

图1.肺癌患者1分离的血清外泌体在电镜形态观察图；

图2.肺癌患者1血清外泌体的Western Blot鉴定图谱；

图3.肺癌患者1血清外泌体中EML4-ALK基因融合RT-PCR电泳图谱；

图4.肺癌患者1RT-PCR扩增得到的EML4-ALK融合基因融合位点的测序结果；

图5.肺癌患者2血清外泌体的电镜形态观察图；

图6.肺癌患者2血清外泌体中EML4-ALK基因融合RT-PCR电泳图谱；

图7.肺癌患者2RT-PCR扩增得到的EML4-ALK融合基因融合位点的测序结果

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

利用本发明进行的肺癌患者EML4-ALK亚型V3a/b融合基因的检测，具体方法如下：

1.血清收集：用血生化管采集待检者外周血5mL，室温静置30分钟后，300g离心15分钟，经分离出的标本从上到下清晰地分成2层，依次为血清层和血细胞层。取血清层上清2000g，离心10分钟去除死亡细胞，取上清10000g离心30分钟去除细胞碎片，最后取上清，分装后-80℃冻存备用。以上过程保证在4-6小时内完成。

2.血清外泌体分离：外泌体提取采用SBI公司ExoQuickTM外泌体提取试剂盒提取，按试剂盒说明书结合文献报道进行操作，以血清为例，步骤如下:

1)从-80℃冰箱中取出血清，各取每份血清样品500μL快速解冻，4℃3000×g离心15分钟。

2)离心后取上清，经过0.45μm滤器过滤。

3)过滤后的血清液体约500μL加入ExoQuickTM试剂120μL，盖紧管盖，颠倒混匀3次。混合物置于4℃冰箱中反应过夜(至少12小时)。

4)4℃，13000rpm，离心30分钟，去除上清液，保留沉淀。

5)4℃，13000rpm，离心3分钟，充分去除上清液，保留沉淀即为外泌体微粒，-80℃冰箱保存备用。

本方法得到的血清外泌体经电镜鉴定(见图1)和外泌体特异的分子标志物鉴定(见图2)表明从血清中可以分离得到的外泌体。

3.待测样本总RNA提取：总RNA提取采用Invitrogen公司试剂提取，按试剂说明书结合文献报道进行操作，以外泌体为例，步骤如下:

(1)向外泌体微粒中加入1mL Trizol，充分混匀，于室温培养5分钟。

(2)加入0.2mL氯仿，盖紧瓶盖剧烈振荡15秒，放置2－3分钟。2－8℃，10000－12000×g离心15分钟。

(3)将上层水相转移到一个新的离心管中，加入0.25mL异丙醇，混匀，室温放置10分钟，2－8℃，10000－12000×g离心10分钟。

(4)弃上清，加入至少1mL75％的异丙醇洗涤，2－8℃，不大于7500×g离心5分钟。

(5)弃上清，空气干燥5－10分钟，加入无RNase的水20μL，反复抽吸使RNA溶解。

(6)55－60℃保温10分钟，-80℃冰箱储存备用。

4.待测样本cDNA制备：

使用Promega公司的GoScript^TM反转录体系对总RNA进行反转录，步骤如下：

(1)根据每个RNA样品的浓度计算200ng RNA所需的体积。

(2)根据每个样品的体积数加入适量体积的无RNA的水，总体积为4μL。

(3)向每个样品中加入1μL随机引物(0.5μg)。

(4)混匀后将其放入70℃加热5分钟，加热后立即将其放置在冰上，5分钟后用小型离心机离心10秒，然后放置在冰上。

(5)按照下表配制反转录体系：

(6)将15μL配制好的反转混合液与之前的5μL样品充分混合，在25℃退火5分钟。

(7)42℃延伸1小时。

(8)将样品放置于70℃加热15分钟以灭活反转录酶的活性。

5.EML4-ALK融合基因的PCR扩增：

基于EML4-ALK不同融合方式设计能够对其进行特异性扩增的引物，包括SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.8的序列。配制50μL PCR反应液：25μL2×Taq PCR混合物，2μL RT-PCR联合引物(Primer 1-8，浓度为10pM/条)，3μL反转的cDNA以及20μL双蒸水。按下列条件进行PCR反应：94℃2分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；4℃放置。

6.电泳检测：取3μl扩增产物进行电泳检测，采用2％(m/v)浓度琼脂糖凝胶，150V恒定电压电泳15分钟，染色后在紫外灯下检查扩增效果，电泳检测结果见图3。图3中GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),和NOTCH1为Notch homolog 1，是外泌体中mRNA含量比较多基因，作为参照物。

7.PCR产物纯化：对PCR产物进行纯化，纯化方式选用Ampure Beads，去除反应液中残留的引物、dNTPs、盐分、非特异PCR产物，最终满足产物长度在200-500bp，DNA纯度：OD260/OD280＝1.6-2.0。

8.PCR产物测序：采用普通DNA测序方法，以Primer1为测序引物，对样本进行测序分析，测序成本低，测序周期短。测序结果见图4。

9.信息分析：将测序结果与不同EML4-ALK融合方式的融合基因序列进行比对，其中融合基因序列来源于NCBI人类基因组参考序列，以此确定样本相应的基因信息。通过序列分析，EML4-ALK融合基因亚型鉴定为V3a/b型。

实施例.2肺癌患者血清的EML4-ALK亚型V1融合基因检测

利用本发明进行肺癌患者血清的EML4-ALK亚型V1融合基因检测，具体方法同实施例1，血清分离得到的外泌体电镜结果见图5、PCR产物电泳检测结果见图6、PCR产物测序结果见图7。

检测结果表明本发明提供的EML4-ALK融合基因检测具有较高的特异性，通过序列分析，EML4-ALK融合基因亚型鉴定为V1型。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院

中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 一组核苷酸序列及在EML4-ALK融合基因快速检测中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gagcttgctc agcttgtact cag 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ggggaatgga gatgttctta ctg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gctacatcac acaccttgac tgg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

aaattgtcga aaataccttc aacac 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cactttgtca gatgagaaat ggg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gatgaaatca ctgtgctaaa ggc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

tcaattttta gtaggcacat cacg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

tggatgcaga aaccagagat ctag 24

Claims

1.一组用于PCR扩增的核苷酸序列组合，所述序列组合选自由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的核苷酸序列组合，所述序列组合由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列组成。

3.权利要求1或2所述的序列组合在EML4-ALK融合基因快速检测中的应用。

4.一种快速检测EML4-ALK融合基因的方法，所述方法包括：

(1)提取生物样本的总RNA；

(2)以步骤(1)获得的RNA为模板，反转录获得cDNA；

(3)以步骤(2)获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，所述引物为由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的一种或多种；

(4)对步骤(3)获得的扩增引物进行分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述生物样本来源于体液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述体液为血清。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述引物由SEQ ID NO.1-8所示核苷酸序列的组合而成。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的分析为电泳法。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的分析为DNA测序法。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述DNA测序法中以SEQ ID NO.1所示的核苷酸为测序引物。