ES2569215T3 - Un nuevo grupo de inhibidores de la ruta de Stat3 e inhibidores de la ruta de las células madre del cáncer - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende (i) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-acetil-7-cloronafto[ 2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2- etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]éster del ácido fosfórico, y 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil éster dimetil éster del ácido fosfórico, y una de sus sales farmacéuticamente aceptables o solvatos, y (ii) un excipiente, vehículo o diluyente para su uso para inhibir una célula madre del cáncer para tratar un cáncer en el que se ha descubierto la presencia de células madre del cáncer y la presencia de una actividad aberrante de la ruta de Stat3, en un sujeto que lo necesite, en la que el excipiente, vehículo o diluyente comprende: un lípido seleccionado del grupo que consiste en un fosfolípido, fosfatidilcolina sintética, fosfatidilcolina natural, esfingomielina, ceramida, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, colesterol, sulfato de colesterol, y lípidos conjugados con haptenos y polietilenglicol (PEG) para la administración intravenosa; o un material ceroso seleccionado del grupo que consiste en mono-, di- o triglicéridos, mono- o diésteres de ácidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con PEG, y Gelucire para la administración oral; o el excipiente, vehículo o diluyente está en una forma seleccionada del grupo que consiste en una emulsión micelar, una suspensión, y una suspensión de nanopartículas, y comprende además albúmina humana para la administración intravenosa.

Description

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DESCRIPCION

Un nuevo grupo de inhibidores de la ruta de Stat3 e inhibidores de la ruta de las celulas madre del cancer Campo de la invencion

La presente descripcion se refiere, en general, al uso de inhibidores de la ruta de Stat3 para tratar trastornos. De modo mas espedfico, la descripcion se refiere al uso de inhibidores de la ruta de Stat3 para dirigirse a celulas madre del cancer y para tratar otros trastornos. De modo aun mas espedfico, la descripcion se refiere al uso de nafto[2,3- b]furan-4,9-diona y otros compuestos relacionados para inhibir a Stat3, para dirigirse a celulas madre del cancer y para tratar enfermedades malignas. La descripcion tambien se refiere a un tratamiento para canceres refractarios, recurrentes o metastasicos, y a procesos para preparar los compuestos pertinentes y sus intermedios, y a una composicion farmaceutica de los compuestos pertinentes.

Antecedentes de la invencion

Celulas madre del cancer (“cancer stem cells", CSC)

En estos ultimos anos, un nuevo modelo de tumorigenesis ha conseguido una amplia aceptacion, en el que se establece como hipotesis que solo una pequena fraccion de la masa tumoral completa es responsable de las actividades tumorigencias dentro del tumor, mientras que el antiguo modelo o modelo genetico clonal postula que todas las celulas tumorales mutadas contribuyen por igual a dichas actividades tumorigenicas. Esta pequena fraccion de celulas tumorigenicas, segun el nuevo modelo, son celulas transformadas con cualidades similares a las celulas madre y se denominan “celulas madre del cancer (CSC). Bonnet y Dick fueron los primeros en demostrar, in vivo, la presencia de CSC en la leucemia mieloide aguda (AML) durante los anos 90 del pasado siglo. Sus datos demuestran que solo una pequena subpoblacion de celulas de AML humana tienen la capacidad de transferir la AML cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes, mientras que otras celulas de AML fueron incapaces de inducir leucemia. Mas adelante se demostro que estas CSC tienen los mismos marcadores celulares, CD34+/CD38-, que las celulas madre hematopoyeticas primitivas [1]. Desde entonces, los investigadores han descubierto CSC de modo concluyente en diversos tipos de tumores, que incluyen tumores de cerebro, mama, piel, prostata, etc.

El modelo de CSC de la tumorigenesis explicana por que es necesario inyectar decenas o centenares de miles de celulas tumorales en un animal experimental para establecer un trasplante de tumor. En la AML humana, la frecuencia de estas celulas es menor de 1 en 10.000 [2]. Aunque son infrecuentes dentro de una poblacion concreta de celulas tumorales, cada vez existen mas pruebas de que estas celulas existen en casi todos los tipos de tumor. Sin embargo, puesto que las lmeas de celulas del cancer se seleccionan de una subpoblacion de celulas del cancer que estan espedficamente adaptadas para crecer en un cultivo de tejidos, las propiedades biologicas y funcionales de las lmeas de celulas del cancer pueden sufrir cambios drasticos. Por tanto, no todas las lmeas de celulas del cancer contienen CSC.

Las celulas madre del cancer comparten muchos rasgos similares con las celulas madre normales. Por ejemplo, las CSC tienen capacidad de autorrenovacion, concretamente, la capacidad para generar otras celulas madre del cancer tumorigenicas, generalmente a una velocidad menor que otras celulas tumorales en division, en oposicion a un numero limitado de divisiones. Las CSC tambien tienen la capacidad de diferenciarse en multiples tipos de celulas, lo cual explicana las pruebas histologicas de que no solo muchos tumores contienen multiples tipos de celulas nativas al organo hospedante, sino que tambien que su heterogeneidad normalmente se mantiene en las metastasis tumorales. Las CSC han demostrado ser fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la reaparicion del cancer. Las CSC tambien se denominan celulas iniciadores del cancer, celulas similares a celulas madre del cancer, celulas del cancer similares a celulas madre, celulas altamente tumorigenicas, celulas madre de tumores, celulas madre de tumores solidos o celulas supermalignas.

La existencia de celulas madre del cancer tiene implicaciones fundamentales en los futuros tratamientos y terapias contra el cancer. Estas implicaciones se manifiestan en la identificacion de la enfermedad, un transporte dirigido selectivo del farmaco, la prevencion de la recurrencia y la metastasis del cancer, y el desarrollo de nuevas estrategias en la lucha contra el cancer.

La eficacia de los actuales tratamientos del cancer a menudo se mide, en los estadios iniciales de ensayo, mediante el tamano del encogimiento del tumor, es decir, la cantidad de masa tumoral que muere. Puesto que las CSC constituyen una proporcion muy pequena del tumor y tienen unas caractensticas biologicas muy diferentes de sus progenies mas diferenciadas, la medicion de la masa tumoral no refleja necesariamente los farmacos que actuan de modo espedfico sobre las celulas madre. De hecho, las celulas madre del cancer parecen ser resistentes a la radioterapia (XRT) y tambien son refractarias a los farmacos quimioterapeuticos y de transporte dirigido [3-5]. Las celulas madre somaticas normales son naturalmente resistentes a agentes quimioterapeuticos: presentan diversas bombas (tales como MDR) que bombean los farmacos hacia el exterior, y presentan protemas de reparacion del ADN. Ademas, tambien presentan una velocidad lenta de recambio celular, mientras que los agentes quimioterapeuticos se dirigen a celulas de replicacion rapida. Las celulas madre del cancer, puesto que son los homologos mutados de las celulas madre normales, tambien pueden tener mecanismos similares que las permitan sobrevivir a las terapias con farmacos y al tratamiento con radiacion. En otras palabras, las quimioterapias y

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radioterapias convencionales destruyen a las celulas diferenciadas o en diferenciacion, que forman la mayor parte del tumor y son incapaces de generar nuevas celulas madre del cancer altamente tumorigenicas. Por otra parte, la poblacion de celulas madre del cancer que genera las celulas diferenciadas y en diferenciacion pueden permanecer intactas y provocar una recafda de la enfermedad. Otro peligro con respecto a la terapia anticancer convencional es la posibilidad de que el tratamiento quimioterapeutico deje solo a las celulas madre del cancer resistentes a la quimioterapia, y es probable que el consiguiente tumor recurrente tambien sea resistente a la quimioterapia.

Puesto que las celulas madre del cancer supervivientes pueden repoblar el tumor y provocar una recafda, es imprescindible que las terapias anticancer incluyan estrategias contra las CSC (vease la figura 1). Esto resulta similar a eliminar las rafces para evitar que los dientes de leon vuelva a crecer aunque se haya cortado la masa de las hierbas a nivel del suelo [6]. Mediante el ataque selectivo a las celulas madre del cancer se pueden tratar pacientes con tumores agresivos inoperables y canceres refractarios o recurrentes, asf como prevenir la recurrencia y la metastasis tumoral. El desarrollo de terapias espedficas que se dirigen a las celulas madre del cancer puede mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cancer, en especial los que padecen canceres metastasicos. La clave para utilizar este potencial sin explotar es la identificacion y la validacion de rutas que sean selectivamente importantes para la supervivencia y la autorrenovacion de las celulas madre del cancer. Por desgracia, aunque en el pasado se han elucidado multiples rutas que subyacen a la tumorigenesis del cancer o la autorrenovacion en celulas madre embrionarias y de adulto, no se han identificado y validado rutas para la autorrenovacion y la supervivencia de las celulas madre del cancer.

Tambien se han realizado muchas investigaciones dirigidas a la identificacion y el aislamiento de celulas madre del cancer. Los metodos empleados principalmente aprovechan la capacidad de las CSC para efluir farmacos, o se basan en la expresion de marcadores de la superficie asociados con las celulas madre del cancer.

Por ejemplo, puesto que las CSC son resistentes a muchos agentes quimioterapeuticos, no resulta sorprendente que las CSC sobreexpresen, de modo casi ubicuo, bombas de eflujo de farmacos, tales como ABCG2 (BCRP-1) [711], y otros miembros de la superfamilia del modulo de union a ATP (ABC) [12, 13]. Por consiguiente, la tecnica de las celulas satelite (“side population”, SP), que originariamente se empleo para enriquecer en celulas madre hematopoyeticas y leucemicas, tambien se ha empleado para identificar y aislar CSC [14]. Esta tecnica, descrita por primera vez por Goodell et al., aprovecha el eflujo dependiente del transportador de ABC diferencial de tintes fluorescentes, tales como Hoechst 33342, para definir y aislar una poblacion celular enriquecida en CSC [10, 15]. De modo espedfico, las SP se revelan bloqueando el eflujo del farmaco con verapamilo, en cuyo momento los tintes ya no pueden ser expulsados de las SP.

Los investigadores tambien se han centrado en descubrir marcadores espedficos que distingan a las celulas madre del cancer de la masa del tumor. Los marcadores de la superficie que son expresados con mas frecuencia por las celulas madre del cancer incluyen CD44, CD133 y CD166 [16-22]. La clasificacion de las celula tumorales basandose principalmente en la expresion diferencial de estos marcadores de la superficie ha sido responsable de la mayona de las CSC altamente tumorigenicas descritas hasta la fecha. Por tanto, estos marcadores de la superficie estan correctamente validados para la identificacion y el aislamiento de celulas madre del cancer procedentes de lmeas celulares de cancer y de la masa de los tejidos tumorales.

Ruta de Stat3

Existen muchos defectos geneticos diferentes en celulas de cancer humano o de mairnfero, y muchos se han estudiado en la busqueda de una cura para el cancer. Por ejemplo, se ha descubierto que el supresor tumoral p53 es defectuoso o esta ausente en mas de la mitad de los canceres humanos. La familia de protemas STAT (“Signal Transducers and Activator of Transcription”, transductores de senales y activadores de la transcripcion) son factores de la transcripcion latentes que se activan en respuesta a citoquinas/factores del crecimiento para estimular la proliferacion, la supervivencia y otros procesos biologicos. Entre estos, Stat3 es activado por la fosforilacion de un resto tirosina cntico mediada por tirosina quinasas del receptor del factor del crecimiento, quinasas Jano o las quinasas de la familia Src, etc. Estas quinasas incluyen, pero no se limitan a EGFR, JAK, Abl, KDR, c-Met, Src, y Her2 [23]. Despues de la fosforilacion de la tirosina, Stat3 forma homodfmeros, se transloca al nucleo, se une a elementos de respuesta al ADN espedficos en las regiones de promotores de los genes diana, e induce la expresion genica [24].

En las celulas normales, la activacion de Stat3 es transitoria y esta fuertemente regulada, y dura de 30 minutos a varias horas. Sin embargo, se ha descubierto que Stat3 permanece aberrantemente activa en una amplia diversidad de canceres humanos, que incluyen todos los carcinomas principales, asf como algunos tumores hematologicos. Stat3 desempena multiples papeles en el avance del cancer. Como es un potente regulador de la transcripcion, se dirige a genes implicados en muchas funciones celulares importantes, tales como Bcl-xl, c-Myc, ciclina D1, Vegf, MMP-2, y survivina [25-30]. Tambien es un regulador negativo clave de la vigilancia inmunologica del tumor y del reclutamiento de celulas inmunologicas [31-33].

La ablacion de la senalizacion de Stat3 mediante ARNsi antisentido, una forma dominante negativa de Stat3 y/o el bloqueo de las tirosina quinasas inhibe ciertas lmeas celulares de cancer o tumores in vitro y/o in vivo [24, 26, 34, 35]. Pero no se ha establecido, de modo empmco, una conexion clara entre Stat3 y la funcionalidad de las celulas

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madre del cancer. Los investigadores tampoco han descubierto un inhibidor de la ruta de Stat3 eficaz para explorar los usos terapeuticos potenciales con respecto a los canceres en los que se ha descubierto la existencia de celulas madre del cancer. Tal como se describio anteriormente, las celulas madre del cancer (CSC) recientemente han demostrado ser fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis y la reaparicion, y deben tomarse en cuenta cuando se disene cualquier terapia curativa que se dirija a un tumor en el que se han descubierto estas celulas, sin tener en cuenta el pequeno tamano de la fraccion que constituyen dentro de la masa tumoral.

En otras enfermedades distintas del cancer se ha demostrado la sobreactivacion de Stat3 por la interleuquina 6 (IL6) en una serie de enfermedades autoinmunologicas e inflamatorias [36]. En fechas recientes, se ha demostrado que la ruta de Stat3 tambien estimula respuestas inmunologicas patologicas a traves de su papel fundamental en la generacion de respuestas de celulas T TH17 [37]. Ademas, se ha descubierto que la inflamacion mediada por la ruta de Stat3-IL6 es el origen causal comun para la aterosclerosis, la enfermedad vascular periferica, la enfermedad de la arteria coronaria, la hipertension, la osteoporosis, la diabetes de tipo 2 y la demencia.

Sumario

La presente invencion se basa, en parte, en las pruebas empmcas proporcionadas en la presente de que Stat3 desempena un papel clave en la capacidad de supervivencia y de autorrenovacion de las celulas madre del cancer (CSC) a lo largo de un amplio espectro de canceres. Por consiguiente, un primer aspecto de la descripcion se dirige a un metodo para inhibir una celula madre del cancer, en el que dicho metodo comprende inhibir al menos una parte, la mayona o sustancialmente toda (por ejemplo, 30%, 40%, 5o%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%) de la actividad de la ruta de Stat3 en una celula pluripotencial del cancer mediante un inhibidor de la ruta de Stat3. El metodo inhibe la autorrenovacion de las CSC o mata a las CSC. El metodo puede realizarse in vitro o in vivo para tratar un cancer, en especial canceres que presentan CSC y que presentan actividades aberrantes de la ruta de Stat3, por ejemplo, actividades sobreactivas. Estos dos criterios pueden satisfacerse en virtud del conocimiento institucional, es decir, si se ha descubierto que el cancer del paciente contiene CSC y presenta actividades aberrantes de la ruta de Stat3, o pueden confirmarse en el paciente individual, por ejemplo, a traves de ensayos realizados sobre una biopsia. En una realizacion preferida, se sabe o se ha confirmado que las CSC poseen actividades aberrantes de la ruta de Stat3.

Los canceres en los que, en la actualidad, se ha descubierto que contienen CSC y actividades aberrantes de la ruta de Stat3 incluyen, pero no se limitan a cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, melanoma, sarcoma, cancer hepatico, tumores cerebrales, mieloma multiple y leucemia. Tambien se ha descubierto que muchas de las formas metastasicas de estos canceres contienen CSC y actividades aberrantes de la ruta de Stat3, tales como el cancer de mama metastasico. En una caractenstica, los metodos de la presente descripcion pueden practicarse para tratar un cancer seleccionado de este grupo. En una realizacion, los metodos de la descripcion pueden practicarse para curar un cancer seleccionado de los siguientes: cancer de pulmon, cancer de mama, cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer hepatico, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico y cancer de prostata.

Ademas, puesto que las CSC han demostrado ser fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la recurrencia del cancer, los metodos de la descripcion pueden practicarse para tratar un cancer que sea metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, inherentemente resistente a la quimioterapia, o que haya recurrido en un sujeto despues de un tratamiento inicial. En una realizacion, el inhibidor de la ruta de Stat3 se afsla, purifica o sintetiza, y puede seleccionarse del grupo que consiste en un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor de Stat3 peptidomimetico, y un inhibidor de Stat3 oligodesoxinucleotfdico de cuarteto-G. El mecanismo de la inhibicion puede seleccionarse del grupo que consiste en inhibir sustancialmente la fosforilacion de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la dimerizacion de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la translocacion nuclear de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la actividad de union al ADN de la protema Stat3, e inhibir sustancialmente las actividades de transcripcion de la protema Stat3.

La presente invencion proporciona una composicion que comprende (i) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3- b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2- il)vinil]ester del acido fosforico, y 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una de sus sales farmaceuticamente aceptables o solvatos, y (ii) un excipiente, vehmulo o diluyente para su uso para inhibir una celula madre del cancer para tratar un cancer en el que se ha descubierto la presencia de celulas madre del cancer y la presencia de una actividad aberrante de la ruta de Stat3, en un sujeto que lo necesite, en la que el excipiente, vehmulo o diluyente comprende:

un lfpido seleccionado del grupo que consiste en un fosfolfpido, fosfatidilcolina sintetica, fosfatidilcolina natural, esfingomielina, ceramida, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, acido fosfatfdico, colesterol, sulfato de colesterol, y lfpidos conjugados con haptenos y polietilenglicol (PEG) para la administracion intravenosa; o

un material ceroso seleccionado del grupo que consiste en mono-, di- o trigliceridos, mono- o diesteres de acidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con pEg, y Gelucire para la administracion oral; o

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el excipiente, vehfculo o diluyente esta en una forma seleccionada del grupo que consiste en una emulsion micelar, una suspension, y una suspension de nanopartfculas, y comprende ademas albumina humana para la administracion intravenosa.

El inhibidor es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2- acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9- diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico, y 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, un enantiomero, diastereomero, tautomero, y una de sus sales o solvatos (denominado en los sucesivo en la presente el “compuesto de la invencion”).

En un segundo aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir la actividad de la ruta de Stat3 celular. El metodo incluye administrar a la celula una cantidad eficaz del compuesto de la invencion, de modo que al menos se reduce la actividad de la ruta de Stat3 no deseada, por ejemplo, en al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%. En una realizacion, la celula es una cSc, o es cancerosa. El metodo puede inducir la muerte celular o inhibir la autorrenovacion en la celula. El metodo puede realizarse in vitro o in vivo.

En un tercer aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar o prevenir un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta de Stat3 en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion, de modo que al menos se reduce una actividad aberrante de la ruta de Stat3. En una caractenstica, la actividad aberrante de la ruta de Stat3 puede identificarse mediante la expresion de Stat3 fosforilada o un regulador sustituto corriente arriba o abajo de la fosforilacion de Stat3. El trastorno puede ser un cancer. En una realizacion, se ha descubierto que el cancer presenta actividades aberrantes de la ruta de Stat3, e incluye, pero no se limita a: cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, cancer cervical, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas. El trastorno tambien puede ser un trastorno no canceroso que se haya descubierto que este asociado con una actividad aberrante de la ruta de Stat3 y, en una realizacion, se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad autoinmunologica, una enfermedad inflamatoria, enfermedades intestinales inflamatorias, artritis, trastorno de desmielinacion autoinmunologico, enfermedad de Alzheimer, lesiones por reperfusion tras isquemia, y esclerosis multiple.

En un cuarto aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar a un paciente, e incluye las etapas de identificar un paciente mediante una actividad aberrante de la ruta de Stat3, y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion. En una realizacion, la etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta de Stat3 comprende ensayar la expresion de Stat3 fosforilada, o un regulador sustituto corriente arriba o abajo de la fosforilacion de Stat3. La etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta de Stat3 comprende ensayar un fluido o tejido enfermo tomado del paciente, que puede ser parte de un tumor.

En un quinto aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar a un paciente, e incluye las etapas de identificar un paciente diagnosticado con un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta de Stat3, y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion. En una realizacion, la etapa de identificar al paciente comprende ensayar al menos un biomarcador que indique el trastorno en el paciente.

En un sexto aspecto, la presente descripcion proporciona un kit que incluye al menos un agente para diagnosticar un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta de Stat3, que puede ser ensayar un biomarcador que indique la presencia del trastorno, y una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion.

En un septimo aspecto, la presente descripcion proporciona un kit que incluye al menos un agente para diagnosticar una actividad aberrante de la ruta de Stat3, y una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion. En una realizacion, el agente ensaya la expresion de Stat3 fosforilada o un regulador sustituto corriente arriba o abajo de la fosforilacion de Stat3.

En un octavo aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir una o mas celulas madre del cancer. El metodo incluye administrar a la celula madre del cancer una cantidad eficaz del compuesto de la invencion. El metodo puede realizarse in vitro o in vivo para tratar un cancer en un sujeto. En una realizacion, se ha descubierto que el cancer contiene CSC, e incluye, pero no se limita a cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, cancer hepatico, melanoma, mieloma multiple, tumores cerebrales, sarcoma, meduloblastoma y leucemia. En una realizacion, el cancer es metastasico. En otra realizacion, el cancer es refractario a una quimioterapia o radioterapia. Por ejemplo, el cancer puede ser inherentemente resistente a la quimioterapia. En otra realizacion, el cancer ha recurrido en un sujeto despues de un tratamiento inicial.

En un noveno aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para identificar un candidato a farmaco capaz de inhibir una celula madre del cancer, comprendiendo dicho metodo seleccionar un candidato a farmaco que inhiba

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la actividad de la ruta de Stat3. El candidate a farmaco, en una realizacion, es capaz de inducir la muerte celular en la celula madre del cancer, y en otra realizacion, de inhibir la autorrenovacion de la CSC. En diversas realizaciones, el candidato a farmaco es un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor de Stat3 peptidomimetico, o un inhibidor de Stat3 oligodesoxinucleotfdico de cuarteto-G. El candidato a farmaco puede tener una capacidad seleccionada de las siguientes: inhibe sustancialmente la fosforilacion de la protema Stat3, inhibe sustancialmente la dimerizacion de la protema Stat3, inhibe sustancialmente la translocacion nuclear de la protema Stat3, inhibe sustancialmente la actividad de union al ADN de la protema Stat3, e inhibe sustancialmente las actividades de transcripcion de la protema Stat3.

En un decimo aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar a un sujeto para un cancer refractario a un tratamiento convencional, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion. El tratamiento convencional puede ser, por ejemplo, una quimioterapia, una radioterapia y/o cirugfa. En una realizacion, el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia.

En un undecimo aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar o prevenir la recafda de un cancer en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugfa.

En un duodecimo aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar o prevenir la metastasis de un cancer en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugfa.

En un decimotercer aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para dirigirse selectivamente a celulas del cancer en un sujeto, por ejemplo, para tratar una enfermedad maligna, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion, de modo que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion cntica durante mas de 24 horas despues de cada dosis, matando con ello selectivamente a las celulas del cancer y al mismo tiempo no afectando a las celulas normales. Como alternativa, segun el metodo de la invencion, la concentracion plasmatica del compuesto no es mayor que la concentracion cntica en un momento concreto despues de cada dosis, por ejemplo, 12, 16, 20 o 24 horas. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administrar de modo que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion cntica, por ejemplo, continuamente, durante mas de una duracion de tiempo seleccionada del grupo que consiste en 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis. En diversas realizaciones, la concentracion cntica es aproximadamente 100 |iM, aproximadamente 50 |iM, aproximadamente 30 |iM, o aproximadamente 20 |iM. En una realizacion, las celulas del cancer son parte de un cancer seleccionado del grupo, o de cualquier de sus subgrupos, que consiste en cancer hepatico, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer esofagico, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer endometrial, cancer de tiroide, cancer de los conductos biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de la vesteula biliar, cancer de la pituitaria, cancer rectal, cancer de las glandulas salivares, cancer nasofarmgeo, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, neuroblastoma, cancer de cervix, leucemia, melanoma, epidermoide oral, cancer de queratinocitos y de piel. En otra realizacion, las celulas del cancer son parte de un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de mama (que incluye el tipo metastasico), cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer de tegado, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico y cancer de prostata.

En un decimocuarto aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar un cancer en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion. Los metodos segun este aspecto de la invencion pueden aplicarse a tratar un cancer similar a los descritos con respecto a los aspectos previos de la invencion. En una caractenstica, el sujeto del tratamiento es un marnffero, por ejemplo, un ser humano.

En un decimoquinto aspecto, la presente descripcion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion, es decir, un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)- nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro- nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una de sus sales farmaceuticamente aceptables o solvatos, y un excipiente, vehteulo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una caractenstica, la composicion es adecuada para la administracion oral, nasal, topica, rectal, vaginal o parenteral, o para una inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

En un decimosexto aspecto, la presente descripcion tambien proporciona un proceso para preparar algunos de los compuestos de la invencion. El metodo prepara un compuesto de formula 4-6,

imagen1

en el que Ri es H, Cl o F, haciendo reaccionar un compuesto de formula 4-4,

imagen2

con una cetona en un disolvente en presencia de una base y un agente oxidante. El agente oxidante puede ser, por 5 ejemplo, O2, Br2, o CBrCl3. En una realizacion, la reaccion se realiza en un recipiente abierto. En una caractenstica, todas las etapas del proceso se realizan en el mismo espacio, es decir, en el mismo recipiente. En diversos ejemplos de realizaciones, el disolvente puede ser tetrahidrofurano (THF), dioxano o tolueno, y la base puede ser 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), trietilamina, o diisopropiletilamina.

En una realizacion del anterior proceso, la cetona es un compuesto de formula 4-3:

imagen3

(4-3)

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El anterior proceso puede incluir tambien las siguientes etapas: hacer reaccionar un compuesto de formula 4-1,

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con bromuro con o sin un disolvente, para producir un compuesto de formula 4-2,

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y despues hacer reaccionar el compuesto de formula 4-2 en un disolvente en presencia de una base, para producir el compuesto de formula 4-3:

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(4-3)

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En un decimoseptimo aspecto, la presente descripcion proporciona un compuesto con dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico.

En un decimoctavo aspecto, la presente descripcion proporciona un compuesto con 3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico.

En un decimonoveno aspecto, la presente descripcion proporciona un proceso para preparar el compuesto mono-[1- (4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico, comprendiendo dicho proceso hacer reaccionar el compuesto 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona con una disolucion seleccionada del grupo que consiste en bis(trimetilsilil)amida de litio, bis(trimetilsilil)amida de sodio, y bis(trimetilsilil)amida de potasio, seguido de la adicion de una disolucion de clorofosfato de dimetilo. El proceso puede comprender tambien purificar un producto bruto obtenido a partir de la reaccion disolviendo el producto en CH2Cl2, lavandolo con NH4Cl saturado y agua, secandolo sobre MgSO2, y despues haciendo pasar el producto a traves de una columna de cromatograffa.

En un vigesimo aspecto, la presente descripcion proporciona un proceso para preparar el compuesto1-(4,9-dioxo- 3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, comprendiendo dicho proceso hacer reaccionar el compuesto mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico con bromuro de trimetilsililo. El proceso puede comprender tambien purificar un producto bruto obtenido a partir de la reaccion mediante HPLC semipreparativa.

Otros aspectos y realizaciones de la presente invencion se indican a continuacion o seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 ilustra las diferencias entre las terapias del cancer convencionales y espedficas de celulas madre del cancer.

La figura 2 muestra la ruta de Stat3 en el cancer.

La figura 3A demuestra que Stat3 esta constitutivamente activa en las celulas satelite de Hoechst.

La figura 3B demuestra que Stat3 esta constitutivamente activa en celulas CD133+.

Las figuras 4A y 4B demuestran que la inactivacion de Stat3 en celulas madre del cancer induce la apoptosis.

La figura 5 demuestra que la inactivacion de Stat3 en celulas madre del cancer inhibe la esferogenesis de las celulas madre del cancer.

La figura 6 demuestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de activacion de la transcripcion de Stat3.

La figura 7A demuestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de union al ADN de Stat3 en un extracto nuclear.

La figura 7B demuestra que los compuestos 401, 416 y 418 inhiben la actividad de union al ADN de Stat3 en un extracto nuclear.

La figura 8A demuestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de union al ADN de Stat3 en tejidos de tumor de xenoinjerto.

La figura 8B demuestra que el compuesto 401 inhibe el nivel de expresion de los efectos corriente abajo de Stat3 en tejidos de tumor de xenoinjerto.

La figura 9A muestra la clasificacion y el analisis de las celulas satelite de Hoechst.

La figura 9B demuestra que las celulas satelite de Hoechst son tan sensibles como las celulas que no son satelite frente al compuesto 401.

La figura 10A demuestra que el compuesto 401 es apoptotico para las celulas satelite de Hoechst.

La figura 10B demuestra que el compuesto 401 es apoptotico para las celulas CD133+.

La figura 11 demuestra que el compuesto 401 bloquea la formacion de esferas de CD44high.

La figura 12 demuestra que un tratamiento in vivo con el compuesto 401 disminuye la esferogenesis de las celulas de tumor xenoinjertadas.

La figura 13 demuestra que el compuesto 401 induce la apoptosis en celulas de cancer.

La figura 14 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico humano y que se comporta de una manera diferente a la quimioterapia convencional, puesto que abole

la formula de mono-[1-(4,9- la formula de 1-(4,9-dioxo-

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el rebote tumoral.

La figura 15 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer de cabeza y cuello humano.

La figura 16 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer de mama humano.

La figura 17 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer de prostata humano.

La figura 18 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer gastrico humano.

La figura 19 demuestra que el compuesto 401 muestra actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto de cancer hepatico humano.

La figura 20 demuestra que el compuesto 401 inhibe la metastasis en el modelo ISMS.

La figura 21 muestra la farmacocinetica del compuesto 401 en ratas.

Descripcion detallada

Tal como se emplean en la presente, las formas en singular “un/una” y “el/la” incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresion “una celula” incluye una pluralidad de celulas e incluye sus mezclas.

Los terminos “aislado” y “purificado”, tal como se emplean en la presente, se refieren a un material que esta sustancial o fundamentalmente exento de los componentes que normalmente lo acompanan en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad generalmente se determinan empleando tecnicas qrnmicas analfticas, tales como una electroforesis en gel de poliacrilamida o una cromatograffa lfquida de alta resolucion.

Tal como se emplean en la presente, la expresion “celula o celulas madre del cancer” y el termino “CSC” son intercambiables. Las CSC son de marnffero y, en realizaciones preferidas, estas CSC son de origen humano, pero no se pretende que se limiten a estas. Las celulas madre del cancer se definen y se caracterizan funcionalmente como una poblacion de celulas que surgen de un tumor solido que: (1) tienen una gran capacidad proliferativa; (2) son capaces de realizar una division celular asimetrica para generar uno o mas tipos de progenie diferenciada con menor potencial proliferativo o para desarrollarse; y (3) son capaces de realizar divisiones celulares simetricas para la autorrenovacion o el automantenimiento. Otras estrategias habituales para caracterizar a las CSC implican la morfologfa y el estudio de los marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional, y la respuesta a farmacos. En la bibliograrta cienrtfica, las CSC tambien se denominan celulas iniciadoras de tumor/cancer, celulas similares a celulas madre del cancer, celulas del cancer similares a celulas madre, celulas altamente tumorigenicas, celulas madre de tumores, celulas madre de tumores solidos, celulas supervivientes a farmacos (DSC), celulas resistentes a farmacos (DRC) o celulas supermalignas.

Tal como se emplea en la presente, el termino “autorrenovacion” se refiere a la capacidad de las celulas madre del cancer para generar nuevas celulas madre del cancer tumorigenicas para reponer o para aumentar su numero.

Tal como se emplean en la presente, los terminos “cancer” y “canceroso” se refieren o describen el trastorno fisiologico en mamfferos en el que una poblacion de celulas se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Las “celulas del cancer” y las “celulas del tumor”, tal como se emplean en la presente, se refieren a la poblacion total de celulas derivadas de un tumor, que incluyen las celulas no tumorigenicas, que comprenden la mayor parte de la poblacion de celulas tumorales, y las celulas madre tumorigenicas (celulas madre del cancer). Los ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos mas concretos de estos canceres incluyen el cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microdtico, cancer de pulmon no microdtico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma escamoso de pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer hepatico, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rinon, cancer de Idgado, cancer de prostata, cancer vulval, cancer de tiroide, carcinoma hepatico y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello.

Un “tumor”, tal como se empela en la presente, se refiere a cualquier masa de tejido se resulta de un excesivo crecimiento o proliferacion celular, tanto benigno (no canceroso) como maligno (canceroso), que incluye las lesiones precancerosas.

La “metastasis”, tal como se emplea en la presente, se refiere al proceso mediante el cual un cancer se extiende o se traslada desde el sitio de origen hacia otras regiones del cuerpo, con el desarrollo de una lesion cancerosa similar en la nueva localizacion. Una celula “metastasica” o “metastatizante” es una celula que pierde los contactos adhesivos con las celulas vecinas y migra a traves de la corriente sangumea o la linfa desde el sitio primario de la

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enfermedad para invadir estructuras corporales vecinas.

Tal como se emplea en la presente, el termino “sujeto” se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mairnfero) que incluye, pero no se limita a seres humanos, primates no humanos, roedores y similares, que sera el receptor de un tratamiento concreto. Generalmente, los terminos “sujeto” y “paciente” se emplean de modo intercambiable en la presente en referencia a un sujeto humano.

Los terminos tales como “tratar” o “tratamiento” o “aliviar” o las expresiones “para tratar” o “para aliviar”, tal como se emplean en la presente, se refieren 1) a medidas terapeuticas que curan, frenan, disminuyen los smtomas y/o detienen el avance de una afeccion o trastorno patologico diagnosticado, y 2) a medidas profilacticas o preventivas que evitan o frenan el desarrollo de la afeccion o trastorno patologico que se quiere tratar. Asf, los sujetos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno; los propensos a padecer el trastorno; y aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. Un sujeto se “trata” con exito segun los metodos de la presente descripcion si el paciente presenta uno o mas de los siguientes: una reduccion en el numero o la ausencia completa de celulas del cancer; una reduccion en el tamano tumoral; la inhibicion o la ausencia de infiltracion de celulas del cancer hacia organos perifericos, que incluye la propagacion del cancer hacia tejidos blandos y hueso; la inhibicion o la ausencia de metastasis tumoral; la inhibicion o la ausencia de crecimiento tumoral; el alivio de uno o mas smtomas asociados con el cancer espedfico; una menor morbilidad y mortalidad; y una mejora en la calidad de vida.

Tal como se emplean en la presente, las expresiones “que inhibe”, “para inhibir” y sus equivalentes gramaticales, cuando se emplean en el contexto de una bioactividad, se refieren a la infrarregulacion de la bioactividad, que puede reducir o eliminar la funcion que se quiere tratar, tal como la produccion de una protema o la fosforilacion de una molecula. En realizaciones concretas, la inhibicion puede referirse a una reduccion de aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% de la actividad que se quiere tratar. Cuando se emplean en el contexto de un trastorno o una enfermedad, las expresiones se refieren al exito en la prevencion de la aparicion de los smtomas, el alivio de los smtomas, o la eliminacion de la enfermedad, afeccion o trastorno.

La expresion “excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable”, tal como se emplea en la presente, significa un material, composicion o vehmulo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante lfquido o solido, implicado en el transporte del agente farmaceutico concreto desde un organo o porcion del cuerpo hacia otro organo o porcion del cuerpo. Cada vehmulo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden actuar como vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen: azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua apirogena; disolucion salina isotonica; disolucion de Ringer; alcohol etflico; disolucion de tampon fosfato; y otras sustancias no toxicas compatibles empleadas en las formulaciones farmaceuticas. En las composiciones tambien pueden estar presentes agentes humectantes, emulgentes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio, estearato de magnesio y copolfmero de oxido de polietileno-oxido de polipropileno, asf como agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.

Los compuestos de la presente invencion pueden formar sales que tambien estan dentro del alcance de esta invencion. En la presente, se entiende que la referencia a un compuesto de la presente invencion incluye la referencia a sus sales, a menos que se indique lo contrario. El termino “sal” (o “sales”), tal como se emplea en la presente, indica sales acidas y/o basicas formadas con acidos y bases inorganicos y/u organicos. Ademas, cuando un compuesto de la presente invencion contiene un resto basico, tal como una piridina o imidazol, y un resto acido, tal como, pero sin limitarse a acido carboxflico, pueden formarse iones bipolares (“sales internas”) y se incluyen dentro del termino “sal” (o “sales”), tal como se emplea en la presente. Se prefieren las sales farmaceuticamente aceptables (es decir, no toxicas, fisiologicamente aceptables), aunque otras sales tambien son utiles, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificacion, en las que pueden emplearse durante la preparacion. Las sales de los compuestos de la presente invencion pueden formarse, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto I, II o III con una cantidad de acido o base, tal como con una cantidad equivalente, en un medio, tal como un medio en el que la sal precipita o en un medio acuoso, seguido de una liofilizacion.

En la presente tambien se contemplan los solvatos de los compuestos de la invencion. Los solvatos de los compuestos de la presente invencion incluyen, por ejemplo, los hidratos.

Estudios recientes han descubierto la presencia de celulas madre del cancer (CSC) con una capacidad exclusiva para regenerar tumores. Estas CSC existen en casi todos los tipos de tumores y estan relacionadas funcionalmente con el crecimiento maligno continuado, la metastasis, la recurrencia y la resistencia a farmacos del cancer. Las CSC y sus progenies mas diferenciadas parecen tener caractensticas biologicas notablemente diferentes. Las selecciones convencionales de farmacos para el cancer dependen de la medicion de la cantidad de masa tumoral y,

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por tanto, no reflejan necesariamente los farmacos que actuan de modo espedfico sobre las CSC. De hecho, se ha demostrado que las CSC son resistentes a las quimioterapias y la radioterapia convencionales, y que cada vez aparecen mas enriquecidas despues de los tratamientos anticancer convencionales, lo cual provoca la recurrencia y que el cancer sea refractario. Los metodos para aislar estas celulas incluyen, pero no se limitan a la identificacion de su capacidad para efluir Hoechst 33342, la identificacion mediante los marcadores de la superficie que expresan estas celulas, tales como CD133, CD44, CD166 y otros, y el enriquecimiento segun su propiedad tumorigenica. Las pruebas cada vez mayores que relacionan a las celulas madre del cancer con la tumorigenesis descubren la enorme oportunidad terapeutica de dirigirse a las celulas madre del cancer.

La clave para utilizar este potencial sin explotar es la identificacion y la validacion de rutas que sean selectivamente importantes para la supervivencia y la autorrenovacion de las CSC. Aunque en el pasado se han elucidado multiples rutas que subyacen a la tumorigenesis en el cancer y en celulas madre embrionarias o celulas madre de adulto, no se han identificado y validado rutas para la autorrenovacion y la supervivencia de las CSC.

La presente descripcion proporciona pruebas de que la actividad de la ruta de Stat3 resulta cntica para la supervivencia y la autorrenovacion de las CSC (ejemplo 1). La presente descripcion tambien proporciona compuestos que son inhibidores eficaces de las actividades de la ruta de Stat3 (ejemplo 2). La presente descripcion tambien proporciona datos in vitro e in vivo de que estos inhibidores de Stat3 inhiben la autorrenovacion de las CSC y son apoptoticos para las CSC (ejemplo 3). La presente descripcion tambien demuestra que estos compuestos pueden matar selectivamente un amplio espectro de celulas del cancer in vitro (ejemplo 4) e inhiben una gama similarmente amplia de canceres in vivo (ejemplo 5). Ademas, la presente descripcion confirma empmcamente la eficacia de los inhibidores de Stat3 contra un cancer metastasico (ejemplo 6). Ademas, la presente descripcion confirma empmcamente que estos compuestos pueden lograr una exposicion PK deseada para la destruccion selectiva de celulas del cancer in vivo (ejemplo 7).

Los datos proporcionados en la presente, combinados con recientes descubrimientos en la investigacion de las CSC, permiten a la presente descripcion proporcionar una serie de metodos dirigidos a inhibir las CSC, o tratar canceres que presentan CSC de modo espedfico, o tratar canceres en general. En la presente tambien se proporcionan metodos dirigidos a inhibir la actividad de la ruta de Stat3 en celulas o tratar trastornos cancerosos y no cancerosos, que esten asociados con unas actividades aberrantes de la ruta de Stat3. La presente descripcion tambien proporciona metodos relacionados (por ejemplo, fabricacion y seleccion de candidatos a farmaco), materiales, composiciones y kits.

Con el descubrimiento de que la infrarregulacion o el bloqueo de la ruta de Stat3 inhibe la autorrenovacion y la supervivencia de las CSC (ejemplo 1), la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir las celulas madre del cancer, en el que al menos una parte de la actividad de la ruta de Stat3 en las CSC se inhibe a traves de un inhibidor de la ruta de Stat3. En una realizacion, la mayona, es decir, mas del 50% de la actividad de la ruta de Stat3 se inhibe. En otra realizacion, sustancialmente toda la actividad de la ruta de Stat3 se inhibe. El metodo puede evitar que las CSC se autorrenueven, de modo que ya no puedan reponer su numero dividiendose para producir celulas CSC tumorigenicas, o el metodo puede inducir la muerte celular en CSC.

Este metodo puede utilizarse parar tratar el cancer de un sujeto. Los canceres en los que se han descubierto CSC y actividades aberrantes (por ejemplo, sobreactivas o constitutivamente activas) de la ruta de Stat3 son buenos candidatos para este tratamiento, e incluyen, pero no se limitan a cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, cancer cervical, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas. En una realizacion, el metodo se emplea para tratar canceres hepaticos, canceres de cabeza y cuello, canceres pancreaticos y/o canceres gastricos. En otra realizacion, el metodo se emplea para tratar el mieloma multiple, tumores cerebrales y sarcomas.

Ademas, puesto que las CSC han demostrado ser fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la reaparicion del cancer, puede practicarse cualquier metodo de la descripcion dirigido a la inhibicion de las CSC para tratar un cancer que sea metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, o que haya recurrido en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

En una realizacion, el inhibidor se afsla, purifica o sintetiza, y puede seleccionarse del grupo que consiste en un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor de Stat3 peptidomimetico, y un inhibidor de Stat3 oligodesoxinucleotfdico de cuarteto-G. El inhibidor tambien puede aislarse o purificarse a partir de un producto natural.

El mecanismo de la inhibicion puede seleccionarse para dirigirse a cualquier etapa en la ruta de Stat3. Por ejemplo, el inhibidor puede inhibir sustancialmente la fosforilacion de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la dimerizacion de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la translocacion nuclear de la protema Stat3, inhibir sustancialmente la actividad de union al ADN de la protema Stat3 y/o inhibir sustancialmente las actividades de transcripcion de la protema Stat3. Como alternativa, el inhibidor de la ruta de Stat3 puede inhibir uno o mas componentes corriente arriba o abajo en la ruta de Stat3.

La ruta de Stat3 puede activarse en respuesta a citoquinas, tales como IL-6, o por una serie de tirosina quinasas, tales como EGFR, JAK, Abl, KDR, c-Met, Src, y Her2. Los efectores corriente abajo de Stat3 incluyen, pero no se limitan a Bcl-xl, c-Myc, ciclina D1, Vegf, MMP-2, y survivina (figura 2). La ruta de Stat3 se encuentra aberrantemente activa en una amplia diversidad de enfermedades humanas, tal como se muestra en la tabla 1. Las muestras clmicas 5 existentes estudiadas demuestran que aparece una ruta de Stat3 persistentemente activa en mas de la mitad de los canceres de mama y pulmon, carcinomas hepatocelulares, mielomas multiples y mas del 95% de los canceres de cabeza y cuello. Tambien se ha demostrado una Stat3 activada en una serie de enfermedades autoinmunologicas e inflamatorias. Ademas, puesto que la inflamacion mediada por citoquinas, tales como la interleuquina 6, es el origen causativo habitual de la aterosclerosis [38], la enfermedad vascular periferica [39, 40], la enfermedad de la arteria 10 coronaria [39, 40], la hipertension [41], la osteoporosis [42], la diabetes de tipo 2 [39] y la demencia [43], y que la ruta gp130-Jak-Stat es la ruta principal activada por IL-6, la inhibicion de la ruta de Stat3 tambien puede prevenir estas enfermedades.

Tabla 1 - Activacion de la ruta de Stat3 en enfermedades humanas

ENFERMEDADES

REF.

Cancer de mama [44]

Cancer de cabeza y cuello (SCCHN) [45]

Cancer de pulmon [46]

Cancer de ovario [47]

Cancer pancreatico [48]

Carcinoma colorrectal [49]

Cancer de prostata [50]

Tumores solidos Carcinoma de celulas renales [51]

Melanoma [52]

Carcinomas hepatocelulares [34]

Cancer cervical [53]

Cancer endometrial [53]

ENFERMEDADES ONCOLOGICAS

Sarcomas [54, 55]

Tumores cerebrales [56]

Canceres gastricos [27]

Mieloma multiple [57]

Leucemia dependiente de HTLV-1 [58]

Leucemia Leucemia mielogenosa cronica [51]

Leucemia mielogenosa aguda [59]

Tumores hematologicos Leucemia de linfocitos granulares grandes [60]

Linfoma de Burkitt/relacionado con EBV [61]

Micosis fungoides [51]

Linfomas Dependiente de Saimiri HSV (celulas T) [51]

Linfoma de celulas T cutaneo [62]

Enfermedad de Hodgkin [51]

Linfoma de celulas grandes anaplasico [63]

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Enfermedades del intestino inflamatorias [64]

Enfermedades inflamatorias Artritis inflamatoria [65-67]

Enfermedades de Crohn [68]

Trastornos inflamatorios cronicos [69]

ENFERMEDADES INMUNOLOGICAS

Autoinmunologicas Artritis reumatoide [65, 66, 7072]

Lupus eritematoso sistemico [73]

Asma [74]

Alergia [75]

Infecciones [76]

Psoriasis [77]

TRASTORNOS PROLIFERATES

Queloides [78]

Verrugas

[79]

Smdrome mielodisplasico [80]

Policitemia vera [81]

ENFERMEDADES DEL SNC

Enfermedad de Alzheimer [36, 82, 83]

Esclerosis multiples (MS)

[36, 82, 84]

En una realizacion, el inhibidor de Stat3 segun la presente descripcion es: 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9- diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3- b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2- il)vinil]ester del acido fosforico, y 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, un enantiomero, diastereomero, tautomero, y una de sus sales o solvatos (el “compuesto de la invencion”) (ejemplo 2). La presente descripcion tambien proporciona datos in vitro e in vivo que indican que el compuesto de la invencion inhibe la autorrenovacion de las CSC e induce la apoptosis en CSC (ejemplo 3).

Despues de proporcionar pruebas de que la infrarregulacion de la ruta de Stat3 inhibe las CSC, la presente descripcion proporciona un metodo para identificar un candidato a farmaco capaz de inhibir una celula madre del cancer. El metodo comprende seleccionar un candidato a farmaco que inhiba la actividad de la ruta de Stat3. En diversas realizaciones, el candidato a farmaco es un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor de Stat3 peptidomimetico, o un inhibidor de Stat3 oligodesoxinucleotidico de cuarteto-G.

En una realizacion, el candidato a farmaco es capaz de inducir la muerte celular en CSC o al menos inhibir su autorrenovacion. Se pueden emplear diversas fases en la ruta para la seleccion del candidato a farmaco. Por ejemplo, diversas realizaciones del metodo pueden seleccionar candidatos a farmaco que inhiban sustancialmente la fosforilacion de la protema Stat3, que inhiban sustancialmente la dimerizacion de la protema Stat3, que inhiban sustancialmente la translocacion nuclear de la protema Stat3, que inhiban sustancialmente las actividades de union al ADN de la protema Stat3, o que inhiban sustancialmente las actividades de transcripcion de la protema Stat3.

Tal como demuestra el siguiente ejemplo 2, el compuesto de la invencion inhibe la actividad de transcripcion de Stat3 y la actividad de union al aDn de Stat3 in vitro. El ejemplo 2 tambien demuestra que el compuesto de la invencion inhibe in vivo la expresion de los efectores corriente abajo de Stat3 (por ejemplo, ciclina D1 y survivina) y la actividad de union al ADN de Stat3.

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir la actividad de la ruta de Stat3 celular, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto de la invencion. En otro aspecto, el compuesto de la invencion puede utilizarse para formular una composicion farmaceutica para tratar o prevenir trastornos o afecciones asociados con actividades aberrantes de la ruta de Stat3. En la presente, un trastorno se considera “asociado con” actividades aberrantes de la ruta de Stat3 si un paciente que padece el trastorno, que puede ser un subtipo dentro de un tipo de trastorno, generalmente presenta, en al menos algunas de las celulas del paciente, una actividad aberrante de la ruta de Stat3 que puede contribuir, pero no necesariamente, a la patologfa

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del trastorno. Algunos de los trastornos en los que se han descubierto actividades aberrantes de la ruta de Stat3 incluyen, pero no se limitan a enfermedades autoinmunologicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades del intestino inflamatorias, artritis, trastorno de desmielinacion autoinmunologico, enfermedad de Alzheimer, ictus, lesiones por reperfusion tras isquemia, y esclerosis multiple. Algunos de los trastornos que se ha descubierto que estan asociados con actividades aberrantes de la ruta de Stat3 son canceres, e incluyen, pero no se limitan a diversos tipos de canceres de mama, canceres de cabeza y cuello, canceres de pulmon, canceres de ovario, canceres pancreaticos, carcinoma colorrectal, canceres de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, canceres cervicales, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas.

Con relacion a este aspecto de la descripcion, se proporciona un kit que incluye uno o mas agentes para diagnosticar un trastorno asociado con actividades aberrantes de la ruta de Stat3, y una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion u otro inhibidor eficaz de la ruta de Stat3. El agente de diagnostico puede ser cualquier reactivo adecuado dependiendo del trastorno sospechoso, y puede incluir agentes necesarios para extraer una muestra de sangre, tomar una biopsia, seleccionar una biomolecula (por ejemplo, un antfgeno o un anticuerpo), o extraer informacion genetica de una muestra. El agente puede incluir un disolvente, un detergente, un anticoagulante, un antfgeno, un anticuerpo, una enzima, un cebador de PCR, etc.

Tanto si un paciente ha sido diagnosticado con un trastorno del cual se ha descubierto que implica una actividad aberrante de Stat3 como si no ha sido diagnosticado, un medico siempre puede ordenar que se realice un ensayo para comprobar si existe una actividad aberrante de Stat3 en una muestra de biopsia tomada del paciente. Por tanto, se proporciona un kit que incluye: uno o mas agentes para diagnosticar actividades aberrantes de la ruta de Stat3, y una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la invencion u otro inhibidor eficaz de la ruta de Stat3. En una caractenstica, la actividad aberrante de la ruta de Stat3 puede identificarse a traves de cualquier medio analftico adecuado para estudiar cualquier indicio de dicha actividad, por ejemplo, expresion (nivel, duracion, etc.) de la Stat3 fosforilada o de un regulador sustituto corriente arriba o abajo de la fosforilacion de Stat3. De modo similar al kit descrito previamente, el agente de diagnostico puede ser cualquier reactivo adecuado dependiendo de los indicios de la actividad aberrante de la ruta de Stat3 que se esten analizando en el ensayo.

Tal como demuestra el siguiente ejemplo 3, el compuesto de la invencion, que es al menos un inhibidor de la ruta de Stat3, mata a las celulas madre del cancer. El ejemplo 3 tambien demuestra que el compuesto de la invencion tambien inhibe la esferogenesis de CSC, una indicacion del exito de la inhibicion de la autorrenovacion de las CSC, tanto in vitro como in vivo.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir las celulas madre del cancer, en el que se administra a las celulas una cantidad eficaz del compuesto de la invencion. Los canceres en los que se han descubierto CSC son buenos candidatos para dichos tratamientos, e incluyen, pero no se limitan a diversos tipos de canceres de mama, canceres de cabeza y cuello, canceres de pulmon, canceres de ovario, canceres pancreaticos, carcinoma colorrectal, canceres de prostata, canceres hepaticos, melanoma, mieloma multiple, tumores cerebrales, sarcomas, meduloblastoma y leucemia.

Ademas, puesto que se ha demostrado que las CSC son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la reaparicion del cancer, puede practicarse cualquier metodo de la descripcion dirigido a inhibir las CSC para tratar un cancer que sea metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, o que haya recurrido en el sujeto despues de un tratamiento inicial. El siguiente ejemplo 6 espedficamente ensaya in vivo la eficacia antimetastasis del compuesto de la invencion, y los datos demuestran una reduccion significativa en el numero de focos tumorales primarios y la metastasis del dgado espontanea.

En el siguiente ejemplo 4, no solo se demuestra que el compuesto de la invencion provoca la apoptosis en un amplio espectro de celulas del cancer, sino que tambien muestra selectividad en su citotoxicidad, lo cual resulta cntico para desarrollar nuevos productos terapeuticos de baja toxicidad. La citotoxicidad selectiva, tal como se emplea en la presente, se refiere a la capacidad de un compuesto para matar a las celulas del cancer y al mismo tiempo no afectar sustancialmente a las celulas normales, a veces bajo ciertas condiciones. Las celulas normales habitualmente se refieren a las celulas sanas no tumorigenicas. Las condiciones que producen una citotoxicidad selectiva para un candidato a farmaco son diffciles de predecir, porque requieren el conocimiento del mecanismo subyacente de la citotoxicidad. Por ejemplo, la disminucion de la toxicidad de un farmaco anticancer que se dirige a la formacion de microtubulos durante la mitosis presenta factores muy diferentes con los que trabajar que un farmaco que bloquee procesos metabolicos celulares. Una condicion que sea adecuada para engendrar una citotoxicidad selectiva debe equilibrarse con la necesidad de que el farmaco sea lo suficientemente toxico como para matar a las celulas del cancer de modo eficaz y sea lo suficientemente tolerable para las celulas normales. Por ejemplo, si se emplea una concentracion menor, esto a menudo significa una infusion prolongada para poder matar a las celulas del cancer.

A partir de los datos generados en los ejemplos de esta descripcion, que incluyen los que aparecen en el ejemplo 4, parece que puede lograrse una citotoxicidad selectiva para el compuesto de la invencion si las celulas afectadas no se exponen a una concentracion cntica del compuesto continuamente mas alla de cierta duracion de tiempo. En un metodo dirigido a matar selectivamente a las celulas del cancer en un sujeto, una composicion farmaceutica que

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contenga el compuesto de la invencion se administra al sujeto, de modo que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantenga por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas despues de cada dosis. Este metodo puede utilizarse para tratar todos los canceres, incluyendo cualquiera de los grupos de canceres descritos en la presente, y para tratar un trastorno asociado a Stat3, habiendose proporcionado una lista ejemplar anteriormente y por tanto no es necesario repetir. Como alternativa, la duracion de tiempo puede restringirse aun mas hasta 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis. La concentracion cntica para cada compuesto puede variar. En diversas realizaciones de la presente invencion, la concentracion cntica es aproximadamente 100 |iM, aproximadamente 50 |iM, aproximadamente 30 |iM o aproximadamente 20 |iM.

En una realizacion del metodo, el cancer que se esta tratando se selecciona del siguiente grupo: cancer hepatico, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, cancer de prostata metastasico, leucemia, linfoma, cancer esofagico, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer endometrial, cancer de tiroide, cancer de los conductos biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de la vesfcula biliar, cancer de la pituitaria, cancer rectal, cancer de las glandulas salivares, y cancer nasofanngeo.

En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para tratar un cancer en un sujeto, en el que se administra al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion. El cancer puede ser metastasico. El sujeto puede ser un mairnfero, por ejemplo, un ser humano.

Para cualquiera de los metodos para tratar un sujeto descritos en la presente, la presente descripcion proporciona unos intervalos de dosificacion eficaces, frecuencias de dosificacion y concentraciones plasmaticas de los compuestos. En diversas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra a una dosificacion: (a) de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 5.000 mg/m2 (IV), o de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 50.000 mg/m2 (PO); (b) de aproximadamente 2 mg/m2 a aproximadamente 3.000 mg/m2 (IV), o de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 50.000 mg/m2 (PO). En diversas realizaciones, el compuesto de la presente invencion puede administrarse en dfas alternos (Q2D), a diario (QD) o dos veces diarias (BID). En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra por ruta oral y no mas de cuatro veces diarias (QID).

En una caractenstica, la composicion farmaceutica se administra al sujeto de modo que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion cntica durante mas de 24 horas (o 12, 16 y 20 horas) despues de cada dosis. Segun otras realizaciones de la invencion, la concentracion plasmatica del compuesto no es mayor que la concentracion cntica en un momento concreto despues de cada dosis, por ejemplo, 12, 16, 20 o 24 horas, como un regimen que evita la toxicidad no selectiva. En diversas realizaciones de la presente invencion, la concentracion cntica es de aproximadamente 100 |iM, aproximadamente 50 |iM, aproximadamente 30 |iM o aproximadamente 20 |iM. Las composiciones, en ciertos casos, se afslan, purifican o sintetizan.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la invencion, y un excipiente, vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una caractenstica, la composicion es adecuada para la administracion oral, nasal, topica, rectal, vaginal o parenteral, o para una inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

Las formulaciones de la presente descripcion incluyen las que son adecuadas para la administracion oral, nasal, topica (que incluye bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse de modo conveniente en forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica farmaceutica. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material vehfculo para producir una forma de dosificacion unitaria variara dependiendo del mamffero que se esta tratando y de la ruta de administracion concreta. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehfculo para producir una forma de dosificacion unitaria, generalmente sera la cantidad del compuesto que produce un efecto terapeutico. En general, con respecto al 100%, esta cantidad variara, por ejemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% de ingrediente activo, de aproximadamente 5% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%.

Las composiciones o formulaciones terapeuticas de la descripcion adecuadas para la administracion oral pueden estar en forma de capsulas, sellos, pfldoras, comprimidos, pastillas para chupar (utilizando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto), polvos, granulos, o como una disolucion o una suspension en un lfquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion lfquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga) y/o como colutorios y similares, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del compuesto de la invencion como ingrediente activo. El compuesto de la invencion tambien puede administrarse como una inyeccion en embolada, electuario o pasta.

En las formas de dosificacion solidas de la descripcion para la administracion oral (capsulas, comprimidos, pfldoras, grageas, polvos, granulos y similares), el compuesto de la invencion se mezcla con uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o cualquiera de los siguientes:

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cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido siKcico; ligantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arabiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o de tapioca, acido algmico, ciertos silicatos, carbonato de calcio, y almidon glicolato de sodio; agentes que retrasan la disolucion, tales como parafina; aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetflico, monoestearato de glicerol y copolfmero de oxido de polietileno-oxido de polipropileno; absorbentes, tales como caolm y arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio y sus mezclas; y agentes colorantes. En el caso de las capsulas, los comprimidos y las pfldoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones solidas de tipo similar tambien pueden emplearse como cargas en capsulas de gelatina blanda y dura, utilizando excipientes tales como lactosa o azucares de la leche, asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas de dosificacion lfquidas para la administracion oral del compuesto de la invencion incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabe y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del ingrediente activo, las formas de dosificacion lfquidas pueden contener diluyentes inertes que habitualmente se emplean en la tecnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulgentes, tales como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodon, cacahuete, mafz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfunlico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitano, y sus mezclas. Ademas pueden emplearse ciclodextrinas, por ejemplo, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, para solubilizar los compuestos.

Ademas de diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulgentes y suspensores, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones, ademas de uno o mas compuestos de la invencion, pueden contener agentes suspensores tales como, por ejemplo, alcoholes isoesteanlicos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y sus mezclas.

Las formulaciones de las composiciones farmaceuticas de la descripcion para la administracion rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o mas compuestos de la invencion, con uno o mas excipientes o vehfculos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un salicilato, y que sean solidos a temperatura ambiente, pero lfquidos a la temperatura corporal y, por tanto, se fundiran en el recto o la cavidad vaginal y liberaran los agentes farmaceuticos activos de la invencion. Las formulaciones de la presente descripcion que son adecuadas para la administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en forma de pulverizado que contengan dichos vehfculos, tal como se conocen en la tecnica como adecuados.

Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de una composicion segun la descripcion incluyen polvos, pulverizados, unguentos, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones esteriles con un veldculo farmaceuticamente aceptable, y con los conservantes, tampones o propelentes necesarios.

Los unguentos, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas del compuesto de la invencion, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de la celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silfcico, talco y oxido de cinc, o sus mezclas.

Los polvos y los pulverizados pueden contener, ademas de un compuesto de esta invencion, excipientes, tales como lactosa, talco, acido silfcico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizados tambien pueden contener propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volatiles, tales como butano y propano.

Tambien se contemplan las formulaciones oftalmicas, los unguentos oculares, polvos, disoluciones y similares, como incluidas en el alcance de esta descripcion.

Las composiciones farmaceuticas de esta descripcion adecuadas para la administracion parenteral comprenden uno o mas compuestos segun la invencion, en combinacion con una o mas disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles farmaceuticamente aceptables, o polvos esteriles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, solutos, que hagan que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor previsto, o agentes suspensores o espesantes.

En algunos casos, para prolongar el efecto de la composicion segun la descripcion, resulta deseable frenar su absorcion por el cuerpo despues de una inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspension lfquida de un material cristalino o amorfo que tenga poca solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del farmaco entonces depende de su velocidad de disolucion que, a su vez, puede depender del tamano de los cristales y la forma cristalina. Como alternativa, la absorcion retrasada de una composicion administrada por

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ruta parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehmulo oleoso. Una estrategia para las inyecciones depot (de liberacion lenta) incluye el uso de copoKmeros de oxido de polietileno-oxido de polipropileno, en las que el vehmulo es fluido a temperature ambiente y solidifica a la temperature corporal.

Los compuestos farmaceuticos de esta invencion pueden administrarse solos o en combinacion con otros agentes farmaceuticos, o con otras terapias anticancer segun se describe en la presente, asf como en combinacion con un excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, el excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un lfpido para la administracion intravenosa. El Kpido puede ser un fosfolfpido, fosfatidilcolinas sinteticas, fosfatidilcolinas naturales, esfingomielina, ceramidas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, acidos fosfatidicos, colesterol, sulfato de colesterol, y lfpidos conjugados de hapteno y PEG. El lfpido puede estar en forma de una nanoemulsion, micelas, emulsiones, suspensiones, nanosuspensiones, niosomas o liposomas. En una realizacion, el excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable esta en forma de una emulsion micelar, suspension, o suspension de nanopartmulas, y comprende tambien una protema intravenosamente aceptable, por ejemplo, albumina humana o uno de sus derivados, para la administracion intravenosa.

En una realizacion, el excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un material ceroso para la administracion oral. El material ceroso puede ser mono-, di- o trigliceridos, mono- o diesteres de acidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con PEG (TPG de vitamina E) y/o Gelucire. El Gelucire puede seleccionarse de Gelucire 44/14, Gelucire 43/0l, Gelucire 50/o2, Gelucire 50/13, Gelucire 37/02, Gelucire 33/0l, Gelucire 46/07, y Gelucire 35/10. En una realizacion, el excipiente, vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable se selecciona de capriol, transcutol hp, labrafil M, labrasol, triacetina, Pharmasolv, etanol, polivinilpirrolidina, carboximetilcelulosa, Tween 20, y Tween 80. En una realizacion, el excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, Gelucire 44/14, se mezcla con un tensioactivo, que puede ser Tween 80 o Tween 20. Estas realizaciones de las composiciones farmaceuticas pueden formularse tambien para la administracion oral.

El compuesto de la invencion puede sintetizarse empleando materiales de partida disponibles en el mercado y procesos muy conocidos por los expertos en la tecnica de la qmmica organica. En los ejemplos 8-10, la presente descripcion proporciona un proceso de fabricacion de algunos de los compuestos reivindicados.

Segun una o mas realizaciones de la presente descripcion, un inhibidor de Stat3 de molecula pequena se refiere cualquier farmaco de bajo peso molecular que muestre una actividad inhibidora contra Stat3. Comparadas con los productos farmaceuticos de peso molecular mayor, tales como protemas, peptidos y carbohidratos, las moleculas pequenas pueden penetrar con mas facilidad las membranas celulares y la barrera hematoencefalica. Estas moleculas tienden a incurrir en costes menores de fabricacion y de desarrollo del proceso.

Segun una o mas realizaciones de la presente descripcion, una terapia de ARNi es el uso directo de ARN de interferencia (ARNi) en el tratamiento de enfermedades, mediante el silenciamiento de genes que generan protemas malas y, por tanto, una enfermedad. El ARNi es un proceso que aparece en la naturaleza que suprime cierta actividad genica en las celulas vivas. Es una funcion eucariota ampliamente conservada que activa el ARN bicatenario en las celulas a traves de intermedios de duplex de ARN cortos, tales como ARN de interferencia pequenos (ARNsi). A traves de una serie de etapas de procesamiento, una de las dos hebras del ARNsi forma complejos con protemas para formar RISC (complejo silenciador inducido por ARN). El RISC reconoce la secuencia de ARN complementaria mediante apareamiento de bases de Watson y Crick y despues la rompe. El ARNi tambien incluye ARNsh, ARNmi y otros.

Segun una o mas realizaciones de la presente descripcion, una terapia antisentido es una forma de tratamiento para infecciones o trastornos geneticos. Cuando se sabe que las secuencia genetica de un gen concreto es la causante de una enfermedad concreta, es posible sintetizar una hebra de acido nucleico (ADN, ARN o un analogo qmmico) que se una al ARN mensajero (ARNm) producido por este gen y lo inactive, “desactivando” este gen con eficacia. Esto es debido a que el ARNm debe ser monocatenario para que pueda traducirse. Este acido nucleico sintetizado se denomina un oligonucleotido “antisentido”, porque su secuencia de bases es complementaria con el ARN mensajero (ARNm) del gen, que se denomina la secuencia “sentido” (de modo que un segmento sentido de ARNm “5'-AAGgUC-3”” puede ser bloqueado por el segmento de ARNm antisentido “3'-UUCCAG-5'”).

Segun una o mas realizaciones de la presente descripcion, un peptidomimetico es una cadena similar a una protema pequena disenada para imitar a un peptido. Generalmente surgen de la modificacion de un peptido existente para alterar las propiedades de la molecula. Por ejemplo, pueden generarse de modificaciones para cambiar la estabilidad o la actividad biologica de la molecula. Esto puede desempenar un papel en el desarrollo de compuestos similares a farmacos a partir de peptidos existentes. Estas modificaciones implican cambios en el peptido que no se producinan en la naturaleza (tales como esqueletos alterados y la incorporacion de aminoacidos no naturales).

Segun una o mas realizaciones de la presente descripcion, los inhibidores oligodesoxinucleotidicos de cuarteto-G son moleculas de ADN catalfticas (ADNzimas) disenadas para inhibir protemas independientes de su actividad de ruptura de ARN en celulas.

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Materiales y metodos

Ensayos biologicos

Los compuestos de la presente invencion pueden ensayarse segun el protocolo descrito anteriormente. La tabla 2 muestra la lista de compuestos descritos en el protocolo.

Tabla 2

Nombre del compuesto

Codigo del compuesto

2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona

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2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona

416

2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona

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2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona

401

2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona

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mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3- b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico

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1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2- il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico

4012

Cultivos celulares: Las celulas HeLa, DU145, H1299, DLD1, SW480, A549, MCF7, LN18, HCT116, HepG2, Paca2, Pancl, LNcap, FaDu, HT29, y PC3 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gemini BioProducts, West Sacramento, CA) y penicilina al 5%/estreptomicina/anfotericina B (Invitrogen).

Celulas satelite de Hoechst: Para identificar y aislar las fracciones de las celulas satelite (SP) y de celulas no satelite, se retiraron celulas SW480 de la placa de cultivo con tripsina y EDTA, se sedimentaron mediante centrifugacion, se lavaron con disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron a 37 °C en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contema FBS al 2% y HEPES 1 mM. Las celulas despues se marcaron con Hoechst 33342 (Invitrogen) a una concentracion de 5 |ig/ml. Las celulas marcadas se incubaron durante 120 minutos a 37 °C, solas o con verapamilo 50 |iM (Sigma-Aldrich, St. Louis). Despues de la tincion, las celulas se suspendieron en disolucion salina equilibrada de Hank (HBSS, Invitrogen) que contema FBS al 2% y HEPES 1 mM, se hacen pasar a traves de un filtro de malla 40 |im, y se mantienen a 4 °C hasta el analisis de la citometna de flujo. El tinte de Hoechst se excita a 350 nm y su fluorescencia se mide a dos longitudes de onda empleando un filtro optico 450 DF10 (filtro de paso de banda de 450/20 nm) y 675LP (filtro de borde paso largo de 675 nm). La ventana de analisis de la dispersion lateral y hacia delante no fue rigurosa, y solo se excluyeron los residuos [15].

Aislamiento de CSC con marcadores de la superficie: La clasificacion de las celulas tumorales basandose principalmente en la expresion diferencial de los marcadores de la superficie, tales como CD44 o CD133, ha sido la responsable de la descripcion de la mayona de las CSC altamente tumorigenicas hasta la fecha. El aislamiento de CD133 se basa en el metodo de Ricci-Vitiani et al. [20], con una ligera modificacion. Las celulas CD133+ se aislaron mediante clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS) o una separacion basada en nanopartfculas magneticas. Brevemente, 107 celulas/ml se marcaron con CD133/1 (AC133)-PE para la clasificacion de celulas basada en FACS, o con CD133/1 (AC133)-biotina (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) para la separacion basada en campos magneticos empleando el kit de seleccion de biotina EasySep® (Miltenyi Biotec) segun las recomendaciones del fabricante. El marcaje no espedfico se bloqueo con el reactivo de bloqueo de FcR suministrado y se realizaron las incubaciones con anticuerpos (1:11) sobre hielo durante 15 minutos en PBS con FBS al 2% y EDTA 1 mM. Se realizaron cinco lavados para el aislamiento con EasySep®, mientras que las celulas se sedimentaron a 400 x g durante 5 minutos y se resuspendieron a 2 x 107/ml antes de la clasificacion mediante FACS.

Las celulas CD44high se aislaron mediante FACS segun los metodos descritos en Ponti et al., con una ligera modificacion [85]. Brevemente, despues de la tripsinizacion y la recuperacion de las celulas durante 30 minutos a 37 °C en medio de crecimiento, las celulas se sedimentaron a 400 x g y se resuspendieron en PBS con FBS al 2% y EDTA 1 mM a 1 x 106 celulas/ml. Las celulas despues se incubaron sobre hielo con una disolucion 1:100 de CD44- FITC (BD Biosciences, San Diego, CA) durante 15 minutos. Como alternativa, se utilizo CD24-PE (BD Biosciences, San Diego, CA) (1:100) para la seleccion negativa. Despues de lavar tres veces, las celulas se resuspendieron a 2 x 106/ml y se hicieron pasar a traves de un tamiz de 40 |iM.

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Ensayo de esferas: Un metodo fiable para medir la capacidad autorrenovadora de una poblacion celular es la capacidad de ser cultivadas como esferas en ausencia de suero o fijacion. Se cultivaron celulas madre del cancer satelite de Hoechst o CD44high FaDu en placas de fijacion ultrabaja en medio de celulas madre del cancer (DMEM/F12, suplemento neurobasal B27, EGF 20 ng/ml, FGF 10 ng/ml, insulina 4 |ig/ml y BSA al 0,4%) para permitir la formacion de esferas. Generalmente, la formacion de esferas se evalua mediante microscopfa despues de 10-14 dfas en cultivo y se puntuan las esferas con >50 celulas.

Ensayo indicador de luciferasa: Se cotransfectaron celulas HeLa con un vector indicador de luciferasa-Stat3 (Stat3-Luc) (Panomics, Fremont, CA) y luciferasa de Renilla (Promega, Madison, WI) utilizando lipofectamina 2000, segun describe el fabricante (Invitrogen). Despues de la transfeccion, las celulas se mantuvieron en medio que contema FBS al 0,5% durante 24 horas. Las celulas despues se trataron con el compuesto indicado durante 30 minutos antes de la adicion de oncostatina M (OSM) 25 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) al medio. Seis horas despues de la adicion de OSM, las celulas se recolectaron y se midieron los niveles de luciferasa de luciernaga y de Renilla utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo, segun describe el fabricante (Promega).

Analisis de la apoptosis: Las celulas tratadas o no tratadas con el compuesto se recolectaron 5 horas despues del tratamiento para la tincion con anexina-V. Las celulas recogidas se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampon que contema anexina-V-FITC y se tineron segun las instrucciones del fabricante (Roche). Se determinaron las celulas positivas a anexina-V mediante una citometna de flujo.

Ensayo de union de ADN de Stat3: Se realizo un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforetica (EMSA) segun describe el fabricante (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Brevemente, se prepararon extractos nucleares a partir de celulas HeLa empleando el kit de extraccion de protemas NucBuster, segun describe el fabricante (EMD Biosciences, San Diego, CA). Se preincubaron 5 |ig del extracto nuclear con la dosis indicada del compuesto indicado durante 30 minutos, antes de una incubacion durante 15 minutos con el oligonucleotido de Stat3 consenso marcado con IR700. Las muestras despues se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y directamente se escanearon utilizando el sistema de formacion de imagenes de infrarrojo Odyssey (Li-Cor Biosciences). Para el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), se preincubaron 5 |ig del extracto nuclear con la concentracion indicada del compuesto indicado durante 30 minutos antes de la adicion del oligo biotinilado (5'-biotina- GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC-3', SEQ ID NO:1). Despues los complejos de ADN-Stat3 se capturaron en placas de 96 pocillos revestidas con estreptavidina (Pierce, Rockford, IL). Los complejos unidos despues se incubaron con anticuerpo policlonal de Stat3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo (GF Healthcare, Pittsburgh, PA). El anticuerpo unido despues se visualizo mediante la adicion de sustrato de TMB (Pierce) y se midio la absorbancia a 450 nm.

Determinacion de la viabilidad celular: Para el analisis de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos a 10.000 celulas por pocillo. Veinticuatro horas despues del cultivo en placa, se anadio el compuesto a las celulas en las dosis indicadas. Veintidos horas despues de la adicion del compuesto se anadio MTT a cada pocillo (0,5 mg/ml, concentracion final) y las placas se incubaron durante 2 horas mas a 37 °C. Despues el medio se aspiro y el producto de formazano se solubilizo en 100 |il de alcohol isopropflico. Se midio la absorbancia de cada pocillo a 570 nm utilizando un lector de microplacas.

Inmunofluorescencia: Las celulas tratadas con el compuesto indicado durante el tiempo indicado se fijaron en formaldehudo al 4% o metanol fno para la deteccion de la anexina-V, la caspasa 3 rota, o Stat3, respectivamente. Los cubreobjetos se secaron al aire y se rehidrataron en PBS a temperatura ambiente durante 10 min. Despues las muestras se incubaron en tampon de bloqueo (PBS, FBS al 5%) durante 10 minutos a temperatura ambiente en una camara humeda. Las celulas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Despues de lavar, las celulas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilucion 1:500 de anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC. Se capturaron imagenes con un microscopio Nikon TE200 equipado con epifluorescencia y una camara CCD de mosaico SPOT. El anticuerpo anti-caspasa 3 rota policlonal (1:100) se obtuvo en Cell Signaling Technology, Danvers, MA. La anexina-V-FITC se obtuvo en Roche, Penzberg, Alemania. El anticuerpo anti-Stat3 policlonal se obtuvo en Santa Cruz.

Inactivacion de genes mediante la tecnologia TPIV®: La tecnologfa TPIV® (Therapeutic Pathway Identification and Validation) (Boston Biomedical Inc., Norwood, MA, EEUU) proporciona plasmidos que pueden emplearse para transfectar en primer lugar bacterias que, a su vez, son captadas por un sujeto marnffero. Despues de la lisis bacteriana, el ARNbc codificado por los plasmidos TPIV® y procesado por las bacterias se libera al citoplasma de la celula de marnffero y realiza la inactivacion de genes dirigida. La tecnologfa de TPIV® se describe en la solicitud de patente PCT de propiedad de los solicitantes n.° PCT/US08/68866, presentada el 30 de junio de 2008.

De modo espedfico, se construye un plasmido TPIV® que codifica secuencias de ARNsi eficaces contra Stat3 mediante clonacion con PCR de un plasmido de Stat3 obtenido en Origene Technologies (Rockville, MD, EEUU) utilizando los siguientes cebadores:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

TPIV-Stat3 (insercion de 300 pb)

Cebadores:

Stat3 TPIV directo 5'-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC (SEQ ID NO:2)

Stat3 TPIV inverso 5'-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG (SEQ ID NO:3).

El plasmido control se construyo utilizando un plasmido pGL2 obtenido en Promega (Madison, WI, EEUU).

TPIV-GL2 (insercion de 300 pb)

Cebadores:

GL2 TPIV directo 5'- C CCTCTAGATGGTTCCTGGAAC (SEQ ID NO:4)

GL2 TPIV inverso 5'-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG (SEQ ID NO:5)

Bacterias de E. coli BL21 (DE3) pLYSe (50-100 |il) qmmicamente competentes se transformaron con un control o 100 ng de plasmido TPIV® dirigido a Stat3 segun las instrucciones del fabricante (Stratagene). Despues se inoculo una unica colonia en medio BHI que contema ampicilina 100 |ig/ml y se cultivo durante la noche a 37 °C. Al d^a siguiente, 5 ml de cada cultivo desarrollado durante la noche se diluyo 1:40 en medio BHI fresco que contema ampicilina 100 |ig/ml y se cultivo durante 2-4 horas mas (hasta DO600 = 0,5). Cada cultivo despues se trato con IPTG (concentracion final 1 mM) durante 2-4 horas para inducir la transcripcion de los ARN bicatenarios largos que pueden ser procesados en un coctel de ARNsi por las bacterias. Despues de la induccion con IPTG, se calculo el numero total de bacterias en cada cultivo midiendo el valor de DO600 (8 x 108 bacterias/ml de cultivo presenta una DO600 = 1). Entonces se calculo el numero de bacterias para cada tratamiento celular segun la confluencia celular y la multiplicidad de infeccion necesaria (MOI, intervalos de prueba de 20:1 a 2000:1, bacterias a celulas) en un volumen de reaccion apropiado. Por regla general, debe elegirse el volumen de reaccion que produzca 3 x 108/ml para 1000:1 MOI. El volumen requerido de cultivo de bacterias despues se centrifugo a 2500 g durante 10 min a 4 °C y el sedimento se lavo una vez con medio de cultivo sin suero que se emplea para que las celulas se bactofeccionen, mas amplicilina 100 |ig/ml e IPTG 1 mM, y se resuspende en el mismo medio a la densidad requerida para la infeccion bacteriana (bactofeccion).

Al mismo tiempo, se afslan celulas de cancer o celulas madre del cancer. Treinta minutos antes de la bactofeccion, el medio de cultivo celular se reemplaza por 2 ml de medio sin suero fresco que contema amplicilina 100 |ig/ml e IPTG 1 mM. Las bacterias preparadas anteriormente despues se anadieron a las celulas a la MOI deseada durante 2 horas a 37 °C.

Despues del periodo de infeccion, las celulas se lavaron 3 veces utilizando el medio de cultivo celular sin suero. Las celulas despues se incubaron con 2 ml de medio de cultivo celular completo fresco que contema amplicilina 100 |ig/ml y gentamicina 150 |ig/ml durante 2 horas para matar a las bacterias extracelulares remanentes. Despues del tratamiento con ampicilina y gentamicina, las celulas se incubaron con 3 ml de medio RPMI 1604 completo fresco que contema ofloxacina 10 |ig/ml para matar a las bacterias intracelulares. Las celulas despues se recolectaron o se analizaron en diversos momentos para evaluar el grado de silenciamiento del gen diana y los fenotipos resultantes.

Evaluaciones in vivo: Tambien se realizaron examenes diarios del estado de salud de cada animal. Se comprobaron los pesos corporales cada tres dfas. Se suministro alimento y agua a diario segun los procedimientos de mantenimiento de animales de la instalacion. El tratamiento que produjo >20% de letalidad y/o >20% de perdida de peso corporal neto se considera toxico. Los resultados se expresan como promedio del volumen tumoral (mm3) + SE. Se considera que unos valores de P < 0,05 son estadfsticamente relevantes.

Mantenimiento de los animales: Ratones nude atfmicos machos o hembras de 4-5 semanas (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se aclimataron a las instalaciones de mantenimiento de animales durante al menos 1 semana antes del inicio del estudio. Todos los procedimientos experimentales utilizados fueron coherentes con las directrices indicadas por the American Physiology Society and the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, y tambien aprobadas por the Institutional Animal Care and Use Committee of Boston Biomedical Inc. Los animales se alojaron en grupos de cuatro en jaulas con lecho de virutas en una habitacion con temperatura controlada (20 °C-22,2 °C), luz controlada (ciclo de luz-oscuridad de 12 horas) y humedad controlada (45-55%). Los animales pudieron acceder al alimento y al agua sin restricciones durante el experimento.

Sistema del modelo de raton nurfe-intraesplenico (modelo ISMS): Ratones nude hembras se anestesiaron y bajo condiciones asepticas, se realizo una incision en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Se inyectaron 106 celulas HT29 de cancer de colon humano en 0,1 ml de PBS bajo la capsula del bazo utilizando una aguja de calibre 27. El bazo volvio a introducirse en la cavidad peritoneal y se cerro la incision. El tratamiento comenzo al dfa siguiente de la implantacion hasta el dfa del examen. El regimen de tratamiento fue de 5qd/semanal por ruta IP. Los ratones se sacrificaron cuando estaban moribundos o 30 dfas despues de la inyeccion. Se retiraron y estudiaron el bazo y el Imgado, y se registro el numero de lesiones tumorales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 1: Identificacion de Stat3 como diana contra celulas madre del cancer

La inactivacion de Stat3 en CSC induce la apoptosis. Para determinar si las celulas madre del cancer expresan Stat3 y si Stat3 esta constitutivamente activa, los inventores realizaron una microscopfa de inmunofluorescencia, que permite no solo el analisis de poblaciones celulares escasas, sino que tambien proporciona informacion adicional sobre la localizacion de protemas y la capacidad de correlacionar la tincion con el fenotipo (concretamente, la apoptosis). Despues de la deteccion inmunofluorescente de p-Stat3 y Stat3 en celulas NSP y SP aisladas mediante FACS de celulas de cancer de colon SW480, se determino que Stat3 en efecto estaba presente en celulas SP y que se encontraba modestamente enriquecida en el nucleo (figura 3A). Ademas, tambien se observo una mayor tincion de p-Stat3 en las celulas SP frente a las celulas NSP, lo cual sugiere que las celulas SP pueden depender mas de Stat3 para la supervivencia.

El estado de la Stat3 tambien se evaluo en celulas CD133+ aisladas a partir de celulas de cancer de cabeza y cuello humano FaDu y celulas de glioblastoma humano LN18. Tal como se muestra en la figura 3B, Stat3 tambien se encuentra constitutivamente activa en estas celulas. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que Stat3 es una diana particularmente importante para las celulas madre del cancer.

Despues se ensayo el efecto de la inactivacion de Stat3 en CSC utilizando TPIV®. El analisis de

inmunofluorescencia revelo que puede lograrse una significativa disminucion de Stat3 a las 24 horas de la infeccion (figura 4A) en CSC recien aisladas (SP) y se descubrio que la mayona de las celulas tratadas con plasmidos TPIV® dirigidos a Stat3 sufrieron apoptosis a las 24 horas de la invencion, mientras que los plasmidos TPIV® control no indujeron la apoptosis por encima de los niveles de las celulas no infectadas control (figura 4B). Estos datos demuestran que las celulas madre del cancer dependen de Stat3 para la supervivencia.

La inactivacion de Stat3 en CSC inhibe la esferogenesis de CSC: Se aislaron celulas madre del cancer satelite de Hoeschst o FaDu CD44high/CD24low mediante FACS, y se cultivaron en placas de fijacion ultrabaja en medio de celulas madre del cancer (DME/F12, suplemento neurobasal B27, EGF 20 ng/ml, FGF 10 ng/ml, insulina 4 |ig/ml y BSA al 0,4%) para permitir la formacion de esferas. Las esferas primarias se recogieron, se disgregaron con tripsina y se distribuyeron en placas de 96 pocillos de fijacion ultrabaja antes del tratamiento con TPIV®. Las bacterias se administraron a una MOI de 1000 durante dos horas antes de la adicion de un coctel de antibioticos

(penicilina/estreptomicina, gentamicina, oflazacina). La formacion de esferas se evaluo despues de 10-14 dfas en cultivo. Se capturaron imagenes representativas de las esferas antes (figura 5, panel izquierdo superior) o despues de la adicion de azul de tripano para identificar a las celulas muertas (figura 5, panel inferior izquierdo). La

esferogenesis relativa se muestra en el panel derecho de la figura 5. Los datos claramente demuestran que la

inactivacion de Stat3 en celulas madre del cancer inhibe la esferogenesis, lo cual demuestra que Stat3 es un factor de autorrenovacion clave de las celulas madre del cancer.

Ejemplo 2: Identificacion de compuestos que inhiben la actividad de la ruta de Stat3

Inhibicion de la actividad de transcripcion de Stat3: Los compuestos se ensayaron para su capacidad de inhibir la actividad de activacion de la transcripcion de Stat3 en celulas utilizando una construccion indicadora de Stat3- luciferasa (Stat3-luc). Se cultivaron celulas transfectadas con Stat3-luc en medio con menor cantidad de suero antes de la adicion del compuesto indicado durante 30 minutos. Las celulas despues se estimularon con oncostatina M (OSM) 25 ng/ml durante 6 horas, seguido de la deteccion de la actividad indicadora de Stat3-luc. La incubacion de las celulas con el compuesto 401 inhibe la actividad indicador de Stat3 estimulada por OSM (figura 6, panel izquierdo). Se incluyo AG490, un inhibidor conocido de la ruta de Jak-Stat, como control positivo para la inhibicion de Stat3. El etoposido, que se incluyo como control para la actividad genotoxica, mostro poca o ninguna inhibicion de Stat3. El compuesto 1001, que es un naftaleno en lugar de una naftoquinona, como los compuestos en esta invencion, no inhibio la actividad indicadora de Stat3 estimulada por OSM incluso a una concentracion mucho mayor (figura 6, panel derecho).

Se ensayaron otros compuestos en los ensayos de indicador de Stat3-luciferasa, y los resultados se resumen en la tabla 3.

Tabla 3

Compuesto n.°

IC50 en los ensayos de Stat3-Luc

401

aprox. 0,25 |iM

416

aprox. 0,75 |iM

418

aprox. 0,75 |iM

301

aprox. 2 |iM

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Inhibicion de la actividad de union al ADN de Stat3: Se emplearon extractos nucleares de celulas HeLa, que contienen Stat3 constitutivamente activada segun se detecta mediante fosforilacion en el resto tirosina 705, para realizar un EMSA de Stat3 para controlar la actividad de union al ADN de Stat3. Se incubaron extractos nucleares con el compuesto indicado antes de la incubacion con un oligonucleotido consenso de Stat3 marcado con IR700. La union de Stat3 al oligonucleotido se controlo mediante una electroforesis en gel y una deteccion empleando un escaner de infrarrojo LiCor Odyssey. Se identifico la banda retrasada de Stat3 y se confirmo mediante un superdesplazamiento con el anticuerpo anti-Stat3 (figura 7A, panel izquierdo) y la inhibicion dependiente de la dosis con el peptido Stat3 (figura 7A, panel intermedio). Se observo la inhibicion dependiente de la dosis de la union al ADN de Stat3 despues de una incubacion de la sonda marcada con el compuesto 401 (figura 7A, panel derecho).

Se ensayaron otros compuestos en los ensayos de EMSA. Tal como se muestra en la figura 7B, los compuestos 401, 416 y 418 pueden inhibir la union al ADN de Stat3.

Inhibicion de los efectores corriente abajo de Stat3 en tejidos de tumor de xenoinjerto: Se prepararon extractos de tumores Paca2 xenoinjertados que fueron tratados con el compuesto 401 o un control de vehfculo 4 horas antes de la recoleccion. Las muestras se analizaron mediante transferencias Western y EMSA para evaluar el nivel de expresion de los efectores corriente abajo de Stat3 y la actividad de union al ADN de Stat3. La muestra tratada con el compuesto 401 (T) mostro una disminucion en la actividad de union al ADN de Stat3 frente al control (V) (figura 8A). Ademas, el tratamiento con el compuesto 401 produjo una disminucion en el nivel de expresion de los efectores corriente abajo de Stat3 ciclina D1 y survivina (figura 8B).

Ejemplo 3: Identificacion de compuestos que se dirigen a las celulas madre del cancer

Identificacion de compuestos que son apoptoticos para celulas madre del cancer: Puesto que se ha demostrado que las celulas madre del cancer expelen activamente a Hoechst, se tineron celulas SW480 con Hoechst y se extrajeron las celulas satelite (mostrado en la figura 9A, area delimitada en el panel izquierdo) para enriquecer las celulas madre del cancer. Para confirmar que estas celulas satelite esta enriquecida con celulas madre del cancer, primero se trato un conjunto control de celulas SW480 con verapamilo, un inhibidor de los transportadores de ABC, antes de tenir con Hoechst. Tal como se muestra en el panel derecho de la figura 9A, el tratamiento con verapamilo produce la perdida de las celulas satelite.

Se determino la IC50 del compuesto 401 contra las celulas satelite de Hoechst en los ensayos MTT y se comparo con la IC50 contra las celulas no satelite. Los resultados demuestran que las celulas satelite son tan sensibles como las celulas no satelite al compuesto 401 (figura 9B, paneles derechos). Sin embargo, las celulas satelite son mucho mas resistentes que las celulas no satelite a la doxorrubicina (figura 9B, paneles izquierdos), lo cual resulta coherente con las publicaciones previas [7, 86]. Estos datos sugieren que el compuesto 401 mata a las celulas madre del cancer.

Las celulas satelite de Hoechst se trataron con el compuesto 401 y se determino el modo de la muerte celular mediante tincion con anexina V (un marcador temprano de la apoptosis). Los resultados demuestran que las celulas moribundas son positivas a anexina V (figura 10A), lo cual demuestra que el compuesto 401 es apoptotico para las celulas madre del cancer.

Como alternativa, se realizo una extraccion con esferas magneticas de anticuerpo de CD133 (uno de los marcadores habituales de la superficie de las celulas madre del cancer) para enriquecer las celulas madre del cancer. Las celulas CD133+ despues se trataron con el compuesto 401, seguido de una tincion con un anticuerpo contra la caspasa 3 rota (una caractenstica de la apoptosis). Tal como se muestra en la figura 10B, muchas de las celulas CD133+ se convierten en positivas a caspasa 3 rota despues de un tratamiento con el compuesto 401, lo cual corrobora que el compuesto 401 es apoptotico para las celulas madre del cancer.

Ademas, se ensayaron las actividades de varios otros compuestos contra las celulas madre del cancer. Brevemente, CSC recien aisladas (celulas Hoechst SP SW480 o celulas FaDu CD44high) se expusieron a un intervalo de dosis (30-0,117 |iM) del compuesto durante 48 h antes de estudiar la viabilidad celular mediante un ensayo MTT. Se calcularon las IC50 representando graficamente el porcentaje de celulas supervivientes. Tal como se muestra en la tabla 4 y la tabla 5, los compuestos de la presente invencion pueden dirigirse a las celulas madre del cancer.

Tabla 4

Compuesto

IC50 (»M)

NSP

SP

401

0,33 0,34

418

0,33 0,34

4011

0,34 0,38

4012

0,81 0,57

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 5

Compuesto

IC50 (pM)

CD44low

CD44mgn

4011

0,42 0,27

4012

0,76 1,05

Identificacion de los compuestos que inhiben la esferogenesis de CSC in vitro: Una de las caractensticas de las celulas madre del cancer es su capacidad para autorrenovarse [87]. Un metodo fiable para medir la capacidad de autorrenovacion de poblaciones celulares es la capacidad de ser cultivadas como esferas en ausencia de suero o fijacion [88]. Para comparar la capacidad del compuesto 401 frente a otros agentes dirigidos y quimioterapeuticos, se cultivaron CSC CD44high aisladas con FACS como esferas durante 72 horas antes de exponerse a un panel de agentes terapeuticos. De los agentes ensayados, solo el compuesto 401 resulto eficaz para prevenir la proliferacion de esferas (figura 11). Notese que las esferas fueron resistentes a doxorrubicina y docetaxel, a pesar de ser aplicados a aproximadamente diez veces sus concentraciones IC50 para la muerte celular en ensayos similares. Se anadieron Tarceva, Sutent y Gleevec a aproximadamente tres veces sus concentraciones terapeuticas indicadas. Estos demuestra que aunque las celulas madre del cancer son resistentes a agentes quimioterapeuticos y dirigidos convencionales, el compuesto 401 es muy eficaz para inhibir su crecimiento.

Identificacion de compuestos que inhiben la esferogenesis de CSC in vivo: Se obtuvieron ratones nu/nu atfmicos hembra de 6 semanas de edad en Charles River Labs (Wilmington, MA). A los ratones se les inyectaron por ruta subcutanea en el flanco 6 x 106 celulas de cancer FaDu o Paca2 en 0,2 ml de DMEM sin suero. Despues de que los xenoinjertos alcanzasen un tamano de aproximadamente 200 mm3, los animales que portan los tumores del xenoinjerto Paca2 fueron administrados con vetuculo, gemcitabina (120 mg/kg, dos veces semanales) o el compuesto 401 (20 mg/kg) por ruta IP durante una semana, y los animales que portan los tumores del xenoinjerto FaDu fueron administrados a diario con vetuculo, carboplatino (30 mg/kg) o el compuesto 401 (20 mg/kg) por ruta IP durante dos semanas antes del sacrificio. Despues, los tumores despues se recogieron para las celulas Paca2 y FaDu, respectivamente. Se obtuvieron suspensiones de celulas individuales despues del sacrificio de los animales y la retirada esteril de los tumores. Brevemente, los tumores se trituraron finamente con escalpelos esteriles en trozos de 0,1 mm3 antes de ser digeridos en colagenasa 1 mg/ml/HBSS durante 15-30 minutos con agitacion constante. Despues de hacer pasar las celulas a traves de un filtro de malla 40 pm se retiraron los eritrocitos, las celulas muertas y los restos celulares extendiendo la suspension celular sobre 1 ml de Histopaque y recogiendo la capa de interfase despues de una centrifugacion a 1440 x g durante 30 minutos. Despues se contaron las celulas vivas y se emplearon para medir su capacidad para formar esferas. Las celulas se distribuyeron en placas de 96 pocillos de fijacion ultrabaja a una densidad de 100 celulas por pocillo en medio de celulas madre del cancer (DMEM/F12, suplemento neurobasal B27, EGF 20 ng/ml, FGF 10 ng/ml, insulina 4 pg/ml y BSA al 0,4%). Se anadio medio fresco cada tres dfas y se determino la formacion de esferas despues de 10-14 dfas en cultivo. Se puntuaron las esferas con >50 celulas. Cuando finalizo el experimento se anadio azul de tripano para identificar las celulas muertas. Tal como se muestra en la figura 12, las quimioterapias convencionales de gemcitabina (panel superior) y carboplatino (panel inferior) enriquecieron las celulas madre del cancer, segun se evidencio por una mayor esferogenesis. Por contraste, los tratamientos con el compuesto 401 disminuyeron las celulas madre del cancer, segun se evidencio por una menor esferogenesis.

Ejemplo 4: Identificacion de los compuestos que destruyen selectivamente un amplio espectro de celulas del cancer

Identificacion de los compuestos que son apoptoticos para un amplio espectro de celulas del cancer in vitro:

Celulas cultivadas en placas de 96 pocillos y tratadas con los compuestos indicados se sometieron a un analisis MTT a las 24 horas despues del tratamiento con el compuesto para determinar la viabilidad celular. Los valores de IC50 calculados en multiples lmeas celulares se resumen en la siguiente tabla 6. Los datos demuestran que estos compuestos tienen una potente actividad contra un amplio espectro de celulas del cancer.

Tabla 6

Lmea celular

Tejido IC50 (»M)

4011

4012 101 301 401 416 418

A549

pulmon 0,95 1,90 1,06

H1299

pulmon 3-10 0,794 0,23 0,25 0,34

MCF7

mama 0,46 0,75 0,46

HeLa

cervix 11,7 3,358 0,43 0,62 0,80

DLD1

colon 0,33 0,54 0,64

SW480

colon 0,32 0,44 0,76

HCT116

colon 0,58 0,69 0,61

HT29

colon 1,27 1,91 1,83

HepG2

hngado 0,25

Paca2

pancreas 0,446 0,11 0,21 0,21

Panc1

pancreas 1,70 2,59 1,54

DU145

prostata 3,7 0,835 0,12 0,22 0,18

PC3

prostata 2,37 3,10 3,04

LNCap

prostata 0,63

FaDu

cabeza y cuello 0,353 1,041 0,39

Ademas, celulas DU145 fueron tratadas primero con DMSO o con las concentraciones indicadas del compuesto 401, despues se tineron con anexina V y despues se realizo un analisis de citometna de flujo 5 horas despues del 5 tratamiento. Los resultados demuestran que el tratamiento con el compuesto 401 produce un aumento dependiente

de la dosis en la tincion de anexina V (figura 13), lo cual demuestra que el compuesto 401 es apoptotico para estas celulas de cancer.

Ejemplos de la selectividad de los compuestos: Bajo las condiciones de ensayo que producen la muerte de casi todas las celulas del cancer, las celulas normales permanecen sustancialmente viables. Las celulas mononucleares 10 de sangre periferica (PBMC) fueron relativamente resistentes al compuesto 401, y tienen una IC50 de MTT de 14 |iM

despues de una incubacion durante 24 horas con el compuesto 401. Esta IC50 es entre 6 a 116 veces mayor que la que se observa en una diversidad de lmeas de cancer, lo cual indica una ventana terapeutica razonable comparado con las celulas de cancer.

De una manera similar a las PMBC, las celulas madre hematopoyeticas de la medula osea CD34+ no resultaron 15 danadas cuando se trataron con el compuesto 401. Tal como se muestra en la tabla 7, la incubacion de celulas

mononucleares de medula osea CD34+ durante 6 horas con el compuesto 401 produjo una IC50 mayor que 30 |iM para los linajes mieloides y eritroides de la medula osea, mientras que las celulas de cancer de prostata DU145 y de colon HT29 presentan unas IC50 menores que 0,5 |iM bajo condiciones similares. Estos datos sugieren una amplia ventana terapeutica (mayor que 50 veces) para el compuesto 401 segun los datos in vitro.

20 Tabla 7 - El compuesto 401 es relativamente no toxico para celulas madre de medula osea CD34+

IC50 del compuesto 401 (^M)

Celulas normales

Celulas de cancer

Eritroides de ME CD34+

Mieloides de ME CD34+ DU145 HT29

>30

>30

<0,2 <0,5

ME = medula osea

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Comparacion de la IC50 del compuesto 401 en celulas mononucleares de medula osea CD34+, celulas DU145 y celulas FaDu en ensayos de formacion de colonias.

Ejemplo 5: Eficacia antitumoral in vivo

Modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico: Se inocularon celulas Paca2 por ruta subcutanea en ratones nude atimicos hembra (4 x 106 celulas/raton). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 450 mm3, los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos de cinco ratones por grupo. Los ratones se trataron por ruta intraperitoneal con el compuesto 401 a 20 mg/kg o con el control de vehnculo a diario. El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en lfpidos al 1,5% y H2O. Los animales recibieron un total de 14 dosis y se dejaron para la observacion despues del tratamiento. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento y se controlaron durante 22 dfas mas despues del tratamiento. Tal como se muestra en el panel izquierdo de la figura 14, el compuesto 401 inhibe fuertemente el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion del crecimiento tumoral era del 64% en el dfa 60 y que era estadfsticamente significativa (p<0,001). De forma mas importante, los volumenes tumorales se mantuvieron estaticos durante el periodo de 22 dfas despues del tratamiento.

En un experimento similar, se inocularon celulas de cancer pancreatico humano panc-1 por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (2 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 60 mm3, los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos de cinco ratones por grupo. Los ratones se trataron por ruta intraperitoneal (IP) con gemcitabina con el regimen convencional (120 mg/kg una vez cada tras dfas) o control de vehnculo, con un total de 6 dosis de gemcitabina o vehnculo de cotrol. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento y se controlaron durante 19 dfas mas despues del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 14, panel derecho, el tratamiento con gemcitabina como monoterapia inhibe el crecimiento tumoral, con una inhibicion del crecimiento tumoral del 47,5% en el dfa 41. Despues de detener el tratamiento, los tumores en el grupo tratado con gemcitabina pronto superaron a los del grupo control.

No se observo rebote de los tumores durante el tratamiento con el compuesto 401 ni en el periodo despues del tratamiento en el modelo de cancer pancreatico humano Paca-2 xenoinjertado, lo cual resulta coherente con su mecanismo de accion dirigido a las celulas madre del cancer. Por contraste, los tumores del xenoinjerto pancreatico humano con la actual quimioterapia convencional de gemcitabina respondieron inicialmente, pero rebotaron durante el tratamiento continuo o superaron a los tumores control despues de detener la dosificacion. La abolicion del rebote del tumor diferencia al compuesto 401 de las quimioterapias convencionales y ofrece una posibilidad para mejorar de forma drastica y fundamental la terapia del cancer.

Modelo de xenoinjerto de cancer de cabeza y cuello: Se inocularon celulas de cancer de cabeza y cuello humano FaDu por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (6 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron por ruta intraperitoneal (IP) con el compuesto 401 a 20 mg/kg o con el control de vehnculo a diario (5 dfas consecutivos, seguido de un detencion de la dosificacion de 2 dfas). El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en lfpidos al 2%, colesterol al 0,1% y H2O. Los animales recibieron un total de 15 dosis del compuesto 401 o del control de vehnculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 15, en este modelo de xenoinjerto de cabeza y cuello muy agresivo, en los animales dosificados con el compuesto 401 por ruta intraperitoneal como monoterapia se inhibio fuertemente el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 75% con un valor p de 0,007. No se produjo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administracion intraperitoneal del vehnculo o del compuesto 401 a 20 mg/kg.

Modelo de xenoinjerto de cancer de mama: Se inocularon celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231 por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (8 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los animales se trataron por ruta oral (PO) con el compuesto 401 a 200 mg/kg o con el control de vehnculo a diario (5 dfas consecutivos, seguido de un detencion de la dosificacion de 2 dfas). El compuesto 401 se formulo a 20 mg/ml en Gelucire al 8% y vitamina E al 20%. Los animales recibieron un total de 15 dosis del compuesto 401 o del control de vehnculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 16, la dosificacion oral del compuesto 401 como monoterapia a 200 mg/kg inhibio fuertemente el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 66% con un valor p de 0,0068. No se produjo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administracion PO del vehnculo o del compuesto 401 a 200 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 puede dosificarse con seguridad en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer de mama humano.

Modelo de xenoinjerto de cancer de prostata: Se inocularon celulas de cancer de prostata humano PC3 por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (8 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron por ruta intraperitoneal (IP) con el compuesto 401 a 20 mg/kg o con el control de vehnculo a diario. El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en lfpidos al 2%, colesterol al 0,1% y H2O. Los animales recibieron un total de 30 dosis del compuesto 401 o del control de vehnculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 17, la dosificacion IP del compuesto 401 como monoterapia a 20 mg/kg inhibio el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 55% con un valor p de 0,015. No se produjo un cambio

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Modelo de xenoinjerto de cancer gastrico: Se inocularon celulas de cancer gastrico humano MKN-45 por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (8 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 180 mm3, los animales se trataron por ruta oral (PO) con el compuesto 401 a 200 mg/kg o con el control de vehfculo a diario. El compuesto 401 se formulo a 20 mg/ml en Gelucire al 8% y vitamina E al 20%. Los animales recibieron un total de 20 dosis del compuesto 401 o del control de vehuculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 18, la dosificacion oral del compuesto 401 como monoterapia a 200 mg/kg inhibio el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 70% con un valor p de 0,01. No se produjo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administracion oral del vehuculo o del compuesto 401 a 200 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 puede dosificarse con seguridad en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer gastrico humano.

Modelo de xenoinjerto de cancer hepatico: Se inocularon celulas de cancer hepatico humano HepG2 por ruta subcutanea en ratones nude atfmicos hembra (8 x 106 celulas/raton) y se dejo que formasen tumores palpables. En este estudio, la dosificacion comenzo cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 700 mm3. Los animales se trataron por ruta intravenosa (IV) con el compuesto 401 a 10 mg/kg o con el control de vehfculo a diario. El compuesto 401 se formulo a 2 mg/ml en albumina al 1,5%. Los animales recibieron un total de 10 dosis del compuesto 401 o del control de vehuculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Tal como se muestra en la figura 19, aunque el tratamiento comenzo a un estadio mucho mas tardfo del crecimiento tumoral, el tratamiento IV con el compuesto 401 como monoterapia a 10 mg/kg todaruta podfa inhibir fuertemente el crecimiento tumoral. Se calculo que la inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 52,3% con un valor p de 0,05. No se produjo un cambio significativo en el peso corporal debido a la administracion IV del vehfculo o del compuesto 401 a 10 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 puede dosificarse con seguridad en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer hepatico humano.

Ejemplo 6: Eficacia antimetastasis

El compuesto 401 tambien se ensayo para determinar su capacidad para inhibir la metastasis en un modelo ISMS. El sistema del modelo de raton nude-intraesplenico (ISMS) es apropiado para los estudios del comportamiento maligno de carcinomas colorrectales, puesto que esta tecnica puede producir metastasis experimentales en el hngado. En este modelo, se inyectaron un millon de celulas HT29 en 0,1 ml de PBS bajo la capsula del bazo de los ratones nude. El bazo volvio a introducirse en la cavidad peritoneal y se cerro la incision. Los ratones se sacrificaron cuando estaban moribundos o 30 dfas despues de la inyeccion. Se retiraron y estudiaron el bazo y el hngado, y se registro el numero de lesiones tumorales. Los ratones se dividieron en dos grupos, un grupo control que habfa recibido vehfculo (n = 4) y el otro grupo, que recibio el compuesto 401 20 mg/kg (n = 4). El farmaco se administro por ruta IP a 5 dfas/semana, comenzando desde el dfa 2 al dfa 30 despues de la inyeccion IS. Se calculo el numero de tumores primarios y tumores hepaticos metastasicos con un microscopio. En la figura 20 se muestran fotograffas representativas. En el grupo control de vehfculo se aprecia una gran carga de tumores primarios en el bazo (figura 20, panel superior izquierdo). Tambien se observaron metastasis hepaticas espontaneas masivas (figura 20, panel superior derecho). Los tratamientos con el compuesto 401 redujeron significativamente el numero de focos de tumor primario y la metastasis hepatica espontanea (figura 20, paneles inferiores).

Ejemplo 7: Farmacocinetica y perfil de toxicidad

Se realizo un analisis farmacocinetico del compuesto 401 en ratas. Ratas Sprague Dawley hembra preparadas para una evaluacion farmacocinetica (9 ratas/grupo) se dosificaron mediante sonda nosogastrica. El volumen de la dosis fue de 10 ml/kg y cada grupo recibio unas preparaciones que conteman el artfculo control (Gelucire 44/14 al 9% y vitamina E TPGS al 18% en agua esteril) o 10 o 30 mg/kg/dfa del compuesto 401 en el artfculo control. Se recogieron muestras de sangre de 3 animales/genero/momento de la predosis y aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10 y 24 horas despues de la dosis inicial. Se recolecto el plasma mediante centrifugacion y se conservo en una nevera ajustada para mantenerse a 75 °C + 15 °C hasta el analisis. La porcion bioanalttica de este estudio se realizo empleando un metodo de LC/MS/MS validado. El lfmite inferior de cuantificacion (LLOQ) fue de 10,0 ng/ml. Tal como se muestra en la figura 21, los datos farmacocineticos demuestran que el compuesto 401 logra y mantiene una concentracion cntica de hasta 7 |iM durante hasta 8 horas.

A estas dosis no se observaron efectos toxicos en ratas con una dosificacion continua durante 28 dfas. Esto incluye la observacion clmica, los ensayos de laboratorios, las determinaciones brutas e histologicas. Juntos, estos datos demuestran que el compuesto 401 puede lograr la exposicion PK deseada para la actividad anticancer selectiva.

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Ejemplo 8

Esquema 1

imagen7

THF: tetrahidrofurano TA: temperatura ambiente

Preparacion de 2-acetil-4H,9H-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona (compuesto de formula 4-6, en la que R1 = R7 = H y R3 = -CH3)

A una disolucion de 18,8 gramos (22 ml, 0,268 moles) de 3-buten-2-ona (formula 4-1 en el esquema 1) en 200 ml de pentano en un bano de hielo con agitacion vigorosa se le anadio lentamente 39,0 gramos (12,54 ml, 0,244 moles) de bromo en 50 ml de pentano a lo largo de 30 minutos. Despues de agitar durante 5 minutos mas en el bano de hielo, la mezcla se evaporo para eliminar la mayor parte del pentano. Un volumen pequeno del resto de 3,4-dibromo- 2 butanona (4-2) de la etapa 1 se disolvio en 400 ml de THF y despues se enfrio en un bano de hielo. A la disolucion en el bano de hielo con agitacion vigorosa se le anadieron lentamente 37,2 gramos (36,5 ml, 0,244 moles) de DBU en 50 ml de THF a lo largo de 30 minutos. Se genero una gran cantidad de sal precipitada. La mezcla se empleo directamente para la siguiente etapa de reaccion. A la mezcla de reaccion de 3-bromo-3-buten-2-ona (4-3) se le anadieron 38,5 gramos (0,220 moles) de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona (4-4). La mezcla resultante se agito vigorosamente en un bano de agua a temperatura ambiente. Despues se anadieron lentamente 44,6 gramos (43,8 ml, 0,293 moles) de DBU a la mezcla a lo largo de 30 minutos. La temperatura de la mezcla de reaccion aumento debido al calor generado por la reaccion y se controlo hasta mantenerla por debajo de 35 °C anadiendo hielo al bano de agua. Despues de agitar vigorosamente durante 3 horas mas al aire a temperatura ambiente se anadieron 1.800 ml de agua a la mezcla. La mezcla resultante se enfrio hasta 0 °C y despues se filtro. El solido filtrado se lavo sucesivamente con 500 ml de agua, 500 ml de bicarbonato de sodio acuoso al 5%, 500 ml de acido acetico al 1% y 250 ml de acetona enfriada en hielo. El solido lavado se recristalizo en 200 ml de acido formico para producir 12 gramos del producto con un rendimiento global del 22,8% para el compuesto 4-6 o 3-2 (R1 = H, R3 = CH3, R7 = H). RMN de 1H (en CDCla) 8 2,67 (s, 3H), 7,61 (s, 1H-3), 7,79-7,84 (m, 2H), 8,22-8,28 (m, 2H).

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Ejemplo 9

Esquema 2

Preparacion del compuesto de mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-N)vmN]ester del acido fosforico

imagen8

A una disolucion de BBI6002 (240 mg, 1 mmol) en 50 THF a -78 °C se le anadio una disolucion de bis(trimetilsilil)amida de litio (1,0 M en THF, 1,2 ml). Despues de agitar a esta temperatura durante 1 hora, la mezcla de reaccion se agito a 0 °C durante 30 min. Despues se anadio a esta mezcla una disolucion de clorofosfato de dimetilo (217 mg, 1,5 mmol) en 5 ml de THF a -78 °C. La mezcla resultante se agito y se dejo que se calentase hasta la temperatura ambiente lentamente. Despues de 1 h de agitacion a temperatura ambiente, el disolvente se evaporo, el residuo se disolvio en CH2Cl2, se lavo con NH4Cl saturado y agua, y se seco sobre MgSO4. La evaporation del disolvente produjo la mezcla de reaccion bruta, que se purifico en una cromatografia en columna para producir el 1- (4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico. RmN de 1H (400 MHz, CDCl3) 8 8,20-8,28 (m, 2H), 7,78-7,82 (m, 2H), 7,07 (s, 1H), 5,78 (t, 1H, J = 2,8 Hz), 5,50 (t, 1H, J = 2,8 Hz), 3,96 (s, 3H), 3,94 (s, 3H); MS m/z 347,20 (M-H).

Ejemplo 10

Esquema 3

Preparacion del compuesto de 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico

imagen9

A una disolucion de 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico (40 mg, 0,114 mmol) en CH2Cl2 (2 ml) a temperatura ambiente se le anadio bromuro de trimetilsililo (71 mg, 0,46 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas y despues se concentro al vacio. El residuo se purifico mediante una HPLC semipreparativa para obtener el producto de mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a- tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico como un solido amarillo. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 8 1H RMN(400 MHz, CDCl3) 8 7,98-8,02 (m, 2H), 7,57-7,62 (m, 2H), 6,92 (s, 1H), 5,54 (t, 1H, J = 2,8 Hz), 5,36 (t, 1H, J = 2,8 Hz); MS m/z 319,20 (M-H).

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Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1. - Una composicion que comprende (i) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-acetil-7-cloro- nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2- etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil]ester del acido fosforico, y 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una de sus sales farmaceuticamente aceptables o solvatos, y (ii) un excipiente, vehuculo o diluyente para su uso para inhibir una celula madre del cancer para tratar un cancer en el que se ha descubierto la presencia de celulas madre del cancer y la presencia de una actividad aberrante de la ruta de Stat3, en un sujeto que lo necesite, en la que el excipiente, vehuculo o diluyente comprende:

   un lfpido seleccionado del grupo que consiste en un fosfolfpido, fosfatidilcolina sintetica, fosfatidilcolina natural, esfingomielina, ceramida, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, acido fosfatfdico, colesterol, sulfato de colesterol, y lfpidos conjugados con haptenos y polietilenglicol (PEG) para la administracion intravenosa; o

   un material ceroso seleccionado del grupo que consiste en mono-, di- o trigliceridos, mono- o diesteres de acidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con pEg, y Gelucire para la administracion oral; o

   el excipiente, vehfculo o diluyente esta en una forma seleccionada del grupo que consiste en una emulsion micelar, una suspension, y una suspension de nanopartfculas, y comprende ademas albumina humana para la administracion intravenosa.
2. 2. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la composicion inhibe la autorrenovacion de las celulas madre del cancer.
3. 3. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que la composicion mata a las celulas madre del cancer.
4. 4. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, melanoma, sarcoma, cancer hepatico, tumores cerebrales, mieloma multiple y leucemia.
5. 5. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que el cancer es metastasico, es refractario a la quimioterapia o la radioterapia, o ha recurrido despues de un tratamiento inicial.
6. 6. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 1, en la que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer hepatico, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer esofagico, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer endometrial, cancer de tiroide, cancer de los conductos biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de la vesfcula biliar, cancer de la pituitaria, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de las glandulas salivares, cancer nasofarmgeo, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, neuroblastoma, cancer de cervix, melanoma, y cancer de piel.
7. 7. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 6, en la que el cancer es cancer colorrectal.
8. 8. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 6, en la que el cancer es cancer gastrico.
9. 9. - La composicion para el uso segun la reivindicacion 6, en la que el cancer es cancer esofagico.
10. 10. - La composicion para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composicion se

    administra por ruta oral y no mas de cuatro veces diarias (QID).
11. 11. - La composicion para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composicion se emplea a una dosificacion de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 50.000 mg/m2 (PO).
12. 12. - La composicion para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composicion se emplea a una dosificacion de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 50.000 mg/m2 (PO).
13. 13. - La composicion para uso segun la reivindicacion 1, en donde el compuesto es 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9- diona.