CN114470152B - 基于srebp-1/pi3k/akt信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂及其应用 - Google Patents

基于srebp-1/pi3k/akt信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于SREBP‑1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂及其应用，所述抑制剂为短肽，所述短肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的抑制剂可以采用现有短肽合成技术生成，成本低，但是效果好，安全性高，选择性高。

Description

基于SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制 剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于抑制 SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂及其应用。
背景技术
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，全球乳腺癌的发病率自20世纪70 年代末开始一直呈上升趋势，美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。在乳腺癌的治疗方面，外科手术仍是治疗乳腺癌的主要手段，化疗、放疗和内分泌治疗作为辅助治疗。随着对乳腺癌的深入研究，治疗手段也越来越多样化，患者的疗效也有所提升。尽管如此，乳腺癌因其高异质性、耐药性、转移等原因，使其治疗受到一定的限制，其治疗任务仍然艰巨。
有研究结果显示，PI3KAkt信号通路在乳腺癌细胞生长、增殖和转移过程中发挥重要的调节作用。例如，在“扶正祛毒方抑制人乳腺癌MCF-7 细胞增殖及对PI3K/Akt信号通路和血管内皮生长因子C、血管内皮细胞生长因子受体3表达的影响(时华等，中国医院用药评价与分析2020年第20卷第12期)探讨了扶正祛毒方对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用及对PI3K/Akt信号通路和血管内皮生长因子C(VEGF-C)、血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)表达的影响。实验结果表明：扶正祛毒方低、中及高剂量组细胞增殖抑制率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示扶正祛毒方对乳腺癌细胞增殖具有较好的抑制效果，且随着剂量的增加抑制效果越明显。扶正祛毒方低、中及高剂量组细胞 VEGF-C、VEGFRC mRNA水平明显低于对照组，差异均有统计学意义 (P<0.05)，提示扶正祛毒方能够下调VEGF-C、VEGFR-3基因水平，且随着剂量的增加下调幅度越大。扶正祛毒方低、中及高剂量组细胞PI3K、 Akt蛋白表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖性，剂量越大降低幅度越明显。结论:扶正祛毒方能够抑制乳腺癌 MCF-7细胞增殖，其机制可能与阻断PI3KAkt信号通路，下调VEGF-C、 VEGFR-3基因表达有关。
王文权等(二苯乙烯苷抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖及对PI3K/Akt 信号通路的影响."肿瘤29.1(2009):5)研究了二苯乙烯苷 (2,3,5,4'tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,THSG)对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用及对PI3K/Akt信号通路的影响，研究结果表明THSG可抑制MCF-7细胞增殖，该作用可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路实现的。
初钊辉等(鱼藤素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响."中西医结合学报09.005(2011):533-538)研究了鱼藤素对 MCF-7细胞株细胞增殖和凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinaseB,PI3K/Akt)信号通路的影响，研究结果表明鱼藤素可能通过抑制PTEN(Ser380)和PDK1(Ser241)蛋白的磷酸化，进而抑制Akt(Thr308)的磷酸化，间接抑制其下游GSK-3β(Ser9)的磷酸化，最终诱导MCF-7细胞凋亡和抑制其增殖。
虽然有大量的中药和化学药物被应用于治疗乳腺癌，但考虑到生物医药成为未来的发展方向，基于短肽类药物对乳腺癌增殖迁移近年来成为研发热点之一。
中国授权专利CN107973839B公开了一种抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽，该活性肽包括如下序列：Asn-Val-Phe-Thr-Val-Ser-Pro，可应用特异性抑制成纤维细胞生长因子刺激的细胞增殖、迁移和侵袭，以及血管生成，增强化药疗效，从而可用于治疗成纤维细胞生长因子及其受体介导的信号通路异常活化的多种恶性肿瘤，包括但不限于胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌、食管癌或结直肠癌等。本发明还公开了包含该肽的抗肿瘤药物和制备方法等。
鉴于上述情况，本申请的发明人试图另辟蹊径，进一步的通过高通量的短肽库的筛选，以期获得更多对乳腺癌具有治疗活性的短肽化合物。
发明内容
为了抑制SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂，本发明提供一种短肽化合物及其应用。具体而言，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及抑制SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂，所述抑制剂为短肽，所述短肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或者是与SEQ IDNO.1的序列相比缺少、替换其中任意一个氨基酸或者是增加一个氨基酸的氨基酸序列。
本发明另一方面还涉及一种药物组合物，其含有上述短肽作为活性成分，优选地，上述短肽作为唯一活性成分。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物包括药物学上可接受的载体。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物为注射制剂，如液体注射剂或冻干粉针剂。
在本发明的另一方面，还涉及上述抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物能够抑制 SREBP-1/PI3K/AKT信号通路。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物能够调控乳腺癌增殖迁移。
有益效果
经多轮筛选和鉴定，本发明获得了一种抑制SREBP-1/PI3K/AKT 信号通路调控乳腺癌增殖迁移的短肽抑制剂对于乳腺癌细胞具有选择性抑制作用，其可以用于治疗乳腺癌，抑制乳腺癌增殖迁移。本发明的抑制剂可以采用现有短肽合成技术生成，成本低，但是效果好，安全性高，选择性高。
附图说明
图1为目标短肽作用于MCF-7细胞后SREBP-1/PI3K/AKT的相对表达水平。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
本发明首先基于已有的6肽库，通过Cell Counting Kit-8法初步筛选短肽对乳腺癌细胞的增殖是否具有抑制作用，从而初步确定短肽序列为 Val-Trp-Arg-Arg-His-Phe。将该短肽序列交由上海生工通过固相合成，将所合成的短肽进行如下实验，以确定其能够通过抑制 SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移。
本研究数据采用SPSS 22.0统计学软件进行处理分析，计数资料用均数±标准差(％表示，两组间比较采用/检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD4检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
1.1细胞培养
使用完全培养基(含有10％FBS的RPMI-1640培养基)在37℃、 5％CO2、完全饱和湿度培养箱中培养人乳腺癌细胞株MCF-7和宫颈癌细胞株Hela；待细胞贴壁后更换培养液,细胞覆盖培养皿皿底80％左右时采用胰蛋白酶消化传代,时间约1～2分钟，比例为1：2；细胞传代至对数生长周期后用于后续实验。
1.2MMT法检测目标短肽对细胞生长抑制的影响
收集对数生长周期的细胞，以3×104个/孔的密度将其接种于96孔培养板中，每孔100μl，5％CO2、37℃完全饱和湿度环境下孵育24h。细胞贴壁后加入浓度梯度(5、10及20μg/L)目标短肽，培养24h后每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h后终止培养，加入DMSO溶液150μl，低速震荡10min，待紫色结晶充分溶解后使用酶标仪检测各孔490nm处的吸光度(OD)，每组设6个复孔，重复3次取平均值，计算增殖抑制率，实验结果如表1所示。
表1目标短肽对癌细胞增殖抑制率的影响(x±s)
Figure BDA0003513199050000051
上述实验结果表明，目标短肽低剂、中及高剂量组对MCF-7细胞增殖抑制率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05％)，但目标短肽低剂、中及高剂量组对宫颈癌细胞株Hela增殖抑制率明显低于MCF-7的实验组，提示目标短肽对乳腺癌细胞增殖具有较好的选择性的抑制效果，且随着剂量的增加选择性抑制效果越明显。
1.3蛋白质印迹法检测SREBP-1、PI3K、AKT蛋白表达水平
取MCF-7细胞，添加RIPA裂解液[50mM Tris(pH 7.4)，150mM氯化钠，1％Triton X-100，1％去氧胆酸钠，0.1％SDS，0.1g/L PMSF]提取总蛋白，利用Braford法测定蛋白浓度。取40μg蛋白上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白。电泳结束后将蛋白通过湿法转移至PVDF上，随后将 PVDF膜用5％脱脂奶粉在室温下封闭2h。T-PBS漂洗3次，添加第一抗体在4℃中封闭过夜。本实施例使用的第一抗体包括SREBP1抗体(1： 1000)、Akt抗体(1：1000)、P-Akt抗体(1：800)。T-PBS漂洗3次，添加辣根过氧化物酶标记的第二抗体(1：5000)于37℃孵育2h，ECL试剂盒显影，利用Image J软件检测灰度值，计算相对表达量，实验结果如图1所示。
图1所示的实验结果表明，目标短肽低、中及高剂量组对人乳腺癌 MCF-7细胞SREBP-1、PI3K、Akt蛋白相对表达水平明显低于对照组，且呈剂量依赖性，剂量越大下降幅度越明显。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 黑龙江中医药大学
<120> 基于SREBP-1/PI3K/AKT 信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂及其应用
<130> CP2022027
<141> 2022-02-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Val Trp Arg Arg His Phe
1 5

Claims (8)

1.基于SREBP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌增殖迁移的抑制剂，所述抑制剂为短肽，所述短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的抑制剂作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，所述抑制剂为唯一活性成分。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，所述药物组合物还包括药物学上可接受的载体。
5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，所述药物组合物为注射制剂。
6.权利要求1所述的抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述药物能够抑制SREBP-1/PI3K/AKT信号通路。
8.根据权利要求6所述的应用，所述药物用于调控乳腺癌增殖迁移。
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