EA020779B1 - СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРА cMET И AXL И ИНГИБИТОРА ErbB - Google Patents

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРА cMET И AXL И ИНГИБИТОРА ErbB Download PDF

Info

Publication number
EA020779B1
EA020779B1 EA201071268A EA201071268A EA020779B1 EA 020779 B1 EA020779 B1 EA 020779B1 EA 201071268 A EA201071268 A EA 201071268A EA 201071268 A EA201071268 A EA 201071268A EA 020779 B1 EA020779 B1 EA 020779B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
lapatinib
inhibitor
ebb
combination
Prior art date
Application number
EA201071268A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201071268A1 (ru
Inventor
Тона М. Джилмер
Джеймс Г. мл. Греджер
Ли Лю
Хун Ши
Original Assignee
ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41257222&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA020779(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи filed Critical ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи
Publication of EA201071268A1 publication Critical patent/EA201071268A1/ru
Publication of EA020779B1 publication Critical patent/EA020779B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака у пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективных количеств а) соединения формулы I или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения и (b) ингибитора ErbB, который ингибирует рецептор ErbB-1, или ErbB-2, или Erb-3, или их комбинацию. Способ по изобретению обращен на потребности в области техники, связанной с открытием комбинированной терапии, которая, как очевидно показано, является более эффективной терапией, чем ранее описанные терапии.

Description

Данное изобретение относится к способу лечения рака ингибитором, направленным на мультикиназы, включая сМЕТ и АХЬ, в комбинации с ингибитором ЕгЬВ.
Как правило, рак возникает в результате дерегуляции нормальных процессов, контролирующих деление клеток, дифференциацию и апоптотическую гибель клеток. Апоптоз (программированная гибель клеток) играет основную роль в эмбриональном развитии и патогенезе различных заболеваний, таких как дегенеративные нервные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и рак. Одним из наиболее изученных проводящих путей, включающих киназную регуляцию апоптоза, является клеточная передача сигнала от рецепторов фактора роста на клеточной поверхности к ядрам (Сге\\'5 апб Епкзоп, Се11, 74:21517, 1993), в частности клеточная передача сигнала от рецепторов фактора роста семейства ЕгЬВ.
ЕгЬВ-1 (также известный как ЕСРК или НЕК1) и ЕгЬВ-2 (также известный как НЕК2) являются белковыми рецепторами фактора роста трансмембранной тирозинкиназы семейства ЕгЬВ. Белковые тирозинкиназы катализируют фосфорилирование специфических тирозильных остатков в различных белках, вовлеченных в регуляцию клеточного роста и дифференциации (А.Р. Абкз, Ргодгезз ίη Сго\\1к Рас1ог Кезеагск, 1990, 2, 97-111; §.А. Соиг!пе1бде, Эеу. 8ирр.1, 1993, 57-64; кА. Соорег, §етш. Се11 Вю1., 1994, 5(6), 377-387; К.Р. Раи1зоп, §етт. 1ттипо1., 1995, 7 (4), 267-277; А.С. Скап, Сигг. Ορίη. 1ттипо1., 1996, 8(3), 394-401).
ЕгЬВ-3 (также известный как НЕК3) является рецептором фактора роста семейства ЕгЬВ, у которого есть домен связывания лиганда, но отсутствует внутренняя тирозинкиназная активность. НЕК3 активируется одним из внеклеточных лигандов (например, херегулином (НКС)), затем становится субстратом для димеризации и последующего фосфорилирования посредством НЕК1, НЕК2 и НЕК4; образуется тот фосфорилированный НЕК3, который ведет к активации путей клеточной сигнализации в отношении митогенных и трансформирующих эффектов.
Такие рецепторные тирозинкиназы широко экспрессируются в эпителиальных, мезенхимальных и нервных тканях, где играют роль в регуляции пролиферации клеток, выживаемости и дифференциации (δίόί1ί;·ι апб Аадпег, §с1епсе, 269: 234 (1995); ТкгеабдШ е! а1., 8с1епсе, 269: 230 (1995)). Повышенная экспрессия ЕгЬВ-2 или ЕгЬВ-1 дикого типа, или экспрессия конститутивно активированных рецепторных мутантов, трансформирует клетки ш укго (Όί Рюге е! а1., 1987; Э|Магсо е! а1., Опсодепе, 4: 831 (1989); Ниб/1ак е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ст. И8А., 84:7159 (1987); О1ап е! а1., Опсодепе, 10:211 (1995)). Повышенная экспрессия ЕгЬВ-1 или ЕгЬВ-2 коррелирована с плохим исходом болезни при некоторых злокачественных опухолях молочной железы и ряде других злокачественных новообразований (§1атоп е! а1., δαепсе, 235: 177 (1987); δ1атоη е! а1., δс^еηсе, 244:707 (1989); Васиз е! а1., Ат. 1. Скп. Ра!к, 102:δ13 (1994)). Сообщается о сверхэкспрессии НКС и/или НЕК3 в многочисленных злокачественных опухолях, включая опухоли желудка, яичников, предстательной железы, мочевого пузыря и молочной железы, и связи сверхэкспрессии с неблагоприятными прогнозами (В. Таппег, 1. Скп. Опсо1. 2006, 24 (26):4317-23; М. Науазкц Скп. Сапсег Кез. 2008, 14(23):7843-9; Н. Кауа, Еиг 1. Супаесо1 Опсо1. 2008, 29(4):350-6).
Способы конъюгирования лекарственного препарата с антителом, обеспечивающего направленную доставку препарата к ЕгЬВ, включают трастузумаб, моноклональное антитело против ЕгЬВ-2, цетуксимаб, антитело против ЕгЬВ-1, антитела против ЕгЬВ3, такие как таЬ3481, моноклональное антитело против человеческого ЕгЬВ3 (коммерчески поставляемое Κ&Ό δу5!ет5, М1ппеарок5, ΜΝ) и низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназы (ТК1), такие как лапатиниб, селективный ингибитор ЕгЬВ-1/ЕгЬВ-2, гефитиниб и эрлотиниб, селективные ингибиторы ЕгЬВ-1. Однако указанные агенты проявляют ограниченную активность при использовании в виде отдельных агентов (Моаззег, ВгШзк 1. Сапсег 97:453, 2007). Поэтому достижением в области онкологии было бы разработать методы терапии с повышенной эффективностью ингибирования ЕгЬВ для лечения ряда злокачественных опухолей.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов данное изобретение касается способа лечения рака у пациента, включающего введение пациенту терапевтически эффективных количеств:
или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения; и
- 1 020779 (Ь) ингибитора ЕтЬВ, который ингибирует рецептор ЕгЬВ-1, или ЕгЬВ-2, или ЕтЬ-3, или их комбинацию;
причем опухолевая клетка указанного рака высоко экспрессирует АХБ.
Способ по данному изобретению обращен на потребности в области техники, связанной с открытием комбинированной терапии, которая, как очевидно показано, является более эффективной терапией, чем ранее описанные терапии.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет кривые зависимости доза-эффект для ингибирования клеточного роста посредством лапатиниба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении лапатиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль, в клетках ОЕ-33 (сМЕТ+ и НЕК2+) и ЫС1-Н1573 (сМЕТ+ и НЕК1+) в присутствии НОР.
Фиг. 2 иллюстрирует (левое поле) влияния НОР на активность лапатиниба и комбинации лапатиниба и соединения I при соотношении лапатиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль в опухолевых линиях со сверхэкспрессией N87 с НЕК2+ и СМЕТ. Фиг. 2 также иллюстрирует (правое поле) ингибирование фосфорилирования сМЕТ, НЕК2, НЕК3, АКТ и ЕКК посредством обработки лапатинибом и соединением I в присутствии и в отсутствие НОР, определяемое анализами вестерн-блоттинга.
Фиг. 3 представляет ингибирование клеточного роста посредством лапатиниба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении лапатиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль, в обеих клетках, ВТ474 (чувствительных к лапатинибу и трастузумабу) и ВТ474-14 (резистентных к лапатинибу и трастузумабу), в присутствии НОР.
Фиг. 4 иллюстрирует индукцию апоптоза (фрагментация ДНК и активация 3/7 каспаз) посредством лапатиниба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении лапатиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль, в обеих клетках, ВТ474 и ВТ474-Н. в присутствии НОР.
Фиг. 5 представляет ингибирование клеточного роста и индукцию апоптоза посредством комбинации соединения I и лапатиниба при различных концентрациях в клетках ВТ474-Н. в присутствии НОР.
Фиг. 6 иллюстрирует 1) ингибирование фосфорилирования НЕК2 (рНЕК2) посредством одного только лапатиниба; 2) ингибирование фосфорилирования АХЬ (рАХЬ) посредством одного только соединения I и 3) ингибирование рНЕК2 и рАХЬ, равно как снижение фосфорилирования АКТ (рАКТ), фосфорилирования ЕКК1/2 (рЕКК1/2) и циклина Ό1, с использованием комбинации соединения I и лапатиниба в клетках ВТ474-14.
Фиг. 7 представляет ингибирование клеточного роста посредством трастузумаба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении трастузумаб:соединение I 1:15 моль-на-моль, после 5 дней обработки соединением в обеих клетках, ВТ474 и ВТ474-14, в присутствии НОР.
Фиг. 8 представляет кривые зависимости доза-эффект ингибирования клеточного роста посредством эрлотиниба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении эрлотиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль, в клетках опухоли легкого, ΝΟΉ1648 (сМЕТ+) и N0-41573 (сМЕТ+ и НЕК1+), в присутствии НОР.
Фиг. 9 иллюстрирует (левое поле, ингибирование клеточного роста с использованием метки) кривые зависимости доза-эффект для ингибирования клеточного роста посредством лапатиниба и соединения I, по отдельности и в комбинации при соотношении лапатиниб:соединение I 1:1 моль-на-моль, в опухолевых клетках ΜΙ<Ν45 (сверхэкспрессия СМЕТ+ и НЕК3) в отсутствие и присутствии НКО. Фиг. 9 также иллюстрирует (правое поле, анализ вестерн-блоттинга с использованием метки) ингибирование фосфорилирования СМЕТ, НЕК1, НЕК3, АКТ и ЕКК путем обработки лапатинибом и соединением I в присутствии и в отсутствие НКО, определяемое анализами вестерн-блоттинга.
Подробное описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение касается лечения рака с использованием эффективных количеств соединения формулы I и ингибитора ЕгЬВ, где соединение формулы I представлено следующей формулой:
или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения.
- 2 020779
В другом аспекте ингибитор ЕтЬВ представляет собой соединение формулы II
или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.
В другом аспекте ингибитор ЕгЬВ представляет собой дитозилатную соль или моногидрат дитозилатной соли соединения формулы II.
В другом аспекте ингибитор ЕгЬВ представляет собой соединение формулы III
или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.
В другом аспекте ингибитор ЕгЬВ представляет собой трастузумаб (реализуемый под названием герцептин).
В другом аспекте ингибитор ЕгЬВ представляет собой цетуксимаб (реализуемый под названием эрбитукс).
В другом аспекте ингибитор ЕгЬВ представляет собой моноклональное антитело против человеческого ЕгЬВЗ.
В другом аспекте рак представляет собой рак желудка, легкого, пищевода, головы и шеи, кожи, эпидермиса, яичников или молочной железы.
В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, страдающего раком молочной железы или раком головы и шеи, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения.
В другом аспекте фармацевтически приемлемый наполнитель включен в соединение или фармацевтически приемлемую соль формулы Били ингибитор ЕгЬВ; или их комбинацию.
Как использовано в описании, термин эффективные количества означает количества лекарственных средств или фармацевтических агентов, которые вызывают требуемый биологический или терапевтический ответ ткани, системы, животного или человека. Кроме того, термин терапевтически эффективные количества означает любые количества, которые при введении субъекту по сравнению с соответствующим субъектом, не получавшим таких количеств, приводят к лучшему лечению, излечиванию, предупреждению или уменьшению интенсивности заболевания, нарушения или побочного эффекта, или снижению скорости продвижения заболевания или нарушения. Термин также включает количества, эффективные для стимуляции нормальной физиологической функции. Подразумевается, что соединения могут быть введены последовательно или, по существу, одновременно.
Соединение по данному изобретению может быть введено любыми подходящими способами, включая пероральный или парентеральный. Фармацевтические составы, адаптированные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы или таблетки; порошки или гранулы; растворы или суспензии в водных или неводных жидкостях или жидкие эмульсии типа масло-в-воде. Составы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые наполнители, известные из уровня техники.
Фармацевтические составы, адаптированные для парентерального введения, в особенности внутривенного введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, делающие состав изотоничным с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут быть представлены в контейнерах с однократной или многократной дозой, например в запаянных ампулах и герметично закрытых флаконах, и могут храниться в сублимированном (лиофилизованном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед употреблением. Экстемпоральные растворы и суспензии для инъекций могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток.
Как использовано в описании, ингибитор ЕгЬВ означает соединение, моноклональное антитело, иммуноконъюгат или вакцину, ингибирующие ЕгЬВ-1, или ЕгЬВ-2, или ЕгЬВ-3, или их комбинацию.
Данное изобретение включает соединения, равно как соответствующие фармацевтически приемлемые соли.
Подразумевается, что слово или в контексте соединение или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения означает либо соединение, либо фармацевтически приемлемую соль указанного соединения (альтернатива), или соединение и фармацевтически приемлемую соль указанного соединения (в комбинации).
Как использовано в настоящем описании, пациент означает млекопитающее, конкретнее человека, страдающего раком.
Как использован в настоящем описании, термин фармацевтически приемлемые означает те соединения, материалы, композиции и лекарственные формы, которые в рамках обоснованного медицинского заключения пригодны для применения в контакте с тканями людей и животных при отсутствии излишней токсичности, раздражения или иных проблем и осложнений. Квалифицированному специалисту понятно, что фармацевтически приемлемые соли соединений для способа по данному изобретению могут быть получены. Указанные фармацевтически приемлемые соли могут быть получены ίη κίΐιι во время окончательного выделения и очистки соединения или раздельным осуществлением взаимодействия очищенного соединения в форме свободной кислоты или в форме свободного основания с подходящим основанием или кислотой соответственно.
Как правило, вводимое дозированное количество соединения формулы I и ингибитора ЕгЬВ представляет такое количество, которое является и эффективным, и толерантным. Предпочтительно количество соединения I составляет в диапазоне примерно от 1 мг до 1000 мг/день и количество ингибитора ЕгЬВ предпочтительно составляет в диапазоне примерно от 1 мкг до 2000 мг/день. Соединение I (Ν1-{3фтор-4-[(6-(метилокси)-7-{[3-(4-морфолинил)пропил]окси}-4-хинолинил)окси]фенил}-М1-(4-фторфенил) -1,1-циклопропандикарбоксамид) может быть получено, как описано в \νθ2005/030140. опубликованном 7 апреля 2005 г. Примеры 25 (с. 193), 36 (с. 202-203), 42 (с. 209), 43 (с. 209) и 44 (с. 209-210) описывают, как может быть получено соединение I. Соединение формулы I может быть получено аналогично. Общий принцип получения соединения I представлен схемой 1.
Примеры ингибиторов ЕгЬВ включают лапатиниб, эрлотиниб и гефитиниб. Лапатиниб, ^(3-хлор-4{[(3-фторфенил)метил]окси}фенил)-6-[5-({[2-(метилсульфонил)этил]амино}метил)-2-фуранил]-4хиназолинамин (представленный, как показано формулой II), является эффективным, пероральным, низкомолекулярным, двойным ингибитором тирозинкиназ ЕгЬВ-1 и ЕгЬВ-2 (ЕОРК и НЕК2), который разрешен в комбинации с капецитабином для лечения НЕК2-позитивного метастатического рака молочной железы.
- 4 020779
Свободное основание, соли НС1 и дитозилатные соли соединения формулы (II) могут быть получены по методикам, описанным в ΑΘ99/35146. опубликованном 15 июля 1999 г. и ΑΘ02/02552, опубликованном 10 января 2002 г. Общая схема получения дитозилатной соли соединения II иллюстрируется схемой 2.
Согласно схеме 2 получение дитозилатной соли соединения формулы (I) протекает в четыре стадии: стадия 1: взаимодействие указанного бициклического соединения и амина с получением указанного йодхиназолинового производного; стадия 2: получение соответствующей соли альдегида; стадия 3: получение дитозилатной соли хиназолина и стадия 4 : получение моногидрата дитозилатной соли.
Эрлотиниб, Ы-(3-этинилфенил)-6,7-бис-{ [2-(метилокси)этил]окси}-4-хиназолинамин (коммерчески доступный под торговой маркой Тагсеуа) представлен, как показано формулой III
Свободное основание и НС1-соль эрлотиниба могут быть получены, например, согласно США 5747498, пример 20.
Г ефитиниб, N-(3 -хлор-4-фторфенил)-7 -метокси-6-[3 -4-морфолин)пропокси] -4-хиназолинамин, представлен, как показано формулой IV
Гефитиниб, коммерчески доступный под торговой маркой ΓΚΕδδΑ® (А81га-2еиеиса), представляет собой ингибитор ЕгЬВ-1, показанный в качестве монотерапии для лечения пациентов с местнораспространенным или метастатическим немелкоклеточным раком легкого после безуспешной химиотерапии как на основе платины, так и на основе доцетаксела. Свободное основание и НС1-соли и ди-НС1-соли гефитиниба могут быть получены по методикам международной патентной заявки № РСТ/СВ96/00961, поданной 23 апреля 1996 г. и опубликованной в качестве ΑΘ96/33980 31 октября 1996 г.
- 5 020779
Методики
Клеточные линии и культивирование.
Клеточные линии карциномы молочной железы человека, ВТ474, НСС1954 и ΜΌΑ-ΜΒ-468, линии плоскоклеточной карциномы головы и шеи, 8СС15, Эе1гоП 562 и 8СС12, клеточные линии карциномы желудка, δΝυ-5, Ηδ746Τ, ΆΟδ, δΝυ-16 и N87, клеточные линии карциномы легкого, Νί.Ί-Η1993. ΝΟΙΗ1573, ΝΟΙ-Η441, ΝΠ-Η2342, ΝΟ-Η1648, НОР-92, ΝΟ-Η596, ΝΠ-Η69, ΝΟ-Η2170 и А549, клеточная линия эпидермальной карциномы А431 и линии карциномы толстой кишки, НТ29, δ\ν48 и ΚΜ12 получают из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клеточную линию карциномы пищевода ОЕ33 получают из Европейской коллекции клеточных культур ЕСАСС (υΚ). Клеточную линию рака молочной железы ЛМТ-1 и клеточную линию карциномы желудка ΜΚΝ-45 получают из Немецкого банка микроорганизмов и клеточных культур СтЬИ (Германия); КРЬ-4, клеточная линия рака молочной железы человека, любезно предоставлена профессором I. КигеЬауавЫ (Катеавак! Μοάίοαΐ 8скоо1, Кига8Йк1, карав). ЬЬ1-ВТ474-к4 (ΒΤ47444), клеточный клон карциномы молочной железы получен клонированием из одной клетки ВТ474 (ΗΕΚ.2+, молочная железа, высокочувствительный к лапатинибу), подвергнутой действию возрастающих концентраций лапатиниба, до 3 мкМ. ΕΙΟΚ.-ΕΟΝ-ΗΝ5 головы и шеи карциномы клеточной линии (ΗΝ5) подарена Институтом исследований злокачественных опухолей (Ιηвйкике оГ Сапсег Кевеагск, 8иггеу, υ.Κ. ΗΝ5Ο2 получен клонированием из одной клетки ΗΝ5 с последующим воздействием возрастающих концентраций лапатиниба.
Линии ВТ474, НСС1954, ΜΌΑ-ΜΒ-468, 8СС15, Эе1гоП 562, 8СС12, δΝυ-5, Ηδ746Τ, АС8, ΝΟ-Ν87, А-431, ΝΟΙ-Η1993, ΝΟΙ-Η441, НОР-92, ΝΟΙ-Η596, ΝΟΙ-Η69, ΝΟΙ-Η2170, А549, ΕΜΤ-1, ΜΚΝ-45, ОЕ33, δΝυ-16, δ^48, ΚΜ12 и НТ29 культивируют во влажной камере при 37°С в 95% воздушной среде, 5% СО2, в среде ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ΡΒδ). Как ΝΟ-Ό1573, так и ΝΟΙ-Η1648 культивируют в бессывороточной среде АСЬ-4, содержащей в соотношении 50:50, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ)/Ρ12, инсулинтрансферриновые добавки δе1еη^ипХ, 50 нМ гидрокортизона, 1 нг/мл ЕСР, 0,01 мМ этаноламина, 0,01 мМ фосфорилэтаноламина, 100 пМ трийодтиронина, 0,5% (мас./об.) ΒδΑ (2 мг/мл), 2 Ь-глутамин, 0,5 мМ пирувата натрия. ΝΟ-Η2342 культивируют в АТСС-формулированной ΌΜΕΜ:Ρ12 среде (№ по каталогу 30-2006) с 0,005 мг/мл инсулина, 0,01 мг/мл трансферрина, 30 нМ селенита натрия (конечная концентрация), 10 нМ гидрокортизона (конечная концентрация), 10 нМ бета-эстрадиола (конечная концентрация), 10 нМ ΗΕΡΕδ (конечная концентрация), дополнительно 2 мМ Ь-глутамина (для конечной концентрации 4,5 мМ) и 5% фетальной телячьей сывороткой (конечная концентрация). ΒΤ474Π4 культивируют в ΚΡΜΙ 1640, содержащей 10% ΡΒδ и 1 мкМ лапатиниба. ΚΡΕ-4 и ΗΝ5 культивируют в ΌΜΕΜ, содержащей 5% ΡΒδ; ΗΝ5 С12 культивируют в ΌΜΕΜ, содержащей 5% ΡΒδ и 1 мкМ лапатиниба.
Испытание на ингибирование клеточного роста и данные испытания.
Ингибирование клеточного роста определяют методом анализа жизнеспособности клеток ί'.ο11Τί^ΓС1о. Клетки высевают на 96-луночный планшет для тканевых культур при следующих плотностях посева на соответствующую среду, содержащую 10% ΡΒδ, при 1000 или 2000 клеток/лунка в зависимости от скорости клеточного роста. ΒΤ474Π4 и ΡΙΝ5Ο2 промывают ΡΒδ и высевают на чашку Петри в соответствующую культуральную среду, не содержащую лапатиниб. Спустя примерно 24 ч после посева клетки подвергают воздействию соединений; клетки обрабатывают десятью последовательными двукратными разведениями (конечные концентрации соединения изменяются в диапазоне от 10, 5, 2,5, 1,25, 0,63, 0,31, 0,16, 0,08, 0,04 до 0,02 мкМ) соединения или комбинации из двух агентов при постоянном соотношении моль на моль 1:1 или как указано. Клетки инкубируют с соединениями в культуральной среде, содержащей либо 5%, либо 10% ΡΒδ, и в присутствии или в отсутствие 2 нг/мл ΗСΡ, лиганда для активации сМЕТ в течение 3 дней или как указано. Уровни АТФ определяют, добавляя Се11 Τ^ίе^ С1о® (Рготеда), инкубируя 20 мин, затем люминесцентный сигнал считывают с планшета δресί^аΜаx Μ5 при времени интегрирования 0,5 с. Клеточный рост рассчитывают относительно контрольных лунок, обработанных растворителем (ДМСО). Концентрацию соединения, ингибирующую 50% контролируемого роста клеток (ΙΟ50), интерполируют, используя следующее эмпирическое уравнение четырехпараметрической кривой:
у= (А + (В-А) / (1 + 10 (к с|с|) где А означает минимальный отклик (ут1п), В означает максимальный отклик (утах), с означает точку перегиба кривой (ЕС50), й означает коэффициент Хилла и х означает 1о§10 концентрации соединения (моль/л).
Эффекты комбинации оценивают, используя значения индекса комбинации (С^ и статистический анализ превышения над максимальным отдельным агентом (ΕΟΗδΑ).
Значения ΟΙ рассчитывают с помощью интерполированных значений Ιί\0 и уравнения взаимного неисключения, выведенного Скои и Τа1а1ау
где ГСзед означает ГС50 ингибитора А; ΙΟ50φ) означает ГС50 ингибитора В; Иа означает концентрацию ингибитора А в комбинации с ингибитором В, ингибирующую 50% клеточного роста, и ИЬ означает концентрацию ингибитора В в комбинации с ингибитором А, ингибирующую 50% клеточного роста. В це- 6 020779 лом, значение С1 в диапазоне от 0,9 до 1,10 указывает на аддитивный эффект для комбинации из двух агентов. С1<0,9 указывает на синергизм (меньшее число указывает на более сильный синергетический эффект) и С1>1,10 указывает на антагонизм.
Превышение над максимальным отдельным агентом (ЕОНБА) определяется как статистически значимое улучшение в комбинации по сравнению с монотерапиями компонентами. Например, если соединения А и В комбинированы при концентрациях д и г, соответственно средний ответ в комбинации Лс|+Вг будет существенно выше, чем средние ответы в Ад или Вг по отдельности. В статистических терминах максимум р-значений для двух сопоставлений Ад+Вг против Ад и Ад+Вг против Вг должен быть ниже соответствующего предела или равен р<0,05. ЕОНБА представляет собой единый подход к оценке лекарственных комбинаций и является критерием ФДА (21 СКЕ 300,50) для утверждения лекарственной комбинации; см., Вопку е1 а1. (2003) или Нипд е1 а1. (1993) в отношении примеров и пояснения. Анализ выполняют, используя двухфакторный анализ дисперсии с взаимодействием (модельными терминами являются доза лекарственного средства А, доза лекарственного средства В и взаимодействие между дозами лекарственного средства А и В), с последующими линейными контрастами между каждой группой комбинации и соответствующими монотерапиями. Анализ проводят, используя §А§ (версия 9, предоставленная §А§ 1п51йи1е, Сагу, Ы.С.). ЕОНБА при каждой дозе рассчитывают как минимальную разность в среднем ингибировании в процентах между комбинацией и каждой из монотерапий из соответствующего контраста АЫОУА. Поскольку существует множество сравнений для конечной точки ингибирования в прцентах, в р-значение вводят поправку на множественные сравнения. Метод Нотте1 реализуют для улучшения критерия мощности, сохраняя контроль частоты ошибки ЕатЛуМке Еггог Ка1е (ЕЩЕ) путем применения метода последовательного отбрасывания. р-Значения как для синергизма, так и антагонизма рассчитывают, используя введение указанной поправки. При использовании метода ЕОНБА синергизм означает, что эффект (или ответ) в комбинации существенно выше, чем максимальный эффект отдельного агента самого по себе с р <0,05; аддитивный означает, что эффект в комбинации несущественно отличается от максимального эффекта отдельного агента самого по себе (р>0,05), антагонист означает, что эффект в комбинации существенно ниже, чем максимальный эффект отдельного агента самого по себе с р <0,05.
Испытания на апоптоз клеток методом оценки гибели клеток ЕЬ1§Ар1ик (оценка фрагментации ДНК) и испытаниями Сакраке-О1о® 3/7.
Апоптоз клеток оценивают как методом оценки гибели клеток ЕЬРЗА, который оценивает фрагментацию ДНК, признак апоптоза; и испытанием Сакраке-01о® 3/7, устанавливающим активность каспазы 3/7, одного из управляющих ферментов апоптоза в клетках.
Набор для оценки гибели клеток ЕЬ1§Ар1ик (Косйе, Маппйепп. Оеттапу) используют согласно инструкциям изготовителя. Клетки высевают на 96-луночные планшеты при плотности 10000 на лунку. Спустя 24 ч клетки дозируют и культивируют дополнительно 48 ч на КРМ1 1640 с 10% ЕВ§ в 5% СО2 при 37°С. Цитоплазматические фракции контроля и обработанных клеток переносят на покрытые стрептавидином 96-луночные планшеты и инкубируют с биотинилированным мышиным антителом к гистону и конъюгированным с пероксидазой мышиным антителом против ДНК при комнатной температуре в течение 2 ч. Абсорбцию определяют при 405-490 нм, используя считывающее устройство для микропланшетов §рее1та Мах Сетни (Мо1еси1аг Иеуюек, 8ипиууа1е, СА).
Испытание Сакраке-01о® 3/7 (Рготеда) представляет собой гомогенный люминесцентный анализ для измерения активностей каспазы-3 и -7. Клетки высевают на 96-луночные планшеты при плотности 5000 на лунку. Спустя 24 ч клетки дозируют и культивируют дополнительно 24 ч на КРМ1 1640 с 10% ЕВ§ в 5% СО2 при 37°С. Активность каспазы 3/7 определяют добавлением люминогенного субстрата каспазы-3/7, содержащего тетрапептидную последовательность ИЕМО, в реагенте, оптимизированном для активности каспазы, активности люциферазы и лизиса клеток, согласно инструкциям изготовителя.
Анализ вестерн-блоттинга.
Клетки высевают при 250000-500000 на лунку на шестилуночные планшеты (Еа1соп тиЙШеП, ВесФи Июкшкоп, РгапкПп Ьакек, N1). На следующий день клетки обрабатывают соединениями в среде для роста, содержащей 10% ЕВ§. После обработки клетки промывают охлажденным РВ§ и лизируют в чашках для культивирования, используя буфер для лизиса клеток [40 ммоль/л Тт18-НС1 (рН 7,4), 10% глицерина, 50 ммоль/л β-глицерофосфат, 5 ммоль/л ЕОТА, 2 ммоль/л ЕИТА, 0,35 ммоль/л ванадат, 10 ммоль/л NаЕ и 0,3% Ттйоп Х-100], содержащий ингибиторы протеазы (Сотр1е1е Рто1еаке 1пШЬйог ТаЬ1е18, Воейтшдет Маппйеш, НтйтапароПк, ΙΝ). Образцы белка (50 мкг), детерминированные с использованием детергент-совместимых анализов на белок Вю-Кай, из контроля и обработанных клеточных лизатов загружают в гели NиРАΟΕ с градиентом 4-12% (№уех, 1пс., 8ап И1едо, СА), подвергают электрофорезу в условиях восстановления и переносят на нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мкм; Вю-Кай ЬаЬотаФпек). Мембранные блоты прополаскивают РВ§ и блокируют в блокирующем буфере Ойуккеу В1оскшд Ьийет в течение 1 ч при комнатной температуре. Блоты зондируют антителами против специфических белков в блокирующем буфере плюс 0,1% Т\\ееп 20 и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Мембраны промывают и инкубируют с вторичными антителами ГКИуе 680 или ГКЭуе 800 при комнатной темпера- 7 020779 туре в течение 1 ч в блокирующем буфере плюс 0,1% Т\уссп 20. Мембраны обнаруживают с помощью системы формирования ИК-изображений Ойуккеу Шгагей Ппащпд §у81ет (Ы-СОК Вю5саспсс5. Ьшсо1п, ЫеЬгакка).
Условия, используемые для анализа вестерн-блоттинга (фиг. 6) следующие: клетки обрабатывают одним только лапатинибом (1 мкМ), одним только соединением I (1 мкМ) или лапатинибом (1 мкМ) в комбинации с соединением I (1 мкМ) в течение 4 ч. Клеточный лизат (50 мкг общего белка) или белки, иммунопреципитированные антителом против фосфотирозина, загружают в гель δΌδ-ΡΑΟΕ. В анализе вестерн-блоттинга используют антитело против специфического белка.
Условия, используемые в анализе вестерн-блоттинга (фиг. 2, правое поле и фиг. 9, правое поле), следующие: клетки обрабатывают одним только лапатинибом (1 мкМ), одним только соединением I (1 мкМ) или лапатинибом (1 мкМ) в комбинации с соединением I (0,1 мкМ) в течение 2 ч в отсутствие или в присутствии НОР или ΗΚΟ, как указано. Клеточный лизат (50 мкг общего белка) или белки, иммунопреципитированные антителом к МЕТ или к ΗΕΚ3, загружают в гель δΌδ-ΡΛΟΕ. В анализе вестернблоттинга используют антитело против специфического белка.
Ингибирование клеточного роста соединением I.
Соединение I является эффективным ингибитором мультикиназ, направленным на сМЕТ, ΚΟΝ, АХЬ, УЕОРК 1/2, ΉΕ2, РООРКЬе1а, сКП и РЬТЗ. Ингибирование клеточного роста оценивают анализом жизнеспособности клеток Се11Т11ег-О1о в клеточных линиях опухоли молочной железы (ВТ474, НСС1954, КРЬ-4, ЛМТ-1, ΜΌΑ-ΜΒ-468 и ВТ474-14), головы и шеи (8СС15, ΗΝ5, Оейго! 562, 8СС12 и ΗΝ5Ο2), желудка (δΝΌ-5, ΜΚΝ-45, Ηδ746Τ, ΑΟδ, δΝΌ-16 и ΝΠ-Ν87), легкого (ΝΟ-Η1993, ΝΟΗ1573, ΝΟ-Η441, ΝΟ-Η2342, ΝΠ-Η1648, НОР-92, ΝΠ-Η596, ΝΠ-Η69, ΝΠ-Η2170, А549), пищевода (ОЕ-33), кожи (А431) и толстой кишки (НТ29, δν48 и КМ12).
Фактор роста гепатоцитов (ΗΟΡ) является лигандом для активации сМЕТ. ΗΟΡ является цитокином с некоторым числом биологических активностей, включающих стимуляцию пролиферации клеток, подвижности и морфогенеза. ΗΟΡ секретируется как неактивный предшественник, который превращается в активную гетеродимерную форму под действием секретированной протеазы, включая активаторы плазминогена. В условиях культивирования клеток ίη νίΐτο большинство клеточных линий опухолей не экспрессирует активную форму ΗΟΡ. Добавление активной формы ΗΟΡ человека в культуральную среду обеспечивает систему активации сМЕТ паракрином. Указывается, что уровень ΗΟΡ сыворотки человека составляет для здоровых людей ~0,2 нг/мл (1. Iттиηο1. МеШойк 2000; 244: 163-173) и повышается до 2 нг/мл у пациентов с раком молочной железы и метастазами в печени (Титог Вю1 2007; 28:36-44). Поэтому ΗΟΡ вносят при 2 нг/мл в культуральную среду, содержащую либо 5%, либо 10% ΡΒδ, для ингибирования клеточного роста и исследования апоптоза.
Сокращения, принятые для таблиц
Ниже приведено пояснение сокращений, используемых в таблицах.
Ν=2 означает, что эксперименты повторяют дважды, независимо. Все анализы дублируют, за исключением случаев, указанных звездочкой;
Юзо означает концентрацию соединения, которая ингибирует 50% клеточного роста контроля, интерполированную с использованием эмпирического уравнения четырехпараметрической кривой, мкМ означает микромоли на литр;
ΗΕΚ амп.+указывает, что ген ΗΕΚ1 (ΗΕΚ1+) или ΗΕΚ2 (ΗΕΚ2+) является амплифицированным в клеточной линии; нет означает, что ни ΗΕΚ1, ни ΗΕΚ2 не является амплифицированным в клеточной линии;
>10 означает, что Κ.'50 не достигает наибольшей исследуемой концентрации (10 мкМ);
ΗΕΚ,-сверх означает сверхэкспрессионные уровни РНК ΗΕΚ3 (интенсивность ΜΑδ 5>300), как установлено аффиметрическим анализом на микрочипах;
ΗΕК3-сверх означает сверхэкспрессионные уровни РНК ΗΕΚ3 (интенсивность ΜΑδ 5<100), как установлено аффиметрическим анализом на микрочипах; сМЕТ+ означает амплификацию гена сМЕТ с >5 копиями ДНК МЕТ, как установлено δΝΡ-СШР;
сМЕТ+ (<5) означает амплификацию гена сМЕТ с <5 копиями ДНК МЕТ, как установлено δΝΡСШР;
сМЕТ-сверх означает сверхэкспрессию РНК сМЕТ (интенсивность ΜΑδ 5>300), как установлено аффиметрическим анализом на микрочипах;
сМЕТ-низкий означает низкие уровни экспрессиии РНК сМЕТ (интенсивность ΜΑδ 5<300), как установлено аффиметрическим анализом на микрочипах;
сМЕТ-тус означает точечную мутацию, делецию, инсерцию или миссенс-мутацию в гене сМЕТ;
-ΗΟΡ означает, что ΗΟΡ не добавляют;
+ΗΟΡ означает, что 2 нг/мл ΗΟΡ добавляют в культуральную среду, содержащую 5 или 10% ΡΒδ;
-ΗΚΟ означает, что ΗΚΟ не добавляют;
+ΗΚΟ означает, что 10 нг/мл ΗΚΟ добавляют в культуральную среду, содержащую 10% ΡΒδ;
НС = нет сведений, поскольку абсолютное значение Κ.'50 агента самого по себе не может быть определено.
- 8 020779
Влияния соединения I на ингибирование клеточного роста
Влияния соединения I, самого по себе, на ингибирование клеточного роста в клеточных линиях опухолей сведены в табл. 1. Как видно из табл. 1, данное соединение очень эффективно в ингибировании клеточного роста опухолевых линий ΜΚΝ-45, §Νυ-5, Н8746Т и ΝΟΙ-Η1993 с сМЕТ+ и НЕКнеамплифицированным (НЕК+=нет), давая значения 1С50 ниже 100 нМ. ΝΟΙ-Η1648, сМЕТамплифицированная клеточная линия опухоли легкого более чувствительна к соединению I в присутствии НОР, что свидетельствует о зависимом от НОР-еМЕТ - активации клеточном росте данной линии.
Таблица 1
Значения 1С50 (мкМ) для ингибирования клеточного роста одним только соединением I в опухолевых клеточных линиях
Клеточные линии СМЕТ НЕК амп.+ Соединение I (1С50 мкМ) , N=2
-НОГ + НСГ
желудка_ЗМ0-5 СМЕТ + Нет 0,012 0,019
желудка ΜΚΝ-45 СМЕТ + Нет 0,014 0,019
легкого Н1993 СМЕТ + Нет 0,044 0,087
желудка Н5746Т СМЕТ + Нет 0,044 0, 162
легкого Н1648 СМЕТ + Нет 1,202 0,470
пищев. ОЕЗЗ сМЕТ + НЕК2 + 0,386 0,445
легкого Н1573 СМЕТ + НЕВ1 + 1,651 1,478
г.ш. ОеГгоИ: 562 СМЕТ+ (<5) Нет 0,458 0,450
легкого Н441 СМЕТ+ <<5) Нет 1,031 1,155
легкого_Н2342 СМЕТ+ <<5) Нет 1,925 1,452
легкого Н596 СМЕТ- муг. (Ε14ϋβ1) Нет 1,061 0,705
легкого Н69 сМЕТ- мут. (Р.988С) Нет 1,274 0,970
легкого НОР-92 сМЕТ- мут. [Т10Ю1) Нет 0,827 0,566
же лудка_5Ни16 сМЕТ-сверх Нет 0,055 0, 054
легкого А549 сМЕТ-сверх Нет 0,885 0, 411
ТОЛСТОЙ кишкиНТ-29 сМЕТ-сверх Нет 0,556 0, 559
толстой кишки 5М48 сМЕТ-сверх Нет 0,260 0, 220
толстой кишки_КМ12 сМЕТ-сверх Нет 0,040 0,100
- 9 020779
легкого_Н2170 сМЕТ-сверх НЕК2 + 0, 684 0,522
кожи_А431 сМЕТ-сверх НЕЕ1 + 0, 687 0, 674
г.ш. ЗСС15 сМЕТ-сверх НЕЕ1 + 0,700 0, 690
г.ш. ΗΝ5 сМЕТ-сверх НЕК1 + 0,726 0, 824
г.ш* ЗСС12 сМЕТ-сверх нет 0, 988 1,189
г.ш._НЫ5С2 сМЕТ-сверх НЕК1 + 0, 858 1,213
молочной железы_НСС1954 сМЕТ-сверх НЕК2 + 1,855 1,856
молочной железы «ΙιηϊΤΙ сМЕТ-сверх ΗΕΒ2 + 1,732 1,911
желудка N87 сМЕТ-сверх НЕК2 + 2,446 2, 320
молочной железы_КРЬ4 сМЕТ-низкий НЕЕ.2 + 0,459 0,625
желудка АС5 сМЕТ-низкий Нет 0,656 0,427
молочной железы_МОА-МВ- 4 6© сМЕТ-низкий НЕЕ1 + 0,813 0,589
молочной железы_ВТ474- сМЕТ-низкий НЕЕ2 + 4,515 4, 016
молочной железы ВТ474 сМЕТ-низкий НЕК2 + 4,974 4,899
Результаты табл. 1 свидетельствуют о том, что пролиферация опухолевых клеток с амплификацией гена сМЕТ сильно зависит от сМЕТ. Как дополнительно иллюстрируется табл. 1, соединение I дает значения 1С50 в диапазоне от 0,04 до ~5 мкМ в ингибировании роста клеток в клеточных линиях с амплификацией сМЕТ менее 5 копий, с мутациями сМЕТ по околомембранному домену (НОР-92: СМЕТ-Т10101; Н69: СМЕТ-К988С и Н596: сМЕТ-ехоп 14, делеция внутри рамки считывания) или сМЕТнеамплифицированных опухолевых линиях, экспрессирующих высокие или низкие количества РНК сМЕТ, обозначенные сМЕТ-сверх и сМЕТ-низкий соответственно. Такие результаты согласуются с данными о том, что соединение I ингибирует многочисленные онкогенные киназы в опухолевых клетках.
Влияние соединения I в комбинации с лапатинибом на ингибирование клеточного роста на клеточных линиях с амплификацией сМЕТ и НЕК.
Как иллюстрируется табл. 2, лапатиниб сам по себе дает средние значения 1С50 0,12 и 0,11 (в присутствии и в отсутствие НОР соответственно) в клеточной линии опухоли молочной железы ВТ474 с низким сМЕТ и НЕК2+, тогда как соединение I само по себе дает средние значения 1С50 4,97 мкМ (с НОР) и 4,90 мкМ (без НОР). Такой результат не является неожиданным, поскольку лапатиниб, в отличие от соединения I, известен как эффективный ингибитор амплифицированного ЕтЬВ-2 (НЕК амп.+). В комбинации лапатиниб и соединение I проявляют либо аддитивный эффект с учетом СТ 0,95 без НОР, либо синергический эффект с учетом О 0,71 с НОР, и усиленное ингибирование клеточного роста при более высоких концентрациях (фиг. 3) в клеточной линии молочной железы_ВТ474.
Для сравнения, эффект ингибирования клеточного роста в клеточной линии опухоли пищевода с совместно амплифицированными сМЕТ и НЕК2 (пищев. ОЕ33) комбинацией лапатиниба и соединения I является заметным и неожиданным. Как следует из табл. 2 и фиг. 1, ОЕ33 проявляет резистентность к лапатинибу ^С50=6,5 мкМ без НОР, >10 мкМ с НОР) и умеренную чувствительность к соединению I (^50=0,42 мкМ без НОР, 0,40 мкМ с НОР), самому по себе. Однако комбинация лапатиниба с соединением I проявляет устойчивый синергический эффект (с учетом как СТ, так и ЕОН8Л) ингибирования клеточного роста в клетках опухоли пищевода ОЕ33 в присутствии и в отсутствие НОР. Подобным образом, как показано в табл. 2 и на фиг. 1, N0-41573, клеточная линия опухоли легкого с сМЕТ и ЕОРК совместной амплификацией резистентна к лапатинибу и умеренно чувствительна к соединению I при раздельном введении; однако комбинирование двух ингибиторов улучшает эффективность (более низкие значения Шэд) и повышает активность ингибирования клеточного роста (синергизм, основано на ЕОН8Л). Хотя и без теоретического обоснования, данные результаты означают, что сМЕТ и НЕК могут влиять друг на друга (перекрестные искажения) и приводить к отклонениям от ингибирования роста, обеспеченного ингибитором НЕК или ингибитором сМЕТ по отдельности, и что комбинация лапатиниба с соединением I преодолевает резистентость в опухолевых клетках с сМЕТ и НЕК совместно амплифицированными.
- 10 020779
Таблица 2
Влияние комбинации соединения I с лапатинибом на ингибирование клеточного роста, на опухолевых клеточных линиях с совместной амплификацией генов как сМЕТ, так и НЕК1 или НЕК2
ных линиях с амплификацией, мутацией или сверхэкспрессией сМЕТ.
Как показано в табл. 3, комбинация лапатиниба и соединения I проявляет синергические эффекты с С1<0,9 в клетках опухолей молочной железы, легкого, желудка, головы и шеи, яичников и кожи с амплифицированным, мутированным или сверхэкспрессированным сМЕТ. Анализ ЕОН8А подтверждает синергизм во всех случаях, за исключением N87 без НОР и Н1993 в присутствии или в отсутствие НОР. В каждом из указанных исключений отдельный агент, лапатиниб или соединение I очень активен сам по себе и эффект комбинации является аддитивным.
Неожиданно, что, как показывает табл. 3, НОР снижает эффективность ингибирования клеточного роста лапатинибом в опухолевых клетках (НЕК2+: N87, Н2170 и НСС1954; НЕК1+: 8СС15, и А431) с НЕК1/НЕК2 амплифицированным и сверхэкспрессированным СМЕТ. Кроме того, комбинирование лапатиниба с соединением I не только превосходит эффект НОР, но также снижает чувствительность, в особенности в клеточных линиях Н2170, НСС1954, 8СС15, НМ5 и А431, в присутствии и в отсутствие НОР. Напротив, НОР не снижает активность лапатиниба в ВТ474 (табл. 2) и КРЬ-4 (табл. 3), двух НЕК2амплифицированных клеточных линиях опухолей молочной железы с низкой экспрессией РНК сМЕТ или экспрессией белка.
Эффект НОР иллюстрируется фиг. 2 для N87. Фиг. 2 (левое поле, ингибирование клеточного роста с использованием метки) показывает, что в отсутствие НОР N87 высокочувствительна к лапатинибу, взятому в отдельности ^С50=0,05 мкм) или в комбинации с соединением I при соотношении 1:1 моль-намоль. Напротив, в присутствии НОР N87 является нечувствительной к лапатинибу С[С5о=4,80 мкМ), довольно чувствительной к комбинации лапатиниба и соединения I (^50=0,05 мкМ). Фиг. 2 (правое поле, анализ вестерн-блоттинг с использованием метки) также показывает, что комбинация лапатиниба и соединения I ингибирует фосфорилирование НЕК2, НЕК3 и сМЕТ и ослабляет клеточную передачу сигнала рАКТ и рЕКК, что соответствует ингибированию клеточного роста как в присутствии, так и в отсутствие НОР.
Табл. 3 и фиг. 2 соответствуют предшествующим открытиям, основанным на утверждении, что НОР активирует сМЕТ. Приведенные выше результаты также указывают на то, что НОР-опосредованная активация сМЕТ может влиять на НЕК и снижать ингибирование роста ингибитором НЕК. Указанные результаты демонстрируют, что комбинирование соединения I с лапатинибом может обеспечивать более эффективную терапию опухолевых клеток со сверхэкспрессией сМЕТ и амплифицированным НЕК.
- 11 020779
Таблица 3
Влияние комбинации соединения I и лапатиниба на ингибирование клеточного роста, на опухолевых клеточных линиях с амплификацией, мутацией или сверхэкспрессией СМЕТ
Клеточные линии СМЕТ НЕК амп. + Среднее Ю50 (мкМ) , N=2 Эффект комбинации
Лапатиниб Лапатиниб или соединение I (лапатиниб + соединение I) Соединение I С1 @ 1С50
-НСГ +НСГ -НСГ +НСГ -НСГ +НСГ -НСГ +Н6Г
желудка N87 сМЕТ-сверх НЕК2 + 0, 05 4,80 0,04 0, 05 2,62 2, 62 0,77 0, 03
легкого Н2170 сМЕТ-сверх НЕК2 + 0,26 4,24 0, 12 0,08 0, 68 0,50 0,79 0,19
молочной железы НСС1954 сМЕТ-сверх НЕК2 + 0,80 5,27 0, 12 0,25 1, 85 1,98 0, 47 0,18
молочной железы КРЪ4 сМЕТ- низкий* НЕК2 + 1,00 0,89 0, 10 0,11 0, 64 0,35 0,33 0,51
яичников 5Κ0ν3 сМЕТ-сверх НЕК2 + 5,02 5, 67 0, 58 0,51 1,57 1,43 0,53 0, 48
г.ш. 5СС15 сМЕТ-сверх НЕК1 + 1,08 3,81 0, 13 0,16 0, 66 0,66 0,33 0,29
кожи А431 сМЕТ-сверх НЕК1 + 2,19 4,60 0,27 0,24 0, 69 0, 65 0, 55 0, 44
г.ш. ΗΝ5 сМЕТ-сверх НЕК1 + 2,37 3, 69 0, 20 0,23 0,88 0,97 0,33 0,32
г.ш. ЗСС12 сМЕТ-сверх Нет >10 >10 0, 30 0,37 1,11 1,16 НС НС
легкого Н1993 сМЕТ+ Нет >10 >10 0, 01 0,02 0,02 0,09 НС НС
легкого Н1648 СМЕТ+ Нет 7,39 >10 0, 15 0,06 1, 18 0,52 0, 15 НС
г.ш. ОебгоаЛ 562 сМЕТ+ «5) Нет 4,02 4, 64 0, 15 0, 17 0,41 0,41 0,44 0,44
легкого Н2342 СМЕТ+ (<5) Нет 6,81 6, 64 0, 65 0, 55 1,80 1, 52 0, 50 0,47
легкого Н441 СМЕТ+ (<5) Нет >10 >10 0, 67 0, 63 1,12 1,17 НС НС
легкого Н596 СМЕТ -мут. Нет >10 >10 0, 67 0,43 1, 18 0,82 НС НС
легкого Н69 СМЕТ -мут. Нет 5,36 4,74 0,72 0, 61 1,27 0,97 0,78 0,83
легкого НОР-92 СМЕТ -мут. Нет >10 >10 0, 44 0,33 0, 83 0,57 НС НС
* На основе экспрессии белка.
Влияния комбинации соединения I и лапатиниба на клеточные линии опухолей с резистентным к лапатинибу НЕК+ ΒΤ474-Ι4, ЛМТ1 и НЫ5С12 являются клеточными линиями с резистентными к лапатинибу НЕЕ2+ или НЕК1+. ЛМТ-1, наследственную, резистентную к лапатинибу или трастузумабу линию, получают от пациента, не реагирующего на трастузумаб. Как ΒΤ474-Ι4, так и НЫ5С12 представляют собой клоны с приобретенной резистентностью к лапатинибу. Как показывает табл. 4, комбинация соединения I с лапатинибом проявляет синергизм (по анализу ЕОН8А) в ингибировании клеточного роста во всех трех резистентных к лапатинибу опухолевых клеточных линиях. Кроме того, как показывает фиг. 3, соединение I восстанавливает чувствительность к лапатинибу в резистентных клетках ΒΤ474-Ι4 и повышает активность лапатиниба как в ВТ474 (чувствительных к лапатинибу), так и ΒΤ474-Ι4 (резистентных к лапатинибу и трастузумабу) клетках. Синергический эффект соединения I и лапатиниба в комбинации обнаружен не только в ингибировании клеточного роста, но также в индукции апоптоза, как иллюстрирует фиг. 4. Как показывает фиг. 4, комбинирование соединения I и лапатиниба повышает как фрагментацию ДНК, так и активацию каспаз 3/7, признаки апоптоза как в ВТ474, так и в ΒΤ474-Ι4 клетках; однако введенные раздельно соединение I при высокой концентрации или лапатиниб индуцируют апоптоз только в ВТ474, чувствительной к лапатинибу, линии.
Таблица 4
Влияние соединения I в комбинации с лапатинибом на ингибирование клеточного роста на клеточных линиях опухолей с резистентным к лапатинибу НЕК+
Клеточные линии СМЕТ НЕК амп. + Средние 1С50 (мкМ), N=2 Эффект комбинации
Лапатиниб Лапатиниб или соединение I (лапатиниб + соединение 1) Соединение I С1 0 1С50
-НСГ +нсг -НСГ +НСГ -НСГ + НСГ -нсг + НСГ
молочной железы ВТ474 сМ£Т-низкий НЕК2 + 0,11 0, 11 0, 10 0, 07 4,76 4,72 0,93 0,72
МОЛОЧНОЙ железы ВТ474-Д4 еМЕТ-низкий НЕК2 + >10 >10 0, 08 0,07 4,79 4,05 НС НС
молочной железы ЛтТ1 сМЕТ-сверх НЕК2 + >10 >10 0, 73 0,74 1.77 2,19 НС НС
г.ш. НИ5С12 сМЕТ-сверх НЕК1 + 4,12 3, 85 0,31 0,41 0,81 1,26 0, 50 0, 47
Эффекты доз соединения I в клеточных линиях ΒΤ474-Ι4 устанавливают с использованием фиксированной концентрации лапатиниба при 1 мкМ. Как показывает фиг. 5А, установлено, что ГС50 соединения I равно 0,11 мкМ при концентрации лапатиниба 1 мкМ. Без лапатиниба ГС50 соединения I равно 3
- 12 020779 мкМ, тогда как лапатиниб сам по себе при 1,0 мкМ проявляет минимальный эффект (ингибирование <50%). Далее, как показывает фиг. 5В, индукция апоптоза также установлена, когда соединение I и лапатиниб комбинированы в тех же условиях дозирования.
Восстановление чувствительности к лапатинибу путем ингибирования соединением I АХЬ в клетках ВТ474-И.
Как неожиданно установлено, АХЬ высоко экспрессируется и фосфорилируется в ВТ474-14. но не экспрессируется в клетках ВТ474, как определено анализом вестерн-блоттинга (иллюстрируемым фиг. 6) и подтверждается количественным ОТ-ПЦР. Сообщается, что АХЬ сверхэкспрессируется в некоторых злокачественных опухолях, включая злокачественные новообразования толстой кишки (Сгауеп е! а1., Ση! I Сапсег 1995; 60:791-7), легкого (8Ыей е! а1., №ор1ак1а 2005; 7:1058-64), пищевода (№то!о е! а1., Ра!йоЬю1оду. 1997; 65(4) : 195-203), щитовидной железы (Йо е! а1., ТйугоМ 1999, 9(6):563-7), яичников (8ип е! а1., Опсо1оду 2004; 66:450-7), желудка (Аи е! а1., Апйрак Кек. 2002; 22 (2В): 1071-8) и молочной железы (Вегс1а/ е! а1., Апп Опсо1 2001; 12:819-24), что связано с неблагоприятными прогнозами. Сверхэкспрессия АХЬ в культуре тканей вызывает онкогенную трансформацию. Таким образом, комбинация по данному изобретению полезна для лечения всех АХЬ-сверхэкспрессирующих опухолей.
Далее, как показано на фиг. 6, лапатиниб сам по себе ингибирует фосфорилирование НЕК2 как в ВТ474, так и ВТ474-И клетках; однако лапатиниб ингибирует передачу в нисходящем потоке сигнала фосфорилирования АКТ и ЕКК и снижает уровень циклина Ό1 только в ВТ474, но не в ВТ474-14 клетках. С другой стороны, соединение I, само по себе, ингибирует фосфорилирование АХЬ, но не передачу в нисходящем потоке сигнала фосфорилирования АКТ в ВТ474-14 клетках. На удивление, комбинация соединения I и лапатиниба существенно ингибирует фосфорилирование НЕК2, АХЬ, АКТ и ЕКК и снижает уровень циклина Ό1 в ВТ474-14 клетках. Эффект вышеуказанного ингибирования клеточной передачи сигнала очень хорошо коррелируется с устойчивым синергизмом, обнаруживаемым комбинацией соединения I и лапатиниба в ингибировании клеточного роста и индукции апоптоза в ВТ474-14. Такие результаты, равно как результаты, приведенные в табл. 5 и на фиг. 7, убедительно доказывают, что 1) сверхэкспрессия АХЬ лежит в основе механизма резистентности к лапатинибу или трастузумабу и 2) комбинация соединения I и лапатиниба или трастузумаба преодолевает резистентность указанных опухолевых клеток.
Влияние комбинации соединения I и трастузумаба на опухолевую клеточную линию с НЕК2+.
Трастузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с внеклеточным сегментом рецептора НЕК2 и ингибирует передачу сигнала от НЕК2. Как иллюстрируется фиг. 7, трастузумаб сам по себе обнаруживает 40% (без НОР) и 35% (с НОР) ингибирование клеточного роста в клетках ВТ474 и незначительное ингибирование в клетках ВТ474-И, ОЕ-33 и N87 после 5 дней обработки. Как показано в табл. 5, комбинирование соединения I с трастузумабом повышает ингибирование клеточного роста во всех четырех линиях с амплифицированным НЕК2, как свидетельствует пониженное значение Κ'50 или синергизм, установленные с использованием ЕОН8А анализа. Кроме того, результаты демонстрируют преимущество комбинирования соединения I с ингибитором НЕК2 в опухолевой клеточной линии с амплифицированным НЕК2.
Таблица 5
Влияние соединения I и трастузумаба на ингибирование клеточного роста на опухолевых клеточных линиях с НЕК2+
Клеточны э линии СМЕТ НЕВ+ НСЕ 1С^о (мкМ) , 5 дней обработки. N=2
Трастузумаб Трастузумаб в (трастузумаб + соединение I) Соединение I в (трастузумаб + соединение I) Соединение I
молочной ВТ474 железы сМЕТ-низк- НЕК2 + -НСЕ >0,687** 0,032 0,465 3, 651
МОЛОЧНОЙ ВТ474 железы сМЕТ-низк. НЕВ2 + +НСЕ >0,687** 0,051 0, 746 3,941
молочной ВТ474_Д4 железы сМЕТ-низк. НЕК2 + -НОЕ >0,687 0, 010 0, 139 2,954
молочной ВТ474 Д4 железы сМЕТ-ниэк. НЕВ2 + +НСЕ >0,687 0,009 0,132 2,909
желудка N87 сМЕТ-сверх НЕЕ2 + -НСЕ >0,687 0,039 0,570 1,361
желудка N87 сМЕТ-сверх НЕК2 + +НОЕ >0,687 0,040 0, 582 1, 616
питев._ ОЕЗЗ сМЕТ+ НЕК2 + -НСЕ >0,687 0,001 0, 016 0, 035
пищев. ОЕЗЗ СМЕТ+ НЕК2 + +НСЕ >0,687 0,003 0, 037 0,127
** Трастузумаб ингибирует максимально 35~40%% клеточного роста в ВТ474 после 5 дней обработки.
Влияние соединения I и эрлотиниба на опухолевые клеточные линии.
Эрлотиниб является ингибитором ЕОРК и при высоких концентрациях также ингибирует НЕК2 в клеточной культуре. Эрлотиниб сам по себе не очень активен в большинстве исследуемых опухолевых клеточных линиях. Комбинация соединения I и эрлотиниба проявляет синергизм в ингибировании кле- 13 020779 точного роста, как свидетельствуют С1<0,9 и подтверждает анализ ЕОН8Л, в клеточных линиях опухолей легкого, головы и шеи, молочной железы, яичников, желудка и эпидермиса, перечисленных в табл. 6.
Причем, как иллюстрирует фиг. 8, обнаружено, что клеточная линия опухоли легкого ЫС1-Н1648 является резистентной к эрлотинибу (1С50>10 мкМ) и умеренно чувствительной к соединению I (1С50=0,96 мкМ без НОР, 0,40 мкМ с НОР), но высокочувствительной к комбинации эрлотиниба и соединения I. Подобным образом, установлено, что ΝΟΙ-Π1573, клеточная линия опухоли легкого с совместной амплификацией сМЕТ и ЕОРК является резистентной к эрлотинибу и умеренно чувствительной к соединению I, но более чувствительной к комбинации двух соединений. Полученные результаты указывают на то, что комбинирование эрлотиниба с соединением формулы I может обеспечивать более эффективную обработку указанных опухолевых клеток.
Таблица 6
Влияние комбинации соединения I и эрлотиниба на ингибирование клеточного роста на клеточных линиях опухолей молочной железы, толстой кишки, желудка, головы и шеи, легкого, яичников и кожи
Клеточные линии сМЕТ НЕЕ амп.+ Среднее 1С50 (мкМ) , N=2 Эффект комбинации
Эрлотиниб Эрлотиниб или соединение I (лапатиниб + соединение I) Соединение I С1 @ 1Сьо
-НЕЕ +-НСГ -НСГ +НСГ -НСГ + НСГ -НСГ + НСГ
молочной железы_КРБ4 сМЕТ-низкий НЕР.2 + >10 >10 0,21 0, 19 0,47 0,59 НС НС
толстой кишки НТ29 сМЕТ-сверх Нет >10 >10 0,43 0,47 0,56 0,57 НС НС
толстой кишки 5М4 8 сМЕТ-сверх Нет 2, 35 2, 62 0,12 0, 09 0,23 0,18 0, 56 0, 44
*елудка_АС5 сМЕТ-низкий Нет >10 >10 0,30 0,31 0,61 0,61 НС НС
же л удк а_3 N016 сМЕТ-сверх Нет 6, 46 9,37 0,05 0, 06 0,06 0,07 0, 86 0, 78
г.ш. ОеДгогС 562 СМЕТ+ (<5) Нет >10 >10 0,25 0,16 0,41 0,37 НС НС
г.ш._НЫ5’ сМЕТ-сверх НБК1 + 6,72 >10 0,13 0,21 0,80 1,09 0,18 НС
г.ш. НМ5С2·*· сМЕТ-сверх НЕЕ1+ >10 >10 0,21 0,29 0,81 1,33 НС НС
г.ш._ЗСС12 сМЕТ-сверх Нет >10 >10 0,37 0,44 1,14 1,36 НС НС
г.ш. ЗСС15 сМЕТ-сверх НЕК1 + 1, 62 7,70 0,13 0, 14 0,63 0,61 0, 30 0,25
легкого_Н1Ь73 СМЕТ* НЕК1 + >10 >10 0, 43 0, 34 1,51 1,03 НС НС
легкого Н1648 сМЕТ + Нет >10 >10 0,33 0, 06 0,96 0,40 НС НС
легкого Н1975 ΤΒϋ Нет >10 >10 0,98 0, 99 1,39 1.22 НС НС
легкого_Н1993* СМЕТ* Нет 8, 13 >10 0,004 0, 02 0,01 0,04 0, 32 НС
легкого Н2170 сМЕТ-сверх НЕН2+ 1,28 7,74 0,33 0, 30 0,67 0,53 0, 90 0, 61
легкого Н2342 СМЕТ* Нет >10 >10 0,84 0, 79 1,61 1, 62 НС НС
легкого Н441 СМЕТ* (<5) Нет >10 I >10 0, 61 0,62 1,26 1,44 НС НС
легкого_Н596 сМЕТ-мут. Нет >10 >10 0, 59 0,44 1,22 0,82 НС НС
легкого Н69 сМЕТ-мут. Нет >10 ! >10 0, 90 0,79 1,20 1,05 НС НС
легксго_НОР-92 сМЕТ-мут. Нет >10 >10 0, 45 0,35 0,82 0,65 НС НС
яичников ЗКОУЗ сМЕТ-сверх НЕК2 + 5,62 | 5,39 0, 84 0,78 1,64 1,54 0,74 0,72
кожи А431* сМЕТ-сверх НЕР.1 + 3,22 >10 0,18 0,20 0,50 0,52 0,44 НС
* N=1, выполнен один эксперимент.
Влияния комбинации соединения I с лапатинибом или антителом против НЕК3 на опухолевые клеточные линии со сверхэкспрессией НЕК3.
Клетки ΜΚΝ45 имеют сМЕТ+ и сверхэкспрессируемый уровень НЕК3. Как показывают табл. 7 и фиг. 9, НКО снижает чувствительность соединения I к ингибированию клеточного роста (значение Κ.'50 повышается от 20 нМ в отсутствие НКО до 450 нМ в присутствии НКО) и фосфорилированию НЕК3 в опухолевых клетках ΜΚΝ45. Неожиданно, что лапатиниб восстанавливает чувствительность соединения I и проявляет сильный синергизм в ингибировании клеточного роста, как свидетельствуют 0=0.12 и анализ ЕОН8Л, при комбинировании с соединением I в присутствии НКО в ΜΚΝ45 клетках. В качестве контроля клетки опухоли желудка Н8746Т с МЕТ+ и низкой экспрессией НЕК3 остаются чувствительными к соединению I даже в присутствии НКО. Вышеуказанные результаты демонстрируют, что комбинирование соединения I с лапатинибом полезно в случае опухолевых клеток с МЕТ+ и сверхэкспрессией НЕК3. Кроме того, комбинирование соединения I с антителом против НЕК3 (шаЬ3481, моноклональное антитело против человеческого ЕгЬВ-3, поставляемое К&Б §у81еш8, М1ииеаро118, ΜΝ) повышает чувствительность соединения I и оказывает синергический эффект (ЕОН8Л) на ингибирование клеточного роста в клетках ΜΚΝ45 (табл. 8).
- 14 020779
Таблица 7
Влияние соединения I в комбинации с лапатинибом на ингибирование клеточного роста в опухолевых клеточных линиях с МЕТ+ и сверхэкспрессией НЕКЗ
Клеточные линии НЕКЗ Средние 1С$о (мкМ), М=2 Эффект комбинации
Лапатиниб Лапатиниб или соединение I {лалатиниб + соединение I) Соединение I С1 е
-НСГ +нск -НСГ +НСГ -нсг + НСГ -нег + НСГ
ΜΚΝ-45 НЕКЗ- сверх 6,16 5, Об 0,01 0, 04 0, 02 0, 45 0,05 0, 12
К5746Т НЕКЗ- низкий 7,69 7,37 0,01 | оУ οι 0,01 ] 0,01
Таблица 8
Влияние соединения I в комбинации с антителом против НЕКЗ на ингибирование клеточного роста в опухолевых клеточных линиях ΜΚΝ-45 со сверхэкспрессией НЕКЗ
Клеточные СМЕТ НЕКЗ + НКС110 нг/мл) , средние ГСьо, N=2
ЛИНИИ анти-НЕКЗаЬ (мкг/мл) анти-НЕКЗаЬ (мкг/мл) или соединение I (мкМ) (анти-НЕКЗаЬ + соединение I5 соединение I (мкМ)
МКМ-45 СМЕТ + НЕКЗ- сверх >10 0, 05 0, 47
Влияние соединения I и гефитиниба на опухолевые клеточные линии.
Гефитиниб является селективным ингибитором НЕК1. Гефитиниб сам по себе не очень активен в двух испытываемых опухолевых клеточных линиях и проявляет умеренную активность в линии опухоли головы и шеи ЗСС15. Комбинация соединения I и гефитиниба проявляет синергизм в ингибировании клеточного роста, как свидетельствуют СК0,9 и/или анализ ЕОНЗА, в клеточных линиях опухолей легкого, головы и шеи, представленных в табл. 9.
Таблица 9
Влияние комбинации соединения I и гефитиниба на ингибирование клеточного роста при постоянном молярном соотношении 1:1 на клеточных линиях опухолей легкого, головы и шеи
Клеточные линии СМЕТ НЕК амп. + Среднее ГС^о (мкМ) N=2 Эффект комбинации
Гефитиниб Гефитиниб или соединение 1 (лапатиниб + соединение υ Соединение I С1 е 1С,О
-нсг + НСГ -нсг + НСГ -нсг + НСГ -нсг + НСГ
легкого _К1648 сМЕТ + Нет 10,2 8 >10 0,18 0,12 0, 85 0, 62 0, 15 НС
легкого _Н1573 СМЕТ + НЕК1 + >10 >10 0,52 0,37 1,75 1/12 НС НС
г. ш. _5СС15 сМЕТ- сверх НЕК1 + 1,21 5, 44 0, 10 0,12 0,67 0,82 0, 25 0, 17
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективных количеств:
    а) соединения формулы I или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения; и
    - 15 020779 (Ь) ингибитора ЕгЬВ, который ингибирует рецептор ЕгЬВ-1, или ЕгЬВ-2, или ЕгЬ-3, или их комбинацию;
    причем опухолевая клетка указанного рака высоко экспрессирует ЛХЕ.
  2. 2. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой соединение формулы II или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.
  3. 3. Способ по п.2, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой дитозилатную соль или моногидрат дитозилатной соли соединения формулы II.
  4. 4. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой соединение формулы III или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения.
  5. 5. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой соединение формулы IV
  6. 6. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой трастузумаб.
  7. 7. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой цетуксимаб.
  8. 8. Способ по п.1, где ингибитор ЕгЬВ представляет собой моноклональное антитело против человеческого ЕгЬВ-3.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, где рак представляет собой рак желудка, легкого, пищевода, головы и шеи, кожи, эпидермиса, яичников или молочной железы.
EA201071268A 2008-05-05 2009-05-05 СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРА cMET И AXL И ИНГИБИТОРА ErbB EA020779B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5032208P 2008-05-05 2008-05-05
PCT/US2009/042768 WO2009137429A1 (en) 2008-05-05 2009-05-05 Method of treating cancer using a cmet and axl inhibitor and an erbb inhibitor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201071268A1 EA201071268A1 (ru) 2011-06-30
EA020779B1 true EA020779B1 (ru) 2015-01-30

Family

ID=41257222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201071268A EA020779B1 (ru) 2008-05-05 2009-05-05 СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРА cMET И AXL И ИНГИБИТОРА ErbB

Country Status (19)

Country Link
US (3) US20090274693A1 (ru)
EP (1) EP2274304A4 (ru)
JP (1) JP2011519941A (ru)
KR (1) KR20110004462A (ru)
CN (1) CN102083824A (ru)
AR (1) AR071631A1 (ru)
AU (1) AU2009244453B2 (ru)
BR (1) BRPI0912582A2 (ru)
CA (1) CA2723699A1 (ru)
CL (1) CL2009001063A1 (ru)
EA (1) EA020779B1 (ru)
IL (1) IL209057A0 (ru)
MX (1) MX2010012101A (ru)
PE (1) PE20091832A1 (ru)
SG (1) SG190623A1 (ru)
TW (1) TW201006829A (ru)
UY (1) UY31800A (ru)
WO (1) WO2009137429A1 (ru)
ZA (1) ZA201007722B (ru)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3173084B1 (en) 2005-11-11 2019-10-23 Boehringer Ingelheim International GmbH Quinazoline derivatives for the treatment of cancer diseases
TWI447108B (zh) 2009-01-16 2014-08-01 Exelixis Inc Ｎ－（４－｛〔６，７雙（甲氧基）喹啉－４－基〕氧基｝苯基）－ｎ’－（４－氟苯基）環丙烷－１，１－二甲醯胺之蘋果酸鹽及其結晶型
HUE025726T2 (en) 2009-03-25 2016-04-28 Genentech Inc Anti-FGFR3 antibodies and their use
US9545381B2 (en) 2009-07-06 2017-01-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Process for drying of BIBW2992, of its salts and of solid pharmaceutical formulations comprising this active ingredient
AR077595A1 (es) * 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
WO2011014872A2 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 The Johns Hopkins University Compositions and methods for diagnosing, treating or preventing neoplasias
UA108618C2 (uk) 2009-08-07 2015-05-25 Застосування c-met-модуляторів в комбінації з темозоломідом та/або променевою терапією для лікування раку
EP2896632B1 (en) * 2009-11-13 2017-10-25 Daiichi Sankyo Europe GmbH Material and methods for treating or preventing HER-3 associated diseases
PL2593090T3 (pl) 2010-07-16 2022-02-21 Exelixis, Inc. Kompozycje farmaceutyczne modulatora c-Met
BR112013004012B1 (pt) 2010-08-20 2021-03-23 Novartis Ag Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor her3, seu uso e composição farmacêutica
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
ES2754973T5 (es) 2010-09-27 2023-03-13 Exelixis Inc Inhibidores duales de MET y VEGF para el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración y metástasis óseas osteoblásticas
SG10201510086VA (en) * 2010-12-23 2016-01-28 Nestec Sa Drug selection for malignant cancer therapy using antibody-based arrays
CN102532109B (zh) * 2010-12-27 2015-05-13 浙江海正药业股份有限公司 一种拉帕替尼及其盐的合成方法
CN102093421B (zh) * 2011-01-28 2014-07-02 北京康辰药业有限公司 一种含磷取代基的喹啉类化合物及其制备方法、以及含有该化合物的药物组合物及其应用
KR20210147117A (ko) 2011-02-10 2021-12-06 엑셀리시스, 인코포레이티드 퀴놀린 화합물들의 제조 방법들 및 상기 화합물들을 함유하는 약학 조성물들
US20120252840A1 (en) 2011-04-04 2012-10-04 Exelixis, Inc. Method of Treating Cancer
GEP201706678B (en) * 2011-05-02 2017-06-12 Exelixis Inc Method of treating cancer and bone cancer
EP2758057B1 (en) 2011-09-22 2017-05-31 Exelixis, Inc. Method for treating osteoporosis
BR112014009302B1 (pt) 2011-10-20 2020-04-28 Exelis Inc Us/Us processo para preparar derivados de quinolina
AU2012339640B2 (en) 2011-11-14 2017-01-05 Ignyta, Inc. Uracil derivatives as AXL and c-MET kinase inhibitors
EP3590538A1 (en) * 2011-12-05 2020-01-08 Novartis AG Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
TWI594986B (zh) 2011-12-28 2017-08-11 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Antineoplastic agent effect enhancer
HUE031624T2 (en) 2012-01-31 2017-07-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Pyridone derivative
US9861624B2 (en) 2012-05-02 2018-01-09 Exelixis, Inc. Method of treating cancer
CN103664879A (zh) * 2012-09-17 2014-03-26 杨育新 一类治疗创伤性脑损伤疾病的化合物及其用途
CN103705521A (zh) * 2012-09-28 2014-04-09 韩冰 一类治疗脑梗塞的化合物及其用途
WO2014093750A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Glaxosmithkline Llc Method of administration and treatment
UA119321C2 (uk) 2013-03-15 2019-06-10 Екселіксіс, Інк. Метаболіти n-(4-{[6,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл]окси}феніл)-n'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксаміду
KR102060540B1 (ko) 2013-04-03 2019-12-31 삼성전자주식회사 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
ES2927651T3 (es) 2013-04-04 2022-11-10 Exelixis Inc Forma de dosificación de cabozantinib y uso en el tratamiento del cáncer
TWI649308B (zh) * 2013-07-24 2019-02-01 小野藥品工業股份有限公司 喹啉衍生物
WO2015057545A2 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cysteine engineered fibronectin type iii domain binding molecules
CN113425727A (zh) 2014-02-04 2021-09-24 安斯泰来制药株式会社 以二氨基杂环甲酰胺化合物为有效成分的医药组合物
CA3181899A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Exelixis, Inc. Crystalline solid forms of n-{4-[(6,7-dimethoxyquinolin-4-yl)oxy]phenyl}-n'-(4-fluorophenyl) cyclopropane-1,1-dicarboxamide, processes for making, and methods of use
JP6666849B2 (ja) 2014-03-17 2020-03-18 エグゼリクシス， インコーポレイテッド カボザンチニブ製剤の投与
ES2768900T3 (es) * 2014-04-03 2020-06-24 Merck Patent Gmbh Combinaciones de agentes terapéuticos contra cáncer
KR102223502B1 (ko) 2014-05-09 2021-03-05 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR/항 Her3 다중 특이 항체 및 이의 이용
TWI723572B (zh) 2014-07-07 2021-04-01 日商第一三共股份有限公司 具有四氫吡喃基甲基之吡啶酮衍生物及其用途
WO2016019285A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Exelixis, Inc. Method of preparing fluorine-18 labeled cabozantinib and its analogs
CA2957466C (en) 2014-08-05 2023-10-17 Exelixis, Inc. Drug combinations to treat multiple myeloma
WO2016104617A1 (ja) 2014-12-25 2016-06-30 小野薬品工業株式会社 キノリン誘導体
FR3039401B1 (fr) * 2015-07-31 2018-07-13 Les Laboratoires Servier Nouvelle association entre le 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione et un inhibiteur de la tyr kinase du egfr
CN106467541B (zh) * 2015-08-18 2019-04-05 暨南大学 取代喹诺酮类衍生物或其药学上可接受的盐或立体异构体及其药用组合物和应用
CA3020749A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Exelixis, Inc. Method of treating renal cell carcinoma using n-(4-(6,7-dimethoxyquinolin-4-yloxy) phenyl)-n'-(4-fluoropheny)cyclopropane-1,1-dicarboxamide, (2s)-hydroxybutanedioate
EP3471750A4 (en) 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES
CN107235896B (zh) * 2016-09-13 2019-11-05 上海翔锦生物科技有限公司 酪氨酸激酶抑制剂及其应用
CN107235897B (zh) * 2016-09-27 2019-08-16 上海翔锦生物科技有限公司 酪氨酸激酶抑制剂及其应用
CA3046963A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
US10597438B2 (en) 2016-12-14 2020-03-24 Janssen Biotech, Inc. PD-L1 binding fibronectin type III domains
WO2018111978A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
WO2018139527A1 (ja) 2017-01-26 2018-08-02 小野薬品工業株式会社 キノリン誘導体のエタンスルホン酸塩
CA3053739C (en) 2017-02-15 2023-02-14 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical composition
WO2019074116A1 (ja) 2017-10-13 2019-04-18 小野薬品工業株式会社 Ａｘｌ阻害剤を有効成分として含む固形がん治療剤
CN113292537B (zh) 2018-06-15 2024-04-05 汉达癌症医药责任有限公司 激酶抑制剂的盐类及其组合物
CN113710322A (zh) * 2019-01-25 2021-11-26 埃克塞里艾克西斯公司 用于治疗激酶依赖性病症的化合物
US11781138B2 (en) 2019-10-14 2023-10-10 Aro Biotherapeutics Company FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof
WO2021076546A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Cd71 binding fibronectin type iii domains
CN115073367A (zh) * 2021-03-16 2022-09-20 南京科默生物医药有限公司 一种用作axl抑制剂的抗肿瘤化合物及其用途
BR112023021325A2 (pt) 2021-04-14 2023-12-19 Aro Biotherapeutics Company Domínios de fibronectina tipo iii de ligação a cd71

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030140A2 (en) * 2003-09-26 2005-04-07 Exelixis, Inc. C-met modulators and methods of use
US20080058312A1 (en) * 2006-01-11 2008-03-06 Angion Biomedica Corporation Modulators of hepatocyte growth factor/c-Met activity

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002056912A2 (en) * 2001-01-16 2002-07-25 Glaxo Group Limited Pharmaceutical combination for the treatment of cancer containing a 4-quinazolineamine and another anti-neoplastic agent
ITRM20030475A1 (it) * 2003-10-15 2005-04-16 Sipa Societa Industrializzazione P Rogettazione E Impianto e metodo per il condizionamento termico di oggetti
UA96139C2 (ru) * 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитело к нейропилину-1 (nrp1)
CN101370519B (zh) * 2005-12-15 2013-07-24 阿斯利康(瑞典)有限公司 治疗癌症的促血管生成素-2拮抗剂和VEGF-A、KDR和/或Flt1拮抗剂的组合
WO2008076415A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Exelixis, Inc. Methods of using mek inhibitors
US8715665B2 (en) * 2007-04-13 2014-05-06 The General Hospital Corporation Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
EP2158215B1 (en) * 2007-05-17 2015-04-22 Genentech, Inc. Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes
WO2009017838A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Exelixis, Inc. Combinations of jak-2 inhibitors and other agents
ES2569215T3 (es) * 2007-09-10 2016-05-09 Boston Biomedical, Inc. Un nuevo grupo de inhibidores de la ruta de Stat3 e inhibidores de la ruta de las células madre del cáncer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030140A2 (en) * 2003-09-26 2005-04-07 Exelixis, Inc. C-met modulators and methods of use
US20070054928A1 (en) * 2003-09-26 2007-03-08 Exelixis, Inc. c-Met modulators and methods of use
US20080058312A1 (en) * 2006-01-11 2008-03-06 Angion Biomedica Corporation Modulators of hepatocyte growth factor/c-Met activity

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GlaxoSmithKline, via its Centre Of Excellence for External Drug Discovery, exercises its options to further develop and commercialise Exelixis' anti-cancer C-Met inhibitior XL880, 14.12.2007, [Найдено 18.05.2011], Найдено из Интернет:, с. 1-3 *
Новые противоопухолевые препараты, Провизор, 2004, вып. 19 [Найдено 18.05.2011], Найдено из Интернет:, c. 1-7 *
РЛС. Энциклопедия лекарств. - М.: РЛС-2007, 2006, с. 886 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009137429A1 (en) 2009-11-12
BRPI0912582A2 (pt) 2015-07-28
UY31800A (es) 2009-11-10
CL2009001063A1 (es) 2010-09-24
MX2010012101A (es) 2010-11-30
US20130142790A1 (en) 2013-06-06
SG190623A1 (en) 2013-06-28
AU2009244453B2 (en) 2012-07-19
CA2723699A1 (en) 2009-11-12
TW201006829A (en) 2010-02-16
US20090274693A1 (en) 2009-11-05
JP2011519941A (ja) 2011-07-14
EP2274304A1 (en) 2011-01-19
PE20091832A1 (es) 2009-12-25
CN102083824A (zh) 2011-06-01
EA201071268A1 (ru) 2011-06-30
KR20110004462A (ko) 2011-01-13
EP2274304A4 (en) 2012-05-30
ZA201007722B (en) 2011-08-31
AU2009244453A1 (en) 2009-11-12
IL209057A0 (en) 2011-01-31
AR071631A1 (es) 2010-06-30
US20130150363A1 (en) 2013-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020779B1 (ru) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРА cMET И AXL И ИНГИБИТОРА ErbB
WO2020130125A1 (ja) 抗体－薬物コンジュゲートとキナーゼ阻害剤の組み合わせ
Mendelsohn et al. The EGF receptor family as targets for cancer therapy
US11202779B2 (en) Combinations for the treatment of neoplasms using quiescent cell targeting with EGFR inhibitors
CN103533961A (zh) 以表皮生长因子受体为靶向的治疗癌症的组合方法
EA018717B1 (ru) Антитело или фрагмент антитела, которое связывается с белком ron человека, и его применение
US20240299388A1 (en) Erk1/2 and shp2 inhibitors combination therapy
JP2013501808A (ja) アポトーシスを促進し、かつ転移を阻害する方法
JP2022027658A (ja) チロシンキナーゼ阻害剤と併用してｅｇｆ／ｅｇｆｒ経路を抑制する方法および組成物
US20140056910A1 (en) Therapeutic agent for cancer having reduced sensitivity to molecular target drug and pharmaceutical composition for enhancing sensitivity to molecular target drug
US20230233540A1 (en) Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
US20220323470A1 (en) Composition and use thereof in the manufacture of medicament for treating cancer
US20220354874A1 (en) Therapeutic compositions and methods for treating cancers
CN115814104A (zh) 抗体药物偶联物制剂及其用途
WO2024209717A1 (ja) 腫瘍治療用医薬組成物
CN118434422A (zh) 抗体-药物缀合物和rasg12c抑制剂的组合
CN117379551A (zh) 一种肿瘤联合治疗疗法
KR101658593B1 (ko) Pi4k 동위효소 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물
TW202227450A (zh) 以縮合嘧啶化合物作為有效成分之腦移行性腫瘤治療劑

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU