JP2018531223A - 癌を治療するための新規のバイオマーカーおよび方法 - Google Patents
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Abstract
癌などのPI3K経路に関連する病態治療のためのバイオマーカー、およびPI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を使用する方法を記載する。具体的には、癌の治療における患者選択のためのバイオマーカー、ならびに治療的処置の方法、診断キット、および検出の方法を記載する。ここでは、PI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子および/またはAKT遺伝子など)の変異、かつ野生型MAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子を有する癌は、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に好都合に応答する可能性が、より高い。
Description
優先権の主張
本願は、その全体が参照によって組み込まれる、2015年9月17日に出願された米国仮特許出願第62/219,698号に対する優先権を主張する。
本願は、その全体が参照によって組み込まれる、2015年9月17日に出願された米国仮特許出願第62/219,698号に対する優先権を主張する。
乳癌は、世界中で最もよく見られる癌の一つであり、毎年、1,300,000を超える症例が診断され、450,000を超える人が死亡している。乳癌を治療する際の最大の課題の一つは、その不均一性である。大量DNAシーケンシングの出現が、乳癌の変異の全体像を提供しており、こうした大量DNAシーケンシングと、コピー数多型および遺伝子発現データとの組み合わせによって、乳癌の10の統合的クラスターへの分類ができるようになっている(非特許文献1および非特許文献2)。PI3K/AKT/mTORシグナル伝達経路は、癌細胞増殖、生存、代謝、およびアポトーシスの重要なメディエーターであることが公知であり(非特許文献3)、10の統合的クラスターの分析は、ホスホイノシチド−3−キナーゼ、触媒性、αポリペプチド(PIK3CA)、すなわちPI3Kのαアイソフォーム(PI3Kα)をコードする遺伝子が、エストロゲン受容体陽性(ER+)クラスターのいくつかにおいて頻繁に変異することを示している。全体的に見ると、PIK3CAは、ルミナルA乳癌症例の45%において変異する(非特許文献4)。これらの研究は、腫瘍発生におけるPIK3CA遺伝子に関係する非常に様々な他の研究(特許文献1にまとめられている)と共に、癌の治療のためのPI3K−α阻害剤を発見するための、かなりの研究努力をもたらしてきた。しかし、癌患者における奏効率は、一般に低く、今日まで、PI3K−α阻害を標的にする抗癌剤は承認されていなかった。
AKTは、PI3Kの主なエフェクターとして、乳癌における成長因子受容体シグナル伝達の結果として乳癌において高頻度で見られる。AKTは、PI3K活性によって産生されたリン脂質PIP3およびPIP2によって活性化される。膜結合型PDK1は、PIP3によって、直接活性化され、活性化ループ上に位置するThr308上のAKTをリン酸化する。HER2−陽性乳癌では、例えば、PI3K経路は、活性化され、Thr308およびThr473のリン酸化によって測定された場合に高い活性のAKTをもたらす(MTORC2によって媒介される)。ER+乳癌では、PIK3CA変異を活性化することが一般的であり、これは、高レベルPIP3およびPIP2を維持するための成長因子活性化、したがって、AKTによって媒介される経路活性の必要性よりも優先する。PI3K活性化のすべてのシグナル伝達効果が、AKTシグナル伝達に起因するはずであるというわけではないが、このキナーゼは、経路における重要な中核であり続け、薬物発見および開発における懸命な努力の焦点である。AKTアイソフォームAKT1、AKT2、およびAKT3の阻害剤が開発されており、乳癌において、現在、臨床試験中である。AKT1の変異を活性化することが、ER+ルミナル乳癌において突き止められている。変異した症例の80%超では、影響を与えるコドンは、リジンへの高頻度の変異(E17K変異)を有するGlu17である。ER+ルミナル乳癌では、この変異の保有率は、およそ3%である。この変異活性化または他の変異活性化が、AKT阻害剤に対する感受性を与えることが考えられ、この仮説は、現在、臨床で試験されている。
乳癌患者の最近のゲノム研究はまた、特にMAP3K1およびMAP2K4、すなわちJNK細胞死経路の2つ上流のMAPKの変異の不活性化を介する、細胞生存の促進または癌におけるアポトーシスにおける、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の果たし得る役割を明らかにし始めている(非特許文献5)。MAP3K1(13〜20%)およびMAP2K4(〜8%)の変異は、ルミナルA乳癌において見られ、PIK3CAとMAP3K1との両方の同時変異は、11.56%のPIK3CA変異体で、臨床試料において報告されている(非特許文献6)。
PIK3CAとMAP3K1/MAP2K4遺伝子との同時変異が、PI3K経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答に寄与するように作用する機構は、(仮にあったとしても)わからないままである。さらに、こうした患者の応答における、AKTとMAP3K1/MAP2K4遺伝子との同時変異の役割(もしある場合には)については、ほんの少ししか知られていない。したがって、PI3K経路の上流成分(PIK3CAおよびAKT遺伝子など)の遺伝子変異とMAP3K1/MAP2K4遺伝子変異との間の相互作用、および腫瘍発生におけるその役割、ならびに、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での患者の治療におけるいずれかのこうした相互作用の関連性を理解する必要性が依然として存在する。
Curtis C et al.,Nature,2012,486,346−352
Dawson S−J et al.,EMBO J,2013,32,617−628
Fruman and Rommel,Nature Reviews 2014,13:140−156
Cancer Genome Atlas Network,Nature,2012,490,61−70
Pham T et al.,Genes&Cancer、2013,4,419−426
Cancer Genome Atlas Network,Nature,2012,490,61−70 and Ellis M et al.,2012,Nature,486,353−360
本明細書は、癌などのPI3K経路と関連する病態の治療のためのバイオマーカー、およびPI3K阻害剤(例えばPI3K−α阻害剤)またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を使用する方法を記載する。詳細には、本明細書は、癌の治療における患者選択のためのバイオマーカー、ならびに治療的処置の方法、診断キット、および検出の方法を提供する。
本明細書で記載するのは、PI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)をコードする遺伝子の状態、およびMAP3K1またはMAP2K4をコードする遺伝子の状態と、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性との間の関連の特定および特徴付けである。したがって、本発明は、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者、特に癌患者を選択する、および/または治療に治療的に応答する可能性が低い患者の治療を回避する、したがって不必要な治療、およびこうした有効ではない治療に伴われる可能性があるいずれかの副作用を回避ための、機会、方法、およびツールを提供する。
本明細書は、一つには、患者選択ツールおよび方法(個別化医療が含まれる)に関する。この選択は、治療されることとなる癌細胞が、野生型のもしくは変異したPI3K経路の上流成分(野生型のもしくは変異したPIK3CA遺伝子または野生型のもしくは変異したAKT遺伝子など)、および野生型のもしくは変異したMAP3K1またはMAP2K4遺伝子を有するかどうかに基づいている。したがって、PI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKTなど)の遺伝的状態(genetic status)、およびMAP3K1またはMAP2K4の遺伝子状態(gene status)は、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性のバイオマーカーとして使用することができる。具体的には、本明細書は、変異−陽性PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子、および変異−陽性MAP3K1またはMAP2K4遺伝子と、その結果生じる、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性の低下との間の関連を記載する。あるいは、本明細書は、変異−陽性PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子、および野生型MAP3K1またはMAP2K4遺伝子と、その結果生じる、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する感受性の増大との間の関連を記載する。
一態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、(a)前記癌を代表する、かつ前記患者からあらかじめ単離した試料において、PI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;(b)前記試料中のMAP3K1遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;(c)前記試料中のMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;(d)(i)前記PI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、変異体であると決定された場合;(ii)前記MAP3K1遺伝子が、野生型であると決定された場合;および(iii)前記MAP2K4遺伝子が、野生型であると決定された場合に、前記患者に、前記PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することとを含む方法が記載される。
別の態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、(a)前記患者の癌細胞におけるAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;(b)前記患者の癌細胞におけるMAP3K1遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;(c)前記患者の癌細胞におけるMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;(d)前記癌細胞が、(i)変異したAKT遺伝子;(ii)野生型MAP3K1遺伝子;および(iii)野生型MAP2K4遺伝子を有する場合、前記患者に、有効量のAKT阻害剤を投与することを含む方法が記載される。
別の態様では、前記癌細胞が、PI3K経路の上流成分、野生型MAP3K1遺伝子、および野生型MAP2K4遺伝子の変異を有する、前記癌の治療のための、前記PI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が記載される。
別の態様では、治療のための、癌を患う患者を除外するための方法であって、前記PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して潜在的に感受性がある癌を有する候補患者を特定することと;候補患者からあらかじめ単離した、癌を代表する試料中のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること(ここでは、前記患者は、前記癌細胞が、変異体MAP3K1またはMAP2K4遺伝子を有する場合に、前記PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して除外される)とを含む方法が記載される。
別の態様では、PI3K経路の上流成分の、また、MAP3K1およびMAP2K4の、その癌細胞遺伝子状態が、既に決定されている患者において、癌を治療する方法であって、前記癌細胞が、PI3K経路の上流成分、野生型MAP3K1遺伝子、および野生型MAP2K4遺伝子の変異を有する場合に、前記患者に前記PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することを含む方法が記載される。
PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に癌が応答することとなる患者について高められる、または該患者を選択することとなるバイオマーカーの明確な必要性が存在する。ある薬剤に応答する可能性が低い患者を特定する患者選択バイオマーカーはまた、非応答性の癌を有する患者の不必要な治療ないし、こうした薬剤の副作用の可能性を減じ、また、その治療効果から恩恵を受ける可能性が最も高い患者を治療について選択できるようにするので、癌の治療において重要である。
バイオマーカーは、「正常な生物学的過程、発病過程、または治療介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価される特徴」と述べることができる。バイオマーカーは、そのバイオマーカーの存在またはレベルと、状態または疾患のいくつかの態様(その状態または疾患の、存在、レベルまたは変化レベル、タイプ、段階、その状態または疾患に対する感受性、またはその状態または疾患を治療するために使用される薬物に対する応答性が含まれる)との間に相関が存在する場合に、ある特定の状態または疾患と関連するあらゆる特定可能および測定可能な指標である。この相関は、質的、量的、または質的と量的の両方あり得る。一般的に、バイオマーカーは、化合物、化合物断片、または化合物の基である。こうした化合物は、生物中に見られる、または生物によって産生される、タンパク質(およびペプチド)、核酸、ならびに他の化合物を含めたあらゆる化合物であり得る。
バイオマーカーは、予測力を有することができ、そのようなものとして、特定の状態または疾患の存在、レベル、タイプ、または段階(特定の微生物または毒素の存在またはレベルが含まれる)、特定の状態または疾患に対する感受性(遺伝的感受性が含まれる)、または特定の治療(薬物治療が含まれる)に対する応答を予測または検出するために使用することができる。バイオマーカーは、研究および開発プログラムの効率を高めることによって、薬物発見および開発の未来において、ますます重要な役割を果たすことになることが考えられる。バイオマーカーは、診断薬、疾患進行のモニター、治療のモニター、および臨床成績の予測因子として使用することができる。例えば、様々なバイオマーカー研究プロジェクトが、特定の癌の、また、特定の循環器および免疫疾患のマーカーを特定しようと試みている。新しい有効なバイオマーカーの開発は、医療および薬物開発の費用の有意な減少と、非常に様々な疾患および状態についての治療の有意な改善の両方をもたらすであろうと考えられている。
臨床試験を最適に設計する、また、これらの試験から最高の情報を得るために、バイオマーカーが必要とされる可能性がある。マーカーは、代用物(surrogate)および癌細胞、またはマーカーが検出可能であり得る他の患者試料において測定可能であり得る。理論上、これらのマーカーはまた、有効性と相関することとなり、したがって、最終的には患者選択のために使用される可能性がある。
したがって、本発明のこの態様の根底をなす技術的問題は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての患者の層別化のための手段の特定である。この技術的問題は、特許請求の範囲および/または本明細書の説明において特徴付けられる態様の提供によって解決される。
本明細書の実施例において詳述する通り、MAP3K1またはMAP2K4遺伝子の変異を有する細胞が、概して、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤による成長阻害に対して感受性が低いことが判明した。成長阻害は、細胞増殖の阻害および/または細胞死の増加の結果として起こり得る。
本明細書は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に対する細胞の感受性を決定する方法を提供する。この方法は、前記細胞におけるPI3K経路の上流成分の遺伝子(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の状態と、MAP3K1およびMAP2K4遺伝子の状態を決定することを含む。細胞は、上流成分の変異(変異したPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)を有し、かつ変異したMAP3K1またはMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がない可能性が高いと特定される。したがって、上流成分の(例えばPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子における)変異と、変異したMAP3K1またはMAP2K4遺伝子を有する患者は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して特に感受性が低いと予測される。細胞は、上流成分の変異(変異したPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)を有し、かつ野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が高いと特定される。したがって、PI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する患者は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して特に感受性があると予測される。
変異したPIK3CA遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する患者は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤での治療に対して感受性があると予測される。変異したAKT遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する患者は、AKT阻害剤での治療に対して感受性があると予測される。
細胞、または細胞の集団は、PI3K経路の上流成分の阻害剤が、細胞成長分析において(細胞増殖の阻害を通して、および/または細胞死の増加を通して)細胞数の増加を阻害する場合に、該阻害剤に対して感受性がある。本明細書に記載する方法は、どの細胞、または細胞の集団が、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が、より高いかということを、成長阻害によって予測するために有用である。
本開示はさらに、一つには、PI3K経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答性の可能性を決定するために使用することができる方法であって、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を投与するかどうかを決定することを含む方法に基づいている。具体的には、本発明の方法は、患者の癌細胞におけるPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の、またMAP3K1およびMAP2K4遺伝子の、遺伝子状態(例えば、野生型か変異しているか)の決定を含む。上流成分の変異(変異したPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)と、変異したMAP3K1またはMAP2K4遺伝子の存在は、癌細胞が、PI3K経路の上流成分の阻害剤と接触させた場合に成長阻害によって応答する可能性が低いことを示す。したがって、上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の、またMAP3K1およびMAP2K4遺伝子の、(癌細胞における)遺伝子状態は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などの、前記上流成分の阻害剤での治療について、患者を選択するために使用することができる。
さらに、PI3K経路の上流成分の阻害剤に対して感受性がある可能性が高い患者の特定のためのインビトロ方法を開示する。開示するのはまた、PIK3CA、AKT、MAP3K1、およびMAP2K4遺伝子の変異状態を検出することが可能なオリゴ−またはポリヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用である。開示するのはまた、PIK3CA、AKT、MAP3K1、およびMAP2K4変異の検出のためのキットの使用である。
開示するのはまた、癌を患う患者が、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での医薬的処置に応答する可能性が高いかを決定するためのインビトロ方法であって、(i)前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと;(ii)前記試料においてPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)が変異を含有するかを決定するステップと;(iii)前記試料においてMAP3K1またはMAP2K4遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む前記方法である。MAP3K1またはMAP2K4遺伝子の変異の非存在は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する癌の特定は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に対する応答について高めることとなる。野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する個々の癌は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に応答する見込みが最大である。
第2のこうした方法は、(i)前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと;(ii)前記試料においてPIK3CA遺伝子が変異を含有するかを決定するステップと;(iii)前記試料においてMAP3K1またはMAP2K4遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む。PIK3CA遺伝子の変異かつMAP3K1またはMAP2K4遺伝子の変異の非存在は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、変異したPIK3CA遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する癌の特定は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に対する応答について高めることとなる。変異したPIK3CA遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する個々の癌は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に応答する見込みが最大である。
さらなるこうした方法は、(i)前記患者からあらかじめ採取した癌を代表する試料を入手するステップと;(ii)前記試料においてAKT遺伝子が変異を含有するかを決定するステップと;(iii)前記試料においてMAP3K1またはMAP2K4遺伝子が変異を含有するかを決定するステップとを含む。AKT遺伝子の変異かつMAP3K1またはMAP2K4遺伝子の変異の非存在は、AKT阻害剤での治療に対する応答の見込みの増大を示す。遺伝子バイオマーカー試験の通り、変異したAKT遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する癌の特定は、AKT阻害剤に対する応答について高めることとなる。変異したAKT遺伝子と野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を含有する個々の癌は、AKT阻害剤に応答する見込みが最大である。
試料「癌を代表する」は、(例えば、生検組織から、または血液中に見られる細胞から)単離された実際の癌細胞含有試料であってもよいし、さらに処理されている試料、例えば癌細胞含有試料からのPCR増幅核酸の試料であってもよいし、患者の血液または他の体液中に見られる循環遊離DNAなどの癌由来の核酸の試料であってもよい。
定義:
「AKT阻害剤」は、プロテインキナーゼBとしても公知であるAKTのアイソフォームのいずれかを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。AKT阻害剤の例としては、MK−2206、イパタセルチブ(ipatasertib)(GDC−0068)、アフレセルチブ(afuresertib)(GSK−2110183)、4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミド、ならびに国際公開第2006/046023号パンフレット、国際公開第2006/046024号パンフレット、および国際公開第2009/047563号パンフレットに記載されているもの
が挙げられる。
「AKT阻害剤」は、プロテインキナーゼBとしても公知であるAKTのアイソフォームのいずれかを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。AKT阻害剤の例としては、MK−2206、イパタセルチブ(ipatasertib)(GDC−0068)、アフレセルチブ(afuresertib)(GSK−2110183)、4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミド、ならびに国際公開第2006/046023号パンフレット、国際公開第2006/046024号パンフレット、および国際公開第2009/047563号パンフレットに記載されているもの
が挙げられる。
「アレル」は、その特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列によって他の形態と区別される、遺伝子座の特定の形態を指す。
「増幅反応」は、標的核酸の、非標的核酸に対する特異的増幅をもたらす核酸反応である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、よく知られている増幅反応である。
「癌」は、本明細書では、腫瘍性形質への細胞の形質転換に起因する、腫瘍性成長成長を指すために使用される。こうした細胞の形質転換は、しばしば遺伝子変異を含む。
「遺伝子」は、発現を制御する、5’または3’隣接領域内に位置し得る(遺伝子の転写される部分の範囲内ではない)プロモーター、エクソン、イントロン、および他の配列因子を含む、RNA産物の調節された生合成のためのすべての情報を含有するDNAのセグメントである。
「遺伝子状態」は、遺伝子が、野生型か野生型でない(すなわち変異体)かということを指す。
「標識」は、分析試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す検出可能なシグナルを生じることが可能な組成物を指す。適切な標識としては、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、生物発光部分などが挙げられる。したがって、標識は、分光、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。
「非同義多様性」は、別の(変更された)ポリペプチド配列の産生をもたらす、遺伝子のコード配列内の、または該コード配列とオーバーラップする多様性(相違(variance))を指す。これらの多様性は、タンパク質機能に影響を与える可能性も与えない可能性もあり、ミスセンスバリアント(別のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換をもたらす)、ナンセンスバリアント(未成熟終止コドンの産生により、切断されたポリペプチドをもたらす)、および挿入/欠失バリアントが含まれる。
「同義多様性」は、コードされるポリペプチドの配列に影響を与えない、遺伝子のコード配列内の多様性(相違)を指す。これらの多様性は、タンパク質機能に間接的に(例えば、遺伝子の発現を変えることによって)影響を与える可能性があるが、反証がない限り、一般に、差しさわりがないと考えられる。
「核酸」は、当技術分野で公知である通りの、天然に見られる天然の核酸、および/または改変された骨格または塩基を有する改変された人工核酸を含めた、一本鎖または二本鎖DNAおよびRNA分子を指す。
「PI3K阻害剤」は、ホスホイノシチド−3−キナーゼのアイソフォーム(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、およびPIK3CG遺伝子の遺伝子産物など)のいずれか1つを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。PI3K阻害剤としては、PI3K−α、PI3K−β、およびPI3K−σ阻害剤が挙げられる。PI3K−βおよびPI3K−σ阻害剤の例は、(R)−8−(1−(3,5−ジフルオロフェニルアミノ)エチル)−N,N−ジメチル−2−モルホリノ−4−オキソ−4H−クロメン−6−カルボキサミドおよびイデラリシブである。
「PI3K−α阻害剤」は、ホスホイノシチド−3−キナーゼのα−アイソフォームを阻害することが可能な、あらゆる化合物または物質である。PI3K−α阻害剤の例としては、BYL719、GDC0032、1−(4−(5−(5−アミノ−6−(5−tert−ブチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ピラジン−2−イル)−1−エチル−1H−1,2,4−トリアゾール−3−イル)ピペリジン−1−イル)−3−ヒドロキシプロパン−1−オン、ならびに国際公開第2009/080705号パンフレット、国際公開第2010/029082号パンフレット、国際公開第2011/000905号パンフレット、および国際公開第2014/114928号パンフレットに記載されているものが挙げられる。
「プライマー」は、コピーされるべき核酸鎖と相補的であるプライマー伸長生成物の合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列を指す。プライマーの長さおよび配列は、プライマーが伸長生成物の合成を予備刺激することが可能であるような長さでなければならない。典型的なプライマーは、標的配列と実質的に相補的な、長さが少なくとも約7ヌクレオチドの配列を含有するが、いくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約15〜26ヌクレオチドを含有するが、より長いまたは短いプライマーも用いることができる。
「多型部位」は、ある集団において少なくとも2つの代替配列が見られる、遺伝子座内の位置である。
「多型」は、多型部位での、個人において認められる配列多様性を指す。多型には、ヌクレオチド置換、挿入、欠失、およびマイクロサテライトが含まれ、必ずしもではないが、遺伝子発現またはタンパク質機能の検出可能な違いをもたらし得る。発現またはタンパク質機能に対する影響の証拠がない場合、非同義バリアントを含めた共通(common)多型は、一般に、野生型遺伝子配列の定義に含まれるとみなされる。検証、観察される頻度、および疾患関連性を含めた、ヒト多型および関連するアノテーションの目録は、NCBIによって管理されている(dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)。遺伝子配列の文脈で使用される場合の用語「多型」は、化合物の固体状態形態の文脈で使用される場合の用語「多型」(これは、化合物の結晶性または非結晶性の性質である)と混同されるべきではないことに留意されたい。当業者は、その文脈によって、意図される意味を理解するであろう。
「プローブ」は、検出されるべきアレルの標的配列と厳密なに相補的である配列を有する、一本鎖の配列特異的なオリゴヌクレオチドを指す。
「応答」は、患者の2つの主要群:部分応答または安定な疾患を示す群、および進行性の疾患の徴候を示す群への分類を含む固形癌効果判定基準(RECIST)に従って行われる測定によって定義される。
「生存」は、患者の全生存期間および無増悪生存期間を包含する。「全生存」(OS)は、薬物投与の開始から、いずれかの原因による死亡までの時間と定義される。「無増悪生存期間」(PFS)は、薬物投与の開始から、進行性疾患の最初の出現またはいずれかの原因による死亡までの時間と定義される。
「PI3K経路の上流成分」は、mTORの上流である(かつmTORは含まれない)PI3K経路の遺伝成分を指す。PI3K経路の上流成分としては、PI3Kのアイソフォーム(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、およびPIK3CG遺伝子が含まれる)、AKTのアイソフォーム(AKT1、AKT2、およびAKT3遺伝子が含まれる)、PTEN、PDK1、SGK、INPP4B、INPP5D、PIK3R1、およびPIK3R2、特にPIK3CAおよびAKT(AKT1およびAKT2など)が挙げられる。PI3K経路の上流成分の阻害剤としては、PI3K阻害剤(PI3K−α、PI3K−β、およびPI3K−σ阻害剤など、例えばPI3K−α阻害剤)、およびAKT阻害剤が挙げられる。
治療のための選択の方法
一態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;癌を代表する該患者試料におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が野生型か変異体かを決定することと;該患者試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
一態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;癌を代表する該患者試料におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が野生型か変異体かを決定することと;該患者試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
別の態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;癌を代表する該患者試料におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
該方法は、実際の患者試料単離ステップを含むことも除くこともできる。したがって、一態様によれば、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、該患者患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
別の態様では、癌を患う患者のための治療を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
一態様では、該方法は、PIK3CA遺伝子の状態の決定を含む。
別の態様では、患者は、その癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子ならびに野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。
別の態様では、該方法は、AKT遺伝子の状態の決定を含む。
別の態様では、患者は、その癌細胞DNAが、変異したAKT遺伝子ならびに野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、AKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。
別の態様では、患者は、その癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子、および変異体MAP3K1遺伝子または変異体MAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について選択されない。
別の態様によれば、PI3K−α阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
別の態様によれば、AKT阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、AKT阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
別の態様によれば、AKT阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、AKT阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
さらなる態様によれば、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、該阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
一態様では、患者は、該癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子、および野生型MAP3K1遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。他の態様では、患者は、該癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、変異体MAP3K1遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤での治療について選択されない。
別の態様では、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を選択するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、該阻害剤での治療について患者を選択することとを含む方法が提供される。
一態様では、患者は、該癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について選択される。他の態様では、患者は、該癌細胞DNAが、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、変異体MAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤での治療について選択されない。
別の態様によれば、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤に対する患者の応答性を予測するための方法であって、該患者の癌細胞におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が野生型か変異体かを決定することと;該患者の癌細胞におけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する患者の応答性を予測することを含む方法が提供される。
別の態様によれば、癌に罹患したヒト患者における、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療の有効性の見込みを決定するための方法であって、該患者の癌細胞におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者の癌細胞におけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;それに基づいて、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する患者の応答性を予測することを含む方法が提供される。
別の態様によれば、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について患者を除外するための方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌細胞含有試料におけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること(ここでは、その癌細胞DNAが、変異体MAP3K1遺伝子または変異体MAP2K4遺伝子を有する場合に、該患者は、該阻害剤での治療について選択されない)を含む方法が提供される。
治療の方法
別の態様によれば、そのPI3K経路の上流成分の、またMAP3K1およびMAP2K4の、癌細胞遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、PI3K経路の上流成分についての変異体遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
別の態様によれば、そのPI3K経路の上流成分の、またMAP3K1およびMAP2K4の、癌細胞遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、PI3K経路の上流成分についての変異体遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
別の態様によれば、その癌細胞PIK3CAまたはAKT遺伝子状態、ならびにMAP3K1およびMAP2K4遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
別の態様では、その癌細胞PIK3CA、MAP3K1、およびMAP2K4遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したPIK3CA遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
別の態様では、その癌細胞AKT、MAP3K1、およびMAP2K4遺伝子状態が既に決定されている患者における癌を治療する方法であって、該癌細胞が、変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、AKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を該患者に投与することを含む方法が提供される。
別の態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者の癌細胞におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子の変異体または野生型状態を決定することと;患者の癌細胞におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子の変異体または野生型状態を決定することと;該細胞が、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
さらなる態様によれば、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;該患者の癌細胞におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;患者の癌細胞におけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該細胞が、PI3K経路の上流成分の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することを含む方法が提供される。
さらなる態様によれば、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;該患者の癌細胞におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者の癌細胞におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該癌細胞が、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することを含む方法が提供される。
さらなる態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌を代表する試料を提供することと;該患者の癌細胞におけるPIK3CA遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;患者の癌細胞におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該癌細胞が、変異したPIK3CA遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
さらなる態様では、癌を患う患者を治療する方法であって、患者からの癌細胞含有試料を提供することと;該患者の癌細胞中のAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;患者の癌細胞におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該癌細胞が、変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する場合に、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を患者に投与することとを含む方法が提供される。
本明細書で使用する場合、用語「有効な」および「有効性」には、薬理学的有効性と生理学的安全性との両方が含まれる。薬理学的有効性は、治療が患者における所望の生物学的効果をもたらす能力を指す。生理学的安全性は、治療の施与に起因する(しばしば副作用と呼ばれる)、細胞、器官、および/または生物体レベルでの、毒性のレベル、または他の有害な生理学的影響を指す。「それほど有効でない」は、治療が、治療的に有意な、より低いレベルの薬理学的有効性および/または治療的により高いレベルの有害な生理学的影響をもたらすことを意味する。
スクリーニングの方法
別の態様によれば、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
別の態様によれば、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
別の態様によれば、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
さらなる態様では、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるPIK3CA遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
さらなる態様では、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療についての適合性を立証するために患者をスクリーニングする方法であって、該患者からあらかじめ単離した癌を代表する試料におけるAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;該患者からあらかじめ単離した試料におけるMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することとを含む方法が提供される。
阻害剤およびその使用
別の態様によれば、その癌細胞がPI3K経路の上流成分の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、PI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
別の態様によれば、その癌細胞がPI3K経路の上流成分の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、PI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
別の態様によれば、その癌細胞が変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
別の態様では、その癌細胞が変異したPIK3CA遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、その癌細胞が変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定されている癌患者を治療するための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
別の態様によれば、PI3K経路の上流成分の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
別の態様によれば、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
さらなる態様では、変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤が提供される。
別の態様によれば、PI3K経路の上流成分の変異と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
別の態様によれば、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の治療における使用のための医薬品の製造のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の使用が提供される。
さらなる態様では、本発明は、PI3K経路の上流成分と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子の変異を有すると特定された癌細胞を伴う癌の予防および治療における使用のための、PI3K経路の上流成分の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
いっそうさらなる態様では、本発明は、変異したPIK3CA遺伝子または変異したAKT遺伝子と、野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有すると特定された癌細胞を伴う癌の予防および治療における使用のための、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を含む医薬組成物に関する。
該医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、植込錠、カプセル、液体含有カプセル、散剤、持続放出製剤、座剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、または使用に適した任意の他の形態の形をとることができる。
投与は、例えば、局所(すなわち、医薬組成物が、その作用が所望される場所に直接的に投与される)、経腸または経口(すなわち、医薬組成物が、消化管を介して与えられる)、または非経口(すなわち、医薬組成物が、消化管以外の他の経路によって、例えば注射によって与えられる)であり得る。
一態様では、活性な化合物またはその塩(PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などの、PI3K経路の上流成分の阻害剤)、および任意選択で別の治療的または予防的薬剤は、通例の手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために適合された医薬組成物として製剤化される。一般的に、静脈内投与のための活性な化合物は、滅菌した等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤も含むことができる。静脈内投与のための組成物は、任意選択で、注射の部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。一般に、これらの成分は、単位剤形で、例えば、アンプルなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは共に混合して提供される。活性な化合物が、注入によって投与されることとなる場合、これを、例えば、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて施与することができる。活性な化合物が、注射によって投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを、これらの成分を投与前に混合できるように提供することができる。
経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ錠、水性または油性の懸濁剤、顆粒剤、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、またはエリキシル剤の形態であり得る。経口的に投与される組成物は、医薬として美味な調製物を提供するための、1以上の任意選択の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテーム、またはサッカリンなどの甘味剤;ペパーミント、冬緑油、またはチェリーなどの香味剤;着色剤;および保存剤を含有することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料も、使用することができる。経口用組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なビヒクルを含むことができる。こうしたビヒクルは、特定の態様では、医薬品グレードのものである。
本発明による使用のための組成物は、1以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使用する従来の方式で製剤化することができる。したがって、活性な化合物および任意選択で別の治療または予防的薬剤ならびにその生理学的に許容できる塩および溶媒和化合物は、(口または鼻を通した)吸入または通気による投与、または経口、非経口、または粘膜(例えば頬側、膣内、直腸内、舌下)投与のための医薬組成物に製剤化することができる。一態様では、局所的または全身的な非経口投与が使用される。
経口投与については、該組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ);崩壊剤(例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの医薬として許容し得る賦形剤を伴って従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることもできるし、使用前の水または他の適切なビヒクルでの構成のための乾燥生成物として提供することもできる。こうした液体調製物は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、もしくは食用硬化脂肪);乳化剤(例えば、レシチン、もしくはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコール、もしくは分留された植物油);および保存剤(例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルもしくはソルビン酸)などの医薬として許容し得る添加物を伴う従来の手段によって調製することができる。これらの調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有することができる。
いくつかの態様では、本明細書に開示する化合物または塩は、0.1〜1mg、1〜10mg、10〜50mg、50〜100mg、100〜500mg、または500mgから5gの前記活性な化合物またはその塩を含む医薬組成物として投与することができる。
いっそうさらなる態様によれば、適切な単位剤形中のPI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤;患者が野生型または変異体のPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;患者が野生型または変異体のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を含有するための容器手段、およびPI3K経路上流成分、MAP3K1およびMAP2K4試験手段;ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
いっそうさらなる態様によれば、適切な単位剤形中のPI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤;患者が野生型または変異体のPIK3CA遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;患者が野生型または変異体のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤を含有するための容器手段、およびPIK3CA、MAP3K1、およびMAP2K4試験手段;ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
いっそうさらなる態様では、適切な単位剤形中のAKT阻害剤;患者が野生型または変異体のAKT遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;患者が野生型または変異体のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有するかどうかを決定するための分析の結果を提供するのに適した試験手段;AKT阻害剤を含有するための容器手段、およびAKT、MAP3K1、およびMAP2K4試験手段;ならびに任意選択で使用のための説明書を含むキットが提供される。
遺伝子状態:野生型か変異体か
本明細書の目的では、野生型の遺伝子状態は、遺伝子の正常または適切な発現、かつ、コードされるタンパク質の正常な機能を示すことが意図される。一方、変異状態は、癌(本明細書に記載する通りの)における、異常または不適切な遺伝子発現、または、変異したPI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKTなど)の、また、MAP3K1およびMAP2K4の公知役割と一致する変更された機能を有するタンパク質の発現を示すことが意図される。限定はされないが、変異、増幅、欠失、ゲノム再編成、またはメチル化プロファイルの変化を含めた、いずれかの数の遺伝的またはエピジェネティックな変更が、変異状態をもたらす可能性がある。しかし、それにもかかわらず、こうした変更が、正常なタンパク質の適切な発現、または機能的に等価なバリアントをもたらす場合、遺伝子状態は、野生型とみなされる。機能的変異遺伝子状態を一般的にもたらさないであろうバリアントの例としては、同義コーディングバリアントおよび共通多型(同義または非同義)が挙げられる。下に論じる通り、遺伝子状態は、機能分析によって評価することもできるし、参照配列から検出された逸脱の性質から推論することもできる。
本明細書の目的では、野生型の遺伝子状態は、遺伝子の正常または適切な発現、かつ、コードされるタンパク質の正常な機能を示すことが意図される。一方、変異状態は、癌(本明細書に記載する通りの)における、異常または不適切な遺伝子発現、または、変異したPI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKTなど)の、また、MAP3K1およびMAP2K4の公知役割と一致する変更された機能を有するタンパク質の発現を示すことが意図される。限定はされないが、変異、増幅、欠失、ゲノム再編成、またはメチル化プロファイルの変化を含めた、いずれかの数の遺伝的またはエピジェネティックな変更が、変異状態をもたらす可能性がある。しかし、それにもかかわらず、こうした変更が、正常なタンパク質の適切な発現、または機能的に等価なバリアントをもたらす場合、遺伝子状態は、野生型とみなされる。機能的変異遺伝子状態を一般的にもたらさないであろうバリアントの例としては、同義コーディングバリアントおよび共通多型(同義または非同義)が挙げられる。下に論じる通り、遺伝子状態は、機能分析によって評価することもできるし、参照配列から検出された逸脱の性質から推論することもできる。
ある種の態様では、PI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKT遺伝子など)および/またはMAP3K1およびMAP2K4遺伝子の野生型または変異の状態は、遺伝子の非同義核酸多様性の存在または非存在によって決定される。アノテートされた機能的影響を伴わない、公知の共通多型に相当する、観察された非同義多様性は、変異体の遺伝子状態に関与しない。
変異状態を意味するPI3K経路の上流成分の遺伝子(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)および/またはMAP3K1/MAP2K4遺伝子の他の多様性には、pre−mRNAからmRNAへのプロセシング間のイントロン/エクソン接合部の認識を低下させるスプライス部位多様性が含まれる。これは、エクソンスキッピング、またはスプライスされたmRNAへの正常なイントロン配列の包含(イントロン保持または潜在的なスプライスジャンクションの利用)をもたらす可能性がある。これは、続いて、正常なタンパク質に対する挿入および/または欠失を伴う異常なタンパク質の産生をもたらす可能性がある。したがって、他の態様では、イントロン/エクソン接合部にスプライス部位認識配列を変えるバリアントが存在する場合、遺伝子は、変異状態を有する。
PI3K経路の上流成分の遺伝子(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)および/またはMAP3K1/MAP2K4遺伝子の非同義、タンパク質発現、もしくは活性喪失(depleting)変異、および/または機能喪失変異は、本明細書に記載する態様における使用のために特に適しており、本開示の態様を提供する。さらなる態様では、こうした変異は、フレームシフト変異、スプライス部位変異、ナンセンス変異、および/またはミスセンス変異であり得る。
PIK3CA変異の特徴付け
国際公開第2014/114928号パンフレットは、乳癌に関してAstraZenecaで実施された(COSMICデータベース(Welcome Trust Sanger Institute,Sep 2011)に基づく)調査を記載しており、ここでは、>5Kヒト腫瘍をカバーするデータセットから、PIK3CA遺伝子の>55の異なる変異が特定された。大多数の変異は、<1%の頻度で生じ、3つは1〜3%の頻度で生じたが、4変異が、PIK3CA変異全体の〜88%を占めていた。これらは、C末端キナーゼドメインにおけるキナーゼドメインミスセンス変異、H1047R(55%)およびH1047L(5%)、ならびにらせん状ドメイン残基、E545K(18%)およびE542K(11%)であった。他のよく見られる乳癌変異の、より多くのリストは、網羅的であることを意図しないが、R38H、R38C、R88Q、N345K、C420R、E453Q、P539R、E542K、E545K、E545A、Q546K、Q546P、M1043I、M1043V、H1047R、H1047L、H1047Yを包含する。したがって、最も一般的な変異の検出に焦点を合わせ、それによって、大多数のPIK3CA変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された腫瘍試料から単離されたDNA内のPIK3CA遺伝子のエクソン1、4、7、9、および20における17変異(E542K、E545A、E545G、E545K、E545D、Q546K、Q546R、Q546E、Q546L、N345K、C420R、R88Q、H1047L、H1047R、H1047Y、G1049R、およびM1043I)を検出するために、Roche Molecular SystemsからのCobas(商標)PIK3CA変異テスト(Mutation Test)が設計される。このキットは、ER+ve乳癌の変異の〜95%を捕捉することが可能である。変異の分布は、他の腫瘍型では異なり、診断戦略は、それに応じて適合させることができる。例えば、子宮内膜癌では、乳癌と比較して、PIK3CA遺伝子コード配列全体を通した変異拡散の、より均一な分布が存在し、タンパク質のN末端領域における、より多くの変異を伴う(Douglas A. Levine,M.D,TCGA 2nd Annual Symposium,November 28,2012によって伝えられた)。
国際公開第2014/114928号パンフレットは、乳癌に関してAstraZenecaで実施された(COSMICデータベース(Welcome Trust Sanger Institute,Sep 2011)に基づく)調査を記載しており、ここでは、>5Kヒト腫瘍をカバーするデータセットから、PIK3CA遺伝子の>55の異なる変異が特定された。大多数の変異は、<1%の頻度で生じ、3つは1〜3%の頻度で生じたが、4変異が、PIK3CA変異全体の〜88%を占めていた。これらは、C末端キナーゼドメインにおけるキナーゼドメインミスセンス変異、H1047R(55%)およびH1047L(5%)、ならびにらせん状ドメイン残基、E545K(18%)およびE542K(11%)であった。他のよく見られる乳癌変異の、より多くのリストは、網羅的であることを意図しないが、R38H、R38C、R88Q、N345K、C420R、E453Q、P539R、E542K、E545K、E545A、Q546K、Q546P、M1043I、M1043V、H1047R、H1047L、H1047Yを包含する。したがって、最も一般的な変異の検出に焦点を合わせ、それによって、大多数のPIK3CA変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された腫瘍試料から単離されたDNA内のPIK3CA遺伝子のエクソン1、4、7、9、および20における17変異(E542K、E545A、E545G、E545K、E545D、Q546K、Q546R、Q546E、Q546L、N345K、C420R、R88Q、H1047L、H1047R、H1047Y、G1049R、およびM1043I)を検出するために、Roche Molecular SystemsからのCobas(商標)PIK3CA変異テスト(Mutation Test)が設計される。このキットは、ER+ve乳癌の変異の〜95%を捕捉することが可能である。変異の分布は、他の腫瘍型では異なり、診断戦略は、それに応じて適合させることができる。例えば、子宮内膜癌では、乳癌と比較して、PIK3CA遺伝子コード配列全体を通した変異拡散の、より均一な分布が存在し、タンパク質のN末端領域における、より多くの変異を伴う(Douglas A. Levine,M.D,TCGA 2nd Annual Symposium,November 28,2012によって伝えられた)。
PIK3CAについては、遺伝子(GenBank受入番号:NG_012113)、mRNA(GenBank受入番号:NM_006218)、およびタンパク質(GenBank受入番号:NP_006209またはSwiss−Prot受入:P42336)に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号:5、10、15、および20で示す。参照遺伝子(ゲノム領域)配列は、5000塩基の上流配列および2000塩基の下流配列を含む。PIK3CA内の変異は、よく知られており(COSMICデータベース−Welcome Trust Sanger Institute)、当業者は、野生型とのDNAまたはタンパク質配列の比較に基づいて、PIK3CA遺伝子状態、すなわち、ある特定のPIK3CA遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
PIK3CAについて開示された遺伝子およびmRNA参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、配列番号.20で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の2つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する1以上の同義変化(この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない)、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型(例えば生殖系列多型)、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
AKT変異の特徴付け
乳癌を含めたヒトの癌において、AKT1ミスセンス点変異が特定されている(下の参考文献1〜3参照)。E17K、すなわちヒトの癌における最も一般的なAKT1変異に加えて、いくつかの他の変異(L52R、C77F、およびQ79K)が、機能的に形質転換していることが示されている(下の参考文献4、5参照)。AKT1タンパク質とAKT2タンパク質との高い配列同一性を考慮すると(Ensemblデータベース−EMBl−EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)、AKT2の対応する変異も形質転換していることが考えられる。
乳癌を含めたヒトの癌において、AKT1ミスセンス点変異が特定されている(下の参考文献1〜3参照)。E17K、すなわちヒトの癌における最も一般的なAKT1変異に加えて、いくつかの他の変異(L52R、C77F、およびQ79K)が、機能的に形質転換していることが示されている(下の参考文献4、5参照)。AKT1タンパク質とAKT2タンパク質との高い配列同一性を考慮すると(Ensemblデータベース−EMBl−EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)、AKT2の対応する変異も形質転換していることが考えられる。
AKT1については、遺伝子(GenBank受入番号:NG_012188)、mRNA(GenBank受入番号:NM_005163)、およびタンパク質(GenBank受入番号:NP_005154またはSwiss−Prot受入:P31749)に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号:1、6、11、および16で示す。AKT2については、遺伝子(GenBank受入番号:NG_012038)、mRNA(GenBank 受入番号:NM_001626)、およびタンパク質(GenBank 受入番号:NP_001617またはSwiss−Prot受入:P31751)に関する参照配列が利用可能である。個々の参照配列は、それぞれ、配列番号:2、7、12、および17で示す。AKT1およびAKT2内の変異は、比較的低い頻度で生じ(COSMICデータベース−Welcome Trust Sanger Institute)、当業者は、野生型とのDNAまたはタンパク質配列の比較に基づいて、AKT1およびAKT2遺伝子状態、すなわち、ある特定のAKT1またはAKT2遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
AKT1およびAKT2について開示された遺伝子、mRNA配列、およびタンパク質の参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、(AKT1について)配列番号.16で、また(AKT2について)配列番号.17で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の2つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する1以上の同義変化(この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない)、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型(例えば生殖系列多型)、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
1.Flatley, E. et al. PIK3CA−AKT pathway mutations in micropapillary breast carcinoma. Human Pathology (2013) 44, 1320−1327.
2.Stemke−Hale, K. et al. An integrative genomic and proteomic analysis of PIK3CA, PTEN and AKT mutations in breast cancer. Cancer Research (2008) 68, 6084−6091.
3.Troxell, M.L. et al. High prevalence of PIK3CA/AKT pathway mutations in papillary neoplasms of the breast. Modern Pathology (2010). 23, 27−37.
4.Yi, K. et al. Functional analysis of non−hotspot AKT1 mutants found in human breast cancers identifies novel driver mutations: implications for personalized medicine Oncotarget (2012) 4, 29−34.
5.Carpten, J.D., et al. A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer. Nature (2007) 448, 439−444.
2.Stemke−Hale, K. et al. An integrative genomic and proteomic analysis of PIK3CA, PTEN and AKT mutations in breast cancer. Cancer Research (2008) 68, 6084−6091.
3.Troxell, M.L. et al. High prevalence of PIK3CA/AKT pathway mutations in papillary neoplasms of the breast. Modern Pathology (2010). 23, 27−37.
4.Yi, K. et al. Functional analysis of non−hotspot AKT1 mutants found in human breast cancers identifies novel driver mutations: implications for personalized medicine Oncotarget (2012) 4, 29−34.
5.Carpten, J.D., et al. A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer. Nature (2007) 448, 439−444.
MAP3K1および/またはMAP2K4変異の特徴付け
文献(下の参考文献1〜4参照)中のいくつかの報告は、MAP3K1およびMAP2K4遺伝子の高頻度の変異を特定した。変異は、いずれかの機能ドメインにおける明らかな濃縮なしに、各遺伝子のコード配列にわたって分布していた。このパターンは、腫瘍抑制遺伝子(ここでは、いわゆる「機能喪失」変異(スプライシング、ナンセンス、およびフレームシフト変異)が、機能性タンパク質の発現を抑制する)としての遺伝子の機能を示す。MAP3K1については、19%の場合では、変異は、コード配列の非同義変化をもたらす(Pham et al Genes and Cancer 2014,4:410−426)が、大多数の場合では、変異は、フレームシフト欠失または挿入である(変異の59%)。その例は、R273fs*27.I761fs*35などのフレームシフト変異、ならびにS431*およびS1344*などのナンセンス変異である。したがって、機能喪失変異の検出に焦点を合わせ、それによって、MAP3K1およびMAP2K4変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。MAP3K1およびMAP2K4については、遺伝子、mRNA、およびタンパク質に関する参照配列が利用可能である(表1)。個々の参照配列の配列番号を、下の表1に示す。
文献(下の参考文献1〜4参照)中のいくつかの報告は、MAP3K1およびMAP2K4遺伝子の高頻度の変異を特定した。変異は、いずれかの機能ドメインにおける明らかな濃縮なしに、各遺伝子のコード配列にわたって分布していた。このパターンは、腫瘍抑制遺伝子(ここでは、いわゆる「機能喪失」変異(スプライシング、ナンセンス、およびフレームシフト変異)が、機能性タンパク質の発現を抑制する)としての遺伝子の機能を示す。MAP3K1については、19%の場合では、変異は、コード配列の非同義変化をもたらす(Pham et al Genes and Cancer 2014,4:410−426)が、大多数の場合では、変異は、フレームシフト欠失または挿入である(変異の59%)。その例は、R273fs*27.I761fs*35などのフレームシフト変異、ならびにS431*およびS1344*などのナンセンス変異である。したがって、機能喪失変異の検出に焦点を合わせ、それによって、MAP3K1およびMAP2K4変異の特定を可能にする、診断分析を構築することができる。MAP3K1およびMAP2K4については、遺伝子、mRNA、およびタンパク質に関する参照配列が利用可能である(表1)。個々の参照配列の配列番号を、下の表1に示す。
MAP3K1およびMAP2K4内の変異は、よく知られており(COSMICデータベース−Welcome Trust Sanger Institute)、当業者は、野生型とのDNAまたはタンパク質配列の比較に基づいて、遺伝子状態、すなわち、ある特定のMAP3K1またはMAP2K4遺伝子が野生型か変異体かということを決定することができるであろう。
MAP3K1およびMAP2K4について開示された遺伝子およびmRNAおよびタンパク質の参照配列は、それぞれ代表的な配列であり、本開示の目的では、比較目的でのみ、好ましいタンパク質参照配列が、(MAP3K1について)配列番号.19で、また(MAP2K4について)配列番号.18で示されることが明らかであろう。正常な個人では、いくらかの配列の違いを有する可能性が高いであろう各遺伝子の2つのコピー、すなわち母系および父系のコピーが存在し、さらに、集団内には、遺伝子配列の多数のアレルバリアントが存在することとなる。野生型とみなされる他の配列には、核酸配列に対する1以上の同義変化(この変化は、コードされるタンパク質配列を変えない)、タンパク質配列を変えるがタンパク質機能に影響を与えない非同義共通多型(例えば生殖系列多型)、およびイントロンの非スプライス部位配列変化を有するものが含まれる。
1.The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature (2012) 490, 61-70.
2.Stephens, P.J. et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature (2012) 486, 400-404.
3.Ellis, M.J. et al. Whole−genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition. Nature (2012) 486, 353−60.
4.Curtis, C. et al. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature (2012) 486, 346-352.
2.Stephens, P.J. et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature (2012) 486, 400-404.
3.Ellis, M.J. et al. Whole−genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition. Nature (2012) 486, 353−60.
4.Curtis, C. et al. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature (2012) 486, 346-352.
治療の有効性の見込みを決定するための方法
別の態様によれば、癌に罹患したヒト患者における、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療の有効性の見込みを決定するための方法であって、前記患者のPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)における、野生型遺伝子に対する少なくとも1つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出することと;前記患者のMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子における、野生型遺伝子に対する少なくとも1つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出すること(ここでは、PI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)における少なくとも1つの非同義核酸相違の存在、かつMAP3K1遺伝子とMAP2K4遺伝子の両方における少なくとも1つの非同義核酸相違の非存在は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療が有効となる可能性が高いことを示す)とを含む方法が提供される。
別の態様によれば、癌に罹患したヒト患者における、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療の有効性の見込みを決定するための方法であって、前記患者のPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)における、野生型遺伝子に対する少なくとも1つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出することと;前記患者のMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子における、野生型遺伝子に対する少なくとも1つの非同義核酸相違の存在または非存在を検出すること(ここでは、PI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)における少なくとも1つの非同義核酸相違の存在、かつMAP3K1遺伝子とMAP2K4遺伝子の両方における少なくとも1つの非同義核酸相違の非存在は、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療が有効となる可能性が高いことを示す)とを含む方法が提供される。
別の態様によれば、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する個人の感受性を評価するための方法であって:
(i)該個人からの癌細胞DNAにおけるPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の非同義的変異状態を決定することと;
(ii)該個人からの癌細胞DNAにおけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子の非同義的変異状態を決定することと;
(iii)該癌細胞におけるPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)と、MAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子の非同義的変異状態を参照することにより、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する該個人の感受性の可能性を決定することと
を含む方法が提供される。
(i)該個人からの癌細胞DNAにおけるPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)の非同義的変異状態を決定することと;
(ii)該個人からの癌細胞DNAにおけるMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子の非同義的変異状態を決定することと;
(iii)該癌細胞におけるPI3K経路の上流成分(PIK3CA遺伝子またはAKT遺伝子など)と、MAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子の非同義的変異状態を参照することにより、PI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対する該個人の感受性の可能性を決定することと
を含む方法が提供される。
PIK3CAの遺伝子状態を決定するための、当業者に利用可能な多数の技術が存在する。該遺伝子状態は、核酸配列の決定によって決定することができる。これは、全長遺伝子のダイレクトシーケンシング、またはその遺伝子内の特定の部位、例えば共通に変異される部位の分析を介する可能性がある。
決定するための代替手段は、PIK3CA遺伝子が野生型か変異体かに関わりなく、転写された遺伝子の機能を評価することである。このPIK3CA遺伝子の機能的変異は、限定はされないがAktおよびS6キナーゼの活性化を含めた、細胞における経路の下流シグナル伝達の増大をもたらす、増大した脂質キナーゼ活性を有するタンパク質を生じる。細胞において発現される場合のPIK3CAバリアントの機能状態を評価するための分析には、限定はされないが、
(i)PIK3CA遺伝子のキナーゼ活性の産物、ホスファチジルイノシトール−三リン酸(PI(3,4,5)P3)の産生増大;
(ii)リン酸化されたAktまたはS6キナーゼのレベル上昇;
(iii)PIK3CAのバリアントで遺伝子導入されたNIH−3T3細胞の増殖巣およびコロニー形成の増大;
が含まれる(Ikenoue T et al.,Cancer Res.,2005 65,4562−4567)。
(i)PIK3CA遺伝子のキナーゼ活性の産物、ホスファチジルイノシトール−三リン酸(PI(3,4,5)P3)の産生増大;
(ii)リン酸化されたAktまたはS6キナーゼのレベル上昇;
(iii)PIK3CAのバリアントで遺伝子導入されたNIH−3T3細胞の増殖巣およびコロニー形成の増大;
が含まれる(Ikenoue T et al.,Cancer Res.,2005 65,4562−4567)。
関連するDNA試料をプロファイルするための代替手段は、超並列シーケンシング(Massively Parallel Sequencing)(次世代シーケンシング(Next Generation Sequencing)、すなわちNGSとしても公知である)を含む。超並列シーケンシング方法は、これらの遺伝子の遺伝子型を決定するために使用することができ、限定はされないが、Illumina、Ion Torrent、Sequenom、およびOxford Nanoporeプラットフォームが、その例である。
試料
遺伝子状態について試験されることとなる患者の試料は、個人から入手したまたは入手可能なあらゆる癌組織もしくは癌細胞含有試料、または血液/血漿もしくは他の体液中に見られる可能性がある循環遊離DNA(cfDNA)などの癌核酸を含有する試料であり得る。試験試料は、好都合には、個人から入手した血液、口腔スワブ、生検組織、または他の体液もしくは組織の試料である。具体例としては、循環癌細胞、血漿または血清中の循環DNA、卵巣癌患者の腹水から単離した細胞、肺内に癌を有する患者の肺喀痰、乳癌患者からの穿刺吸引物、尿、末梢血、細胞擦過物、毛包、皮膚パンチ、または頬側試料が挙げられる。
遺伝子状態について試験されることとなる患者の試料は、個人から入手したまたは入手可能なあらゆる癌組織もしくは癌細胞含有試料、または血液/血漿もしくは他の体液中に見られる可能性がある循環遊離DNA(cfDNA)などの癌核酸を含有する試料であり得る。試験試料は、好都合には、個人から入手した血液、口腔スワブ、生検組織、または他の体液もしくは組織の試料である。具体例としては、循環癌細胞、血漿または血清中の循環DNA、卵巣癌患者の腹水から単離した細胞、肺内に癌を有する患者の肺喀痰、乳癌患者からの穿刺吸引物、尿、末梢血、細胞擦過物、毛包、皮膚パンチ、または頬側試料が挙げられる。
試験試料が、試験試料における配列に相当する核酸配列と同等のものであり得るということ、すなわち、試料核酸内の領域の全部または一部を、分析の前に、いずれかの好都合な技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、第一に増幅することができることを理解されたい。核酸は、ゲノムDNA、または分画された細胞もしくは細胞全体のRNAであり得る。特定の態様では、RNAは、全細胞RNAであり、ランダムプライマーまたはポリAプライマーを使用して第一鎖cDNAを標識するための鋳型として直接使用される。試験試料中の核酸またはタンパク質は、標準の方法論に従って、試料から抽出することができる(Green&Sambrook,Eds.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2012,4th edition,Vol.1−3,ISBN 9781936113422)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと)。
本発明の診断方法は、個人または患者からあらかじめ採取した試料を使用して実施することができる。こうした試料は、凍結によって保存する、または、ホルマリン−パラフィンまたは他の媒体中で固定および包埋することができる。あるいは、新鮮な癌細胞含有試料を入手して使用することができる。
本明細書に開示する方法は、あらゆる適切な癌由来の細胞を使用して適用することができる。治療に適した癌は、本明細書に記載する。
変異の保有率
PIK3CAの変異は、臨床腫瘍に広く見られるが、各遺伝子の変異の保有率は、腫瘍組織型によって著しく異なる。例えば、PIK3CA変異は、乳癌においては比較的に一般的であるが、腎臓腫瘍においては比較的に稀である(表2)。
PIK3CAの変異は、臨床腫瘍に広く見られるが、各遺伝子の変異の保有率は、腫瘍組織型によって著しく異なる。例えば、PIK3CA変異は、乳癌においては比較的に一般的であるが、腎臓腫瘍においては比較的に稀である(表2)。
AKT1およびAKT2の変異は、臨床腫瘍に広く見られ、変異の保有率は、腫瘍組織型によって変わる(表3および4)。
MAP3K1の変異は、乳房、胃、および子宮癌を含めた多くの癌型に見られる(表5)。すべての乳癌研究を合計した保有率は、およそ6%であるが、特定の型の乳癌では、より高い可能性がある。例えば、乳癌において見られる変更の75%は、ルミナルA、HER2陰性/ER+癌に見られ、ここでは、MAP3K1変異の保有率は、11%から16%であり得る。
MAP2K4の変異は、乳房、結腸、膵臓、および胃を含めた多くの癌型に見られる(表6)。すべての乳癌研究を合計した保有率は、およそ3%であるが、特定の型の乳癌では、より高い可能性がある。例えば、乳癌において見られる変更の75%は、ルミナルA、HER2陰性/ER+癌に見られ、ここでは、MAP2K4変異の保有率は、8%から10%であり得る。
いずれの当業者にも明らかであろう通り、この頻度データは、新しいものとして、絶えず改善および更新されており、より包括的なデータが、TCGA(The Cancer Genome Atlas)およびICGC(International Cancer Genome Consortium)などのヒト癌ゲノムプロファイリングコンソーシアムから出てくる。したがって、PIK3CAまたはAKT従属物およびMAP3K1および/またはMAP2K4従属物を伴う追加の腫瘍型が、同定され、本明細書に記載する通りのPI3K−α阻害剤またはAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に適している可能性がある。
関連する適応
癌の治療が示される場合、これは、転移の予防および転移、すなわち癌の拡散の治療を指すことができることが理解されよう。したがって、本明細書に開示する方法は、転移を有しない患者を、転移が発生するのを阻止するためにまたは発生するまでの期間を延長するために治療するために、また、既に転移を有している患者を、転移それ自体を治療するために治療するために、使用される可能性がある。さらに、癌の治療は、定着した原発腫瘍(1または複数)および進行している原発腫瘍(1または複数)の治療を指すことができる。
癌の治療が示される場合、これは、転移の予防および転移、すなわち癌の拡散の治療を指すことができることが理解されよう。したがって、本明細書に開示する方法は、転移を有しない患者を、転移が発生するのを阻止するためにまたは発生するまでの期間を延長するために治療するために、また、既に転移を有している患者を、転移それ自体を治療するために治療するために、使用される可能性がある。さらに、癌の治療は、定着した原発腫瘍(1または複数)および進行している原発腫瘍(1または複数)の治療を指すことができる。
したがって、癌の治療の一態様は、転移の予防に関する。
別の態様では、癌の治療は、転移の治療に関する。
別の態様では、癌の治療は、定着した原発腫瘍(1または複数)または進行している原発腫瘍(1または複数)の治療に関する。
本明細書では、癌の治療は、癌それ自体の予防を指すことができる。
一態様では、癌が言及される場合、これは、腫瘍細胞の増殖、生存、侵襲性、および遊走能力をもたらすシグナル伝達ステップに含まれるPI3K経路の上流成分の阻害に対して感受性がある腫瘍を指すことができる。
一態様では、癌は、PIK3CAまたはAKT遺伝子などのPI3K経路の上流成分の変異を保持するものである。
一態様では、癌は、変異、増幅、または他の異常に基づくPIK3CA−従属物またはAKT−従属物を呈するものである。
一態様では、癌は、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、膀胱癌、脳癌、結腸直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、陰茎癌、および他のPI3キナーゼ依存性の癌から選択される。
一態様では、癌は、乳癌である。
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性の乳癌である。
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性のルミナル乳癌である。
一態様では、癌は、エストロゲン受容体陽性のルミナルA乳癌である。
一態様では、癌は、転移状態である。
一態様では、癌は、転移状態ではない。
核酸の検出のための方法
本発明の状況では、薬物治療に対する応答を予測するために、変異したPI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKTなど)の、また、変異したMAP3K1またはMAP2K4核酸の検出を用いることができる。これらの遺伝子の変異は、DNAレベルで起こるので、本発明の方法は、ゲノムDNA、ならびに転写物およびタンパク質それ自体の変異または相違の検出に基づくことができる。検出される変異が、対象において実際に発現されることを確実にするために、転写物および/またはポリペプチドの分析によってゲノムDNAの変異を確認することが望ましい可能性がある。
本発明の状況では、薬物治療に対する応答を予測するために、変異したPI3K経路の上流成分(PIK3CAまたはAKTなど)の、また、変異したMAP3K1またはMAP2K4核酸の検出を用いることができる。これらの遺伝子の変異は、DNAレベルで起こるので、本発明の方法は、ゲノムDNA、ならびに転写物およびタンパク質それ自体の変異または相違の検出に基づくことができる。検出される変異が、対象において実際に発現されることを確実にするために、転写物および/またはポリペプチドの分析によってゲノムDNAの変異を確認することが望ましい可能性がある。
ある遺伝子内の1以上の位置でのバリアントヌクレオチドの存在または非存在を検出するために使用することができる、数多くの分析手順が存在することが、当業者には明らかであろう。一般に、アレル多様性の検出は、変異識別技術、任意選択で増幅反応(ポリメラーゼ連鎖反応に基づくものなど)および任意選択でシグナル発生系を必要とする。当技術分野で利用可能な多数の変異検出技術が存在し、これらを、当技術分野で利用可能な多くのものが存在するうちのシグナル発生系と組み合わせて使用することができる。アレル多様性の検出のためのたくさんの方法が、Nollau et al.,Clin. Chem.,1997,43,1114−1120;Anderson SM.Expert Rev Mol Diagn.,2011,11,635−642;Meyerson M.et al.,Nat Rev Genet.,2010,11,685−696によって;また標準の教科書、例えば‘‘Laboratory Protocols for Mutation Detection’’,Ed.by U.Landegren,Oxford University Press,1996、および‘‘PCR’’,2nd Edition by Newton&Graham,BIOS Scientific Publishers Limited,1997に概説されている。
上に述べた通り、癌を有する患者におけるPIK3CA遺伝子中のある特定の相違または複数の相違の存在または非存在を決定することは、様々な様式で実施することができる。こうした試験は、一般に、生体試料、例えば、組織生検、尿、便、喀痰、血液、細胞、組織擦過物、胸部吸引物、または他の細胞性材料から収集されたDNAまたはRNAを使用して実施され、また、限定はされないが、PCR、アレル特異的プローブを用いるハイブリダイゼーション、酵素による変異検出、ミスマッチの化学的切断、質量分析、または(ミニシーケンシングを含めた)DNAシーケンシングを含めた様々な方法によって実施することができる。
適切な変異検出技術としては、増幅不応性変異システム(amplification refractory mutation system)(ARMS(商標))、増幅不応性変異システム線形伸長(linear extension)(ALEX(商標))、競合的オリゴヌクレオチドプライミングシステム(COPS)、Taqman、分子標識(Molecular Beacon)、制限断片長多型(RFLP)、および制限部位に基づくPCR、および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)技術が挙げられる。
当業者は、上に記載した技術と同様の技術を、AKTおよび/またはMAP3K1/MAP2K4遺伝子の変異を検出するために使用できることを知っているであろう。特定の態様では、バイオマーカー遺伝子内のヌクレオチドを決定するために用いられる方法は、アレル特異的増幅(アレル特異的PCR)−例えば増幅不応性変異システム(ARMS)、シーケンシング、アレル識別分析、ハイブリダイゼーション、制限断片長多型(RFLP)、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)から選択される。
特定の態様では、アレル特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションは、以下によって実施することができる:(1)例えば多くのDNAチップ適用と同様に、溶液中の標識された試料を伴う、固相(例えば、ガラス、ケイ素、ナイロン膜)に結合させたアレル特異的オリゴヌクレオチド;または(2)結合された試料(しばしば、クローン化したDNAまたはPCR増幅したDNA)、および溶液中の標識されたオリゴヌクレオチド(ハイブリダイゼーションによるシーケンシングを可能にするための、特異的または短いアレル)。診断試験は、2以上の相違の同時決定を可能にする、しばしば固形状支持体上の、一団の相違を含むことができる。こうしたハイブリダイゼーションプローブは、当技術分野で周知であり(例えば、Green&Sambrook,Eds.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2012,4th edition,Vol.1−3,ISBN 9781936113422),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと)、2以上の相違部位にまたがることができる。
したがって、一態様では、少なくとも1つの変異の存在または非存在の検出は、推定上の変異部位を含有するPIK3CAまたはAKT核酸および/またはMAP3K1およびMAP2K4核酸を、少なくとも1種の核酸プローブと接触させることを提供する。プローブは、相違部位を含み、かつその相違部位に相補的ヌクレオチド塩基を含有する、核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、優先的にハイブリッド形成する。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知の標識を使用する、検出可能な標識を用いて検出することができる。こうした標識としては、限定はされないが、放射性、蛍光、色素、および酵素標識が挙げられる。
別の態様では、少なくとも1つの変異の存在または非存在の検出は、推定上の変異部位を含有するPIK3CAまたはAKT核酸および/またはMAP3K1およびMAP2K4核酸を、少なくとも1種の核酸プローブと接触させることを提供する。プライマーは、相違部位を含み、かつその相違部位に相補的ヌクレオチド塩基を含有する、核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、優先的にハイブリッド形成する。
特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央に(その結果、増幅は、ディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する;例えば、Gibbs,et al.,1989. Nucl. Acids Res.,17,2437−248を参照のこと)、または、一方のプライマーの3’最末端に(ここでは、適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防止または低下させ得る(例えば、Prossner,1993,Tibtech,11 238を参照のこと))、対象となる変異に対して相補的なヌクレオチド塩基を保持することができる。
さらに別の態様では、少なくとも1つの変異の存在または非存在の検出は、少なくとも1つの核酸配列を配列決定することと、得られた)配列を公知の野生型核酸配列と比較することを含む。
あるいは、少なくとも1つの変異の存在または非存在は、少なくとも1つの核酸配列の質量分析的決定を含む。
一態様では、少なくとも1つの核酸相違の存在または非存在の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施することを含む。仮定上の相違を含有する標的核酸配列が増幅され、増幅された核酸のヌクレオチド配列が決定される。増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することは、少なくとも1つの核酸セグメントを配列決定することを含む。あるいは、増幅産物を、自動化されたおよび手動のゲル電気泳動などを含めて、そのサイズに従って増幅産物を分離することが可能なあらゆる方法を使用して分析することができる。
ゲノム核酸の変異は、好都合には、増幅された核酸断片の移動度シフトに基づく技術によって検出される。例えば、Chen et al.,Anal Biochem 1996,239,61−9は、競合的移動度シフトアッセイによる一塩基変異の検出を記載している。さらに、Marcelino et al.,BioTechniques 1999,26,1134−1148の技術に基づく分析が、商業的に利用可能である。
ある特定の実施例では、ミスマッチの存在の結果としての、毛細管系における二重鎖核酸の移動度シフトに基づいて変異の存在を検出するために、キャピラリー・ヘテロ二重鎖分析を使用することができる。
試料からの、分析のための核酸の産生は、一般に、核酸増幅を必要とする。多くの増幅方法が、酵素による連鎖反応(ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または自家持続配列複製など)に、または、クローン化されているベクターのすべてまたは一部の複製に頼っている。好ましくは、本発明に従う増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって示される通り、指数関数的な増幅である。
多くの標的およびシグナル増幅方法が、文献に、例えば、これらの方法の一般的概説が、Landegren,U.,et al.,Science,1988 242,229−237 and Lewis,R.,Genetic Engineering News 1990,10,54−55に記載されてきた。これらの増幅方法は、本発明の方法において使用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、in situ PCR、リガーゼ増幅反応(LAR)、リガーゼハイブリダイゼーション、Qβバクテリオファージレプリカーゼ、転写に基づく増幅システム(TAS)、転写産物シーケンシングを用いるゲノム増幅(GAWTS)、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、およびin situハイブリダイゼーションが含まれる。様々な増幅技術における使用に適したプライマーは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特に、米国特許第4,683,195号明細書および米国特許第4,683,202号明細書に記載されている核酸増幅方法である。PCRは、DNAポリメラーゼによってもたらされるプライマー伸長反応のサイクルの繰り返しからなる。標的DNAを、熱変性させ、増幅されるべきDNAの逆鎖上の、標的配列を挟む2つのオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる。これらのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼを伴う使用のためのプライマーとなる。DNAは、プライマー伸長によってコピーされて、両方の鎖の第2のコピーが作製される。加熱する変性、プライマーハイブリダイゼーション、および伸長のサイクルを繰り返すことによって、標的DNAを、約2から4時間で百万倍以上に増幅することができる。PCRは、増幅の結果を決定するための検出技術と共に使用されるべきである分子生物学ツールである。PCRの利点は、PCRが、標的DNAの量をおよそ4時間で百万から十億倍増幅することによって感受性を高めることである。PCRは、診断的状況において、あらゆる公知の核酸を増幅するために使用することができる(Mok et al.,Gynaecologic Oncology,1994,52:247−252,)。
増幅不応性変異システム(ARMS(商標))(Newton et al.,Nucleic Acids Res.,1989,17,2503−2516)などのアレル特異的増幅技術はまた、一塩基変異を検出するために使用することができる。適切なPCR増幅条件下では、プライマーの3’末端に位置する一塩基ミスマッチが、完璧に適合するアレルの優先的増幅のために十分であり(Newton et al.,1989、上記)、近縁の種の識別を可能にする。上に記載したプライマーを使用する増幅システムの基本は、ミスマッチした3’残基を有するオリゴヌクレオチドが、適切な条件下で、PCRにおいてプライマーとして機能しないこととなることである。この増幅システムは、アガロースゲル電気泳動後の反応混合物の目視検査のみによるジェノタイピングを可能にする。
増幅産物の分析は、自動化されたおよび手動のゲル電気泳動、質量分析などを含めて、そのサイズに従って増幅産物を分離することが可能なあらゆる方法を使用して実施することができる。
核酸の単離、増幅、および分析の方法は、当業者にとって慣行的であり、プロトコルの例は、例えば、Green&Sambrook,Eds.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2012,4th edition,Vol.1−3,ISBN 9781936113422)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、N.Y.)で見ることができる。PCR増幅において使用される方法に特に有用なプロトコル源は、M.J.McPherson、S.G.Mailer、R.Beynon、C.HoweによるPCR(Basics:From Background to Bench),Springer Verlag;1st edition (October 15,2000),ISBN:0387916008である。
本明細書はまた、PIK3CA遺伝子もしくはAKT遺伝子、および/またはMAP3K1遺伝子およびMAP2K4遺伝子内の標的核酸を増幅するための縮重プライマーと、増幅プロトコルおよび結果の分析を含む説明書を含む、予測および診断キットを記載する。あるいは、このキットは、増幅および増幅産物の分析を実施するための、緩衝液、酵素、および容器も含むことができる。このキットは、スクリーニングの構成部品、または診断キット(DNAマイクロアレイなどの他のツールを含む)、または他の補助物も含むことができる。好ましくは、キットはまた、正常な組織試料、および/または参照遺伝子における様々な相違を表す一連の試料から単離された核酸などの、1以上の対照鋳型を提供する。
一態様では、キットは、それぞれの対が参照(PIK3CAまたはAKT、および/またはMAP3K1およびMAP2K4)遺伝子の異なる領域(各領域 相違の可能性の部位)を増幅し、それによって、1つの反応またはいくつかの並行する反応における生体試料におけるいくつかの遺伝子相違の発現の分析のためのキットを提供することが可能な、2以上のプライマー対を提供する。
キット中のプライマーは、増幅産物の検出および核酸相違の結果解析を容易にするために、標識、例えば蛍光標識することができる。キットはまた、1回の分析で2以上の相違が検出されるようにすることもできる。したがって、組み合わせキットは、参照遺伝子の別のセグメントを増幅することが可能なプライマーを含むこととなる。これらのプライマーは、相違を区別するように、例えば別の蛍光標識を使用して、別の方式で標識することができる。
開示されるのはまた、限定はされないが、現在市販されているPIK3CA変異検出キットおよびAKT変異検出キットを含めた、PIK3CAまたはAKTおよび/またはMAP3K1およびMAP2K4変異の検出のためのキットの使用である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のPIK3CAは、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定/特定される特定の変異体型のPIK3CAは、R38、R88、N345、C420、E453、P539、E542K、E545K、Q546、M1043、M1043、およびH1047R位置のものである。
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定/特定される特定の変異体型のPIK3CAは、E542、E545、およびH1047位置のものである。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のAKTは、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定/特定される特定の変異体型のAKTは、E17K、L52R、C77F、およびQ79K位置のものである。
一例として乳癌などの腫瘍を使用する、上のすべての態様については、決定/特定される特定の変異体型のAKTは、E17K位置にある。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP3K1は、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP3K1は、未成熟翻訳停止をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP3K1は、機能喪失をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP3K1は、コード配列の非同義変化をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP3K1は、R273fs*27.I761fs*35、S431*、およびS1344*位置のものである。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP2K4は、遺伝子全体にわたるすべての位置にある。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP2K4は、未成熟翻訳停止をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP2K4は、機能喪失をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP2K4は、コード配列の非同義変化をもたらす変異を特徴とする型である。
上のすべての態様については、決定/特定される変異体型のMAP2K4は、位置R273fs*27.I761fs*35、S431*、およびS1344*のものである。
本明細書全体を通して、PI3K経路の上流成分の遺伝的状態について言及する。誤解を避けるために、PI3K経路の上流成分を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、PI3K遺伝子(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、およびPIK3CD遺伝子が含まれる)の状態、AKTのアイソフォーム(AKT1、AKT2、およびAKT3遺伝子が含まれる)の状態、PTEN遺伝子の状態、PDK1遺伝子の状態、SGK遺伝子の状態、INPP4B遺伝子の状態、INPP5D遺伝子の状態、PIK3R1遺伝子の状態、およびPIK3R2遺伝子の状態を包含する、追加の態様が提供される。ある特定の追加の態様は、PIK3CA遺伝子のみの状態が包含される、本明細書に記載される態様のいずれかである。さらなる特定の追加の態様は、AKT遺伝子のみの状態が包含される、本明細書に記載される態様のいずれかである。
同様に、また、誤解を避けるために、MAP3K1遺伝子とMAP2K4遺伝子の両方を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、MAP3K1遺伝子のみの状態を包含する追加の態様、およびMAP2K4遺伝子のみの状態を包含するさらなる態様が提供される。
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でAKT遺伝子について言及する場合、追加の態様は、AKT1およびAKT2から選択される遺伝子である。いっそうさらなる態様では、該遺伝子は、AKT1遺伝子のみである。いっそうさらなる態様では、該遺伝子は、AKT2遺伝子のみである。
さらに、本明細書全体を通して、PI3K経路の上流成分の阻害剤について言及する。誤解を避けるために、PI3K経路の上流成分の阻害剤を包含するいずれかの特定の態様が記載される場合、PI3Kアイソフォームの阻害剤(PI3K−α、PI3K−β、およびPI3K−σ阻害剤など)を包含する追加の態様、ならびにAKTのアイソフォームの阻害剤(AKT1、AKT2、AKT1/2、およびAKT3阻害剤が含まれる)を包含する追加の態様を包含する追加の態様が提供される。
いっそうさらなる態様では、PI3K経路の上流成分の阻害剤について言及される場合、前記阻害剤は、PI3K−α阻害剤およびAKT阻害剤から選択される。
同様に、いずれかの特定の態様が、PI3K−α阻害剤およびAKT阻害剤からの阻害剤の選択を包含する場合、前記阻害剤がPI3K−α阻害剤のみである追加の態様、および前記阻害剤がAKT阻害剤のみである追加の態様が提供される。
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でPI3K−α阻害剤について言及する場合には必ず、前記阻害剤が1−(4−(5−(5−アミノ−6−(5−tert−ブチル−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル)ピラジン−2−イル)−1−エチル−1H−1,2,4−トリアゾール−3−イル)ピペリジン−1−イル)−3−ヒドロキシプロパン−1−オン(化合物A)である追加の態様が提供される。
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でAKT阻害剤について言及する場合、追加の態様は、AKT1およびAKT2から選択されるAKTのアイソフォームの阻害剤である。さらなる態様では、阻害剤は、AKT1/2アイソフォームの二重阻害剤である。いっそうさらなる態様では、阻害剤は、アイソフォームAKT1のみの阻害剤である。さらなる態様では、阻害剤は、アイソフォームAKT2のみの阻害剤である。
さらに、また、誤解を避けるために、本明細書内でAKT阻害剤について言及する場合には必ず、前記阻害剤が4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミド(化合物B)である追加の態様が提供される。
実験プロトコルにおいて使用される略語:
PIP2:PI(4,5)P2、ホスファチジルイノシトール4,5−二リン酸
s.c.:皮下に
ATP:アデノシン三リン酸
DMSO:ジメチルスルホキシド
TRIS:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
CHAPS:3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸
DTT:ジチオスレイトール
FBS:ウシ胎児血清
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
BSA:ウシ血清アルブミン
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
HRP:西洋わさびペルオキシダーゼ
RPMI:ロズウェルパーク記念研究所1640培地
4NQO:4−ニトロキノリンN−オキシド
EMEM:イーグル最小必須培地
CO2:二酸化炭素
PBST:リン酸緩衝生理食塩水/Tween
Ab:抗体
MTS試薬:[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、分子内塩;MTS]および電子結合試薬(フェナジンメトサルフェート)PMS。
PIP2:PI(4,5)P2、ホスファチジルイノシトール4,5−二リン酸
s.c.:皮下に
ATP:アデノシン三リン酸
DMSO:ジメチルスルホキシド
TRIS:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
CHAPS:3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸
DTT:ジチオスレイトール
FBS:ウシ胎児血清
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
BSA:ウシ血清アルブミン
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
HRP:西洋わさびペルオキシダーゼ
RPMI:ロズウェルパーク記念研究所1640培地
4NQO:4−ニトロキノリンN−オキシド
EMEM:イーグル最小必須培地
CO2:二酸化炭素
PBST:リン酸緩衝生理食塩水/Tween
Ab:抗体
MTS試薬:[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、分子内塩;MTS]および電子結合試薬(フェナジンメトサルフェート)PMS。
実施例1:PIK3CA−MAP3K1二重変異体プロファイルについての公知の細胞株変異の分析。
PIK3CA−変異体バックグラウンドにおける、PI3K経路阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性に対する、MAP3K1機能喪失の影響を試験するために、臨床試料において特定される変異、および公的なドメインで利用可能な細胞株に存在する変異の包括的な調査を実施した。これらの細胞株はいずれも、所望のPIK3CA−MAP3K1二重変異体プロファイルと適合する遺伝的プロファイルを有しなかった。PIK3CA変異とMAP3K1変異を含有することが判明した細胞株のみ、結果を潜在的に混乱させて所望されない部位外影響(off−site effect)の可能性を生じるであろう、他の遺伝子内の欠失も含有していた(図1)。
PIK3CA−変異体バックグラウンドにおける、PI3K経路阻害剤に対する腫瘍細胞の感受性に対する、MAP3K1機能喪失の影響を試験するために、臨床試料において特定される変異、および公的なドメインで利用可能な細胞株に存在する変異の包括的な調査を実施した。これらの細胞株はいずれも、所望のPIK3CA−MAP3K1二重変異体プロファイルと適合する遺伝的プロファイルを有しなかった。PIK3CA変異とMAP3K1変異を含有することが判明した細胞株のみ、結果を潜在的に混乱させて所望されない部位外影響(off−site effect)の可能性を生じるであろう、他の遺伝子内の欠失も含有していた(図1)。
実施例2:PIK3CA変異とMAP3K1変異の両方を含有する細胞株の産生、およびPI3K経路の上流成分の阻害剤の活性に対するMAP3K1発現消失の効果の分析。
利用可能な細胞株が存在しなかったので、2つの方法によって:第1に、siRNA導入を介するMAP3K1の発現の一過性ノックダウンによって(図2A);第2に、高精度遺伝子編集技術を使用してMAP3K1遺伝子内の挿入または欠失を永続的に誘発することによって(図2B)、PIK3CA変異およびMAP3K1不活性化を再現する細胞株モデルを産生した。
利用可能な細胞株が存在しなかったので、2つの方法によって:第1に、siRNA導入を介するMAP3K1の発現の一過性ノックダウンによって(図2A);第2に、高精度遺伝子編集技術を使用してMAP3K1遺伝子内の挿入または欠失を永続的に誘発することによって(図2B)、PIK3CA変異およびMAP3K1不活性化を再現する細胞株モデルを産生した。
この手法とは関係なく、PIK3CA変異体細胞株という状況でのMAP3K1不活性化は、pAKT(T308)のレベルの増大をもたらす。
方法1:siRNA導入を介するMAP3K1の発現の一過性ノックダウン
MCF7細胞は、ヒト乳癌由来である。これは、エストロゲン受容体(ER)を発現し、かつHER2、すなわちEGFRファミリーの成長因子受容体の発現を欠くことを特徴とする。これらの理由で、この細胞株は、ER+/HER2−ルミナル乳癌についての許容できるモデルとみなされる。第2の細胞株、T47Dは、同様の特性を有する。さらに、MCF7およびT47D細胞は、PIK3CA遺伝子の「ホットスポット」変異を保持し、PI3Kαアイソフォーム選択的化合物での治療後に、経路阻害と生存率の両方に対する感受性が最も高いもののうちの一つである。MCF7は、変異c.1633G>A(p.E545K)を保持し、T47Dは、変異c.3140A>G(p.H1047R)を保持する。
MCF7細胞は、ヒト乳癌由来である。これは、エストロゲン受容体(ER)を発現し、かつHER2、すなわちEGFRファミリーの成長因子受容体の発現を欠くことを特徴とする。これらの理由で、この細胞株は、ER+/HER2−ルミナル乳癌についての許容できるモデルとみなされる。第2の細胞株、T47Dは、同様の特性を有する。さらに、MCF7およびT47D細胞は、PIK3CA遺伝子の「ホットスポット」変異を保持し、PI3Kαアイソフォーム選択的化合物での治療後に、経路阻害と生存率の両方に対する感受性が最も高いもののうちの一つである。MCF7は、変異c.1633G>A(p.E545K)を保持し、T47Dは、変異c.3140A>G(p.H1047R)を保持する。
商業的に利用可能ないくつかの起源のsiRNA二重鎖(Sigma、DharmaconおよびQIAGEN)を、ウエスタンブロッティングによって全長タンパク質の発現をモニタリングすることによって、MAP3K1の効率的なノックダウンについて試験した。最良の働きをするsiRNA二重鎖の選択後、細胞を、事前のsiRNA媒介性MAP3K1ノックダウンを伴うまたは伴わずに、PI3Kα選択的阻害剤化合物Aで処理した。siRNAノックダウン効果の一過性の性質が原因で、細胞生存率分析は実施可能ではなかった。
RNA干渉(RNAi)およびプラスミド導入のためのプロトコル。
細胞を、Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)およびFuGENE HD(Roche)を使用して、一過的に遺伝子導入した。Dharmaconから購入したON−TARGETplus MAP3K1 siRNAおよびスクランブル陰性対照を遺伝子導入して、40nMの最終濃度にした。プラスミドの導入は、15μlのFugene HDと混合した10μg DNAを使用して行い、24および48時間インキュベートした。
細胞を、Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)およびFuGENE HD(Roche)を使用して、一過的に遺伝子導入した。Dharmaconから購入したON−TARGETplus MAP3K1 siRNAおよびスクランブル陰性対照を遺伝子導入して、40nMの最終濃度にした。プラスミドの導入は、15μlのFugene HDと混合した10μg DNAを使用して行い、24および48時間インキュベートした。
MCF7、T47D細胞内のリン酸化されたAKT(T308)を測定するためのプロトコル。
低継代MCF7およびT47D細胞を、AZ Cell Bank Collectionから入手し、以前に記載されている通りに培養した(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。野生型およびMCF10A−PI3KαH1047Rは、Horizon Discoveryによって提供された。
低継代MCF7およびT47D細胞を、AZ Cell Bank Collectionから入手し、以前に記載されている通りに培養した(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。野生型およびMCF10A−PI3KαH1047Rは、Horizon Discoveryによって提供された。
培養後、細胞を溶解させ、タンパク質をイムノブロッティング(IB)(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)によって分析した。膜を、MAP3K1に対する抗体(Santa Cruz)、リン酸化AKT(Thr308)(Cell Signaling Technology)、およびビンキュリン(Sigma)を使用してブロットした。結合した抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体および化学発光分析(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)を用いて検出した。
方法2:MAP3K1遺伝子における挿入または欠失の産生
MAP3K1不活性化の効果をさらに試験する、また、ヒト乳房腫瘍に見られる変異を模倣するために、AstraZeneca Swedenの高精度遺伝子編集技術を利用して、その発現を不活性化するために、MAP3K1遺伝子における挿入または欠失を産生した。所望されるコンストラクトを用いるMCF7およびMCF10A−PI3KαH1047Rの導入後、個々の細胞を、細胞選別によって選択し、クローンとして成長させた。MCF7変異体クローンは、MCF7−CR1およびMCF7−CR2であった。MCF10A−PI3KαH1047R細胞において産生された変異体クローンは、MCF10A−H1047R−CR1およびMCF10A−H1047R−CR2であった。
MAP3K1不活性化の効果をさらに試験する、また、ヒト乳房腫瘍に見られる変異を模倣するために、AstraZeneca Swedenの高精度遺伝子編集技術を利用して、その発現を不活性化するために、MAP3K1遺伝子における挿入または欠失を産生した。所望されるコンストラクトを用いるMCF7およびMCF10A−PI3KαH1047Rの導入後、個々の細胞を、細胞選別によって選択し、クローンとして成長させた。MCF7変異体クローンは、MCF7−CR1およびMCF7−CR2であった。MCF10A−PI3KαH1047R細胞において産生された変異体クローンは、MCF10A−H1047R−CR1およびMCF10A−H1047R−CR2であった。
MAP3K1変異体クローンの産生および検証のためのプロトコル。
gRNAは、以前に記載された手順(Doudna et al.,Science 346,(6213):1258096,2014;Ran et al.,Cell 154,1380−9,2013;Tsai et al.,Nature Biotechnology,32,569−576,2014)を使用して設計した。MAP3K1座位を標的にするgRNAを、gRNA−Cas9−GFPをコードするベクターにサブクローニングし、この配列を、その後確認した。細胞を、FuGENE HD(Roche)を使用して一過的に遺伝子導入し、緑色蛍光(GFP)について選別した。モノクローナル培養株を、限界希釈によって選択した。
gRNAは、以前に記載された手順(Doudna et al.,Science 346,(6213):1258096,2014;Ran et al.,Cell 154,1380−9,2013;Tsai et al.,Nature Biotechnology,32,569−576,2014)を使用して設計した。MAP3K1座位を標的にするgRNAを、gRNA−Cas9−GFPをコードするベクターにサブクローニングし、この配列を、その後確認した。細胞を、FuGENE HD(Roche)を使用して一過的に遺伝子導入し、緑色蛍光(GFP)について選別した。モノクローナル培養株を、限界希釈によって選択した。
ゲノムDNAを、QIAGENキットを使用して、増殖クローンから単離した。標的領域を増幅するためのPCR反応を、Fusion Flash DNAポリメラーゼ(Fermentas)を使用して実施した。10μlのPCR産物(product)を、直接的に変性させ(95℃、10分)、ハイブリッド形成させ(−0.1℃/1秒)、CelI酵素(Recombinetic)で処理した。消化された産物を、10%アクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析した。
変異したゲノムDNAのサンガーシーケンシング:CelI分析のために使用された同じPCR産物を、Topoクローン化(Life Technologies)し、試料あたり少なくとも5つの個々のクローンのプラスミドDNAを単離し、M13リバースプライマーを使用して配列決定した。
実施例2A
siRNA導入を介して産生された細胞株を使用する、MAP3K1発現消失の、化合物Aの薬理学的活性に対する効果を、PI3Kαの下流のシグナル伝達出力(readout)の阻害のレベルをモニタリングすることによって調べた。この経路の主な出力は、トレオニン308でのAKTのリン酸化である。このリン酸化は、PDK1(それ自体がPI3Kによって産生されるPIP3(ホスファチジルイノシトール3,4,5−三リン酸)によって活性化される)によって実施される。さらなる経路出力は、Thr246でのPRAS40(プロリンリッチAKT1基質)のリン酸化である。このリン酸化は、mTORC1複合体の活性化およびp70S6Kの活性化を可能にし、リボソームタンパク質S6のリン酸化の増強をもたらす。MCF7およびT47D細胞における化合物AによるPI3Kαの選択的阻害の影響をモニタリングした(これは、経路活性化および生存について、このアイソフォームに依存することが示されている)(Fritsch et al.,MCT,10:1158/1535−7163,2014)。MCF7細胞は、活性化しているホットスポットE545K変異に起因する、PI3K経路の高い基礎レベルの活性を有することが示されている。
siRNA導入を介して産生された細胞株を使用する、MAP3K1発現消失の、化合物Aの薬理学的活性に対する効果を、PI3Kαの下流のシグナル伝達出力(readout)の阻害のレベルをモニタリングすることによって調べた。この経路の主な出力は、トレオニン308でのAKTのリン酸化である。このリン酸化は、PDK1(それ自体がPI3Kによって産生されるPIP3(ホスファチジルイノシトール3,4,5−三リン酸)によって活性化される)によって実施される。さらなる経路出力は、Thr246でのPRAS40(プロリンリッチAKT1基質)のリン酸化である。このリン酸化は、mTORC1複合体の活性化およびp70S6Kの活性化を可能にし、リボソームタンパク質S6のリン酸化の増強をもたらす。MCF7およびT47D細胞における化合物AによるPI3Kαの選択的阻害の影響をモニタリングした(これは、経路活性化および生存について、このアイソフォームに依存することが示されている)(Fritsch et al.,MCT,10:1158/1535−7163,2014)。MCF7細胞は、活性化しているホットスポットE545K変異に起因する、PI3K経路の高い基礎レベルの活性を有することが示されている。
250nM化合物Aでの24時間の治療は、MAP3K1 mRNA上で不活性な対照siRNA二重鎖であらかじめ遺伝子導入された対照細胞におけるThr308上のAKTのリン酸化の著しい低下をもたらした(図2A)。一方、MAP3K1のsiRNAノックダウンは、より高い基礎レベルのpAKT−Thr308シグナル(〜10倍(MCF7)および2.3〜倍(T47D)増大をもたらした(図2A)。
実施例2B
高精度遺伝子編集技術を使用して産生された、選択されたMAP3K1欠損細胞株(MCF7クローンCR1.4およびCR2.5)を使用して、経路活性も評価した。MAP3K1のsiRNAノックダウンを使用する前に観察された通り、この遺伝子の不活性化は、MAP3K1 mRNAおよびタンパク質の発現消失をもたらした。先に見られた通り、MAP3K1の喪失は、Thr308上のpAKTの基礎レベルの増大をもたらした。さらに、化合物Aを使用するPI3Kシグナル伝達の阻害は、ウエスタンブロッティングによって評価されるThr308上のpAKTに対するその影響に基づくと、それほど顕著ではない(図2B)。
高精度遺伝子編集技術を使用して産生された、選択されたMAP3K1欠損細胞株(MCF7クローンCR1.4およびCR2.5)を使用して、経路活性も評価した。MAP3K1のsiRNAノックダウンを使用する前に観察された通り、この遺伝子の不活性化は、MAP3K1 mRNAおよびタンパク質の発現消失をもたらした。先に見られた通り、MAP3K1の喪失は、Thr308上のpAKTの基礎レベルの増大をもたらした。さらに、化合物Aを使用するPI3Kシグナル伝達の阻害は、ウエスタンブロッティングによって評価されるThr308上のpAKTに対するその影響に基づくと、それほど顕著ではない(図2B)。
実施例3:親細胞株に対するMAP3K1欠損細胞株の、成長速度ならびに化合物Aおよび化合物Bに対する感受性を決定するための増殖分析。
実施例2に記載したプロトコルおよび方法に従って、本発明者らは、PIK3CA変異体細胞株を使用して、化合物Aに対する感受性に対するMAP3K1欠失の影響を、化合物BおよびGenentech AKT阻害剤GDC−0068と比較した。
実施例2に記載したプロトコルおよび方法に従って、本発明者らは、PIK3CA変異体細胞株を使用して、化合物Aに対する感受性に対するMAP3K1欠失の影響を、化合物BおよびGenentech AKT阻害剤GDC−0068と比較した。
対照MCF7(親)およびMAP3K1欠損(CR2.5)細胞株を、完全増殖培地で培養し、以前に記載されている通りに、化合物A、化合物B、およびGDC−0068で処理した。一晩のインキュベーション後、細胞溶解物を調製し、PI3K経路におけるリン酸化されたタンパク質に対して特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングによって分析した(図3)。
MAP3K1およびpJNK対照ブロットは、それぞれ、タンパク質発現が遺伝子編集を介して効率的に阻害されること、また、経路の機能的不活性化に反映されることを示す。pPRAS40抗体は、AKT活性の出力として使用した。これは、MCF7 CR2.5細胞株が、より高いpPRAS40の基礎レベルを有し、さらに、これが化合物A、化合物B、およびGDC−0058阻害に対して抵抗性であることを示す。pS6 RP抗体は、PI3Kα活性の遠位出力として使用した。これは、化合物A、化合物B、およびGDC−0068が、親MCF7細胞におけるpS6 RP活性を効率的に阻害することができるのに対して、MAP3K1欠損細胞(CR2.5)は、すべての処理に対して抵抗性であることを示す(図3)。
このデータは、MAP3K1およびPIK3CAの同時変異が、PI3Kα経路阻害剤に対する抵抗性を増進すること、また、これは、AZ阻害剤(化合物Aおよび化合物B)に特異的ではなく、Genentech GDC−0068 AKT阻害剤でも観察される一般的な抵抗性現象であることを示唆する。
実施例4:親細胞株に対するMAP3K1欠損細胞株の、成長速度ならびに化合物Aおよび化合物Bに対する感受性を決定するための増殖分析。
MAP3K1の有害な変異を有し、かつMAP3K1タンパク質の発現を有しないことが確認されたクローンを使用して、単層での成長を特徴付け、Incucyte技術を使用して、従来の増殖培地における単層培養での細胞増殖を測定した。
MAP3K1の有害な変異を有し、かつMAP3K1タンパク質の発現を有しないことが確認されたクローンを使用して、単層での成長を特徴付け、Incucyte技術を使用して、従来の増殖培地における単層培養での細胞増殖を測定した。
IncuCyte技術を使用する増殖分析のためのプロトコル
MCF7およびMCF10A細胞を、96ウェルプレートに、それぞれ、10% FBSを含有するRPMI培地または5%のHS(ウマ血清)を含有するDMEM/F12培地中に、2000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。37℃での16時間のインキュベーション後、化合物Aの濃度、化合物B(30μMから117nM)、またはAZD2014(15μMから66nM)を、分析プレートに添加した。次いで、プレートをIncuCyteに入れ、6時間ごとに3日間スキャンされるように設定した。コンフルエントデータの相対的割合を、対照のDMSO処理細胞に対して規準化し、PRISM(Graphpad)を使用して非線形回帰曲線に当てはめた。
MCF7およびMCF10A細胞を、96ウェルプレートに、それぞれ、10% FBSを含有するRPMI培地または5%のHS(ウマ血清)を含有するDMEM/F12培地中に、2000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。37℃での16時間のインキュベーション後、化合物Aの濃度、化合物B(30μMから117nM)、またはAZD2014(15μMから66nM)を、分析プレートに添加した。次いで、プレートをIncuCyteに入れ、6時間ごとに3日間スキャンされるように設定した。コンフルエントデータの相対的割合を、対照のDMSO処理細胞に対して規準化し、PRISM(Graphpad)を使用して非線形回帰曲線に当てはめた。
クローンMCF7−CR1.4、MCF7−CR1.8、およびMCF7−CR2.5は、親MCF7細胞よりも2倍速く増殖した。同様に、クローンH1047R−CR2.3およびH1047R−CR2.7は、親MCF10AH1047R細胞よりも速く増殖した(増殖曲線は示さない)。
上流PI3K経路阻害剤・化合物A(PI3Kα選択的、国際公開第2014/114928号パンフレット参照)、および化合物B(AKT1/2アロステリック阻害剤、国際公開第2009/047563号パンフレット参照)、ならびにmTORC1/2複合体の下流経路阻害剤(AZD2014、国際公開第2008/023161号パンフレット参照)の、H1047R−CR2.3およびMCF7−CR1.4の増殖に対する効果を試験した(図4、5、および6)。500nM化合物Bは、MCF10A−H1047R親細胞とMCF7親細胞との両方の増殖を阻害することが可能であったが、得られるMAP3K1−変異体細胞株の成長に対する効果は有しなかった(図4および図6)。MCF10A−H1047R親細胞と比較して、クローンH1047R−CR2.3の増殖に対する最大効果の半分のために必要とされる化合物Bの濃度(IC50)は、10倍増大していることが推定された(図5)。MCF7細胞では、増殖に関して、同様の観察が行われた。500nM化合物Bは、親のMCF7細胞の成長を低下させることが可能であったが、化合物Bの、MCF7−CR1.4の増殖に対する効果は存在しなかった(図4〜Dおよび図6B)。この場合、増殖に関するIC50は、3倍増大した(図5)。
本発明者らはまた、化合物Aの、両方の組の細胞株の増殖に対する効果を試験した。本発明者らは、化合物Aが、クローンH1047R−CR2.3の増殖に関して、親系統MCF10A−H1047R系統と比較して、より高いIC50を有することを発見した(図4A〜B、および図5)。MCF7−CR1.4では、親のMCF7細胞と比較して、同様の効果が見られた(図4C〜D、および図5)。
一方、親細胞株とMAP3K1変異体細胞株を比較すると、mTORC1/2阻害剤AZD2014のIC50の有意な変化は見られなかった(図5)。AZD2014は、親と変異体バックグラウンドのどちらにおいても、増殖を低下させるのに効率的であった。
まとめると、これらのデータは、PIK3CA変異のバックグラウンドにおけるMAP3K1遺伝子不活性化が、化合物Aおよび化合物B、すなわちPI3K経路の上流成分の2種の阻害剤による癌細胞の増殖の阻害を低下させることを示唆する。一方、下流成分の阻害剤、mTORC1/2による増殖の阻害は、MAP3K1不活性化によって影響を受けない。
実施例5:3D成長培養における、MAP3K1活性化または喪失の、PI3K経路の阻害剤に対する効果の分析
培養で成長させる癌細胞は、3次元形式(3D)で培養された場合に、阻害剤に対して非常に異なる感受性を示すことができることが知られている。上皮細胞は、細胞外マトリクス(ECM)の影響下で、十分に組織化された偏向した腺状構造を形成する。ECMへの接着は、正常な上皮細胞増殖、分化、および生存の制御に必要である。3Dマトリゲルは、上皮細胞に適切なインテグリンの足場を提供することによって、インビボのヒト腫瘍状況をある程度再現する。これは、細胞運命決定および薬物感受性を決定する可能性がある受容体および生存タンパク質上の発現に不可欠である。最後に、3D培養における管腔形成の、また、乳腺発達中の乳管伸長の研究はどちらも、管腔クリアランスにおけるアノイキスの重要な役割を裏付ける(Debnath et a.,Nature Reviews Cancer,5:675−688,2005))。MAP3K1は、JNK経路の活性化を介する(アノイキスを含めた)ストレス応答において活性化されることが報告されているので、3D成長培養は、MAP3K1不活性化または喪失の、細胞成長および生存に対する、より明らかな効果、ならびにPI3K経路の阻害剤に対する感受性に対するその影響を示すはずである。
培養で成長させる癌細胞は、3次元形式(3D)で培養された場合に、阻害剤に対して非常に異なる感受性を示すことができることが知られている。上皮細胞は、細胞外マトリクス(ECM)の影響下で、十分に組織化された偏向した腺状構造を形成する。ECMへの接着は、正常な上皮細胞増殖、分化、および生存の制御に必要である。3Dマトリゲルは、上皮細胞に適切なインテグリンの足場を提供することによって、インビボのヒト腫瘍状況をある程度再現する。これは、細胞運命決定および薬物感受性を決定する可能性がある受容体および生存タンパク質上の発現に不可欠である。最後に、3D培養における管腔形成の、また、乳腺発達中の乳管伸長の研究はどちらも、管腔クリアランスにおけるアノイキスの重要な役割を裏付ける(Debnath et a.,Nature Reviews Cancer,5:675−688,2005))。MAP3K1は、JNK経路の活性化を介する(アノイキスを含めた)ストレス応答において活性化されることが報告されているので、3D成長培養は、MAP3K1不活性化または喪失の、細胞成長および生存に対する、より明らかな効果、ならびにPI3K経路の阻害剤に対する感受性に対するその影響を示すはずである。
3D−マトリゲル培養のためのプロトコル
3D培養については、細胞を、商業的に利用可能な成長因子減少型(growth factor−reduced)マトリゲル(Mgel)(BD Biosciences,San Diego,CA)にプレーティングし、成長させた(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。IF分析のための固定の前に、エンドポイント(第15日)まで3日ごとに、腺房を500nM化合物Bで処理した。3D−マトリゲルMCF10A腺房構造は、第15日に固定し、サイズ測定およびIF顕微鏡分析のために処理した(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。
3D培養については、細胞を、商業的に利用可能な成長因子減少型(growth factor−reduced)マトリゲル(Mgel)(BD Biosciences,San Diego,CA)にプレーティングし、成長させた(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。IF分析のための固定の前に、エンドポイント(第15日)まで3日ごとに、腺房を500nM化合物Bで処理した。3D−マトリゲルMCF10A腺房構造は、第15日に固定し、サイズ測定およびIF顕微鏡分析のために処理した(Avivar−Valderas et al.,MCB,31(17):3616−29,2011)。
アノイキス分析については、細胞を収集した(Avivar−Valderas et al.,MCB、31(17):3616−29,2011)。定量化後、5.105/mlの細胞を、指示された時点で、適切な増殖培地を伴う超低接着プレート(Corning)内に保持した、および/または化合物Bで処理した。
形態形成の15日後、遺伝子編集を介するMAP3K1−阻害(MCF7 CR2.)は、腺房の数を実質的に増加させなかったが、対照(親MCF7)腺房と比較した場合に、腺房体積を有意に増大させた(図7A、左パネル)。これは、細胞増殖の増大または/および細胞死(ECM欠乏細胞におけるアノイキス)の減少によって説明される可能性がある。後者を試験するために、管腔形成(アノイキスが起こる主要区画)を分析するための、カスパーゼ3(アノイキス出力)での染色、および共焦点エクアトリアル切断(confocal equatorial section)を実施した。
さらに、化合物B処理が、対照培養株(MCF7親)における腺房体積を有意に低下させたのに対して、この効果は、MAP3K1欠損腺房において部分的に逆戻りした(図7A、左パネル)。したがって、化合物Bが、MCF10A−H1047R対照腺房において、陽性の切断カスパーゼ3事象の数の有意な増加を誘発したのに対して、この増加は、MAP3K1欠損MCF10A−H1047R腺房では有意ではなかった(図7A、右パネル)。
これらのデータは、MAP3K1喪失が、細胞死を低下させ、PI3K経路の上流阻害剤によって媒介されるアポトーシスの誘導を減弱することを示唆している。
MAP3K1阻害が、化合物B(図3)に対する感受性を低下させることを示唆する以前の2Dインビトロデータを確認するために、本発明者らは、3D−腺房を、PI3Kα経路マーカーpS6 RPで染色した。ECM接着細胞(外縁に位置する)は、親腺房において、pS6 RPに対して陽性であった。予測通り、pS6 RP陽性細胞の数は、MCF7−CR2.5において、より大きかった(図7B、灰色バー)。最後に、化合物B治療が、親腺房における陽性pS6 RP細胞の数を激しく減少させたのに対して、この効果は、MCF7 CR2.5腺房では逆戻りした(図7B、黒色バー)。
実施例6:親の対照細胞株に対するMAP3K1欠損の成長率を比較するための、インビボ異種移植片分析。
本発明者らは、早期発癌事象をモデル化するために、3D MCF7およびMCF10A−H1047R培養株分析を使用した。この手法を使用して、本発明者らは、MAP3K1喪失が、腫瘍成長体積を促進し、化合物B誘導性のアポトーシスを妨げることを観察した。これらは、2Dインビトロ分析よりも、より生理学的な手法に相当するが、本発明者らは、インビボ分析を使用して、これを実証した。図8は、移植後25および45日でのMCF7親−対−MCF7 CR2.5の腫瘍体積の違いを示す。第45日には、違いは、有意ではないのに対して、第25日には、MAP3K1欠損細胞は、親よりも大きい腫瘍を有し、CR2.5クローンが、より効率的に生着し、親の対照細胞よりも早く成長することを示唆している。
本発明者らは、早期発癌事象をモデル化するために、3D MCF7およびMCF10A−H1047R培養株分析を使用した。この手法を使用して、本発明者らは、MAP3K1喪失が、腫瘍成長体積を促進し、化合物B誘導性のアポトーシスを妨げることを観察した。これらは、2Dインビトロ分析よりも、より生理学的な手法に相当するが、本発明者らは、インビボ分析を使用して、これを実証した。図8は、移植後25および45日でのMCF7親−対−MCF7 CR2.5の腫瘍体積の違いを示す。第45日には、違いは、有意ではないのに対して、第25日には、MAP3K1欠損細胞は、親よりも大きい腫瘍を有し、CR2.5クローンが、より効率的に生着し、親の対照細胞よりも早く成長することを示唆している。
方法3:インビボ研究
親MCF7および変異体MAP3K1 MCF7 C2.5細胞を、先に記載した通りに、完全増殖培地中で培養した。80%コンフルエントに到達したら、培養物を以前に記載されている通りに、トリプシン処理し、計数し、移植した(Kevin Hudson et al. MCT,10.1158/1535−7163.MCT−15−0687)。要約すると、5×106細胞を、0.50mg/21dエストロゲンペレット移植で、SCIDマウスの側腹部の皮下に移植した。腫瘍は、目に見えるようになったら、週2回測定し、動物は、体重減少が認められない限り、週2回計量した。腫瘍が約1.6cm3に到達した時、または腫瘍/動物状態を書き取る時、実験を停止させた。
親MCF7および変異体MAP3K1 MCF7 C2.5細胞を、先に記載した通りに、完全増殖培地中で培養した。80%コンフルエントに到達したら、培養物を以前に記載されている通りに、トリプシン処理し、計数し、移植した(Kevin Hudson et al. MCT,10.1158/1535−7163.MCT−15−0687)。要約すると、5×106細胞を、0.50mg/21dエストロゲンペレット移植で、SCIDマウスの側腹部の皮下に移植した。腫瘍は、目に見えるようになったら、週2回測定し、動物は、体重減少が認められない限り、週2回計量した。腫瘍が約1.6cm3に到達した時、または腫瘍/動物状態を書き取る時、実験を停止させた。
本明細書に記載した実施例は、PI3K経路の上流成分の遺伝的状態と、MAP3K1/MAP2K4遺伝子の状態との間の関連を示す。具体的には、MAP3K1またはMAP2K4遺伝子の変異が、PI3K−α阻害剤およびAKT阻害剤などのPI3K経路の上流成分の阻害剤の効果の低下をもたらすことが示される。一方、mTORなどのPI3K経路の下流成分の阻害剤では、影響は見られなかった。したがって、PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療について検討されている患者にとって、患者のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子の遺伝的状態が決定されることが好都合である。野生型MAP3K1およびMAP2K4遺伝子を有する患者が、治療について優先的に選択されるであろう。
Claims (15)
- 癌を患う患者を治療する方法であって、
(a)前記癌を代表する、かつ前記患者からあらかじめ単離した試料において、PI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、野生型か変異体かを決定することと;
(b)前記試料中のMAP3K1遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;
(c)前記試料中のMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;
(d)(i)前記PI3K経路の上流成分の遺伝的状態が、変異体であると決定された場合;
(ii)前記MAP3K1遺伝子が、野生型であると決定された場合;および
(iii)前記MAP2K4遺伝子が、野生型であると決定された場合に、
前記患者に、前記PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することと
を含む方法。 - 前記PI3K経路の上流成分が、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、AKT1、AKT2、AKT3、PTEN、PDK1、SGK、INPP4B、INPP5D、PIK3R1、およびPIK3R2から選択される、請求項1の方法。
- 前記PI3K経路の上流成分が、AKT1、AKT2、および/またはAKT3である、請求項2の方法。
- 前記癌が、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、外陰癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、膀胱癌、脳癌、結腸直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、皮膚癌、膵臓癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、陰茎癌、または他のPI3キナーゼ依存性のである、請求項1〜3のいずれか一項の方法。
- 前記癌が、乳癌である、請求項4の方法。
- 前記阻害剤が、4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミドである、請求項1〜5のいずれか一項の方法。
- 癌を患う患者を治療する方法であって、
(a)前記患者の癌細胞中のAKT遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;
(b)前記患者の癌細胞中のMAP3K1遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;
(c)前記患者の癌細胞中のMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定することと;
(d)前記癌細胞が、
(i)変異したAKT遺伝子;
(ii)野生型MAP3K1遺伝子;および
(iii)野生型MAP2K4遺伝子
を有する場合、前記患者に、有効量のAKT阻害剤を投与することを含む方法。 - 前記阻害剤が、4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミドである、請求項7の方法。
- 前記癌細胞が、PI3K経路の上流成分の変異、野生型MAP3K1遺伝子および野生型MAP2K4遺伝子を有する、前記癌の治療のための、前記PI3K経路の上流成分の阻害剤の使用。
- 前記PI3K経路の上流成分が、AKT1、AKT2、および/またはAKT3である、請求項9の使用。
- 前記阻害剤が、4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシ−プロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル)ピペリジン−4−カルボキサミドである、請求項9〜10のいずれか一項の方法。
- 治療のための、癌を患う患者を除外するための方法であって、
前記PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して潜在的に感受性がある癌を有する候補患者を特定することと;
候補患者からあらかじめ単離した、癌を代表する試料中のMAP3K1およびMAP2K4遺伝子が、野生型か変異体かを決定すること(ここでは、前記患者は、前記癌細胞が、変異体MAP3K1またはMAP2K4遺伝子を有する場合に、前記PI3K経路の上流成分の阻害剤での治療に対して除外される)と
を含む方法。 - 前記PI3K経路の上流成分が、AKT1、AKT2、および/またはAKT3である、請求項12の方法。
- PI3K経路の上流成分の、また、MAP3K1およびMAP2K4の、その癌細胞遺伝子状態が、既に決定されている患者において、癌を治療する方法であって、前記癌細胞が、PI3K経路の上流成分の変異、野生型MAP3K1遺伝子および野生型MAP2K4遺伝子を有する場合に、前記患者に前記PI3K経路の上流成分の有効量の阻害剤を投与することを含む方法。
- 前記PI3K経路の上流成分が、AKT1、AKT2、および/またはAKT3である、請求項14の方法。
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