CN107412231A - 苦木西碱q在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小分子天然化合物苦木西碱Q（Picrasidine Q，分子式：C15H10N2O3，分子量：266.3）的新应用。本发明首先验证了苦木西碱Q能够抑制成纤维细胞生长因子受体2激酶活性，另外，本发明还验证了苦木西碱Q对肿瘤细胞的抑制作用，尤其是对食管鳞癌细胞的抑制作用。研究结果表明：苦木西碱Q能够抑制食管鳞癌细胞KYSE30、KYSE70、KYSE410、KYSE510的增殖，克隆的形成，以及诱导细胞凋亡，造成细胞周期G1期阻滞。从而显示了苦木西碱Q对食管鳞癌细胞有显著的抑制效果。因此，苦木西碱Q能够作为成纤维细胞生长因子受体2激酶抑制剂起到对肿瘤的预防及治疗作用。

Description

苦木西碱Q在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及苦木西碱Q在抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
背景技术
在全球范围内，食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第八位，死亡为第6位，每年新增病例约为456000例。食管癌具有一定的种族及地域性特点，东亚、东非及南非、欧洲南部发病率较高，其中近70%的食管癌发生在中国。从近期发布的中国癌症统计情况可知，在我国男性常见的肿瘤中食管癌排第3位，而在女性中食管癌患病排第5位。
目前治疗食管癌的方法主要包括内窥镜治疗、手术、化疗以及放疗。内窥镜治疗主要用于早期食管癌的治疗，由于其异时性及可能产生的头颈部转移，内窥镜治疗后常需要后续的检查及辅助治疗。我国食管癌的手术治疗效果较好，手术切除率为56.3%～80%，5年生存率30%左右。对手术后复发、有远处转移病人，常进行化疗、放疗、免疫治疗等。对于颈段食管癌的治疗则以放疗为主，手术仅限于放疗失败者。化疗不仅能够为手术及放疗提供辅助治疗，还常用于不可切除的晚期局部肿瘤或转移性的食管癌的治疗，在食管癌的治疗上起着十分重要的作用。
成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）是一种跨膜的酪氨酸激酶受体。成纤维细胞生长因子受体2与细胞增殖、肿瘤发生、转移及血管生成密切相关，目前已经发现许多疾病都与成纤维细胞生长因子受体2突变或不同亚型的表达有关。成纤维细胞生长因子受体2的突变发生在多种癌症中，成纤维细胞生长因子受体2既扮演着致癌的角色，同时又具有抑癌的作用。它与癌症的发生有着密切的关系。因此开发抑制成纤维细胞生长因子受体2激酶的天然化合物，既能够抑制其激酶活性抑制肿瘤的发生，又能够避免合成化疗药易于产生耐药性。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种苦木西碱Q在抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
苦木西碱Q（Picrasidine Q）是一种小分子天然化合物，分子式：C15H10N2O3，分子量：266.3，CAS号：101219-61-8，其可以从植物明日叶（Angelica Keiskei）中分离纯化得到，也可以直接购买普通市售产品。
本发明提供了一种天然化合物苦木西碱Q在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用，即苦木西碱Q在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
具体的，本发明发现了苦木西碱Q在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用，即其对食管鳞癌细胞具有抑制作用。
进一步的，苦木西碱Q在浓度为20－60 μM时能够抑制食管鳞癌细胞（如KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510等）的增殖、克隆形成的数量及大小。同时，苦木西碱Q还可以诱导食管鳞癌细胞凋亡及抑制细胞周期，能够诱导食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE410产生细胞周期G1期阻滞。
本发明发现：苦木西碱Q在制备成纤维细胞生长因子受体2激酶抑制剂中的应用，也就是发现了苦木西碱Q对成纤维细胞生长因子受体2激酶的抑制作用，苦木西碱Q对其产生抑制作用的适宜浓度为：12.5－50 μM。
本发明经研究发现：苦木西碱Q可以作为成纤维细胞生长因子受体2激酶的抑制剂，并可应用于其他类型肿瘤的预防及治疗。成纤维细胞生长因子受体2与细胞增殖、肿瘤发生、转移及血管生成密切相关，抑制成纤维细胞生长因子受体2激酶的活性能够起到预防及治疗肿瘤的作用。本发明的苦木西碱Q能够抑制成纤维细胞生长因子受体2激酶活性，并能够抑制食管癌增殖、诱导食管癌细胞凋亡及细胞周期阻滞。因此苦木西碱Q应用于其他种类的肿瘤（如：肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等）可能也会有抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞情况。此外，本发明的苦木西碱Q还可与其他化疗药或激酶抑制剂一起使用，用于肿瘤的预防及治疗。
附图说明
图1为苦木西碱Q对成纤维细胞生长因子受体2激酶的抑制作用，其中，苦木西碱Q对成纤维细胞生长因子受体2激酶产生抑制作用的浓度范围为:12.5 μM-50 μM；
图2为苦木西碱Q在对食管鳞癌细胞抑制作用，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510的增殖；图中为以对照组为100%时加药不同浓度在不同时间点的细胞活性；
图3为苦木西碱Q在对食管鳞癌细胞抑制作用，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510的增殖；图中为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线；
图4为苦木西碱Q抑制食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低；图中为对加药以及对照组克隆数量的统计结果；*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001；
图5为苦木西碱Q抑制食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510克隆形成。其中，随着加药浓度的增加，克隆数显著降低，并且克隆明显变小；图中为相应组的克隆显微照片；
图6为苦木西碱Q诱导食管鳞癌细胞凋亡，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510产生凋亡。图中为对流式测定的对不同浓度苦木西碱Q诱导的早期凋亡和晚期凋亡总和统计的结果；*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001；
图7为苦木西碱Q诱导食管鳞癌细胞凋亡，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510产生凋亡。图中为相应细胞加药不同浓度时的流式分析结果图；
图8为苦木西碱Q诱导食管鳞癌细胞周期阻滞，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE70、KYSE410产生G1期阻滞。图中为对流式测定的对不同浓度苦木西碱Q诱导的G1期细胞的阻滞，从而表现出G1期细胞增多；*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001；
图9为苦木西碱Q诱导食管鳞癌细胞周期阻滞，其中，苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE410产生G1期阻滞。图中为相应细胞加药不同浓度时的流式分析结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
应用试验
材料与方法
1.材料
1.1试剂
苦木西碱Q购自武汉天植生物技术有限公司，纯度为98%。AnnexinⅤ购自Biolegend公司，PI购自索莱宝公司。成纤维细胞生长因子受体2激酶试剂盒购自日本cyclex公司。星孢霉素Staurosporine购自selleckchem公司。
1.2仪器与器材：
海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Thermo 超净工作台；酶标仪Multiskan GO microplateSpectrophotometer；流式细胞分析仪（BD公司）。
2方法
2.1 成纤维细胞生长因子受体2激酶实验
根据cyclex公司激酶试剂盒提供的实验方案，测定不同浓度苦木西碱Q及阳性对照药成纤维细胞生长因子受体2 激酶抑制剂星孢霉素Staurosporine对成纤维细胞生长因子受体2激酶的抑制作用。
2.2 细胞增殖实验
食管鳞癌细胞KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510种于96孔板，每孔1000-2000细胞，24小时后分别加入不同浓度的苦木西碱Q，分别在0小时、24小时、48小时、72小时加入20 µl噻唑蓝（MTT）随即放入37℃培养箱中孵育1个小时，取出后将96孔板内的液体弃掉，加入100µl二甲基亚砜（DMSO），利用酶标仪在波长为570 nm和620 nm下检测细胞增殖情况。
2.3琼脂糖克隆形成实验
下层胶为0.6%琼脂粉（Agar）加入相应浓度的苦木西碱Q，上层胶为0.3% 琼脂粉加入相应浓度的苦木西碱Q 以及KYSE30、KYSE70、KYSE410和KYSE510细胞。每周对克隆进行显微照相，统计克隆数量。
2.4细胞凋亡测定
KYSE30、KYSE70、KYSE410和KYSE510细胞分别种于6 cm细胞培养皿中，24小时后加入不同浓度苦木西碱Q，72小时后收样，用AnnexinⅤ及PI共染细胞，用流式细胞仪进行凋亡的测定。
2.5细胞周期测定
KYSE30、KYSE70、KYSE410和KYSE510细胞分别种于6 cm细胞培养皿中，24小时后KYSE30加入不同浓度苦木西碱Q，KYSE70、KYSE410、KYSE510饥饿24小时后加入不同浓度苦木西碱Q，加药48小时后收样，样品由70%乙醇固定过夜，用流式细胞仪对细胞周期阻滞情况进行检测。
实验结果。
1）苦木西碱Q对成纤维细胞生长因子受体2激酶活性具有抑制作用（见图1），其中，苦木西碱Q对成纤维细胞生长因子受体2激酶产生抑制作用的浓度范围为:12.5 μM-50 μM。
2）苦木西碱Q对食管鳞癌细胞具有抑制作用（见图2至5）。其中，图2和3的结果表明：苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE30、KYSE70、KYSE410和KYSE510的增殖。图2为以对照组为100%时加药不同浓度在不同时间点的细胞活性，图3为加药不同浓度在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线。图4和5为苦木西碱Q抑制食管鳞癌细胞KYSE30、KYSE70、KYSE410、KYSE510克隆形成。其中，随着加药浓度增加克隆数显著降低，克隆明显变小。图4为对加药以及对照组克隆数量的统计结果；图5为相应组的克隆显微照片。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
3）苦木西碱Q能够诱导食管鳞癌细胞凋亡（见图6和7）。图6和7的结果表明：苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE30、KYSE70、KYSE410、KYSE510产生凋亡。随着药物浓度的增加，凋亡逐渐增多。图6为对流式测定的对不同浓度苦木西碱Q诱导的早期凋亡和晚期凋亡总和统计的结果。图7为相应细胞加药不同浓度时的流式分析结果图。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
4）苦木西碱Q能够诱导食管鳞癌细胞周期阻滞（见图8和9）。图8和9的结果表明：苦木西碱Q在浓度范围为:20 μM-60 μM时能够诱导食管鳞癌细胞KYSE70，KYSE410产生G1期阻滞。随着药物浓度的增加，G1期细胞数逐渐增多。图8为对流式测定的对不同浓度苦木西碱Q诱导的G1期细胞的阻滞从而表现出G1期细胞增多，图9为相应细胞加药不同浓度时的流式分析结果图。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。
综上可以看出：本发明经研究发现苦木西碱Q能够抑制成纤维细胞生长因子受体2激酶活性，是一种成纤维细胞生长因子受体2激酶抑制剂，并能够抑制食管鳞癌KYSE30，KYSE70，KYSE410，KYSE510细胞的增殖，克隆的形成，以及诱导细胞凋亡，造成细胞周期G1期阻滞。

Claims (5)

1.苦木西碱Q在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，苦木西碱Q在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，苦木西碱Q在浓度为20－60 μM时能够抑制食管鳞癌细胞克隆形成的数量及大小。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，苦木西碱Q在诱导食管鳞癌细胞凋亡及抑制细胞周期中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，苦木西碱Q在制备成纤维细胞生长因子受体2激酶抑制剂中的应用。
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