JP7324933B2 - Ｊｗａ遺伝子活性化およびｈｅｒ２分解に基づく抗腫瘍化合物、その製造方法およびその使用 - Google Patents

Ｊｗａ遺伝子活性化およびｈｅｒ２分解に基づく抗腫瘍化合物、その製造方法およびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、抗腫瘍薬の分野に属し、ＪＷＡ遺伝子活性化およびＨＥＲ２分解に基づいて抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍化合物に関すると共に、該抗腫瘍化合物の製造方法および使用に関する。
悪性腫瘍（癌）は中国人の健康を深刻に脅かす重大な公衆衛生上の問題である。中国国家癌センターが２０１９年に発表した統計データによると、悪性腫瘍による死亡は住民の全死因の２３．９１％を占め、かつここ十数年の悪性腫瘍の発病・死亡はいずれも持続的な上昇傾向を示しており、悪性腫瘍による医療費は毎年２２００億元（ＲＭＢ）を超え、予防・制御の情勢は厳しい。過去のデータと比べると、癌による負担は持続的な上昇傾向にある。最近１０数年来、悪性腫瘍の発病率は毎年約３．９％の増加率を維持し、死亡率は毎年２．５％の増加率を維持している。肺癌、肝臓癌、上消化器系腫瘍および結腸直腸癌、女性乳癌などは中国の主要な悪性腫瘍である。男性では肺癌が第１位、女性では乳癌が第１位である。年齢分布から見ると、悪性腫瘍の発病は年齢の増加に従って上昇し、４０歳以下の青年群の中で悪性腫瘍の発病率は低いレベルにあり、４０歳以降から急速に上昇し始め、発病人数分布は主に６０歳以上に集中し、８０歳の年齢群にピークに達し、異なる悪性腫瘍の年齢分布には差異がある。過去１０数年の間に、悪性腫瘍の生存率は徐々に上昇する傾向を示し、現在中国では悪性腫瘍の５年の相対生存率は約４０．５％であり、１０年前と比べて約１０％上昇したが、先進国とはまだ大きな差がある。悪性腫瘍の発病には性差が存在し、男性で発病する第１位のものは肺癌で、毎年の新発病例は約５２．０万であり、その他の高発病の悪性腫瘍は順に胃癌、肝臓癌、結腸直腸癌や食道癌などであり、上位１０位の悪性腫瘍の発病は、男性全ての悪性腫瘍の発病の約８２．２０％を占めている。女性で発病する第１位のものは乳癌で、毎年発病は約３０．４万であり、その他の主な高発病の悪性腫瘍は順に肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌や胃癌などであり、女性では最初の１０位の悪性腫瘍の発病は女性のすべての悪性腫瘍の発病の約７９．１０％を占めている。
１９８５年にヒト上皮成長因子受容体２（ＥＲＢＢ２またはＨＥＲ２）を同定して以来、ヒトＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）癌遺伝子の腫瘍学、特に乳癌（ＢＣ）における相関性はずっと注目されてきた。この遺伝子は１８５－ｋＤ膜貫通型ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）をコードし、ＨＥＲ１（またはＥＧＦＲ）、ＨＥＲ３やＨＥＲ４などの受容体ファミリーに属する。これらのチロシンキナーゼドメインの活性化は、通常、特定のリガンドによって誘導されるホモ二量体およびヘテロ二量体によって達成される。いったん活性化すると、ファミリー受容体を介した細胞シグナル伝達が細胞の増殖と生存につながる。ＨＥＲ２の活性化機序は他の分子と異なり、特定の成長因子リガンドを欠いており、リガンド活性化の条件と同様に、固定化されたコンフォメーションによって活性化される。この特性により、ＨＥＲ２はこのファミリーの他のレセプターの第一選択ヘテロ二量体シャペロン分子となる。
ＨＥＲ２陽性乳癌（ＨＥＲ２＋ＢＣ）は全ＢＣｓの１５～２０％を占める。過去２０年間に、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ）、および抗体－薬物結合体（ａｄｃ）の発明および使用は、患者の予後を著しく改善した。しかしながら、標的治療に反応したのは、ＨＥＲ２陽性の患者の約５０％に過ぎず、ＨＥＲ２＋転移性ＢＣ（ｍＢＣ）に対したのはほとんど無効である。大部分の治療失敗の原因は、抗ＨＥＲ２治療の原発性または獲得性薬剤耐性である。近年、ＨＥＲ２と結合する薬物の損傷、ＨＥＲ２と平行あるいは下流のシグナル経路の構成的活性化、代謝リプログラミングや免疫系活性の低下など、様々な薬物耐性機序が発見されている。そのため、ＨＥＲ２陽性の患者にとって、ＨＥＲ２過剰発現タンパク質を分解する治療方法を探すことは現在の急務となっている。
本特許出願の発明者となる周建偉氏は、研究チームを率いて過去２０年以上にわたり、彼自身が発見し命名したＪＷＡ（別名ＡＲＬ６ＩＰ５）遺伝子の構造と機能、特にこの遺伝子と人類の重大な疾患との関係を重点として模索しており、一連の研究成果を遂げている。ＪＷＡ遺伝子は細胞分化の調節に参与する重要な分子であること（Chinese Sci Bull, 2001; Chinese Sci Bull, 2002; Biochem Biophys Res Commu, 2006）、ＪＷＡタンパク質は細胞骨格結合タンパク質であり、細胞骨格の組み立てと細胞遊走を調節する機能があること（Chinese Sci Bull, 2003; Chinese Sci Bull. 2004; Cell Signal. 2007）、ＪＷＡは生体組織の正常な細胞の活発な環境応答遺伝子とＤＮＡ修復タンパク質であること（J Biomed Sci, 2005; Free Radic Biol Med, 2007; Nucleic Acids Res, 2009）、ＪＷＡ遺伝子の発現レベルは胃癌、黒色腫、食道癌、肝臓癌などの多くの癌組織において発現レベルがその癌周辺の正常組織より明らかに低いこと、癌組織でのＪＷＡ発現レベルと患者の生存期間は正の相関があること（Oncogene, 2010; Clin Cancer Res, 2012; J Gastroenterol, 2013; Carcinogenesis, 2013; Carcinogenesis, 2014）、シスプラチン耐性に対する研究において、シスプラチン耐性胃癌細胞のＪＷＡ発現レベルを高めることは、ＣＫ２活性を阻害することによってＤＮＡ修復タンパク質ＸＲＣＣ１のリン酸化レベルと胃癌細胞のシスプラチンに対する耐性を阻害することができ、このような癌細胞のシスプラチンに対する感受性を回復させることができること（Cell Death Dis, 2014）を相次いで発見した。近年、胃癌細胞においてＪＷＡは転写と翻訳後のユビキチン化修飾機序を通じてＨＥＲ２の発現レベルを阻害できることが発見され、この機序はＪＷＡが胃癌細胞の悪性表現型を阻害することと関係がある（Oncotarget, 2016a, 2016b）。以上のように、ＪＷＡ遺伝子は多種の異なる分子機序を介してマルチターゲットに作用して癌阻害遺伝子の作用を発揮することができる。
また、この一連の研究成果に基づいて、本出願の発明者は、特許出願番号ＣＮ９８１１１４２２．９、授権公告番号ＣＮ１０６５８７６Ｃ、発明名称『細胞骨格様遺伝子のコードタンパク質特異性抗体』である発明、特許出願番号ＣＮ２０１３１０１７８０９９．Ｘ、授権公告番号ＣＮ１０３２３９７１０Ｂ、発明名称が『抗腫瘍活性を有するポリペプチドおよびその使用』である発明、特許出願番号ＣＮ２０１６１０１６４４９１．２、授権公告番号ＣＮ１０５８２０２３０Ｂ、発明名称が『抗腫瘍活性ポリペプチドおよびその使用』である発明、特許出願番号ＣＮ２０１６１０８５７４０９．４、授権公告番号ＣＮ１０６６３２２９９Ｂ、発明名称が『抗腫瘍化合物、その製造方法およびその使用』である発明を含む複数発明の特許を出願して授権された。
本発明の主な目的は、従来技術に基づいて、発明者の最新の研究成果に従って、ＪＷＡ遺伝子の発現を活性化させた後にＥ３ユビキチン化酵素をカスケード活性化するなどの機序によりＨＥＲ２を特異的に分解することで、ＨＥＲ２過剰発現悪性腫瘍の阻害または治療作用を実現することができる、ＪＷＡ遺伝子活性化およびＨＥＲ２分解に基づく抗腫瘍化合物を提供することである。また、本発明は、該化合物の製造方法および使用を提供する。
本発明の主な技術的思想は以下の通りである。発明者は、これまでの一連の研究成果によれば、ＪＷＡが顕著な癌阻害遺伝子の生物学的機能を有することを示し、また多くのヒト悪性腫瘍の発生及び発展の実験的関与モデルにおいて検証した。多数の悪性腫瘍組織細胞中のＪＷＡタンパク質の発現レベルは癌周辺の正常組織より有意に低く、ＪＷＡタンパク質はまたＨＥＲ２の過剰発現を阻害する作用がある。このため、本発明者は、ＪＷＡ遺伝子のプロモーター調節領域を含むレポーター遺伝子細胞モデルを設計、構築し、ハイスループットスクリーニングにより、ＪＷＡ遺伝子の発現を活性化される小分子化合物を見出し、仮に所望な小分子化合物が得られた場合、ＨＥＲ２高発現の癌細胞においてその潜在的な抗腫瘍生物学効果が検証される。
発明者の課題研究グループは、これを主な技術的思想とし、中国国家化合物ライブラリー等の機関と協力してハイスループットスクリーニングを実施し、いくつかのスクリーニングされたリード化合物を基礎とし、目標とする化合物分子構造の修飾をさらに行い、一連のジベンゾチアゾールアミン類化合物を合成し、さらに多種の細胞モデルと動物モデルを用いて研究・検証したところ、このシリーズの化合物が細胞とマウスの体内組織器官のＪＷＡ遺伝子発現を効果的に活性化できることを見出した。
本発明に係る抗腫瘍化合物は、以下の通りである。
次の式Ｉ：
Figure 0007324933000001
（式中、Ｒ１は、ＯＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、およびＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれ、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、およびＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれ、
Ｒ３は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ３からなる群から選ばれ、
Ｒ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ３からなる群から選ばれ、
Ｒ５は、Ｈ、ＣＨ３、およびＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれる。）で表される式Ｉの化合物である、ＪＷＡ遺伝子活性化およびＨＥＲ２分解に基づく抗腫瘍化合物。
このような化合物は、ジベンゾチアゾールアミン類化合物である。
好ましくは、Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ３はＦまたはＣＦ３であり、Ｒ４はＨまたはＦであり、Ｒ５はＨである。
好ましくは、前記式Ｉの化合物は、
４－フルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、４，７－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、４，６－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、４－メトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，７－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，６－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、４，７－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、および４，６－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンからなる群から選ばれる１つの化合物であり、
それぞれの構造式は、
Figure 0007324933000002
である。
実験により、上記抗腫瘍化合物は細胞とマウス体内の組織器官のＪＷＡ遺伝子の発現を効果的に活性化できることが検証された。特に、発明者の研究グループは、上記抗腫瘍化合物がＥ３ユビキチン化酵素等をカスケード活性化するなどの機序により腫瘍細胞において過剰発現したＨＥＲ２タンパク質を特異的に分解し、腫瘍細胞の増殖、成長等を阻害する機能を有することを明らかにした。また、ＨＥＲ２を過剰発現したヒト乳癌細胞皮下担癌ヌードマウスモデルにおいて、上記抗腫瘍化合物の代表的な化合物の顕著な腫瘍阻害効果を検証し、特に、この代表的な化合物は、顕著な腫瘍阻害効果を発揮しながら、マウスの心臓、肝臓、腎臓などの主要臓器の機能に対する一定の保護作用を示す（詳細は以下の具体的な実施例を参照）。
また、本発明は以下のステップを含むことを特徴とする本発明の抗腫瘍化合物の製造方法を提供する。

［式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選ばれる１つであり、前記銅塩は、酸化第二銅、酸化第一銅、塩化第二銅、塩化第一銅、臭化第二銅、臭化第一銅、またはヨウ化第一銅であり、前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、または水素化ナトリウムであり、前記溶媒は、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、またはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであり、前記加熱の温度は８０～１２０℃である。（注：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の限定は前記の通りであり、ここでは詳しく説明しない。）］
好ましくは、ＸはＣｌであり、前記銅塩はヨウ化第一銅であり、前記アルカリは炭酸カリウムであり、前記溶媒はジメチルスルホキシドであり、前記加熱の温度は１００℃である。
また、本発明は、前記抗腫瘍化合物の薬用塩を提供する。
好ましくは、前記薬用塩は、式Ｉの化合物と、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸またはリンゴ酸との塩である。
また、本発明は、前記抗腫瘍化合物または前記薬用塩を含有する医薬組成物を提供する。
また、本発明は、前記抗腫瘍化合物、または前記薬用塩、または前記記医薬組成物の、ＪＷＡ遺伝子活性化剤または抗腫瘍薬の製造における使用を提供する。
好ましくは、前記腫瘍は、ＪＷＡ遺伝子の低発現およびＨＥＲ２の過剰発現に関連する腫瘍であり、乳癌、胃癌、肺癌、グリオーマなどを含み、前記抗腫瘍薬は、ＪＷＡタンパク質の発現を活性化させた後、ＨＥＲ２タンパク質を分解することにより抗腫瘍作用を発揮する医薬品である。
さらに、上記の抗腫瘍化合物、薬用塩、医薬組成物の具体的な剤形については、従来技術に基づいて実際の必要に応じて選択することができ、例えば、錠剤、散剤、丸剤、カプセル剤、坐剤、顆粒剤、懸濁剤、内服液、注射剤等の薬学的剤形があり、そのうち、経口錠剤およびカプセルは、充填剤、潤滑剤、分散剤、希釈剤や接着剤などの従来の賦形剤を含有している。
本発明の抗腫瘍化合物およびその薬用塩は、従来技術と比較して、ＪＷＡタンパク質の発現を効果的に活性化することができ、さらに、Ｅ３ユビキチン化酵素をカスケード活性化するなどにより過剰発現したＨＥＲ２タンパク質を特異的に分解することにより、腫瘍細胞の増殖およびインビボ成長を阻害することができる。
本発明の抗腫瘍化合物およびその薬用塩の優れた利点は、癌細胞において過剰発現しているＨＥＲ２タンパク質を分解することであり、これまで国際的に汎用されてきた種々の抗ＨＥＲ２抗体やＨＥＲ２タンパク質キナーゼ活性を阻害する阻害剤とは全く異なっている。分子細胞生物学の理論から、本発明の抗腫瘍化合物およびその薬用塩はＨＥＲ２過剰発現癌に対する現在の抗癌治療手段よりも著しく優れており、その原因としては、本発明の抗腫瘍化合物の作用が最終的にＨＥＲ２タンパク質を分解することであり、これにより、抗ＨＥＲ２抗体または阻害剤を使用する場合、ＨＥＲタンパク質の適応的アロステリックに起因する現在の薬物耐性現象の物質的基礎を根本的に排除することができる。本発明の抗腫瘍化合物およびその薬用塩は、低い用量で同様に顕著な腫瘍治療活性を有し、かつ正常組織細胞に対して毒性がないだけでなく、心臓、肝臓、腎臓などの重要な臓器に対して一定の保護作用があり、応用の将来性が期待できる。
本発明の実施例１１における、ＪＷＡ遺伝子のｃＤＮＡと、タンパク質をコードするアミノ酸と、レポーター遺伝子を構築するためのプロモーターの配列図である。 本発明の実施例１１におけるＪＷＡ遺伝子プロモーターを含むレポーター遺伝子の構造図である。 本発明の実施例１２における、２種類のヒト乳癌細胞のクローン形成に対するＪＡＣ１の影響の結果を示す図である。 本発明の実施例１３における、２種類のヒト乳癌細胞のＨＥＲ２発現および細胞局在に対するＪＡＣ１の影響の結果を示す図である。 本発明の実施例１４における、ＪＡＣ１が２種類のヒト乳癌細胞のＪＷＡ発現を活性化しながら、ＨＥＲ２の発現を阻害した結果を示す図である。 本発明の実施例１５における、ＪＡＣ１がＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３の２種類のヒト乳癌細胞の遊走を阻害した結果を示す図である。 本発明の実施例１６における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞皮下担癌マウスの体重増加の曲線図である。 本発明の実施例１６における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞皮下担癌マウスの体積の曲線図である。 本発明の実施例１６における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞マウスの皮下担癌の重量の結果を示す図である。 本発明の実施例１６における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌細胞マウスの皮下担癌の腫瘤重量／体重比の結果を示す図である。 本発明の実施例１６における、処理群ごとに分離したヒト乳癌ＢＴ４７４皮下担癌瘤組織の結果を示す図である。 本発明の実施例１６における、ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞マウスの皮下担癌に対する各群の腫瘍阻害率の結果を示す図である。 本発明の実施例１６における、ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞マウスの皮下担癌組織の各群における関連分子の発現図である。 本発明の実施例１７における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌細胞皮下担癌マウスの主要臓器のＨＥ染色写真である。 本発明の実施例１８における、ＪＡＣ１処理ヒト乳癌細胞皮下担癌マウスの血液生化学結果を示す図である。 本発明の実施例１９における、ＪＡＣ１がＪＷＡの発現を活性化しながら、ＨＥＲ２の発現を阻害するオフターゲット効果の検証結果を示す図である。
以下、添付図面を参照して、実施例と組み合わせて本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
４－フルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
球形還流冷却管、磁性体（撹拌子）を備えた５０ｍＬ乾燥ナス形フラスコに、２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン（０．９６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ヨウ化第一銅（０．３１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．４７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）を加え、１００℃に加熱し、６時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、水（６０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、３回抽出し、水洗して飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して溶媒を減圧蒸発し、黒色固体を得て、粗生成物をシリカゲル粉末で砂状物に作製し、シリカゲルカラムにより精製し［溶離剤：ＶＰＥ：ＶＥＡ＝５：１］、得られた黒色固形物を酢酸エチルまたはメタノールで数回スラリー化し、白色固形物（０．７ｇ、収率：３９％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，３Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３３２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
４，７－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」の代わりに「２－クロロ－４，７－ジフルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」を用いて灰白色の固体（１．１ｇ、収率５７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７３（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，３Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３５０．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
４，６－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」の代わりに「２－クロロ－４，６－ジフルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」を用いて灰白色の固形物（０．８ｇ、収率：４５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．６５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３５０．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
４－メトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」の代わりに「２－クロロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール」を用いて白色固形物（１．１ｇ、収率：６７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１５－７．０７（ｍ，３Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３８２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，７－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」の代わりに「４，７－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」を用いて白色固形物（１．４ｇ、収率：７３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７４（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２７－７．１５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３６２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，６－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」の代わりに「４，６－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」を用いて白色固形物（１．２ｇ、収率：６４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ）， ６．７９（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３３２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
４，７－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」の代わりに「２－クロロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール」を用い、「４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」の代わりに「４，７－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」を用いて白色固形物（０．９ｇ、収率：５３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４１２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
４，６－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンの製造
実施例１に示す方法を参照し、「２－クロロ－４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール」の代わりに「２－クロロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール」を用い、「４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」の代わりに「４，６－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン」を用いて白色固体（０．８ｇ、収率：４７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８－７．１７（ｍ，１Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４１２．１｛［Ｍ＋Ｈ］＋｝。
なお、実施例１～８は、本発明でハイスループットスクリーニングされた化合物の一部のみを示しており、本発明の全ての化合物を示しているわけではない。
医薬組成物の製造：錠剤
式Ｉの化合物またはその薬用塩（１ｇ）と乳糖（２３ｇ）および微結晶セルロース（５．７ｇ）とをミキサーで混合した。得られた混合物をローラープレス機でプレス成形することにより、シート状プレス材を得た。このシート状プレス材をハンマー粉砕機で粉砕して粉状物に製作し、得られた粉状物材料を２０メッシュの篩にかけた。篩にかけた材料に、軽質シリカ（０．３ｇ）とステアリン酸マグネシウム（０．３ｇ）を加えて混合した。得られた混合物を製錠機で打錠して錠剤を製造した。
一例として、式Ｉの化合物としては、実施例１～８の化合物を用いることができる。
一例として、薬用塩の酸根（酸基）部分としては、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸などを用いることができる。
医薬組成物の製造：ゼラチンカプセル
式Ｉの化合物またはその薬用塩（１ｇ）と、微結晶セルロース（０．３５ｇ）および乳糖（０．１５ｇ）とを水で造粒した後、この顆粒を架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（０．０４ｇ）およびステアリン酸マグネシウム（０．０１ｇ）とを混合した。得られた混合物をゼラチンカプセルに充填してゼラチンカプセルを製造した。（本実施例のゼラチンカプセルは、中国蘇州カプセル有限公司が製造したものであり、該ゼラチンカプセルは薬用規格に適合している。）
一例として、式Ｉの化合物としては、実施例１～実施例８の化合物を用いることができる。
一例として、薬用塩の酸根部分としては、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸などを用いることができる。
ジベンゾチアゾールアミン類化合物の生物学的活性の比較
実施例１～８で合成された化合物をＪＡＣ１、ＪＡＣ１０１１、ＪＡＣ１０１２、ＪＡＣ１０１３、ＪＡＣ１０１４、ＪＡＣ１０１５、ＪＡＣ１０１６、ＪＡＣ１０１７の順に命名した。
ＪＷＡ遺伝子２０００ｂｐプロモーター配列とルシフェラーゼ指示機能を含むレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションしたヒト気管支上皮ＨＢＥ細胞を用いてハイスループットスクリーニングを行い、２回のハイスループットスクリーニングを経て、化合物の濃度範囲は０．００～３．３０μｇ／ｍＬであり、化合物による細胞処理時間は４８時間であり、以上の８つの代表的な化合物のレポーター遺伝子蛍光値を測定し表１に示し、８つの代表的な化合物の日本語と英語の対照関係を表２に示す。
表１の結果から、これらの８つの化合物はすべて細胞のＪＷＡ遺伝子の発現を活性化することができ、かつ良好な用量－効果関係が示され、そのうち、ＪＡＣ１はＪＷＡ遺伝子に対する活性化作用が特に顕著であることがわかった。
ＪＷＡ遺伝子全長ｃＤＮＡ配列、タンパク質をコードするアミノ酸配列、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を構築するためのＪＷＡ遺伝子２０００ｂｐプロモーターＤＮＡ配列を図１に示す。ＪＷＡ遺伝子のプロモーター配列を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子の分子構造を図２に示す。
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞のクローン形成能（悪性増殖能）に対するＪＡＣ１の影響
本実施例は、ＨＥＲ２を過剰発現したヒト乳癌細胞ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３のクローン形成能（悪性増殖能）に対する小分子化合物ＪＡＣ１処理の影響を検出することを目的とする。
２種類のヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３を、それぞれ２０％および１０％のウシ胎児血清、通常の二重抗体を含むＤＭＥＭ培地に、３７℃、５％のＣＯ２で培養した。対数成長期のＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞を採取し、それぞれ８００個／ウェルの密度で６ウェルプレートに均一に接種し、細胞が壁に接着した後、異なる濃度（０、１、１０μＭ）のＪＡＣ１含有培地に交換し、それぞれ細胞を処理した。細胞クローン塊の成長状況により、１０～１５日培養後に細胞培養を中止し、シャーレを除去し、メタノールで固定した後、クリスタルバイオレットで成長した細胞クローン塊を染色し、写真撮影後、ＩｍａｇｅＪソフトでクローン塊（５０個以上の細胞を含む）の数を計数し、統計ソフトＳＰＳＳで計数結果を分析した。
実験の結果、図３に示すように、対照群と比べ、各用量の小分子化合物ＪＡＣ１でＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３を処理すると、細胞クローン形成能が有意に阻害され、かつ用量－効果の関係が示された。
なお、実施例１～８の残りの各化合物について、本実施例の方法で検出した結果、ＪＡＣ１とほぼ一致し、いずれもＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３の細胞クローン形成能が有意に阻害され、かつ用量－効果の関係が示された。
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞ＨＥＲ２分子の細胞内局在化に対するＪＡＣ１の影響
本実施例は、小分子化合物ＪＡＣ１による処理が、ＨＥＲ２の細胞内局在化に影響を与えるか否かを観察することを目的とする。
３５ｍｍのレーザー共焦点専用皿に細胞を接種し、異なる濃度（０、１、１０μＭ）のＪＡＣ１で細胞を２４時間処理した後、メタノールで１５分間固定し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、正常な羊血で１時間ブロックし、その後一次抗体を加えて４℃で一晩インキュベートし、翌日ＰＢＳＴで３回洗浄した後、蛍光二次抗体およびＤＡＰＩを加え、レーザー共焦点下で撮影した。
実験の結果、図４に示すように、ＪＡＣ１濃度の上昇に伴い、ＪＷＡ含有量が上昇し、ＨＥＲ２発現レベルが低下したが、弱まったＨＥＲ２は依然として細胞膜に局在化しており、すなわちＪＡＣ１処理はＨＥＲ２の細胞膜局在特性に影響を与えなかった。
なお、実施例１～８の残りの各化合物について、本実施例の方法で検出した結果、ＪＡＣ１とほぼ一致し、すなわち、化合物濃度の上昇に伴い、ＪＷＡ含有量が上昇し、ＨＥＲ２の発現レベルが低下したが、弱まったＨＥＲ２は依然として細胞膜に局在化しており、すなわち、その処理はＨＥＲ２の細胞膜局在特性に影響を与えなかった。
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞ＪＷＡおよびＨＥＲ２タンパク質の発現レベルに対するＪＡＣ１の影響
本実施例は、細胞モデルを用いて、ＪＡＣ１処理がＪＷＡの上昇およびＨＥＲ２タンパク質の発現レベルの低下に与える効果を検証することを目的とする。
対数成長期の細胞を一般的に消化し、細胞密度４０％～５０％で６ウェルプレートに接種し、各用量のＪＡＣ１で細胞を２４時間処理した後、ＲＩＰＡ（０．５％ＰＭＳＦを含む）細胞溶解液０．１ｍＬを加えてタンパク質を採取し、１２０００×ｇで１５分間遠心分離後に上清を取り、タンパク質濃度を測定し、タンパク質を煮た。濃度１０％のポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質電気泳動を行い、１ウェル当たり４０μｇのタンパク質を添加し、６０Ｖで３０分間、９０Ｖで１．５～２時間の条件で電気泳動を行った。電気泳動終了後、湿式トランスファー（湿式転膜）を行い、ゲル内からＰＶＤＦ膜にタンパク質を転移させた。トランスファー後、５％脱脂乳を用いて常温で１～２時間ブロックし、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）で膜を５分間ずつ３回洗浄し、４℃で対応の一次抗体を一晩インキュベートした。翌日、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で膜を５分間ずつ３回洗浄し、室温で二次抗体を１～２時間インキュベートし、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で膜を５分ずつ８回洗浄した。膜上にＥＣＬ発光液を滴下して露光した。
実験の結果、図５に示すように、ＪＡＣ１濃度の増加に伴い、ＪＷＡタンパク質レベルが上昇し、ＨＥＲ２タンパク質レベルが低下した。
なお、実施例１～８の残りの各化合物について、本実施例の方法で検出した結果、ＪＡＣ１とほぼ一致し、化合物の濃度の上昇に伴い、ＪＷＡタンパク質のレベルが上昇し、ＨＥＲ２タンパク質のレベルが低下した。
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞の遊走能に対するＪＡＣ１の影響
本実施例は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走実験により、乳癌細胞ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞の遊走能に対するＪＡＣ１の影響を検出することを目的とする。
対数成長期のＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞を採取し、細胞密度４０％～５０％で６ウェルプレートに接種し、細胞が壁に粘着した後に医薬品を投与し、ＪＡＣ１濃度をそれぞれ０、１、１０μＭとした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーへのマトリゲル塗布：実験前日、２４ウェルプレート、いくつかのＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを用意した。母液１ｍｇ／ｍＬ、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにＦＮを１０倍希釈した。各チャンバーの底部にＦＮ ５０μＬを塗布し、クリーンベンチに２時間放置して風乾させ、細胞培養器にて一晩放置した。
実験当日、０．２５％の膵酵素で細胞を消化し、無血清培地に懸濁させて細胞数を計数し、細胞密度を３×１０５個／ｍＬに調整し、１００μＬをＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーの上層に植えた。チャンバーの下室（下部コンパートメント）に１０％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有する培地６００μＬを添加した。インキュベーターで１２時間培養した後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーを取り出し、９５％メタノールで２０分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、クリスタルバイオレットで３０分間染色した。さらにＰＢＳで３回洗浄し、上室（上部コンパートメント）の細胞を綿棒で軽く拭き取った。最後にウェルをスライドガラスの上に置き、倒立顕微鏡下で観察して撮影し、各チャンバーの上、下、左、右、中にそれぞれ１つの視野を撮影し、チャンバーを通過する上層の細胞の数を計数して、統計的に分析した。
実験の結果、図６に示すように、ＪＡＣ１は乳癌細胞のＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３の遊走能が有意に阻害でき、かつ用量－効果の関係が示された。
なお、実施例１～８の残りの各化合物について、本実施例の方法で検出した結果、ＪＡＣ１とほぼ一致し、乳癌細胞のＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３の遊走能が有意に阻害され、かつ用量－効果の関係が示された。
ＨＥＲ２陽性乳癌細胞皮下担癌ヌードマウスの腫瘍成長に対するＪＡＣ１の影響
本実施例は、ヒト乳癌細胞免疫不全マウスの皮下腫瘍モデルを作成し、ＪＡＣ１で関与した後、乳癌細胞の皮下成長に及ぼす影響を観察することを目的とする。
対数成長期のヒト由来乳癌細胞ＢＴ４７４細胞を採取し、無菌条件下で５×１０６／１００μＬ細胞懸濁液を製造し、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下担癌を行い、腫瘍体積の大きさが７５～１２５ｍｍ３になると、マウスを無作為に群分けし、空白対照群（Ｍｏｃｋ）、溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群、１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群、および陽性対照ハーセプチン・パクリタキセル（ＴＨ）処理群に分けた。そのうち、ＪＡＣ１は毎日投与、腹腔注射とし、ハーセプチンは１０ｍｇ／ｋｇ、週２回投与、腹腔注射とし、パクリタキセルは２０ｍｇ／ｋｇ、週１回投与、腹腔内投与とする。投与日から２日おきにマウスの体重を量り、マウスの腫瘍径を観察・測定し、腫瘍体積を算出した。動物倫理学の要求により、このモデルマウスでは担癌腫瘍の体積が２５００～３０００ｍｍ３になると、モデルを終了し、麻酔後に実験動物を安楽死し、相応の検査・分析を行った。
その結果、実験中、各群のマウスの体重はすべて緩やかな上昇傾向を示した（図７）。
対照群と比べ、５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群、１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１群およびハーセプチン・パクリタキセル（ＴＨ）処理群の腫瘍体積の増加速度は明らかに低下し（図８）、腫瘍重量は減少し（Ｐ＜０．０５）、各群の平均腫瘍重量の大きさは順にＴＨ群＜１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１群＜５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１群であった（図９）。腫瘍重量と体重との比は減少し（Ｐ＜０．０５）、かつＴＨ群の腫瘍重量と体重との比は最も低かった（図１０）。
図１１は各群のマウスから分離した腫瘍の組織図である。
腫瘍阻害率：５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群は３１．２２％、１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群は４６．２１％、ハーセプチン・パクリタキセル（ＴＨ）処理群は５２．３６％であった。５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１、１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１、ハーセプチン・パクリタキセルはすべて有効であり、各処理群の腫瘍阻害率は、順にＴＨ＞１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１＞５０ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１であった（図１２）。
さらに、各処理群の乳腺癌皮下担癌の腫瘍組織関連分子の発現レベルに対してウェスタンブロット検出を行い、結果を図１３に示し、ＪＡＣ１処理群では、ＨＥＲ２の発現は明らかに低下し、ＪＷＡの発現レベルは明らかに増加し、ハーセプチンがヒト化抗－ＨＥＲ２抗体であり、この抗体が使用後に細胞ＨＥＲ２タンパク質エピトープと結合しているため、ウェスタンブロット実験において一次抗体がＨＥＲ２と結合することができないため、本実験条件下ではＴＨ群はＨＥＲ２の発現を検出することができなかった。
担癌マウスの主要臓器構造に対するＪＡＣ１処理の影響
実施例１６によってＪＡＣ１がヒト乳癌細胞皮下担癌の成長を阻害するヌードマウスモデルが確立された。モデル完了時、各処理条件下でマウスの主要臓器に損傷があるか否かを観察するため、マウスを麻酔して安楽死し、マウスの主要臓器組織として心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳をホルマリン溶液で固定し、パラフィンで包埋した後、通常切片し、ＨＥ染色を行い、まずマウスの主要臓器の形態構造が正常か否かを検査し、測定した。結果により、この実験条件下で、各処理群のマウスの主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳）は光学鏡下で明らかな異常が見られなかった（図１４）。
担癌マウスの血液生化学指標に対するＪＡＣ１処理の影響
実施例１６によってＪＡＣ１がヒト乳癌細胞皮下担癌の成長を阻害するヌードマウスモデルが確立された。モデル完了時、各処理条件下で実験マウスの主要臓器に損傷があるか否かを観察するために、マウスを麻酔した後、全血を採血して血清を分離し、全自動生化学分析装置で血清生化学指標の変化を検出した。図１５に示すように、結果から明らかなように、各処理群のマウスの主要臓器に形態構造上明らかな病変が見られなかったが、対照群と比べて、ＪＡＣ１処理、特に１００ｍｇ／ｋｇのＪＡＣ１処理群のマウス血清中の肝機能ＡＬＴとＡＳＴ、トリグリセリドＴＧ、心筋キナーゼＣＫおよびそのアイソザイムＣＫＭＢはすべて明らかに低下し、抗酸化作用のスーパーオキシドディスムターゼＳＯＤのレベルは明らかに増加した。これらの指標はパクリタキセル＋ハーセプチン処理群でも対照群より改善したが、有意差はなかった。
これらの結果により、ＪＡＣ１はヒト乳癌ＢＴ４７４細胞マウス皮下担癌の成長を効果的に阻害できるだけでなく、腫瘍の成長による体内の生化学的機能障害に対しても比較的に良い関与作用があることが示唆され、陽性対照薬処理群では腫瘍阻害率はＪＡＣ１処理群よりやや高かったが、腫瘍による生体内生化学的機能障害に対する改善作用は顕著ではなかった。
ＪＡＣ１がＪＷＡ発現を活性化すると同時にＨＥＲ２発現を阻害することによるオフターゲット効果の検証
ＨＥＲ２過発現癌細胞に特異的に作用するＪＡＣ１の小分子以上のこのような生物学的機能を観察した後、ＪＡＣ１の腫瘍阻害作用のオフターゲット効果を実験により検証した。まず、Ｃｒｉｓｐ／ｃａｓ９技術を用いてＨＥＲ２陽性のＪＷＡ遺伝子を取り除いたヒトＢＧＣ８２３胃癌細胞を構築し、それぞれＪＷＡ（ＪＷＡ ＷＴ）含有とＪＷＡ（ＪＷＡ ＫＯ）遺伝子欠損のヒト胃癌細胞ＢＧＣ８２３株（以前にＨＥＲ２発現陽性であることを証明した）を用いて、１０μＭのＪＡＣ１で細胞を４８時間処理した後にタンパク質を採取し、ウェスタンブロット法でＪＷＡ野生と欠損性ＢＧＣ８２３細胞のＪＷＡとＨＥＲ２発現レベルを検出した。
図１６に示すように、結果から明らかなように、ＪＷＡ野生型（ＪＷＡ ＷＴ）胃癌細胞において、ＪＡＣ１処理はＪＷＡの発現を顕著に活性化すると同時にＨＥＲ２の発現レベルを阻害することができ、一方、ＪＷＡ欠損（ＪＷＡ ＫＯ）の胃癌細胞では、ＪＡＣ１処理後にＪＷＡとＨＥＲ２の発現に顕著な影響が見られなかった。
これらの結果では、ＪＡＣ１のＨＥＲ２阻害作用はＪＷＡの活性化によって達成され、ＪＡＣ１には明らかなオフターゲット効果がないことが示されている。
本発明では、実施例１１の方法でハイスループットスクリーニングを行ったところ、細胞のＪＷＡ遺伝子の発現を活性化し得る化合物が多数得られたが、実施例１～８の化合物を除く残りの化合物は、以下の通りであり、
Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝ＨまたはＯＨ、Ｒ３＝ＦまたはＣｌ、Ｒ４＝ＨまたはＦ、Ｒ５＝ＨまたはＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ１＝ＣＨ３、Ｒ２＝ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３、Ｒ３＝ＩまたはＣＦ３、Ｒ４＝ＢｒまたはＣＦ３、Ｒ５＝ＨまたはＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ１＝ＣＨ２ＣＨ３、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３またはＯＣＨ３、Ｒ３＝ＢｒまたはＣｌ、Ｒ４＝ＣｌまたはＩ、Ｒ５＝ＨまたはＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ１＝ＯＣＨ３、Ｒ２＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３またはＯＨ、Ｒ３＝ＦまたはＣＦ３、Ｒ４＝ＨまたはＣＦ３、Ｒ５＝ＨまたはＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ１＝ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｒ２＝ＣＨ３またはＯＣＨ３、Ｒ３＝ＣｌまたはＩ、Ｒ４＝ＢｒまたはＩ、Ｒ５＝ＨまたはＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３。
注：上記化合物の置換基が複数の置換位置に存在し得る場合、または化合物に複数の異性体が存在する場合は、すべての可能な化合物を含むことを意味する。
上記化合物はいずれも細胞のＪＷＡ遺伝子の発現を活性化することができるので、ＪＷＡ遺伝子活性化剤または抗腫瘍薬となる見込みもあり、このため、これらの化合物は全て本発明の保護範囲に含まれるべきである。
さらに、本発明の化合物は、悪性腫瘍の治療効果を高めるために、他の医薬品および他の治療手段と組み合わせて使用することもできる。
上記の実施例に加えて、本発明はさらに他の実施形態を有してもよい。均等置換または均等変換を用いて形成された技術的解決手段は、すべて本発明の保護範囲に該当する。

Claims (14)

  1. 次の式Ｉ：
    Figure 0007324933000006
    （式中、Ｒ１は、ＯＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、およびＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれ、
    Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、およびＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれ、
    Ｒ３は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ３からなる群から選ばれ、
    Ｒ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ３からなる群から選ばれ、
    Ｒ５は、Ｈ、ＣＨ３、およびＣＨ２ＣＨ３からなる群から選ばれる。）で表される化合物である、ＪＷＡ遺伝子活性化およびＨＥＲ２分解に基づく抗腫瘍化合物
    （ただし以下の化合物を除く：
    Figure 0007324933000007
  2. Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ３はＦまたはＣＦ３であり、Ｒ４はＨまたはＦであり、Ｒ５はＨであることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍化合物。
  3. 前記式Ｉの化合物は、
    ４，７－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４－メトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，７－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，７－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、および
    ４，６－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミンからなる群から選ばれる１つの化合物であり、
    それぞれの構造式は、
    Figure 0007324933000008
    であることを特徴とする、
    請求項１に記載の抗腫瘍化合物。
  4. 次のステップを含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗腫瘍化合物の製造方法。

    （式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選ばれる１つであり、前記銅塩は、酸化第二銅、酸化第一銅、塩化第二銅、塩化第一銅、臭化第二銅、臭化第一銅、またはヨウ化第一銅であり、前記アルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、または水素化ナトリウムであり、前記溶媒は、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、またはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであり、前記加熱の温度は８０～１２０℃である。）
  5. 前記ＸはＣｌであり、前記銅塩はヨウ化第一銅であり、前記アルカリは炭酸カリウムであり、前記溶媒はジメチルスルホキシドであり、前記加熱の温度は１００℃であることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
  6. 請求項１～３のいずれか１項に記載の抗腫瘍化合物の薬用塩。
  7. 前記薬用塩は、式Ｉの化合物と、塩酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、フマル酸またはリンゴ酸との塩であることを特徴とする、請求項６に記載の薬用塩。
  8. 次の式Ｉ：
    Figure 0007324933000010
    （式中、Ｒ １ は、ＯＨ、ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＯＣＨ ３ 、およびＯＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ２ は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＯＣＨ ３ 、およびＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ３ は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ４ は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ５ は、Ｈ、ＣＨ ３ 、およびＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれる。）で表される化合物又は式Iで表される化合物の薬用塩
    を含有する、医薬組成物。
  9. Ｒ １ はＯＣＨ ３ であり、Ｒ ２ はＨまたはＯＣＨ ３ であり、Ｒ ３ はＦまたはＣＦ ３ であり、Ｒ ４ はＨまたはＦであり、Ｒ ５ はＨである、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記化合物は、
    ４－フルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，７－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，６－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４－メトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，７－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，６－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，７－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン及び
    ４，６－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン
    （それぞれの構造式は、
    Figure 0007324933000011
    である）
    並びに
    それらの薬用塩
    から選ばれる１つの化合物であることを特徴とする、
    請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 次の式Ｉ：
    Figure 0007324933000012
    （式中、Ｒ １ は、ＯＨ、ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＯＣＨ ３ 、およびＯＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ２ は、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ 、ＯＣＨ ３ 、およびＯＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ３ は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ４ は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＣＦ ３ からなる群から選ばれ、
    Ｒ ５ は、Ｈ、ＣＨ ３ 、およびＣＨ ２ ＣＨ ３ からなる群から選ばれる。）で表される化合物又は式Iで表される化合物の薬用塩
    を含有する、腫瘍を治療するための医薬組成物。
  12. Ｒ １ はＯＣＨ ３ であり、Ｒ ２ はＨまたはＯＣＨ ３ であり、Ｒ ３ はＦまたはＣＦ ３ であり、Ｒ ４ はＨまたはＦであり、Ｒ ５ はＨである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記化合物は、
    ４－フルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，７－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，６－ジフルオロ－Ｎ－（４－メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４－メトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，７－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    Ｎ－（４－フルオロベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－４，６－ジメトキシベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン、
    ４，７－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン及び
    ４，６－ジメトキシ－Ｎ－（４－（トリフルオロメチル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－アミン
    （それぞれの構造式は、
    Figure 0007324933000013
    である）
    並びに
    それらの薬用塩
    から選ばれる１つの化合物であることを特徴とする、
    請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 前記腫瘍は、ＪＷＡ遺伝子の低発現と、ＨＥＲ２の過剰発現とに関連する腫瘍であり、前記腫瘍は乳癌、胃癌、肺癌、グリオーマを含み、前記医薬組成物は、ＪＷＡタンパク質の発現を活性化させた後、ＨＥＲ２タンパク質を分解することにより前記腫瘍を阻害する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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