KR20220131224A - 허혈-재관류 손상 및/또는 폐 손상을 치료하기 위한 화합물, 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 MAP3K2/MAP3K3 억제제를 사용하여 뇌졸증 후를 포함하지만 이에 제한되지 않는 허혈-재관류 손상(IRI)을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 MAP3K2/MAP3K3 억제제를 사용하여 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI) 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 본 개시내용 내에서 유용한 조성물, 및 조성물을 포함하는 키트를 포함한다.

Description

허혈-재관류 손상 및/또는 폐 손상을 치료하기 위한 화합물, 조성물 및 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2019년 11월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/938,083호에 대한 우선권을 주장하며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

연방 후원 연구 또는 개발에 관한 성명

본 발명은 HL135805 하에 정부 지원으로 만들어졌으며 국립 보건원에 의해 수여되었다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)(IRI)은 허혈 기간 후 혈액 공급이 회복될 때 발생한다. 뇌졸중의 경우, 재관류는 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)와 같은 혈전 용해제에 의해 유발된 혈전 용해에 의해, 또는 혈전의 기계적 제거를 통해 달성될 수 있다. 자발적 재관류는 또한 허혈성 뇌졸중 후에 발생한다. 재관류는 영향을 받은 조직에 산소 공급을 회복시키며, 불행히도 이것은 영구적인 허혈에 비해 해로운 영향을 미친다.

허혈성 뇌졸중 후 재관류 손상은 흥분성 아미노산의 방출, 이온 불균형, 산화 스트레스, 염증, 세포자멸사 유도 및/또는 괴사와 같지만 이에 제한되지 않는 다양한 메카니즘을 포함하는 복잡한 병태생리학적 과정이다. 혈관내 치료(혈전 절제술 및 혈전 파괴 포함)의 최근 발전으로, 재관류 손상은 뇌졸중 치료에서 점점 더 중요한 문제가 되었다. 따라서 뇌에서의 허혈-재관류 손상의 메커니즘 및 이 과정이 불필요한 세포 및 조직 손상 없이 치료적으로 관리될 수 있는 방법을 이해하는 것이 매우 중요하다.

2019년 12월 중국 우한에서 수많은 사람들을 괴롭힌 감염원으로 신종 코로나바이러스가 등장하였다. 이 바이러스는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 원인 인자인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 지정되었다. 이 질병은 팬데믹 수준으로 전 세계적으로 빠르게 퍼졌다.

다른 기관계도 영향을 받지만, 상기도 및 폐는 SARS-CoV-2에 대한 바이러스 진입 및 복제의 주요 지점이며, 호흡기 질환은 관련 장애인 COVID-19의 주요 징후일 뿐만 아니라 주요 사망 원인이다. COVID-19가 진행됨에 따라, 이것은 일반적으로 급성 폐 손상(acute lung injury)(ALI)의 징후인 중증 폐부종(severe lung edema)으로 나타나며 중증 저산소혈증(severe hypoxemia) 및 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)(ARDS)으로 진행될 수 있다. 특히, ALI의 발생 및 중증도는 SARS-CoV-2 감염된 개인의 예후와 관련이 있는 것으로 나타났으며, ALI/ARDS는 보고된 바에 따르면 COVID-19가 다기관 기능 장애 및 사망으로 진행하는 병태생리학의 핵심이다. COVID-19 관련 ARDS에 대해 몇 가지 뚜렷한 징후, 예를 들어, 중증 저산소혈증이 있는 경우 비교적 정상적인 폐 탄성(lung compliance)이 보고되었다. 그러나, 차이점은 증후군 자체의 광범위한 이질성을 반영하는 것으로 볼 수 있으며, 최근 생겨난 증거가 ARDS와 관련된 과거 및 코로나바이러스 감염 모두에 대한 호흡기계 역학의 광범위한 유사성을 나타낸다는 것을 시사하였다. 따라서, ALI/ARDS에서 잠재적인 임상 이점이 있는 치료는 코로나바이러스 감염(예를 들어, COVID-19)의 중증도를 줄이고 영향을 받는 환자에서, 코로나바이러스 감염이 ALI/ARDS로 진행된 환자 및 폐 및/또는 호흡기에 영향을 미치지만 ALI/ARDS로 진행되지 않은 코로나바이러스 감염을 갖는 환자 모두에서 전체 생존율을 개선할 것으로 예상된다.

급성 폐 손상(ALI) 및 더 심각한 형태의 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 폐에 대한 직간접적인 손상으로 인해 발생하며, 이는 코로나바이러스 감염 또는 지질다당류(LPS)-유도된 ALI/ARDS, 흡인-유도된 ALI/ARDS, 허혈-재관류로 인한 ALI/ARDS, 및/또는 세균/바이러스 ALI/ARDS과 같은 기타 원인과 관련될 수 있다. ALI/ARDS의 원인과 관계없이, 이러한 폐 손상은 사망률이 높은 심각한 건강 문제를 나타낸다. ALI/ARDS의 발병률은 미국에서 연간 대략 200,000명으로 보고되며 사망률은 약 40%이다. 현재 이 질환에 대한 약리학적 개입은 없다. 이러한 상태의 관리는 지원 조치에 크게 의존한다. ALI/ARDS 환자에서 시험된 약리학적 요법(therapy)은 효과를 보이지 못했다. 따라서, 이 질환의 치료적 개입에 대한 명확한 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.

MAP3K2 및 MAP3K3은 MAP3K 슈퍼패밀리의 MEK 키나제(MEKK) 하위그룹의 고도로 보존된 두 구성원이다. 이들은 C 말단에 키나제 도메인을 포함하고 N 말단 근처에 PB1 도메인을 포함한다. MAP3K2 및 MAP3K3의 키나제 도메인은 94% 서열 동일성을 공유하며, 이 두 키나제는 기질을 공유할 것으로 예상된다. 시험관내 키나제의 일시적인 발현은 ERK1 및 ERK2, p38, JNK 및 ERK5의 자가-활성화 및 활성화로 이어진다. 마우스에서, 이러한 키나제는 심혈관 발달, 림프구 분화, 및 NF-카파B 조절에 관여한다. 그러나, 다른 생리학적 사건에서 이들의 역할은 조사되지 않았다.

고통받는 대상체(subject)에서 허혈-재관류 손상, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상, 및/또는 급성 호흡곤란 증후군을 치료, 개선(ameliorating) 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 신규한 치료학적 치료법을 확인하는 것이 당업계에 필요하다. 특정 실시양태에서, 허혈-재관류에 걸린 대상체는 허혈성 뇌졸중을 겪었다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상이 급성 폐 손상 및/또는 급성 호흡곤란 증후군으로 진행되었다. 또 다른 실시양태에서, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상이 급성 폐 손상 및/또는 급성 호흡곤란 증후군으로 진행되지 않았다. 본 개시내용은 이러한 요구를 다루고 충족시킨다.

본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈-재관류 손상(IRI)을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙(pazopanib), 및/또는 이의 염 및/또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈에 의해 야기되지 않은 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI) 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙, 및/또는 이의 염 및/또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.

본 개시내용은 추가로 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 호중구를 약물과 접촉시키는 단계 및 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준이 증가하면, 약물은 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI, 및/또는 ARDS을 치료하는데 효과적이다.

본 개시내용은 추가로 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 약물을 투여한 후 대상체에서 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계(여기서, 약물을 투여한 후 대상체의 호중구 ROS 생산 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 호중구 ROS 생산 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적이다); 및/또는 (ii) 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준을 측정하는 단계(여기서, 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적이다)를 포함한다.

본 개시내용의 특정 실시양태에 대한 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 개시내용을 예시하기 위한 목적으로, 특정 실시예양태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 개시내용은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 파조파닙이 관내 중대뇌 동맥(MCA) 폐색 뇌 뇌졸중 마우스 모델에서 뇌 IRI를 감소시킨다는 것을 예시한다. 13마리의 암컷 C57bl 마우스(9주령)를 혈액 재관류가 허용되기 전에 60분 동안 폐색시켰다. 이들 중 7마리는 재관류 30분 후에 안와후 정맥내 주사를 통해 60μg의 파조파닙을 투여받았다. 동물은 안락사되기 24시간 전에 신경학적 손상에 대해 점수를 매겼다(오른쪽 하단 막대 차트). 그후 TCC로 뇌 절편을 염색하여 뇌 경색을 평가하였다. TCC 염색된 이미지가 도시되며, 경색 크기가 정량되어 오른쪽 상단의 막대 차트에 표시된다.
도 2는 파조파닙이 재관류 시점에 투여된 경우 파조파닙이 관내 중대뇌 동맥(MCA) 폐색 뇌 뇌졸중 마우스 모델에서 뇌 IRI를 감소시키지 못한다는 것을 예시한다. 6마리의 암컷 C57bl 마우스(9주령)를 혈액 재관류가 허용되기 전에 60분 동안 폐색시켰다. 이들 중 3마리는 재관류 직후 안와후 정맥내 주사를 통해 60μg의 파조파닙을 투여받았다. 신경학적 손상 점수(오른쪽 하단의 막대 차트), TCC-염색된 뇌 절편 이미지 및 뇌 경색 크기 정량화가 오른쪽 상단에 표시된다.
도 3a-3f는 MAP3K2/3-null 호중구가 ROS(반응성 산소종) 생산을 제외하고는 정상적인 기능을 보인다는 것을 나타낸다. 도 3a: DKO 호중구에서 MAP3K2 및 3개 단백질의 손실. 골수 호중구는 각각 MAP3K2 및 3-특이 항체를 사용하여 웨스턴에 의해 분석되었다. 도 3b: 1μM fMLP의 존재하에서 WT 및 MAP3K2/3-결핍 골수 호중구로부터의 ROS 방출. 도 3c: B에 나타낸 바와 같이 자극 후 5분 동안 트레이스 아래 영역으로부터 계산된 단리된 호중구로부터의 ROS 양이 표시된다(데이터는 평균 ± sem로 표시됨, 일원 Anova; n=5). K2 및 K3은 각각 Map3k2 ^-/- 및 Map3k3 ^-/- 을 나타낸다. 도 3d: MAP3K2/3-결핍은 fMLP 2회 용량 및 MIP2(μM 단위)에 의해 자극된 마우스 호중구로부터의 ROS 생산을 증가시킨다. 데이터는 평균 ± sem으로 표시된다(***, p<0.001; 스튜던츠 t-검정; n=3). 도 3e: 1μM fMLP에 의해 자극된 골수 호중구로부터의 ROS 생산은 시토크롬 C 분석을 사용하여 측정되었다. 도 3f: 키나제 무효 변종(kinase dead mutant)이 아닌 WT MAP3K3의 발현은 DKO 호중구에서 ROS 생산을 억제한다. 호중구를 GFP, MAK3K3-GFP, 또는 GFP와 융합된 MAP3K3 키나제 무효(KD)에 대한 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. GFP-양성 세포를 다음날 분류하고 ROS 방출 분석에 사용하였다. 데이터는 평균 ± sem으로 표시된다(일원 Anova 검정, n=3).
도 4a-4p는 MAP3K2 및 3-결핍이 호중구 기능에 미치는 영향을 도시한다. 도 4a-4d: 호중구를 fMLP의 자극하에 Dunn 챔버 화학주성에 적용하였다. 대표적인 세포 이동 추적은 (도 4a 및 4b)에 도시된다. 세포가 얼마나 빨리 이동하고 화학주성인자 구배를 얼마나 잘 따르는지에 대한 전좌 및 방향성 매개변수는 (도 4c) 및 (도 4d)에 도시된다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n>50). DKO, Map3k2 ^-/- , Map3k3 ^-/- . 도 4e: 내피 세포에 대한 호중구의 부착은 전단 유동 챔버에서 조사하였다. 도 4f-4g: fMLP로 자극된 호중구에 대한 LFA-1 및 MAC-1 인테그린의 세포 표면 발현. 도 4h: fMLP에 의한 활성화시 호중구에 대한 인테그린의 결합력(avidity)을 반영하는 ICAM-1에 대한 호중구의 결합. 도 4i: 염증이 있는 복막으로의 호중구의 침윤. 도 4j-4k: 자극시 호중구 과립으로부터의 MMP 및 MPO의 방출. 도 4l: 1μM fMLP에 의해 자극된 호중구로부터의 ROS 생산은 완충액(Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}를 갖는 HBSS 중의 0.25% BSA, 10mM Isoluminol, 100u/ml HRP)에서 루미놀을 사용하여 측정되었다. 도 4m 및 4n: 복막 및 골수로부터의 호중구를 EasySep™ 마우스 호중구 농화 키트(Stemcell Tech)를 사용하여 단리하고 이소루미놀을 사용하여 ROS를 측정하기 전에 1μM fMLP로 자극하였다. 도 4o: 200 nM PMA에 의해 자극된 호중구로부터의 ROS 생산은 이소루비놀을 사용하여 측정되었다. 도 4e-4o의 데이터는 평균 ± sem으로 표시된다(스튜던츠 t-검정). 도 4p: MAP3K3 및 이의 돌연변이체의 발현은 도 3f를 뒷받침하는 웨스턴 분석에 의해 검출되었다.
도 5a-5g는 조혈 세포에서 MAP3K2의 손실과 골수 세포에서 MAP3K3의 손실이 급성 폐 손상을 개선한다는 것을 나타낸다. 도 5a 및 5d: DKO 마우스에서 감소된 폐 투과성. DKO 및 대조군 WT 마우스는 HCl 또는 LPS-유도 ALI를 거친 후 폐 투과성 측정을 거쳤다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n=8). 도 5b 및 5e: 손상된 폐의 대표적인 조직학. Br, 기관지; V, 혈관; 노란색 원은 혈관주위 간질성 부종의 영역을 나타낸다. 혈관주위 간질성 부종 및 ALI 지수에 대한 정량은 도 6a에 도시되어 있다. 도 5c 및 5f: DKO 마우스는 연장된 생존을 보여준다(Mantel-Cox 로그 순위 검정; n=5; p=0.004). 도 5g: HCl-손상된 폐로부터의 호중구 및 DKO 마우스의 BAL은 WT 마우스보다 더 많은 양의 ROS를 생산한다. 데이터(평균 형광 강도)는 평균 ± sem으로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n=4).
도 6a-6f는 ALI에 대한 MAP3K2 및 3-결핍의 영향을 나타낸다. 도 6a: 도 5a-5g에 대한 혈관주위 간질성 부종 및 폐 손상 지수의 정량화. 도 6b: HCl-유도된 ALI 모델에서 폐 투과성에 대한 MAP3K2(K2) 또는 MAP3K3(K3) 결핍의 영향. DKO 및 WT 마우스의 HCl-손상된 폐의 BAL에서 골수 세포 존재. 절대 세포 수가 표시된다. 도 6d: DKO 및 WT 마우스의 HCl-손상된 폐에서 골수 세포 침윤. 폐를 PBS로 관류하고 유동 분석 전에 콜라게나제로 소화시켰다. 표시된 데이터는 CD45로 사전-게이팅되었다. 절대 세포 수가 표시된다. 도 6e: HCl-유도된 ALI 후 DKO 및 WT 마우스에서 순환 혈액 세포의 수. 도 6f: DKO 및 WT 마우스에서 HCl-손상된 폐의 BAL에서 사이토카인 수준. 도 6a-6f의 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정).
도 7a-7i: MAP3K3이 S208에서 p47^phox를 인산화하여 NADPH 산화효소 활성을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 7a: MAP3K3은 p^47phox를 인산화한다. 시험관내 키나제 분석은 정제된 재조합 MAPK3K3 및 면역침전된 NADPH 산화효소 서브유닛을 사용하여 수행하였다. NADPH 산화효소 서브유닛은 HA-태그가 있는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었으며, 항-HA 항체가 면역침전을 위해 사용되었다. 도 7b: MAP3K3은 p47^phox의 S208을 인산화시킨다. 시험관내 키나제 분석은 재조합 MAP3K3 및 GST-p47SH3(WT) 또는 S208E 돌연변이(SE)를 포함하는 GST-p47SH3을 사용하여 수행하였다. GST-p47SH3은 2개의 SH3 도메인을 포함하는 글루타티온 S-트랜스퍼라제-융합된 p47^phox 단편(잔기 151-286)이다. 도 7c: p47^phox의 Ser-208의 포스포-모방 돌연변이(phosphomimetic mutation)는 재구성된 ROS 생산 분석에서 감소된 활성을 초래한다. COS-7 세포를 WT p47^phox 또는 이의 S208A(SA) 또는 S208E(SE) 돌연변이체와 함께 p22^phox, p67^phox 및 p97^phox에 대한 플라스미드로 공동형질감염시켰다. PMA-유도된 ROS 생산이 도시되어 있다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(양측 일원 Anova, n=4). 도 7d: S208A 돌연변이체가 아닌 WT p47^phox는 MAP3K3에 의해 억제된다. COS-7 세포를 MAP3K3의 존재 또는 부재하에 WT p47^phox(왼쪽 패널) 또는 이의 S208A 돌연변이체(오른쪽 패널)와 함께 p22^phox, p67^phox 및 p97^phox에 대한 플라스미드로 공동형질감염시켰다. PMA-유도된 ROS 생산이 도시되어 있다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정). 도 7e: p47^phox의 Ser-208의 포스포-모방 돌연변이는 p22^phox와의 상호작용을 손상시킨다. GST 풀다운 분석은 GST-p47SH3 S208A 또는 S208E 돌연변이체 및 p22^phox의 MBP-융합된 C-말단(잔기 96-164)(p22C)으로 수행하였다. 단백질의 검출을 위해 웨스턴 분석을 사용하였다. 도 7f: p47^phox의 Ser-208의 인산화는 fMLP에 의해 자극된다. 호중구를 다양한 기간 동안 fMLP(1μM)로 자극한 다음 웨스턴 분석을 수행하였다. 7g: FMLP-자극된 p47^phox 인산화는 MAP3K2/3에 의존한다. 도 7h: p47^phox-KI 마우스로부터의 호중구는 WT보다 더 많은 ROS를 방출한다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n>5). 도 7i: p47^phox-KI 마우스는 HCl-유도된 ALI 후 폐 투과성이 감소하였다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n>4).
도 8a-8i는 MAP3K2/3이 p47^phox의 인산화에 의해 NADPH 산화효소 복합체 2를 조절함을 나타낸다. 도 8a-8b: COS-7 세포를 도면에 나타낸 바와 같이 NADPH 산화효소 서브유닛에 대한 플라스미드로 형질감염시키고 PMA의 존재 또는 부재화에 처리하였다. ROS 생산 및 단백질 발현을 결정하였다. 도 8c: 키나제 무효 변종이 아닌 WT MAP3K3은 재구성된 COS-7 시스템에서 ROS 생산을 억제할 수 있다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(일원 Anova, LacZ의 경우 n=4 및 기타의 경우 3). 도 8d: 도식 모델은 어떻게 MAP3K2/3이 ROS 생산을 억제하는지를 보여준다. MAP2K2/3은 Ser-208에서 p47^phox를 인산화한다. 인산화는 p47^phox와 p22^phox 사이의 상호작용을 방해하여 NADPH 산화효소 활성 및 ROS 생산을 억제한다. 도 8e: 항-포스포-S208 p47^phox 항체의 검증. HEK293 세포를 WT 또는 S208A p47^phox와 함께 WT로 공동형질감염시켰다. 다음 날 웨스턴 분석을 수행하였다. 도 8f-8g: 도 7f 및 7g에서의 웨스턴 블롯의 정량화. 데이터는 총 p47에 대한 p-p47의 정규화된 값으로 표시된다. n=3. 도 8h-8i: DNA 시퀀싱(도 8h; 상단, 서열 번호 2-3, 및 하단, 서열 번호 4-5) 및 웨스턴 분석(도 8i)에 의한 p47^phox S208 A 녹 인(knock in)의 검증. WT 및 p47^phox-KI(KI) 마우스로부터의 호중구를 표시된 시간 동안 fMLP(1μM)로 자극하고 도 8i에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 9a-9l은 p47^phox-KI에 의한 폐 미세환경의 변화를 도시한다. 도 9a: 폐 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱의 t-SNE 플롯. 도 9b: 내피 세포의 경로 농축 분석. Akt 신호전달과 관련된 것들만 표시된다. 도 9c: WT 및 MAP3K2/3 DKO 마우스로부터의 폐 절편을 포스포-S473 AKT(pAKT) 및 CD31에 대해 염색하였다. HCl에 의한 ALI 유도 6시간 후에 샘플을 수집하였다. 도 9d: 도 10a에 대한 CD31 염색에 의해 표시된 내피 세포 p-AKT 염색의 정량화. 각 기준점은 한 마리의 마우스로부터 8개 이상의 혈관 절편의 평균이다. 도 9e: WT 마우스와 비교하여 DKO 마우스의 HCl-손상된 폐로부터의 단백질 추출물에서 S308에서 AKT의 인산화 증가. 정량화는 평균 ± sem으로 표시된다(스튜던츠 t-검정). 도 9f: 낮은 농도의 H₂O₂는 TEER을 향상시키고 1차 마우스 폐 내피 세포에서 AKT를 자극한다. 도 9g: 도 10b에 대한 정량화. 도 9h: 감소된 시토크롬 C는 공동-배양된 MAP3K2/3-결핍 호중구(DKO)에 의해 내피 세포에서 증가된 AKT 인산화를 중단시킨다. 도 9i: fMLP-자극된 p47^phox-KI의 공동-배양은 fMLP-자극된 WT 호중구에 비해 폐 내피 세포에서 더 큰 AKT 인산화를 유발한다. 도 9j-9l: HCl-유도된 ALI 직전에 꼬리 정맥을 통해 페길화된 카탈라제(Cat; 2000U/마우스)를 정맥내 투여하면 WT 마우스에서 투과성, 간질성 부종 및 사망률이 증가한다. 가열-비활성화(iCat)가 mock에 더하여 대조군으로 사용되었다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다. 도 9d-9g, 9i, 9j, 및 9l의 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정).
도 10a-10i는 p47^phox-KI에 의한 폐미세환경의 변화를 도시한다. 도 10a 및 10f-10i: WT 및 p47^phox-KI 마우스로부터의 폐 절편을 패널에 나타낸 바와 같이 포스포-S473 AKT(pAKT), CD31, 평활근 액틴(SMA), ABCA3, 활성화된 카스파제 3(CASP3) 및/또는 Ki67에 대해 염색하였다. 샘플은 손상 후 24시간에 수집된 (도 10i)를 제외하고는 HCl에 의한 ALI 유도 6시간 후에 수집하였다. 대표적인 공초점 이미지가 도시되어 있다. 정량화는 도 9d, 11b, 12a-12c에 도시되어 있다. 도 10b: fMLP-자극된 MAP3K2/3-결핍 호중구(DKO)의 공동-배양은 fMLP-자극된 WT 호중구에 비해 더 큰 AKT 인산화를 유발하며, 이러한 AKT 인산화의 차이는 카탈라제(Cat)의 존재에 의해 없어지지만, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)에 의해서는 그렇지 않다. 정량화가 도 9g에 나타내어져 있다. 도 10c: SOD의 존재 또는 부재하에 fMLP-자극된 WT 또는 DKO 호중구와 공동-배양된 마우스 폐 내피 세포의 TEER 측정. 도 10d: HCl 주입 직전 꼬리 정맥을 통해 페길화된 카탈라제(2000U/마우스)를 정맥내 투여하면 투과성이 증가하고 HCl-유도된 투과성 변화에 대한 MAP3K2/3 결핍의 영향이 없어진다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(이원 Anova; ns, 유의하지 않음). 도 10e: 단일 세포 RNA 시퀀싱을 사용한 p47^phox-KI(KI) 및 WT 샘플의 유전자 발현의 비교를 위한 바이올린 플롯. EC1 및 EC2는 두 개의 내피 세포 하위그룹이다.
도 11a-11e는 p47^phox-KI에 의한 폐 내피 미세환경의 변화를 도시한다. 도 11a: 폐 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱의 t-SNE 플롯. 도 11b: 도 10f에 대한 SMA 염색에 의해 표시된 p-AKT 염색의 정량화. 각 기준점은 한 마리의 마우스로부터 8개 이상의 혈관 절편의 평균이다. 도 11c, 11d, 11e: p47^phox-KI 및 WT 폐의 폐 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱으로부터의 유전자 발현의 비교를 위한 바이올린 플롯. 도 11b의 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정).
도 12a-12g는 p47^phox-KI에 의한 폐 내피 미세환경의 변화를 도시한다. 도 12a-12c: 도 10g, 10h, 및 10i에 대한 ABCA3 양성 세포에서 p-AKT, Ki67 또는 CASP3 염색의 정량화. 각 기준점은 한 마리의 마우스로부터 30개 이상의 ABCA3-양성 세포의 평균이다. 도 12d: 폐 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱의 t-SNE 플롯. 도 12e-12f: p47^phox-KI 및 WT 폐의 폐 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱으로부터의 유전자 발현의 비교를 위한 바이올린 플롯. 도 12g: PDPN 및 활성화된 카스파제 3(CASP3)에 대한 항체로 염색된 ALI 폐 절편의 공초점 이미지. 도 12a-12c 및 12g의 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정).
도 13a-13e는 MAP3K2/3 및 호중구에 의한 p47^phox의 인산화에 대한 파조파닙의 효과를 나타낸다. 도 13a-13b: 시험관내 키나제 분석에서 MAP3K2 또는 3에 의한 p47^phox 인산화에 대한 다양한 용량의 파조파닙의 효과는 S208에서 항-포스포-p47^phox를 사용하여 결정되었다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(n=3회 독립적인 실험; 일원 Anova). 도 13c: 파조파닙은 fMLP(1μM)에 의해 자극된 호중구에서 p47^phox의 Ser-208의 인산화를 억제한다. 도 13d-13e: 파조파닙은 MAP3K2/3에 따라 fMLP(1μM)-자극된 호중구로부터 ROS 방출을 증가시킨다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(양측 Anova 검정, n=4).
도 14a-14b는 인산화 및 인간 호중구에 대한 파조파닙의 효과를 도시한다. 도 14a: 시험관내 키나제 분석에서 MAP3K2 또는 3에 의한 MEK5 인산화에 대한 파조파닙의 효과. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(일원 Anova). 도 14b: 마우스 호중구에서 ERK 및 p38 인산화에 대한 파조파닙의 효과.
도 15a-15h는 파조파닙이 ALI를 개선한다는 것을 도시한다. 도 15a 및 15b: 치료적 치료 방식의 도식적 표현. 마우스(C57Bl 암컷, 8주)를 1.5mg/Kg의 파조파닙으로 비강내로 처리하였다. 도 15c-15f: 손상 후 폐 투과성 및 조직학을 검사하였다(데이터는 평균 ± sem로 표시됨; 스튜던츠 t-검정, n=10). 혈관주위 간질성 부종의 정량화는 간질 부종 면적 대 혈관 면적의 비율로서 이루어졌다. 폐 손상의 정량화도 나타내어져 있다. 폐의 동일한 엽으로부터 8개 이상의 절편을 각 마우스에 대해 정량하였다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정; n=5). 도 15g-15h: 파조파닙의 치료적 처리는 ALI 모델에서 사망률을 감소시킨다(Mantel-Cox 로그 순위 검정; n=8).
도 16a-16j는 파조파닙이 ALI를 개선시킨다는 것을 도시한다. 도 16a: BAL 및 파조파닙의 존재 또는 부재하에 처리된 HCl 폐 손상을 거친 마우스의 폐로부터의 호중구를 DCFDA를 사용하여 ROS에 대해 측정하였다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다 (스튜던츠 t-검정, n=4). 도 16b-16d: 파조파닙은 BAL 및 폐의 호중구 침윤 또는 BAL 사이토카인 함량에 유의한 효과를 보이지 않는다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다. mock 및 파조파닙 치료 사이에 유의성 없음(스튜던츠 t-검정; n=5). 도 16e-16g: 예방적 방식의 도식적 표현. 마우스(C57Bl 암컷, 8주)를 LPS 모델에서는 3일 동안 위관영양법을 통해 60mg/Kg/일 파조파닙으로 처리한 반면, HCl 모델에서는 마우스를 1.5mg/Kg 파조파닙으로 비강내로 1회 처리하였다. 도 16g-16h: 손상 후 폐 투과성을 검사하였다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다 (스튜던츠 t-검정; n=5). 도 16i-16j: 사망률은 Mantel-Cox 로그 순위 검정을 사용하여 분석하였다.
도 17a-17e는 파조파닙이 MAP3K2/3-p47^phox 경로를 통해 작용한다는 것을 보여준다. 도 17a, 17b, 및 17d: 마우스를 도 15a에 기술된 바와 같이 처리한 다음 폐 투과성을 측정하였다. 도 17c: p47^phox S208A 녹-인(knock-in)은 ROS 생산을 증가시키고 호중구에 대한 파조파닙의 효과를 없앤다. WT 또는 p47^phox-KI 마우스의 호중구를 20nM의 파조파닙의 존재 또는 부재하에 fMLP(1μM)로 자극하였다. 도 17e: HCl 주입 직전 꼬리 정맥을 통해 페길화된 카탈라제(2000U/마우스)를 정맥내 투여하면 투과성이 증가하고 HCl-유도된 투과성 변화에서 파조파닙의 효과가 없어진다. 도 17a-17e의 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(이원 Anova; ns, 유의하지 않음).
도 18a-18c는 파조파닙의 작용 메카니즘을 도시한다. 도 18a: 파조파닙은 p47^phox가 결핍된 마우스에서 생존율을 증가시키지 못했다. 도 18b: 파조파닙은 ALI 폐 추출물에서 S473에서 AKT의 인산화를 증가시킨다. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정). 도 18c: AKT 억제제(MK-2206)는 HCl-손상된 폐에서 파조파닙의 보호 효과를 없앤다(데이터는 평균 ± sem로 표시된다).
도 19a-19d는 파조파닙이 인간 손상된 폐에서 부종을 개선한다는 것을 도시한다. 도 19a: 100nM의 fMLP의 존재하에서 인간 호중구로부터의 ROS 생산에 대한 파조파닙의 효과. 데이터는 평균 ± sem로 표시된다(스튜던츠 t-검정, n=12). 도 19b: 5쌍 LT(폐 이식) 수용자의 환자 정보. 도 19c: 폐 부종에 대한 파조파닙의 효과. *p<0.05 (선형 혼합 모델 반복 측정 분석). 도 19d: 대표적인 흉부 X선 이미지. 흉부 X-선 검사는 수술 후 1일 및 2일에 수행하였다. 환자 #1a는 적색 윤곽선으로 표시된 왼쪽 폐를 제공받았고 약물은 받지 않은 반면, 환자 #1b는 동일한 기증자로부터 녹색 윤곽선으로 표시된 오른쪽 폐를 제공받았고 파조파닙을 제공받았다. 환자 #1b는 1일째에 환자 #1a보다 폐 혼탁을 덜 나타내었고, 2일째에는 유의적인(significant) 개선이 있었다. 참고로, 환자 #1b는 나중에 수술을 받았고 환자 #1a보다 허혈 시간이 더 길었다.
도 20은 HCl-유도된 ALI 모델에서 파조파닙 IV에 대한 비제한적인 투과율 백분율을 도시한다.
도 21은 MHV-1 마우스 모델에서 파조파닙 IV에 대한 비제한적인 투과율 백분율을 도시한다(연구 1).
도 22는 MHV-1 마우스 모델에서 파조파닙 IV에 대한 비제한적인 투과율 백분율을 도시한다(연구 2).
도 23은 2-파트 2상 연구에 대한 비제한적 설계 다이어그램을 도시하고, 여기서 Pts는 참가자를 나타내고 QXT-101은 파조파닙 IV를 나타낸다.

본 개시내용은 부분적으로 MAP3K2 및/또는 MAP3K3 억제가 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)(IRI), 급성 폐 손상(acute lung injury)(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome)(ARDS)을 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견에 관한 것이다.

뇌졸중 동안 호중구가 풍부하게 축적되고, 혈전용해-후 재관류가 호중구를 더욱 활성화시킨다. 뇌 실질로의 호중구의 이동 및 이들의 풍부한 프로테아제의 방출은 일반적으로 신경 세포 사멸의 주요 원인으로 간주되며 혈액 뇌 장벽(BBB)의 파괴, 뇌 부종 및 뇌 손상에 기여한다. 또한, ALI의 특징 중 하나는 폐에 호중구가 풍부하게 존재한다는 것이며 여기서 이들은 미생물 감염에 대한 선천 면역에서 중요한 역할을 하고 염증-관련 조직 손상에 기여하며 폐 부종 형성과 명확하게 연관되어 있다. 호중구는 ALI/ARDS에서 염증성 조직 손상의 확장 및 장벽 기능의 붕괴에서 주된 역할을 하며, 이들 백혈구는 COVID-19에서도 폐 손상을 증폭시키는 것으로 보이며, 이는 호중구가 COVID-19 환자에서 ARDS 발병 및 ARDS에서 사망으로의 진행에 있어 위험 인자임을 보여주는 발견에 의해 뒷받침된다. 또한, 증가된 호중구 수준은 이 집단에서 질병 중증도와 관련이 있는 것으로 나타났다.

호중구는 주로 NOX 계열의 구성원인 식세포 NADPH 산화효소를 통해 반응성 산소종(ROS)을 생성한다. 이것은 4개의 세포질 성분(p47^phox, p67^phox, p40^phox, 및 Rac)과 2개의 막 서브유닛(gp91^phox/NOX2 및 p22^phox)로 구성된다. 세포 활성화시, 세포질 성분이 막 성분으로 동원되어 활성 홀로효소(holoenzyme)를 형성하여 ROS를 생성한다. 주요 활성화 사건 중 하나는 PKC를 포함한 단백질 키나제에 의한 세포질 p47^phox 서브유닛의 인산화이다. 인산화는 내부 SH3 도메인을 포함하는 자가-억제 분자내 상호작용을 방해하여, NADPH 산화효소의 활성화에 필요한 p22^phox와의 상호작용을 야기한다. MAP3K2 및 MAP3K3은 Serine 208에서 p47^phox를 인산화함으로써 호중구 NADPH 산화효소의 음성 조절인자이다. 이러한 인산화는, p47^phox에서 이전에 알려진 인산화 부위와 대조적으로, p22^phox와 p47^phox 상호작용을 방지하고 NADPH 산화효소 활성 억제 및 ROS 억제를 야기한다. MAP3K2/3의 유전적 손실 또는 이들의 약리학적 억제는 호중구에서 ROS 생산을 증가시킨다. 호중구에서 방출된 ROS는 H₂O₂로 전환되며, 이것이 내피 세포에 작용하여 장벽 기능을 강화하고 염증 반응을 억제하며 유익한 치료 효과를 제공한다.

본원에 입증된 바와 같이, MAP3K2/3 활성을 억제하는 파조파닙은 호중구에서 ROS 생산을 증가시키고 뇌 IRI를 개선한다. 중대뇌 동맥 폐쇄(MCAO)의 관내 필라멘트 또는 봉합사 모델을 사용하여, 파조파닙 치료는 재관류 후 0.5시간에 i.v. 제공될 때 더 적은 경색 크기 및 개선된 신경학적 결손 점수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본원에 추가로 입증된 바와 같이, 파조파닙은 골수 세포에서 ROS 생산을 증가시키고 급성 폐 손상을 개선한다. 파조파닙은 폐 혈관계 완전성을 강화하고 폐 상피 세포 생존 및 증식을 촉진하여 폐 장벽 기능 및 ALI에 대한 내성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 파조파닙은 ALI 사망률을 감소시키고 부종을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 파조파닙은 2개의 마우스 ALI 모델에서 MAP3K2/3 결핍의 효과, 즉 폐 투과성 및 간질성 부종의 감소 및 생존률 증가를 반복하는 것으로 나타났다. 또한, 코로나바이러스-유도된 마우스 폐 손상 모델인 뮤린 간염 바이러스 균주 1(MHV-1)에서, 파조파닙으로의 치료는 폐 투과성의 유의한 감소를 제공하였다.

이전에 어떠한 약물도 ALI 또는 ARDS 환자의 생존률에 있어 유의한 개선을 입증하지 못했으며, 현재 SARS CoV-2 감염 환자에서 폐 손상(ALI 또는 ARDS) 치료에 승인된 약물은 없다. 또한, ALI에서 파조파닙에 대한 MoA(작용 기전)는 독특하며 현재까지 ALI/ARDS 환자에서 임상적으로 평가된 다른 약물과는 다르다. 이것은 또한 면역 반응의 다른 측면을 표적으로 하는 COVID-19에 대해 조사중인 다른 '면역억제제'와도 다르다. 면역억제제의 사용은 병리학적 면역 반응의 억제와 면역-매개 바이러스 제거의 보존 사이의 균형을 필요로 한다. 하나의 측면에서, ALI/ARDS에서 파조파닙에 대한 새로 발견된 잠재적 메카니즘에 기반하여, 면역 억제가 예상되지 않아 이 약제는 COVID-19와 같은 코로나바이러스 감염을 앓고 있는 환자에게 보다 유리한 대체 치료제를 제공한다.

본 개시내용은 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI, 및/또는 ARDS를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물은 재관류가 발생한 후에 대상체에게 투여된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 다음 용어 각각은 이 섹션에서 이와 관련된 의미를 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, "약"은, 양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 여전히 보다 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미하며, 이러한 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다.

질환 또는 장애의 증상의 중증도, 환자가 이러한 증상을 경험하는 빈도, 또는 둘 다가 감소하면, 질환 또는 장애가 "완화"된다.

하나의 측면에서, 대상체와 관련하여 용어 "공동-투여된" 및 "공동 투여"는 본 개시내용 내에서 고려되는 장애 또는 질환을 또한 치료할 수 있는 화합물과 함께 본 개시내용의 화합물 또는 이의 염을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 공동-투여된 화합물은 별도로, 또는 단일 치료 접근법의 일부로 임의의 종류의 조합으로 투여된다. 공동-투여된 화합물은 다양한 고체, 겔 및 액체 제형하에 고체 및 액체의 혼합물로서, 및 용액으로서 임의의 종류의 조합으로 제형화될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "조성물" 또는 "약제학적 조성물"은 본 개시내용 내에서 유용한 적어도 하나의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체의 혼합물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 환자 또는 대상체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 한다. 정맥내, 경구, 에어로졸, 비경구, 안과, 비강, 폐 및 국소 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 화합물을 투여하는 다중 기법들이 당업계에 존재한다.

본원에 사용된 "질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화되는 동물의 건강 상태이다.

동물에서 본원에 사용된 바와 같은 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면, 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 더 저하시키는 것은 아니다.

본원에 사용된 용어 "유효량", "약제학적 유효량" 및 "치료적 유효량"은 무독성이지만 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 제제(agent)의 양을 지칭한다. 그 결과는 질환의 하나 이상의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변화일 수 있다. 임의의 개별 경우에 적절한 치료량은 일상적인 실험을 사용하여 당업계의 통상의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.

"설명 자료(instructional material)"는, 이 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 키트(kit)에서 본 개시내용의 조성물 및/또는 화합물의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록, 도표, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 키트의 설명 자료는, 예를 들면, 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 화합물 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 배송될 수 있다. 대안적으로, 설명 자료는 수용자가 설명 자료와 화합물을 협력적으로 사용할 의도로 용기와는 별도로 배송될 수 있다. 설명 자료의 전달은, 예를 들면, 간행물 또는 키트의 유용성을 전달하는 다른 표현 매체의 물리적 전달에 의해 이루어질 수 있거나, 대안적으로 예를 들어 전자 메일과 같은 컴퓨터에 의한 전자 전송에 의해 달성되거나 웹사이트에서 다운로드할 수 있다.

용어 "환자", "대상체" 또는 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 본원에 기술된 방법에 따른 시험관내 또는 동일 반응계에서의 임의의 동물 또는 이의 세포를 지칭한다. 비제한적 실시양태에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "파조파닙"은 5-((4-((2,3-디메틸-2H-인다졸-6-일)(메틸)아미노)피리미딘-2-일)아미노)-2-메틸벤젠설폰아미드, 또는 이의 염, 호변이성체, 및/또는 용매화물을 지칭한다:

본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기하지 않고 비교적 비독성인 담체 또는 희석제와 같은 물질을 지칭하며, 즉 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 이것이 함유된 조성물의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에서 또는 환자에게 본 개시내용 내에서 유용한 화합물의 운반 또는 수송하는데 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 안정제, 분산제, 현탁제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 담체를 의미한다. 전형적으로, 이러한 작제물은 신체의 하나의 기관 또는 일부에서 신체의 다른 기관 또는 일부로 운반되거나 수송된다. 각각의 담체는 본 개시내용 내에서 유용한 화합물을 포함하는 제형의 다른 성분과 상용성이며 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; 분말상 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 호마유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 표면 활성제; 알긴산; 피로겐-비함유 물; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알콜; 인산염 완충액; 및 약제학적 제형에서 사용되는 기타 무독성 상용성 물질. 본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"는 또한 본 개시내용 내에서 유용한 화합물의 활성과 상용성이고 환자에게 생리학적으로 허용되는 임의의 및 모든 코팅, 항균제 및 항진균제, 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 개시내용 내에서 유용한 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 실시에 사용되는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 기타 추가 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)]에 기술되어 있다.

본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 약제 또는 화합물의 투여가 시작될 당시 이러한 증상이 발병하지 않은 대상체에서 질환 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 발병을 피하거나 지연시키는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "재관류 손상" 또는 "허혈-재관류 손상" 또는 "IRI" 또는 "재산소화 손상"은 허혈 또는 산소 부족(무산소 또는 저산소증) 기간 후에 조직으로 혈액 공급이 회복될 때 야기되는 조직 손상이다. 허혈 기간 동안 혈액으로부터의 산소 및 영양소의 결핍은 순환 회복이 정상 기능의 회복보다(또는 이와 함께) 산화 스트레스의 유도를 통해 염증 및 산화 손상을 초래하는 상태를 만든다. 허혈성 조직의 재관류는 종종 미세혈관 손상과 관련이 있으며, 특히 조직을 가로질러 확산 및 유체 여과의 증가를 야기하는 모세혈관과 세동맥의 투과성 증가로 인한 것이다. 재관류 손상은 뇌졸중에서 저산소성 뇌 손상의 생화학에서 중요한 역할을 한다. 유사한 실패 과정이 심장 마비의 역전 후 뇌 부전에 관여된다. 허혈 및 재관류 손상의 반복되는 병치레는 또한 욕창(pressure sores) 및 당뇨병성 족부 궤양(diabetic foot ulcer)과 같은 만성 상처의 형성 및 치유 실패로 이어지는 요인으로 생각된다. 지속적인 압력은 혈액 공급을 제한하고 허혈을 유발하며, 재관류 동안 염증이 발생한다. 이 과정이 반복됨에 따라, 결국 상처를 입힐 정도로 조직이 손상된다. 또한, 재관류 손상은 이식 수술(간, 폐, 심장 및 신장과 같지만 이에 제한되지 않음)의 일반적인 합병증이다.

본원에 사용된 용어 "ROS"는 반응성 산소 종을 지칭한다. ROS의 비제한적인 예는 퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼 및/또는 일중항 산소이다.

용어 "염"은 본 개시내용의 방법 내에서 유용한 유리 산 및/또는 염기의 부가염을 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적 적용에서 유용성을 제공하는 범위 내의 독성 프로파일을 갖는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되지 않는 염은 그럼에도 불구하고 본 발명의 방법 내에서 유용한 화합물 및/또는 조성물의 합성, 정제 또는 제형화 과정에서의 유용성과 같은 본 발명의 실시에서 유용성을 갖는 높은 결정도와 같은 특성을 가질 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 탄산, 황산(황산염 및 황산수소 포함) 및 인산(인산수소 및 인산이수소 포함)을 포함한다. 적절한 유기산은 유기산의 지방족, 지환족, 방향족, 아르지방족, 헤테로사이클릭, 카복실산 및 설폰산 부류로부터 선택될 수 있으며, 이의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 말론산, 사카린, 푸마르산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 4-하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산(파모산), 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 판토텐산, 2-하이드록시에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로메탄설폰산, 설파닐산, 사이클로헥실아미노설폰산, 스테아르산, 알긴산, β-하이드록시부티르산, 살리실산, 갈락타르산 및 갈락투론산을 포함한다. 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물의 적합한 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은, 예를 들면, 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 전이 금속 염을 포함하는 금속 염, 예를 들면 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은 또한 염기성 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민(N-메틸글루카민으로도 알려짐) 및 프로카인으로부터 제조된 유기 염을 포함한다. 이들 염 모두는, 예를 들면, 적절한 산 또는 염기를 화합물 및/또는 조성물과 반응시킴으로써 상응하는 화합물로부터 제조될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 화합물의 "용매화물"은 하나 이상의 용매 분자와 화합물의 회합에 의해 형성된 실체를 지칭한다. 용매화물은 물, 에테르(예를 들어, 테트라하이드로푸란, 메틸 3급-부틸 에테르) 또는 알콜(예를 들어, 에탄올) 용매화물, 아세테이트 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물은 물 및 에탄올과 같은 용매와 함께 용매화된 형태로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물은 용매화되지 않은 형태로 존재한다.

본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 제1 분자가 제2 분자(예를 들어, 특정 수용체 또는 효소)에 우선적으로 결합하지만, 반드시 그 제2 분자에만 결합하는 것은 아님을 의미한다.

"치료적" 치료는 병리 징후를 감소시키거나 제거할 목적으로 병리 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료이다.

본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 본원에서 고려되는 상태 및/또는 본원에서 고려되는 상태의 하나 이상의 증상을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 구제, 개량, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로, 환자에의 치료제, 즉 본 개시내용의 화합물(단독으로 또는 다른 약제학적 제제와 조합하여)의 적용 또는 투여, 또는 본원에서 고려되는 상태 및/또는 본원에서 고려되는 상태의 하나 이상의 증상이 있는 (예를 들어, 진단 또는 생체외 적용을 위해) 환자로부터 단리된 조직 또는 세포주에의 치료제의 적용 또는 투여로서 정의된다. 이러한 치료법은 약리유전체학 분야에서 얻은 지식을 기반으로 특별히 맞춤화되거나 수정될 수 있다.

하기 비제한적인 약어가 본원에서 사용된다: MAP3K2 또는 MEKK2, 미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 2; MAP3K3 또는 MEKK3, 미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 3; MEK, 미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제; MEKK, MEK 키나제; RBC, 적혈구; ROS, 반응성 산소 종.

본 개시내용 전체에 걸쳐, 본 개시내용의 다양한 측면은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 개시내용의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위를 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.1, 5.3, 5.5 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.

화합물 및 조성물

특정 실시양태에서, 파조파닙, 및 이의 염 또는 용매화물이 본 개시내용의 방법 내에서 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용 내에서 유용한 화합물 및/또는 조성물은 미국 특허 제7,105,530호; 제7,262,203호; 제7,858,626호; 및 제8,114,885호에 인용되어 있으며; 이들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물이 또한 본 개시내용 내에서 고려된다.

방법

재관류 손상, 허혈- 재관류 손상 및/또는 재산소화 손상을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법

본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 재관류 손상(reperfusion injury), 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury), 및/또는 재산소화 손상(reoxygenation injury)을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법을 포함한다. 본 개시내용은 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)을 앓고 있는 대상체에서 허혈-재관류 손상을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법을 포함한다. 본 개시내용은 허혈성 뇌졸중을 앓지 않는 대상체에서 허혈-재관류 손상을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙, 및/또는 이의 염 및/또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 투여 경로는 경구이다. 또 다른 실시양태에서, 투여 경로는 비경구이다. 또 다른 실시양태에서, 투여 경로는 경구, 비경구, 비강, 흡입, 기관내, 폐내 및 기관지내로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 1일 3회, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 2일마다, 약 3일마다, 약 4일마다, 약 5일마다, 약 6일마다 및/또는 약 일주일에 한 번 대상체에게 투여된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 관류가 발생한 후에 대상체에게 투여된다.

특정 실시양태에서, 대상체에서 IRI를 치료하는데 필요한 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 용량은 경구로 대상체에서 암(예를 들어, 진행성 신세포 암종(advanced renal cell carcinoma))을 치료하는데 필요한 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 용량보다 낮다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 내에서 사용되는 용량은 대상체의 체중당 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 질량으로 환산하여 암을 치료하는데 필요한 경구 용량의 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 또는 1:100이다. 또 다른 실시양태에서, 약제의 용량은 약 5-200mg/일이다.

특정 실시양태에서, 대상체에 대한 화합물 및/또는 조성물의 투여는 암을 치료하기 위한 화합물 및/또는 조성물의 투여와 관련된 유의적인 이상 반응, 부작용 및/또는 독성을 일으키지 않는다. 이상 반응, 부작용 및/또는 독성의 비제한적인 예는 간독성(hepatotoxicity)(이것은 혈청 트랜스아미나제 수준 및 빌리루빈의 증가에 의해 입증 및/또는 검출될 수 있음), 연장된 QT 간격 및 다형성 심실 빈맥(torsade de pointes), 출혈성 사건, 응고의 감소 또는 방해, 동맥 혈전성 사건, 위장관 천공 또는 누공(fistula), 고혈압, 갑상선 기능 저하증, 단백뇨, 설사, 모발 색 변화(탈색), 메스꺼움, 식욕 부진 및 구토를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 대상체는 중환자실(ICU)에서 치료를 받고 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 응급실(ER)에서 치료를 받고 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 산소 호흡기를 달고 있다.

특정 실시양태에서, 대상체는 IRI의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선 및/또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제를 추가로 투여받는다.

특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 개시내용은 IRI를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 호중구를 약물과 접촉시키는 단계 및 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준이 증가하면, 약물은 IRI을 치료하는데 효과적이다.

본 개시내용은 IRI를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 약물 투여 후 대상체에서 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 것을 포함한다. 약물 투여 후 대상체의 호중구 ROS 생산 수준이 약물 투여 전 대상체의 호중구 ROS 생산 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 IRI을 치료하는데 효과적이다.

폐 손상을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 또는 급성 폐 손상을 예방, 개선 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상이 급성 폐 손상으로 진행되었다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상은 ALI로 진행되지 않았다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염은 COVID-19이다. 특정 실시양태에서, 급성 폐 손상은 ARDS이다. 특정 실시양태에서, ALI/ARDS는 지질다당류(LPS)-유도된 ALI/ARDS이다. 특정 실시양태에서, ALI는 흡인-유도된 ALI/ARDS이다. 특정 실시양태에서 흡인-유도된 ALI/ARDS로 고통받는 대상체는 의식 장애(약물 과다복용, 발작, 뇌혈관 사고, 진정제, 마취 절차를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)를 가진 대상체 또는 허약한 노인 대상체이다. 특정 실시양태에서, 페 손상은 허혈 재관류에 의해 유발되는 ALI/ARDS이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 폐 이식과 관련된 허혈 재관류 손상에 의해 유발된 ALI/ARDS를 치료, 개선 및/또는 예방한다. 특정 실시양태에서, 급성 폐 손상은 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 의해 유발된 ARDS이다. 특정 실시양태에서, ALI/ARDS는 코로나바이러스 감염과 관련된다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염은 COVID-19이다.

특정 실시양태에서, 파조파닙 염은 파조파닙 염산염이다. 특정 실시양태에서, 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물은 당업계의 숙련가에게 공지된 임의의 추가 성분을 포함하는 조성물 또는 제형으로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물/제형은 하이드록시프로필 베타덱스(HPB)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물/제형은 파조파닙 염산염, HPB 및 주사용수를 포함하는 정맥내 조성물이다.

파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물은 당업계의 숙련에게 공지된 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 경구이다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 비강이다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 정맥내이다. 또 다른 실시양태에서, 투여 경로는 경구, 비경구(정맥내와 같지만, 이에 제한되지 않음), 비강, 흡입, 기관내, 폐내 및 기관지내로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS이 발생하기 전에 대상체에게 투여된다. 특정의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS이 발생한 후에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 약 1일 3회, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 2일마다, 약 3일마다, 약 4일마다, 약 5일마다, 약 6일마다 및/또는 약 일주일에 한 번 대상체에게 투여된다. 특정의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물은 진정, 마취 절차 또는 폐 이식과 같은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 초래할 수 있는 발생 전에 짧은 기간 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 짧은 기간은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 초래할 수 있는 발생 전 약 한 달 내지 약 하루 사이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS을 초래할 수 있는 발생일에 대상체에게 투여되며, 여기서 화합물 및/또는 조성물은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 초래할 수 있는 발생 직전까지 당일 어느 때라도 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 대상체에서 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS을 치료하는데 필요한 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 용량은 경구로 대상체에서 암(진행성 신세포 암종(advanced renal cell carcinoma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 치료하는데 필요한 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 용량보다 낮다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 내에서 사용되는 용량은 대상체의 체중당 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물의 질량으로 환산하여 암을 치료하는데 필요한 경구 용량의 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 또는 1:100이다. 또 다른 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-500 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-450 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-400 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-350 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-300 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5 mg/일, 10 mg/일, 15 mg/일, 20 mg/일, 25 mg/일, 30 mg/일, 35 mg/일, 40 mg/일, 45 mg/일, 50 mg/일, 55 mg/일, 60 mg/일, 65 mg/일, 70 mg/일, 75 mg/일, 80 mg/일, 85 mg/일, 90 mg/일, 95 mg/일, 100 mg/일, 105 mg/일, 110 mg/일, 115 mg/일, 120 mg/일, 125 mg/일, 130 mg/일, 135 mg/일, 140 mg/일, 145 mg/일, 155 mg/일, 160 mg/일, 165 mg/일, 170 mg/일, 175 mg/일, 180 mg/일, 185 mg/일, 190 mg/일, 195 mg/일, 200 mg/일, 205 mg/일, 210 mg/일, 215 mg/일, 220 mg/일, 225 mg/일, 230 mg/일, 235 mg/일, 240 mg/일, 245 mg/일, 250 mg/일, 255 mg/일, 260 mg/일, 265 mg/일, 270 mg/일, 275 mg/일, 280 mg/일, 285 mg/일, 290 mg/일, 295 mg/일, 또는 300 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5 mg/일, 10 mg/일, 15 mg/일, 20 mg/일, 25 mg/일, 30 mg/일, 35 mg/일, 40 mg/일, 45 mg/일, 50 mg/일, 55 mg/일, 60 mg/일, 65 mg/일, 70 mg/일, 75 mg/일, 80 mg/일, 85 mg/일, 90 mg/일, 95 mg/일, 100 mg/일, 105 mg/일, 110 mg/일, 115 mg/일, 120 mg/일, 125 mg/일, 130 mg/일, 135 mg/일, 140 mg/일, 145 mg/일, 155 mg/일, 160 mg/일, 165 mg/일, 170 mg/일, 175 mg/일, 180 mg/일, 185 mg/일, 190 mg/일, 195 mg/일, 200 mg/일, 205 mg/일, 210 mg/일, 215 mg/일, 220 mg/일, 225 mg/일, 230 mg/일, 235 mg/일, 240 mg/일, 245 mg/일, 250 mg/일, 255 mg/일, 260 mg/일, 265 mg/일, 270 mg/일, 275 mg/일, 280 mg/일, 285 mg/일, 290 mg/일, 295 mg/일, 또는 300 mg/일과 같거나 더 크다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5 mg/일, 10 mg/일, 15 mg/일, 20 mg/일, 25 mg/일, 30 mg/일, 35 mg/일, 40 mg/일, 45 mg/일, 50 mg/일, 55 mg/일, 60 mg/일, 65 mg/일, 70 mg/일, 75 mg/일, 80 mg/일, 85 mg/일, 90 mg/일, 95 mg/일, 100 mg/일, 105 mg/일, 110 mg/일, 115 mg/일, 120 mg/일, 125 mg/일, 130 mg/일, 135 mg/일, 140 mg/일, 145 mg/일, 155 mg/일, 160 mg/일, 165 mg/일, 170 mg/일, 175 mg/일, 180 mg/일, 185 mg/일, 190 mg/일, 195 mg/일, 200 mg/일, 205 mg/일, 210 mg/일, 215 mg/일, 220 mg/일, 225 mg/일, 230 mg/일, 235 mg/일, 240 mg/일, 245 mg/일, 250 mg/일, 255 mg/일, 260 mg/일, 265 mg/일, 270 mg/일, 275 mg/일, 280 mg/일, 285 mg/일, 290 mg/일, 295 mg/일, 또는 300 mg/일과 같거나 더 낮다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-250 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-200 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-150 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 5-100 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 200 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 비강내 또는 경구 용량은 약 200 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 용량은 약 80 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 정맥내 용량은 약 80 mg/일이다. 특정 실시양태에서, 약물의 정맥내 용량은 HPB 및 주사용수를 추가로 포함하는 파조파닙 염산염 조성물/제형의 약 80 mg/일이다.

특정 실시양태에서, 대상체에 대한 화합물 및/또는 조성물의 투여는 암을 치료하기 위한 화합물 및/또는 조성물의 투여와 관련된 유의적인 이상 반응, 부작용 및/또는 독성을 일으키지 않는다. 이상 반응, 부작용 및/또는 독성의 비제한적인 예는 간독성(hepatotoxicity)(이것은 혈청 트랜스아미나제 수준 및 빌리루빈의 증가에 의해 입증 및/또는 검출될 수 있음), 연장된 QT 간격 및 다형성 심실 빈맥(torsade de pointes), 출혈성 사건, 응고의 감소 또는 방해, 동맥 혈전성 사건, 위장관 천공 또는 누공, 고혈압, 갑상선 기능 저하증, 단백뇨, 설사, 모발 색 변화(탈색), 메스꺼움, 식욕 부진 및/또는 구토를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 대상체는 중환자실(ICU)에서 치료를 받고 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 응급실(ER)에서 치료를 받고 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 산소 호흡기를 달고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 진정 또는 마취 절차를 포함하는 치료를 받고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 폐 이식을 받고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 코로나바이러스 감염에 대한 치료를 받고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 COVID-19에 대한 치료를 받고 있다.

특정 실시양태에서, 대상체는 ALI/ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선 및/또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제를 추가로 투여받는다. 예시적인 제제는 글루코코르티코이드, 계면활성제, N-아세틸시스테인, 흡입 산화질소, 리포솜 PGE 1, 포스포디에스테라제 억제제(예를 들어, 리소필린, 펜톡시필린), 살부타몰 IV, 프로시스테인, 활성화된 단백질 C, 흡입 알부테롤, 항진균제, 이뇨제, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, ALI/ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선 및/또는 감소시키는 치료가 대상체에게 제공된다. 예시적인 치료는 신소호흡기 지원, 엎드린 자세, 체외막 산소 공급, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 대상체는 코로나바이러스 감염에 대한 적어도 하나의 추가 제제 치료 및/또는 요법을 추가로 투여받는다. 치료 및/또는 요법은 증상 완화를 위한 일반의약품, 예를 들어, 아세트아미노펜; 기계적 환기; 항바이러스제; 및 플라즈마 요법을 포함할 수 있다. 예시적인 항바이러스 약물은 아바카비르, 아시클로비르, 아데포비르, 아만타딘, 앰플리젠, 암프레나비르, 아르비돌 우미페노비르, 아타자나비르, 아트리플라, 발록사비르 마르복실, 빅타비, 보세프레비르, 불레비르티드, 시도포비르, 코비시스타트, 콤비비르, 다클라타스비르, 다루나비르, 델라비르딘, 데스코비, 디다노신, 도코사놀, 돌루테그라비르, 도라비린, 에독수딘, 에파비렌즈, 엘비테그라비르, 엠트리시타빈, 엔푸비르타이드, 엔테카비르, 에트라비린, 팜시클로비르, 포미비르센, 포삼프레나비르, 포스카넷, 간시클로비르, 이바시타빈, 이발리주맙, 이독수리딘, 이미퀴모드, 이무노비르, 인디나비르, 라미부딘, 레터모비르, 로피나비르, 로비리드, 마라비록, 메티사존, 모록시딘, 넬피나비르, 네비라핀, 넥사비르, 니타족사나이드, 노르비르, 오셀타미비르, 펜시클로비르, 페라미비르, 플레코나릴, 포도필로톡신, 랄테그라비르, 렘데시비르, 리바비린, 릴피비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 시메프레비르, 소포스부비르, 스타부딘, 타리바비린, 텔라프레비르, 텔비부딘, 테노포비르 알라페나미드, 테노포비르 디소프록실, 테노포비르, 티프라나비르, 트리플루리딘, 트리지비르, 트로만타딘, 트루바다, 우미페노비르, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 비크리비록, 비다라빈, 잘시타빈, 자나미비르, 지도부딘, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 치료 및/또는 요법은 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스 감염의 치료, 개선 및/또는 예방을 돕는 약제학적 활성 화합물을 포함한다. 코로나바이러스 감염의 치료, 개선 및/또는 예방에 도움이 되는 것으로 여겨지는 예시적인 화합물은 렘데시비르, 덱사메타손, 하이드록시클로로퀸, 클로로퀸, 아지트로마이신, 토실리주맙, 아칼라브루티닙, 토파시티닙, 룩소리티닙, 바리시티닙, 아나킨라, 카나키누맙, 아프레밀라스트, 마릴리무맙, 사릴루맙, 로피나비르, 리토나비르, 오셀타미비르, 파비피라비르, 우미페노비르, 갈리데시비르, 콜히친, 이버멕틴, 비타민 D, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2)에 감염된 것으로 결정된 대상체 또는 코로나바이러스(예를 들어, COVID-19)로 인한 감염 또는 질환으로 진단된 대상체는 격리되거나 자가 격리가 요청된다.

특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

본 개시내용은 코로나바이러스 감염와 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 호중구를 약물과 접촉시키는 단계 및 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준이 증가하면, 약물은 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 치료하는데 효과적이다.

본 개시내용은 코로나바이러스 관련 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 약물 투여 후 대상체에서 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 것을 포함한다. 약물 투여 후 대상체의 호중구 ROS 생산 수준이 약물 투여 전 대상체의 호중구 ROS 생산 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 코로나바이러스 관련 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 치료하는데 효과적이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 약물 투여 후 대상체의 폐에서 H₂O₂의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 약물 투여 후 대상체의 폐의 H₂O₂ 수준이 약물 투여 전 대상체의 폐의 H₂O₂수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 코로나바이러스 관련 폐 손상 및/또는 ALI/ARDS를 치료하는데 효과적이다.

이론에 의해 제한되고 싶지는 않지만, 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여하면 MEK 키나제 MAP3K2 및 MAP3K3의 억제를 초래하는 것으로 믿어지며, 여기서 MAP3K2 및 MAP3K3의 억제는 호중구로부터의 ROS 증가를 야기한다. ROS는 폐에서 H₂O₂로 전환되어 내피 세포에서 AKT 인산화를 자극하여 혈관 장벽 완전성을 강화하고 모세혈관 누출을 방지하며 폐의 폐포액을 제거하는 것으로 가정된다. 또한 낮은 농도의 H₂O₂는 폐 내피 세포의 경내피 전기 저항을 강화하고 이들 세포에서 AKT 인산화를 자극하는 것으로 믿어진다. 따라서, 대상체에게 치료적 유효량의 파조파닙 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여하면 폐 혈관계 완전성이 향상되고 폐 상피 세포 생존 및 증식이 촉진되어 폐 장벽 기능 및 코로나바이러스 감염 및/또는 ALI/ARDS에 대한 저항이 증가하는 것으로 가정된다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스 감염은 COVID-19이다.

키트

본 개시내용은 파조파닙, 및/또는 이의 염 및/또는 용매화물, 어플리케이터(applicator), 및 이의 사용에 대한 설명 자료를 포함하는 키트를 포함한다. 키트에 포함된 설명 자료는 IRI, 코로나바이러스 관련 폐 손상, ALI/ARDS, 또는 본 개시내용 내에서 고려되는 기타 질환 또는 장애를 예방, 개선 및/또는 치료하기 위한 설명을 포함한다. 설명 자료는 파조파닙 및/또는 이의 염 및/또는 용매화물이 대상체에게 투여되어야 하는 양 및 빈도를 언급한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 IRI, 코로나바이러스 감염, 및/또는 ALI/ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 개선, 예방 및/또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 ALI/ARDS 및/또는 코로나바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 치료, 개선, 예방 및/또는 감소시키는 것으로 여겨지는 치료를 대상체에게 제공하기 위한 설명을 추가로 포함한다. 예시적인 치료는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.

병용 요법

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물은 IRI, 코로나바이러스 감염, 또는 ALI/ARDS를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 유용한 적어도 하나의 추가 화합물 및/또는 요법과 조합하여 본 개시내용의 방법에 유용하다. 이러한 추가 화합물은 IRI, 코로나바이러스 감염, 및/또는 ALI/ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 개선, 예방 및/또는 감소시키는 것으로 알려진 본원에서 확인된 화합물 또는 화합물들, 예를 들어 상업적으로 이용 가능한 화합물을 포함할 수 있다.

본 개시내용 내에서 고려되는 추가 요법의 비제한적 예는 항염증 스테로이드 또는 비스테로이드 약물을 포함한다.

상승 효과는, 예를 들면, S자형(Sigmoid)-E_max 방정식(Holford & Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453), Loewe 가감성 방정식(Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326) 및 중앙값-효과 방정식(Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55)과 같은 적합한 방법을 사용하여 계산될 수 있다. 위에서 언급한 각 방정식은 약물 조합의 효과를 평가하는데 도움이 되는 상응하는 그래프를 생성하기 위해 실험 데이터에 적용될 수 있다. 위에서 언급한 방정식과 관련된 상응하는 그래프는 각각 농도-효과 곡선, 아이소볼로그램 곡선 및 조합 지수 곡선이다.

투여/투여량/제형

투여 섭생은 유효량을 구성하는 것에 영향을 미칠 수 있다. 치료 제형은 본 개시내용에서 고려되는 질환 또는 장애의 발병 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 여러 분할 투여량 및 시차 투여량이 매일 또는 순차적으로 투여될 수 있거나, 투여량이 연속적으로 주입되거나, 볼루스 주사(bolus injection)일 수 있다. 또한, 치료적 제형의 투여량은 치료적 또는 예방적 상황의 긴급성에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다.

본 개시내용의 방법에 유용한 약제학적 조성물은 안과, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강, 협측 또는 다른 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형은 프로젝트된 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유하는 재밀봉된 적혈구, 및 면역학적 기반 제형을 포함한다.

환자, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 대한 본 개시내용의 조성물의 투여는 공지된 절차를 사용하여, 본 개시내용에서 고려되는 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 투여량 및 기간 동안 수행될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 치료 화합물의 유효량은 환자에서의 질환 또는 장애의 상태; 환자의 연령, 성별 및 체중; 및 본 개시내용에서 고려되는 질환 또는 장애를 치료하는 치료 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 투여 섭생은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 여러 분할 용량이 매일 투여될 수 있거나 치료 상황의 긴급성에 의해 나타나는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소될 수 있다. 본 개시내용의 치료 화합물에 대한 유효 용량 범위의 비제한적인 예는 약 0.01 내지 5,000 mg/체중 kg/일이다. 당업계의 통상의 숙련가는 과도한 실험 없이 관련 인자를 연구하고 치료 화합물의 유효량에 관해 결정할 수 있을 것이다.

본 개시내용의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성 없이 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다.

본 개시내용의 화합물의 치료적 유효량 또는 용량은 환자의 연령, 성별 및 체중, 환자의 현재 의학적 상태 및 본 개시내용에서 고려되는 질환 또는 장애의 진행에 의존한다.

당업계의 통상의 기술을 가진 의학 박사, 예를 들어 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키기 위해 필요한 것보다 낮은 수준에서 약제학적 조성물에 사용된 본 개시내용의 화합물의 용량을 시작할 수 있다.

본 개시내용의 화합물의 적합한 용량은 1일 약 0.01 mg 내지 약 5,000 mg, 예를 들어 1일 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 예를 들면 약 1 mg 내지 약 500 mg, 예를 들어 약 5 mg 내지 약 250 mg의 범위일 수 있다. 용량은 단일 용량 또는 다중 용량, 예를 들어 1일 1 내지 4회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 다중 투여량이 사용되는 경우, 각 투여량의 양은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 1일 1mg의 용량은 0.5mg의 2회 용량으로 투여될 수 있으며, 용량 사이에는 약 12시간의 간격이 있다.

투여를 위한 본 개시내용의 화합물은 약 1 μg 내지 약 10,000 mg, 약 20 μg 내지 약 9,500 mg, 약 40 μg 내지 약 9,000 mg, 약 75 μg 내지 약 8,500 mg, 약 150 μg 내지 약 7,500 mg, 약 200 μg 내지 약 7,000 mg, 약 3050 μg 내지 약 6,000 mg, 약 500 μg 내지 약 5,000 mg, 약 750 μg 내지 약 4,000 mg, 약 1 mg 내지 약 3,000 mg, 약 10 mg 내지 약 2,500 mg, 약 20 mg 내지 약 2,000 mg, 약 25 mg 내지 약 1,500 mg, 약 30 mg 내지 약 1,000 mg, 약 40 mg 내지 약 900 mg, 약 50 mg 내지 약 800 mg, 약 60 mg 내지 약 750 mg, 약 70 mg 내지 약 600 mg, 약 80 mg 내지 약 500 mg, 및 그 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분 증분 범위일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물의 용량은 약 1 mg 내지 약 2,500 mg이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물에 사용되는 본 개시내용의 화합물의 용량은 약 10,000 mg 미만, 또는 약 8,000 mg 미만, 또는 약 6,000 mg 미만, 또는 약 5,000 mg 미만, 또는 약 3,000 mg 미만, 또는 약 2,000 mg 미만, 또는 약 1,000 mg 미만, 또는 약 500 mg 미만, 또는 약 200 mg 미만, 또는 약 50 mg 미만이다. 유사하게, 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 제2 화합물의 용량은 약 1,000 mg 미만, 또는 약 800 mg 미만, 또는 약 600 mg 미만, 또는 약 500 mg 미만, 또는 약 400 mg 미만, 또는 약 300 mg 미만, 또는 약 200 mg 미만, 또는 약 100 mg 미만, 또는 약 50 mg 미만, 또는 약 40 mg 미만, 또는 약 30 mg 미만, 또는 약 25 mg 미만, 또는 약 20 mg 미만, 또는 약 15 mg 미만, 또는 약 10 mg 미만, 또는 약 5 mg 미만, 또는 약 2 mg 미만, 또는 약 1 mg 미만, 또는 약 0.5 mg 미만, 및 이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분 증분이다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 1일 1회 내지 5회 또는 그 이상 범위의 투여량으로 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 매일 1회, 2일마다, 3일마다 내지 1주일에 1회, 및 2주마다 1회를 포함하지만 이에 제한되지 않는 투여량 범위로 환자에게 투여된다. 본 개시내용의 다양한 병용 조성물의 투여 빈도는 연령, 치료할 질환 또는 장애, 성별, 전반적인 건강 및 기타 요인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 요인에 따라 개인마다 다르다는 것이 당업계의 숙련가에게 용이하게 자명하다. 따라서, 본 개시내용은 임의의 특정 투여 요법으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 임의의 환자에게 투여될 정확한 투여량 및 조성물은 환자에 대한 모든 기타 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정된다.

1일당 투여되는 화합물의 양은, 비제한적인 예에서, 매일, 격일로, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 또는 5일마다 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 격일로 투여하는 경우, 1일당 5mg 용량은 월요일에 시작할 수 있으며, 첫 번째 후속 1일당 5mg 용량은 수요일에 투여하고, 두 번째 후속 1일당 5mg 용량은 금요일에 투여하는 식으로 계속될 수 있다.

환자의 상태가 개선되는 경우, 의사의 재량에 따라 본 개시내용의 억제제의 투여가 임의로 연속적으로 제공되고; 대안적으로, 투여되는 약물의 용량은 일시적으로 감소되거나 특정 기간 동안 일시적으로 연기된다(즉, "휴약기"). 휴약기의 길이는 임의로 단지 예를 들어 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일을 포함한 2일 내지 1년으로 다양하다. 휴약기 동안의 용량 감소는 단지 예를 들어 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함한 10%-100%를 포함한다.

일단 환자의 상태의 개선이 일어나면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 후속적으로, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 다는, 질환 또는 장애의 함수로서, 개선된 질환이 유지되는 수준으로 감소된다. 특정 실시양태에서, 환자는 하나 이상의 증상의 재발시 장기간에 걸친 간헐적 치료를 필요로 한다.

본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 화합물은 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 용어 "단위 투여 형태"는 치료를 받는 환자를 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각 단위는 임의로 적합한 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 단위 투여 형태는 단일 1일 용량 또는 다중 1일 용량(예를 들어, 1일 약 1 내지 4회 또는 그 이상) 중 하나일 수 있다. 다중 1일 용량이 사용되는 경우, 단위 투여 형태는 각 용량에 대해 동일하거나 상이할 수 있다.

LD₅₀(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)의 결정을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이러한 치료 섭생의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 임의로 결정된다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이며, 이것은 LD₅₀과 ED₅₀ 사이의 비율로서 표현된다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량 범위를 공식화하는데 임의로 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 최소 독성을 갖는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 임의로 달라진다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 사용하여 제형화된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 개시내용의 화합물 및 약제학적 허용되는 담체를 포함한다.

담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들면, 당, 염화나트륨, 또는 만니톨 및 소르비톨과 같은 다가 알콜을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 단독으로 또는 제2 약제와 조합하여, 본 개시내용의 화합물의 치료 유효량을 보유하는 용기; 및 본 개시내용에서 고려되는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선 및/또는 감소시키기 위해 화합물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 포장된 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제형은 통상적인 부형제, 즉 당업계에 공지된 임의의 적합한 투여 방식에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 사용될 수 있다. 약제학적 제제는 멸균될 수 있고 원하는 경우 보조제, 예를 들어 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압 완충제에 영향을 주기 위한 염, 착색제, 향미제 및/또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있다. 이들은 또한 원하는 경우 다른 활성제와 조합될 수 있다.

본 개시내용의 임의의 조성물의 투여 경로는 경구, 비강, 직장, 비경구, 설하, 경피, 경점막(예를 들어, 설하, 혀, (경)협측, (경)요도, 질(예를 들어, 경- 및 질주위), (내)비강 및 (경)직장), 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 척수강내, 피하, 근육내, 피내, 동맥내, 정맥내, 기관지내, 흡입 및 국소 투여를 포함한다.

적합한 조성물 및 투여 형태는, 예를 들면, 정제, 캡슐, 캐플릿, 환제, 겔 캡, 트로키, 분산액, 현탁액, 용액, 시럽, 과립, 비드, 경피 패치, 겔, 분말, 펠렛, 마그마, 로젠지, 크림, 페이스트, 플라스터, 로션, 디스크, 좌약, 비강 또는 경구 투여용 액체 스프레이, 흡입용 건조 분말 또는 에어로졸화 제형, 방광내 투여용 조성물 및 제형 등을 포함한다. 본 개시내용에서 유용한 제형 및 조성물은 본원에 기술된 특정 제형 및 조성물에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 약제학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 브리칭(breaching) 및 조직의 브리치를 통한 약제학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 따라서 비경구 투여는 조성물의 주사에 의한 약제학적 조성물의 투여, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 관통 비외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약제학적 조성물의 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 안내, 유리체내, 피하, 복강내, 근육내, 흉골내 주사, 종양내, 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다.

비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 앰플 또는 방부제를 함유한 다중 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식 가능한 서방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 특정 실시양태에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균 피로겐-비함유 물)로 재구성하기 위해 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.

추가 투여 형태

본 개시내용의 추가 투여 형태는 미국 특허 제6,340,475호; 제6,488,962호; 제6,451,808호; 제5,972,389호; 제5,582,837호; 및 제5,007,790호에 기술된 바와 같은 투여 형태를 포함한다. 본 개시내용의 추가 투여 형태는 또한 미국 특허 출원 제20030147952호; 제20030104062호; 제20030104053호; 제20030044466호; 제20030039688호; 및 제20020051820호에 기술된 바와 같은 투여 형태를 포함한다. 본 개시내용의 추가 투여 형태는 또한 PCT 출원 제WO 03/35041호; 제WO 03/35040호; 제WO 03/35029호; 제WO 03/35177호; 제WO 03/35039호; 제WO 02/96404호; 제WO 02/32416호; 제WO 01/97783호; 제WO 01/56544호; 제WO 01/32217호; 제WO 98/55107호; 제WO 98/11879호; 제WO 97/47285호; 제WO 93/18755호; 및 제WO 90/11757호에 기술된 바와 같은 투여 형태를 포함한다.

제어 방출 제형 및 약물 전달 시스템

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제형은 단기, 급속-오프셋 뿐만 아니라 제어 방출, 예를 들어 서방출, 지연 방출 및 박동성 방출 제형일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

지속 방출이라는 용어는 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 제공하고, 반드시 그런 것은 아니지만, 연장된 기간에 걸쳐 약물의 혈중 농도를 일정 기간 동안 실질적으로 일정하게 유지할 수 있는 약물 제형을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 기간은 한 달 이상으로 길 수 있으며 볼루스 형태로 투여된 동일한 양의 제제보다 더 긴 방출이어야 한다.

서방출을 위해, 화합물은 화합물에 서방출 특성을 제공하는 적합한 중합체 또는 소수성 물질과 함께 제형화될 수 있다. 이와 같이, 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 화합물은 마이크로입자 형태로, 예를 들면, 주사에 의해 또는 이식에 의해 웨이퍼 또는 디스크 형태로 투여될 수 있다.

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물은 서방출 제형을 사용하여 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 환자에게 투여된다.

지연 방출이라는 용어는 약물 투여 후 약간의 지연 후에 약물의 초기 방출을 제공하고, 반드시는 아니지만, 약 10분 내지 최대 약 12시간의 지연을 포함할 수 있는 약물 제형을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 본원에서 사용된다.

박동성 방출이라는 용어는 약물 투여 후 약물의 펄스형 혈장 프로파일을 생성하는 방식으로 약물의 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 본원에서 사용된다.

즉시 방출이라는 용어는 약물 투여 후 즉시 약물의 방출을 제공하는 약물 제형을 지칭하기 위해 통상적인 의미로 본원에서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 단기는 약물 투여 후 최대 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 40분, 약 20분, 또는 약 10분 및 이의 임의의 또는 모든 전체 또는 부분 증분의 기간을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 급속-오프셋은 약물 투여 후 최대 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 40분, 약 20분, 또는 약 10분 및 이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분 증분의 기간을 지칭한다.

당업계의 숙련가들은 일상적인 것 이상의 실험을 사용하여 본원에 기술된 특정 절차, 실시양태, 청구범위 및 실시예에 대한 수많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주되고 여기에 첨부된 청구범위에 의해 커버된다. 예를 들면, 당업계-인지된 대안을 사용하고 일상적인 실험만 사용하여 반응 및/또는 처리 조건을 수정하는 것은 본 출원의 범위 내에 있음을 이해해야 한다.

값 및 범위가 본원에 제공되는 경우에는 어디나, 이들 값 및 범위에 포함되는 모든 값 및 범위는 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 것으로 이해해야 한다. 더욱이, 이러한 범위 내에 속하는 모든 값 뿐만 아니라 값 범위의 상한 또는 하한도 본 출원에 의해 고려된다.

하기 실시예는 본 개시내용의 측면을 추가로 예시한다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로든 본원에 제시된 바와 같은 본 개시내용의 교시 또는 개시내용을 제한하지 않는다.

실시예

본 개시내용은 이제 하기 실시예를 참조하여 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며 본 개시내용은 어떠한 방식으로든 이러한 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.

실시예 1: 파조파닙은 뇌 허혈- 재관류 손상을 개선한다

방법:

관내 중대뇌 동맥(MCA) 폐색:

일과성 국소 허혈은 나일론 필라멘트로 관내 중대뇌 동맥(MCA) 폐쇄에 의해 생성되었다. 이것은 뇌졸중 연구에서 가장 널리 사용되는 것 중 하나이다. 이 모델은, 어느 정도, 인간의 혈전색전성 혈전을 용해시키기 위한 자발적 또는 치료적 개입(예를 들어, tPA 투여) 후 혈류의 회복을 시뮬레이션한다.

마우스를 70% N₂O/30% O₂ 혼합물 중의 2.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 경부 정중절개 후, 좌측 총경동맥, 외경동맥, 및 내경동맥을 조심스럽게 분리하였다. 근위 좌측 총경동맥과 외부 경동맥을 결찰하였다. 실리콘-고무 코팅된 나일론 모노필라멘트(0.23mm, Yushun Bio)를 총경동맥의 작은 동맥절개술을 통해 원위 내경동맥으로 도입하고 MCA가 폐색될 때까지 MCA의 기시부에서 8-9mm 원위로 전진시켰다. 재관류를 가능하게 하기 위해 삽입한지 1시간 후에 마취하에 경동맥에서 봉합사를 빼냈다. 그후, 상처를 닫았다. 마우스를 24시간의 재관류 기간 동안 25℃의 에어컨이 있는 방에서 유지시켰다.

신경학적 결손 점수의 평가:

뇌졸중 수술을 받은 마우스의 신경학적 결손은 0-4의 척도로 측정되었다. 1시간 폐색 및 24시간 재관류 후, 동물을 다음과 같이 신경학적 손상에 대해 점수를 매겼다: 0 = 정상적인 자발적 움직임; 1 = 앞다리를 뻗지 못함; 2 = 영향을 받은 쪽으로 선회; 3 = 영향을 받은 쪽의 부분 마비; 4 = 자발적인 운동 활동이 없음.

경색 크기의 결정:

24시간 재관류 후, 마우스를 CO₂로 사망시켰다. 뇌를 즉시 제거하고 5개의 관상 조각으로 절편화하였다. 뇌 절편을 37℃에서 15분 동안 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염화물 일수화물(TTC)에서 배양한 다음 4% 파라포름알데히드에서 밤새 배양하였다. 뇌 절편을 촬영하고 허혈성 손상 부위를 영상 분석 시스템(NIH Image)에 의해 측정하였다. 뇌경색의 백분율은 다음 공식으로 계산되었다: % = 경색 용적/총 뇌 용적.

약물 제조 및 투여:

파조파닙을 HP-베타-CD(2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린)에 스톡 용액으로서 8.6 mg/ml로 용해시켰다. 이를 1.2mg/ml로 염수에 희석하였다. 50μl/마우스를 안와후정맥 주사를 통해 투여하였다.

뇌 허혈-재관류 손상에 대한 파조파닙의 효과를 시험하였다. 치료 효과를 시험하기 위해, 파조파닙을 정맥내 제공하였다. (1) 허혈성 뇌졸중의 급성기 및 (2) 재관류 후 0.5시간의 두 시점을 선택하였다. 파조파닙 치료는 재관류 후 0.5시간에 제공하였을 때 경색 크기가 더 적은 것으로 나타났다(도 1). 허혈기 동안 약물을 투여한 경우, 뇌경색의 크기 또는 신경학적 점수는 개선되지 않았다(도 2).

실시예 2: 파조파입은 MAP3K2 및 3의 억제를 통해 급성 폐 손상을 개선한다

재료 및 방법:

재료

다음 시약은 Sigma에서 구입하였다: N-포르밀-L-메티오닐-L-류실-L-페닐알라닌(fMLP), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 리포다당류(LPS), 리소레시틴, 파라포름알데히드(PFA), FITC 알부민, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 이소루미놀. Percoll은 GE Healthcare(Uppsala, Sweden)에서, 소 혈청 알부민(BSA)은 American Bio(Natick, MA)에서, GMCSF는 Peprotech에서, 리포펙타민 키트 및 세포 트레이스 염료는 Thermo Fisher에서 구입하였다. 다음 재료는 GIBCO에서 구입하였다: 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 행크스 균형 염 용액(HBSS), 인산염 완충 염수(PBS).

연구에 사용된 상업용 항체는 다음과 같다: GST 항체(2624, Cell signaling), His 항체(2366, Cell Signaling), HA 항체(MMS-101R, Covance), Myc 항체(MMS-150R, Covance), 항-포스포-AKT 항체(4060 및 2965, Cell Signaling), 항-AKT 항체(9272, Cell Signaling), 항-MEKK2 (19607, Cell Signaling), 항-MEKK3 항체(5727, Cell Signaling), 항-p47^phox 항체(17875, Santa Cruz), 항-CD31 항체(102502, BioLegend), 항-α-평활근 액틴 항체(ab8211, Abcam), 항-ABCA3 항체(ab24751, Abcam), 항-포도플라닌 항체(AF3244-SP, R&D), 항-4 하이드록시노넨알 항체(ab46545, Abcam), 항-절단된 카스파제 3 항체(9661, Cell signaling), 항-Ki67 항체(9129, Cell signaling), 항 Rac1 항체(ab33186, Abcam), 항-활성 Rac1 항체(26903, NewEast), 및 항-β-액틴 항체(4967, Cell Signaling). 토끼 다클론성 항-S208 p47^phox는 Abiocode에서 합성 펩티드(KRGWVPApSYLEPLD; 서열 번호 1로부터 제조되었다.

단백질 A/g PLUS-아가로스 비드는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 사이토카인 측정을 위한 ELISA 키트는 eBioscience(San Diego, CA)에서 구입하였다. MAP3K3 및 p67^phox에 대한 cDNA는 ADDGENE에서, p47^phox 및 gp91^phox에 대한 cDNA는 Open Biosystems에서 구입하였다.

HEK293 및 Cos-7 세포는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 일상적으로 마이코플라스마 검사를 받았으며 음성이었다.

마우스

Map3k2 ^-/- 마우스는 문헌[Guo, et al., 2002, Mol Cell Biol 22:5761-5768]에 이전에 기술된 반면 Map3k3 ^{fl /fl} 마우스는 문헌[Wang, et al., 2009, J Immunol 182:3597-3608]에 기술되었다. Map3k2 ^-/- 및 Map3k3 ^{fl /fl} 둘 다를 C57Bl/6N 배경으로 역교배하였다. p47^phox-결핍 마우스(B6N.129S2-Ncf1^tm1Shl/J)는 p47^phox-결핍 마우스와 관련된 모든 실험에 대해 WT 대조군 마우스와 함께 JAX에서 입수하였다. 골수-특이 MAP3K3 KO, MAP3K2 KO 및 DKO 마우스는 Map3k3 ^{fl /fl} 및/또는 Map3k2 ^{fl /fl} 마우스를 Lyz-Cre 마우스와 교배하여 생성하였다. 이들 마우스는 모두 C57Bl/6N 배경에 있다. p47^phox S208A 녹인 마우스 라인은 Cyagen Biosciences에 의해 C57Bl/6N 배경으로 CRISPR/Cas에 의해 생성하였다.

골수 이식

WT 및 돌연변이 마우스의 한배 새끼로부터의 골수를 Envigo(East Millstone, NJ)에서 구입한 야생형 수용자 C57Bl/6N 마우스에 이식하였으며, 이것은 1000cGy X선 조사를 받았다. 8주 후, 이식된 마우스를 실험에 사용하였다.

호중구 준비 및 형질감염

마우스 골수 호중구는 장골로부터 단리하였다. ACK 완충액(155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ 및 127μM EDTA)으로 적혈구(RBC)를 용해한 후, 81%, 62% 및 45% Percoll로 구성된 불연속 Percoll 구배에서 골수 세포를 분리하였다. 호중구를 81%와 62% Percoll 사이의 간기에서 수집하고, HBSS에서 세척하고, 분석에 사용하였다.

호중구 형질감염을 위해, 호중구(3x10⁶개 세포/100μl)를 제공된 뉴클레오펙션 용액에서 1.6μg의 DNA와 혼합하고 Nucleofector 장치(Lonza, Switzerland)를 사용하여 전기천공하였다. 그후 세포를 분석 전 8-24시간 동안 배지(RPMI 1640, 10% FBS(V/V), GMCSF 25ng/ml)에서 37℃, 5% CO₂를 갖는 습한 공기에서 배양하였다.

Dunn 챔버 주화성 분석

Dunn 챔버를 사용한 주화성 분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다. 야생형 및 돌연변이 호중구는 세포를 상이한 추적 염료로 표지함으로써 동시에 분석하였다. 표지된 그룹은 염료로부터의 임의의 영향의 가능성을 완전히 제거하기 위해 연구에서 교대하였다. 타임-랩스 이미지 시리즈는 30분 동안 30초 간격으로 획득하였으며 이전에 기술된 바와 같이 MetaMorph 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 호중구 주화성을 정량화하기 위해 두 가지 매개변수를 입수한다: 평균 방향 오차(average directional error) 및 운동성. 평균 방향 오차는 세포 이동 방향과 구배 방향 사이의 각도를 측정하고 세포가 구배를 얼마나 잘 따르는지를 반영한다. 운동성은 세포 이동 속도이다.

인테그린 발현 분석

골수-유래 호중구를 유세포 분석 완충액(1% BSA를 갖는 PBS)에 재현탁하고 fMLP(1μM)로 표시된 기간 동안 자극하고, 4% PFA로 고정한 다음 FITC 표지된 항 LFA-1 또는 항 Mac-1로 염색하였다. 샘플을 BD LSR II 유세포 분석기로 분석하였다.

ICAM -1 결합 분석

분석은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다. ICAM-1-Fc-F(ab')2 복합체는 Cy5-접합된 AffiniPure 염소 항-인간 Fcγ 단편-특이 IgG F(ab')2 단편(Jackson Immunobiology) 및 ICAM-1-Fc(100μg/ml, R&D)를 PBS에서 30분 동안 4℃에서 배양함으로써 생성되었다. 0.5% BSA, 0.5 mM Mg^{2 +} 및 0.9 mM Ca^{2 +}를 포함하는 PBS에 0.5 Х 10⁶개 세포/ml로 재현탁된 호중구를 fMLP(1μM)의 존재 또는 부재하에 5분 동안 ICAM-1-Fc-F(ab')2 복합체와 혼합하였다. 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 5분 후, 3ml의 빙냉 FACS 완충액을 첨가하여 고정을 중단하였다. 세포를 펠릿화하고, 300μl의 FACS 완충액에 재현탁시키고, 유세포 분석기에서 분석하였다.

염증이 있는 복막으로의 호중구 침윤 및 유동 챔버 접착 분석

복막염 침투 모델의 경우, 정제된 야생형 및 돌연변이 호중구를 각각 2.5μM CFSE [5-(및 -6)-카복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르] 및 2.5μM Far-Red DDAO SE로 표지하였으며, 그 반대도 가능하다. 상이한 형광 표지를 갖는 WT 및 돌연변이 세포를 1:1 비율로 혼합하고 2시간 전에 2ml의 3% 티오글리콜레이트(TG)를 주사한 야생형 한배 새끼의 안와후 정맥동에 주사하였다. 마우스를 1시간 30분 후에 안락사시켰다. 복막의 세포를 수집하고 세포 계수 및 유세포 분석에 의해 분석하였다. 제시된 데이터는 상호 형광 표지화를 사용한 실험의 조합이다.

전단 응력하에서 내피 세포에 대한 호중구 부착을 조사하기 위해, 마우스 내피 세포를 10μg/ml 피브로넥틴 코팅된 커버슬립 상에 융합될 때까지 배양하고 4시간 동안 50ng/ml TNFα로 처리하였다. 내피 세포층을 포함하는 커버슬립을 PBS로 세척하고 유동 챔버 장치(GlycoTech)에 두었다. 상기한 바와 같이 상이한 형광 표지로 표지된 WT 및 돌연변이 세포를 1:1 비율로 혼합하고 1dyn/cm²의 전단 유속으로 챔버로 유동시켰다. 그후 부착 세포를 검사하고 형광 현미경하에서 계수하였다.

ROS 방출 분석

세포외 ROS 방출의 측정을 위해, 단리된 호중구를 반응 완충액(Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}, 10mM 이소루미놀, 100u/ml HRP를 갖는 HBSS 중의 0.25% BSA)에 넣고 fMLP 또는 PMA로 자극하였다. 총 ROS 생산의 측정을 위해, 호중구를 반응 완충액(Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}, 10mM 이소루미놀, 100u/ml HRP를 갖는 HBSS 중의 0.25% BSA)과 함께 배양한 다음 자극하였다. 화학발광은 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 연속적으로 판독하였다. COS-7 세포에서 재구성된 ROS 생산 시스템의 경우, PMA(2μM)를 자극에 사용하였다.

마우스 일차 호중구의 슈퍼옥사이드 생산을 또한 시토크롬 C 분석으로 측정하였다. 간단히 말해서, 시토크롬 C(100μM, Sigma C2506)를 마우스 일차 호중구 현탁액에 첨가하였다. 그후, 90μl 분취량(1x10⁶개 세포)을 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮기고 540nm(시토크롬 C의 등흡광점) 및 550nm에서 기초 판독을 수행하였다(SpectraMax iD3; Molecular Devices). 산화 파열(oxidative burst)은 10μl fMLP(최종 농도 4μM)를 첨가하여 후속적으로 개시하였다. 540 nm 및 550 nm에서의 흡광도를 30분 동안 14초마다 기록하였다. 540nm에서 수득된 신호를 정규화하여 신호를 계산하였다.

호중구 탈과립 분석

백만 개의 호중구를 37℃에서 5분 동안 10μM CB와 함께 배양한 후 fMLP(500nM)로 또 다른 10분 동안 자극하였다. 얼음 위에 놓아서 반응을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 상청액을 각각 EnzChek 미엘로퍼옥시다제 활성 분석 키트 및 EnzChek 젤라티나제/콜라게나제 분석 키트(Life Technologies, Grand Island, NY)를 사용하여 MPO 및 MMP 함량에 대해 분석하였다.

LPS -유도된 폐 손상

마우스를 케타민/자일라진(100mg/kg 및 10mg/kg)으로 마취시켰다. 마우스 자세를 똑바로 유지하면서 22G 카테터(Jelco, Smiths Medical)를 성대 아래 1.5cm로 유도하고, LPS(50μl, 1mg/ml, 대장균 011:B4)를 주입하였다. 손상 유도 22시간 후, 100μl의 FITC-표지된 알부민을 안와후 정맥을 통해 주사하고, 손상 유도 24시간 후 마우스를 샘플 수집을 위해 안락사시켰다. 기관지폐포 세척액을 수득하기 위해, 1ml의 PBS를 폐에 주입하고 기관 카테터를 통해 회수하였다. 기준선 투과도 측정을 위해, LPS가 없는 염수를 동일한 방식으로 투여하였다. 제시된 데이터에서 기준선 투과도 측정치를 공제하였다.

생존 실험에서, 마우스에 먼저 10μg/ml의 알파-GalCer 100μl를 안와후 투여하였다. 12시간 후, 마우스에 LPS(50μl, 30mg/ml, 대장균 055:B5)를 경구기관으로 투여하였다.

산 흡인-유도된 폐 손상

마우스를 케타민/자일라진(1gm/kg 및 100mg/kg)으로 마취시키고, 경구기관 점적을 위한 맞춤형 마운트에서 이들의 앞니로부터 수직으로 고정하였다. 22G 카테터(Jelco, Smiths Medical)를 성대 아래 1.5cm로 유도하고, 2.5μl/g의 0.05M HCl을 주입하였다. 손상 유도 4시간 후, 100μl의 FITC-표지된 알부민(10 mg/ml)을 안와후 정맥을 통해 주사하였다. 손상 유도 6시간 후 마우스를 샘플 수집을 위해 안락사시켰다. 기준선 투과도 측정을 위해, HCl이 없는 염수를 동일한 방식으로 투여하였다. 제시된 데이터에서 기준선 투과도 측정치를 공제하였다.

생존 실험에서, 마우스는 2.5μl/g의 0.1M HCl을 경구기관으로 제공받았으며 관찰 기간을 30시간까지 연장하였다.

폐 조직학적 절편의 정량화

급성 폐 손상 지수는 HE-염색된 폐 절편을 사용하여 정량화하였다. 혈관주위 간질성 부종의 정량화는 혈관주위 간질성 부종 면적 대 혈관 면적의 비율로서 수행되었다. 폐의 동일한 엽에서 8개 이상의 절편을 각 마우스에 대해 정량화하였다.

손상된 폐의 호중구에서 ROS의 측정

HCl ALI-유도 15분 후, BAL을 폐에서 수집하였다. 그후 마우스 폐를 기계적으로 분리하고 40μm 메쉬를 통해 여과하여 단일-세포 현탁액을 생성하고, 적혈구를 용해시켰다. 펠릿화되고 재현탁된 BAL 세포 및 전체 폐 세포를 1μM CM-H2-DCFDA(C6827, Invitrogen)로 37℃에서 30분 동안 표지하였다. 그후 세포를 표면 마커(CD45; BD Bioscience 564279; Ly-6G; BD Bioscience 560602)에 대해 표지하였다. 유세포 분석은 BD LSRII에서 수행하였다.

GST 풀다운 분석

재조합 단백질을 대장균에서 발현시키고 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 그후 단백질을 200μl의 결합 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 1% Triton, 0.12% SDS, 1mM 디티오트레이톨, 10% 글리세롤, 1× 프로테아제 억제제 칵테일)에서 4℃에서 밤새 진탕기에서 배양하였다. 다음날 아침, 글루타티온 비드를 추가 2시간 동안 단백질 혼합물에 첨가하였다. 광범위한 세척 후, 비드 상의 단백질을 SDS/PAGE로 분해하고 웨스턴 블롯으로 검출하였다.

시험관내 키나제 분석

50μl 반응 완충액(100mM Tris-HCl pH 7.4, 50mM EGTA, 100mM MgCl₂)에서, ThermoFisher Scientific에서 구입한 재조합 MAP3K3 및/또는 MAP3K2 단백질을 차가운 ATP(50μM) 및/또는 [γ-³³P]-ATP(10μCi)의 존재하에 37℃에서 30분 동안 면역-침전 기질 단백질 또는 재조합 His-태그된 p47^phox와 함께 배양하였다. SDS 부하 완충액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 샘플을 5분 동안 비등시켰다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 포스포이미저(phosphoimager)로 가시화 및 정량화하거나 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

인간 호중구

제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 호중구 농화 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 혈액 샘플의 버피 코트를 호중구 농화에 적용하였다. 간단히 말해서, 고갈 항체 칵테일을 버피 코트와 혼합한 다음 자성 입자와 함께 배앙하였다. 그후 표지 없는 호중구를 다른 원뿔형 튜브에 부음에 따라 원치 않는 세포를 고정하는데 EasySep Magnet을 사용하였다. 농화된 호중구를 펠릿화하고 ROS 생산 분석 또는 웨스턴 분석을 위해 분석 완충액(Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}를 갖는 행크스 완충액, 0.25% BSA)에 재현탁하였다.

내피 세포와 호중구의 이중층 공동-배양

Transwell 삽입물(24-웰 튜브, 0.4-μm 기공 크기, Corning, Inc. 353095)의 폴리카보네이트 막(25,000개 세포/cm²) 외부에 마우스 일차 폐 내피 세포(MLEC)를 플레이팅하고, 배양 플레이트의 웰에 거꾸로 배치하였다. 세포가 부착된 후, Transwell 삽입물을 뒤집어 플레이트의 웰에 재삽입하였다. 배지는 접종 24시간 후 무혈청 배지로 교체하였다. SOD(60U/ml), 카탈라제(100U/ml) 또는 모의 물질을 2시간 후 30분 동안 하부 챔버에 추가하였다. 그후 5μM fMLP로 자극된 마우스 호중구를 30분 동안 삽입물의 상부 표면(6×10⁶개 세포/cm²)에 플레이팅하였다. 배양 기간의 말기에, 삽입물 상단의 호중구를 면봉으로 제거하고, 삽입물의 다른 면에 있는 내피 세포를 웨스턴 분석을 위해 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 용해시켰다.

경-내피 전기 저항( TEER ) 측정

ECIS 8W10E+ 어레이(Applied BioPhysics)를 10μg/ml의 폴리-D-리신(PDL)으로 코팅하고 멸균수로 세척하였다. 완전 EBM-2 배지(300μl)를 빠른 임피던스 배경 확인을 위해 각 웰에 추가하였다. 이어서, 불멸화된 마우스 폐 내피 세포를 코팅된 어레이의 300μl EBM-2 배지에 60,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 CO₂ 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 세포층의 전기 저항은 대략 600-700ohm의 안정적인 저항이 달성될 때까지 ECIS 시스템(Applied BioPhysics)에서 계속 기록하였으며, 그후 배지를 웰에서 제거하고 100μl의 분석 완충액(Ca^{2 +} 및 Mg^{2 +}를 갖는 행크스 완충액, 0.25% BSA)으로 교체하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 재평형화하도록 한 다음 1μl의 SOD(60U/ml), 카탈라제(100U/ml) 또는 모의 물질을 30분 동안 웰에 첨가한 후 5μM fMLP를 포함하는 분석 완충액 중의 50μl 마우스 호중구를 첨가하였다. 데이터를 실험 전반에 걸쳐 실시간으로 수집하였다. 모든 ECIS 측정은 4kHz의 AC 주파수에서 분석하였으며, 이는 전체 주파수 범위(1kHz - 64kHz)를 따라 주파수 스캔에 의해 이러한 세포 유형에 대해 가장 민감한 주파수로 확인되었다. TEER 값은 모의 처리된 WT 호중구와 공동 배양된 값에 대해 정규화되었다.

단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 샘플 준비

폐를 PBS로 관류하여 혈액을 제거하고 가위로 잘게 썬 다음, 약하게 교반하면서 미리-가온된 콜라게나제 용액(Ca^{2 +}/Mg^{2 +}를 갖는 PBS 중 2mg/ml)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 생성된 단일 세포 현탁액을 40μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 세포를 차가운 0.1% BSA/PBS에 재현탁시켰다. 생존 염료(Fixable Viability Dye eFluor 506, eBioscience)로 생/사 염색한 후, 세포를 Fc-차단 시약(BD Biosciences)과 함께 4℃에서 5분 동안 배양하고, 항-CD45.2 mAb-PE-Cy7 항체와 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그후 세포를 100μm 노즐 및 40psi 압력(FACSAria 기기, BD Biosciences)을 사용하여 분류하였다.

단일-세포 RNA- seq

단일-세포 3' RNA-seq 라이브러리는 Chromium 단일 세포 V3 시약 키트 및 컨트롤러(10X Genomics)를 사용하여 준비하였다. 라이브러리를 품질에 대해 평가한 다음 HiSeq 4000 기기(Illumina)에서 시퀀싱하였다. 초기 데이터 처리는 Cell Ranger 버전 2.0 파이프라인(10X Genomics)을 사용하여 수행하였다. 마우스 데이터세트에 대한 Loupe Browser 파일은 매핑된 읽기에 대한 정규화와 함께 Cell Ranger 파이프라인의 집계 기능을 사용하여 생성되었으며, 단일 세포 브라우저(10x Genomics)를 사용하여 볼 수 있다. 세포당 발현된 유전자의 수에 따른 필터링을 포함한 후처리는 Seurat 패키지 V2.3.4 및 R 3.5.3을 사용하여 수행하였다. t-SNE(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)를 사용한 클러스터링 및 시각화 후. 세포 클러스터의 확인은 마커 유전자에 의해 안내된 최종 정렬된 대상에서 수행하였다. WT 및 KI 마우스의 세포 사이의 각 클러스터에 대해 차등 유전자 발현 분석을 수행하였다. Seurat를 사용하여 t-SNE 플롯과 바이올린 플롯을 생성하였다. GSEA 소프트웨어(Broad Institute 버전 3.0) 및 MSigDB 버전 6.2를 사용하여 농화에 대해 유전자 발현 데이터를 분석하였다. RNA 시퀀싱 데이터는 Gene Expression Omnibus(GEO; 액세스 번호: 토큰 "ypglyscoxhizron"를 갖는 GSE134365)에 기탁된다.

환자, 개입 및 데이터 수집

파조파닙의 치료적 잠재력의 검증을 위한 파일럿 임상 연구는 단일 LT를 받은 5쌍의 폐 이식 환자를 대상으로 수행하였다(짝을 이루는 각 수용자는 동일한 기증자로부터 하나의 폐를 제공받았다). 이들은 단일 LT에 적격하고 2018년 3월 1일과 2018년 8월 31일 사이에 연구 등록에 동의한 모든 환자를 나타낸다. 쌍을 이룬 환자는 각각 수술 전 및 개입 없이 파조파닙 200mg을 제공받도록 무작위 배정되었다. LT 후 5일 이내 기준선 특성, 수술 정보, 중환자실 입원 기간 동안의 의료 기록, 산소호흡기 매개변수, 동맥혈 가스 분석, 및 흉부 X-선 결과를 수집하였다. 5명의 기증자 모두 자발적 장기 기증 프로그램에 등록되었으며 사고 또는 질병으로 사망하였다.

흉부 X선 점수는 다음의 방식으로 수득하였다: 심장 영역을 중앙으로 간주하고 폐 영역을 4개의 사분면으로 분할하였다. 불투명하지 않은 영역, 0점; 1/4 폐 면적으로 제한된 불투명한 영역, 1점; 2/4 폐 면적으로 제한된 불투명한 영역, 2점; 3/4 폐 면적으로 제한된 불투명한 영역, 3점; 모든 폐 영역에서 불투명한 영역, 4점. 점수는 치료에 대해 블라인드된 임상의 및 방사선 전문의에 의해 독립적으로 수집되었고, 평균이 사용되었다. 두 평가자 사이의 차이가 1점 이상인 경우, 합의에 도달하기 위해 토론을 수행하였다. 저산소혈증 지수 = 동맥혈 가스 분석으로 측정된 PaO₂/FiO₂.

통계 분석 및 연구 설계

마우스 연구의 경우, 연구를 위한 최소 그룹 크기는 α가 0.05이고 검정력이 0.8인 DSS Researcher's Toolkit으로 검정력 계산을 사용하여 결정되었다. 동물을 비블라인드로 그룹화하지만 무작위로 분류하였으며 대부분의 자격 실험에 대해 조사관은 블라인드되었다. 분석으로부터 어떠한 샘플 또는 동물도 배제되지 않았다. 통계적 검정을 수행하기 전에 실험군 사이의 정규 분포 및 유사 변동을 포함한 데이터에 대한 가정의 타당성을 검토하였다. 두 그룹 간의 평균의 비교는 비쌍성 양측 t-검정에 의해 수행되었다. 2개 이상의 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA에 의해 수행된 반면, 2개 이상의 독립 변수 인자와의 비교는 Prism 8.0 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 이원 ANOVA에 의해 수행되었다. 카플란 마이어 생존 분석을 위해, 로그순위 검정이 사용되었다. 통계 검정은 생물학적 복제를 사용하였다. P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.

파일럿 임상 연구에서, 선형 혼합 모델 반복 측정 분석을 수행하여, 대상체내 상관관계 및 쌍을 이루는 수용자의 상관관계 둘 다를 설명하는 두 그룹 간의 시간 경과에 따른 저산소혈증 및 X선 점수를 비교하였다. 두 그룹 간의 결과 궤적의 차이를 조사하기 위해 시간 그룹 상호작용이 모델에 포함되었다. 선형 대조를 사용하여 각 이식후 일자의 차이 및 그룹 간의 전체 평균 차이도 비교하였다. 분석은 SAS 버전 9.4(SAS Inc., Cary, NC)로 수행하였다. 유의도는 p < 0.05, 양측으로 설정되었다.

결과:

MAP3K2 및 MAP3K3은 호중구로부터의 ROS 생산을 억제한다

마우스에서, Map3k3 유전자는 다양한 조혈 세포에서 풍부하게 발현되며 이의 발현은 골수 세포에서 가장 높다. 또한, 이의 가까운 상동체 Map3k2는 마우스 골수 세포에서도 발현된다. MAP3K2 및 MAP3K3 단백질 둘 다는 웨스턴 분석에 의해 호중구에서 쉽게 검출될 수 있었다(도 3a). 호중구 기능의 조절에 있어서 이러한 MEKK 서브패밀리의 역할을 이해하기 위해, Map3k2 ^-/- Map3k3 ^{f / f} LyzCre 마우스로부터 단리된 MAP3K2/3-결핍 호중구를 사용하여 일련의 기능 시험을 수행하였다. MAP3K2/3-결핍은 시험관내 호중구 주화성(도 4a-4d), 전단 유동하에서 내피 세포에 대한 호중구 부착(도 4e), 또는 β2 인테그린의 발현 또는 활성화(도 4f-4h)에 영향을 미치지 않았다. 일치하게, 결핍은 생체내 호중구 모집 모델에서 염증이 있는 복막으로의 호중구 침윤에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 4i). 또한, MAP3K2/3-결핍은 호중구 탈과립을 유의하게 변화시키지 않았다(도 4j 및 4k). 그러나, MAP3K2/3 결핍은 fMLP(도 3b-3e, 도 4l-4n), MIP2(도 3d) 또는 PMA(도 4o)에 의한 자극시 호중구로부터 총 ROS(루미놀로 측정) 또는 방출된 ROS(이소루미놀 또는 시토크롬 C로 측정)을 증가시켰다. 개별 MAP3K 녹아웃은 ROS 생산에서 유의한 상승을 보였지만, 이들의 효과는 이중 녹아웃(도 3c)보다 적은 것으로 보이며, 이는 이들 두 키나제가 기능적으로 중복된다는 발상과 일치한다. MAP3K2/3-결핍 호중구에서 야생형(WT)이지만 키나제-무효(KD)가 아닌 MAP3K3의 발현은 ROS 방출을 억제할 수 있으며, 이는 ROS 방출의 조절에 있어서의 키나제 활성의 중요성을 나타낸다(도 3e & 도 4p).

MAP3K2 /3-결핍은 ALI로부터 마우스를 보호한다

ALI에서 호중구의 중요성을 감안하여, 이러한 두 MAP3K의 결핍의 효과를 마우스 ALI 모델에서 평가하였다. 비-조혈 세포로부터의 기여를 제한하기 위해, Map3k2 ^-/- Map3k3 ^f/f LyzCre 마우스 라인에서 치명적으로 조사된 WT 수용자 마우스로 입양 골수 전달을 수행하였다. 그 결과로 생긴 마우스를 DKO로 지정하며, 이는 모든 조혈 세포에서 MAP3K2 및 골수 세포에서 MAP3K3이 결핍된다. WT 한배 새끼로부터 골수 전달을 받은 DKO 및 이들의 대조군 마우스는 먼저 LPS의 경구기관 점적을 통해 LPS-유도 ALI를 받았다. 이러한 ALI 모델은 폐포 공간으로의 호중구 유입, 폐부종 및 높은 사망률을 수반하는 폐 투과성 증가를 포함하여 인간 ALI의 많은 특징을 가진 감염후 염증-유도된 폐 손상을 개괄한다. DKO 마우스는 대조군 마우스보다 유의하게 낮은 폐 투과성 및 혈관주위 간질 부종을 가졌다(도 5a 및 5b, 도 6a). DKO 마우스는 또한 WT 대조군 마우스에 비해 유의하게 감소된 사망률을 보였다(도 5c).

그후 HCl의 경구기관 점적에 의해 유도되는 다른 ALI 모델을 시험하였다. HCl 모델은 인간에서 산 흡인-유도된 ALI/ARDS를 개괄한다. 흡인성 폐렴(aspiration pneumonitis)으로도 알려진 이러한 상태는 위의 산 내용물의 폐 흡인으로 인해 발생한다. 이것은 의식 혼란(disturbed consciousness)(예를 들어, 약물 과다 복용, 발작, 뇌혈관 사고, 진정, 마취 절차)을 가진 환자 및 허약한 노인에게서 자주 발생할 뿐만 아니라 전신 마취와 관련된 모든 사망의 최대 30%를 차지한다. 산-유도된 ALI 모델에서, DKO 마우스는 또한 대조군 마우스보다 폐 투과성 및 혈관주위 간질 부종이 유의하게 더 낮았을 뿐만 아니라(도 5d 및 5e, 도 6a) WT 대조군 마우스에 비해 사망률이 유의하게 감소한 것으로 관찰되었다(도 5f). 산-유도된 ALI는 LPS-유도된 ALI에서 복잡한 염증 반응의 관여 없이 폐 장벽 세포의 직접적인 손상의 결과이기 때문에, 산 ALI 모델은 추가 기계론적 조사에 사용되었다.

골수-특이 MAP3K2 KO(Map3k2 ^{f / f} LyzCre) 및 MAP3K2/3 DKO(Map3k2 ^f/f Map3k3 ^f/f LyzCre) 마우스를 생성하였다. 단리된 호중구로부터의 ROS 생산과 일치하게(도 3c), 골수-특이 DKO는 HCl ALI 모델에서 각각의 골수-특이 KO보다 투과성에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 6b). 골수 세포 수를 조사하였으며 손상된 폐, 기관지폐포 세척액 또는 순환계의 골수 세포 수에 유의한 차이가 DKO 및 WT 대조군 마우스 사이에서 관찰되지 않았다(도 6c-6e). 또한, 기관지폐포 세척액에서 TNFα 또는 IL-6의 함량의 유의한 차이는 없었다(도 6f). 이러한 결과는 함께, 골수 세포에서 MAP3K2 및 3의 결핍이 손상된 폐에서 골수 침윤 또는 사이토카인 생산보다는 폐 투과성에 주로 영향을 미친다는 것을 시사한다.

ROS가 일반적으로 조직 손상에 해로운 것으로 간주된다는 점을 감안할 때, 급성 폐 손상에 대한 골수-특이 MAP3K2 및/또는 3-결핍의 유익한 효과는 예상되지 않았다. MAP3K2/3이 결핍된 호중구가 손상된 폐에서 실제로 더 많은 ROS를 생성한다는 것을 확인하기 위해, BAL 및 HCl 손상을 받은 폐에서 호중구의 ROS를 유세포 분석에 의해 측정하였으며 손상된 폐에서 WT 호중구와 비교하여 MAP3K2/3-결핍 호중구에서 상승된 ROS 생산이 관찰되었다(도 5g).

MAP3K2 /3은 Ser208에서 p47 ^phox 를 인산화한다

다음으로 MAP3K2 및 3이 호중구에서 ROS 생산을 어떻게 조절하는지를 조사하였다. Nox2 복합체는 호중구로부터 방출되는 ROS의 주요 공급원이기 때문에, 키나제가 Nox2 복합체의 서브유닛 중 하나를 인산화하는지 여부에 대한 가능성을 연구하였다. 시험관내 키나제 분석을 수행하였으며, p22^phox, p67^phox (도 7a), gp91^phox, 또는 p40^phox(데이터는 표시되지 않음)가 아닌 p47^phox가 MAP3K3에 의해 인산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. MAP3K3에 대한 인산화 부위 컨센서스 서열은 알려져 있지 않지만, p47^phox 서열을 인산화의 가능성이 있는 부위를 식별하기 위해 관련 키나제 MAP3K5에 대해 보고된 펩티드 어레이 데이터와 함께 Scansite 실행을 사용하여 분석하였다. 이 분석은 p47^phox의 Ser-208을 이전에 관찰된 것 중에서 가장 점수가 높은 부위로 예측하였다. 이 부위가 p47^phox의 단편(도 7b)에서 돌연변이되었을 때, MAP3K3-매개 인산화가 유의하게 감소되었으며, 이것은 이 잔기가 MAP3K3에 의해 인산화될 수 있음을 나타낸다.

NDAPH 산화효소의 활성에 대한 이러한 인산화의 효과를 결정하기 위해, NADPH 산화효소 서브유닛 p47^phox, p67^phox, p40^phox, NOX2, 및 p22^phox를 발현함으로써 COS-7 세포에서 재구성된 NADPH 산화효소 활성 분석을 실행하였다. 이들 단백질은 COS-7 세포에서 발현되지 않거나 불충분하게 발현된다. PMA의 첨가시, 재구성된 COS-7 세포로부터 ROS의 생산이 검출될 수 있으며, 이러한 ROS 생산은 p47phox의 외인성 발현에 완전히 의존한다(도 8a 및 8b). 중요하게도, 이의 키나제 무효 돌연변이가 아닌 WT MAP3K3의 발현은 이 시스템에서 ROS 생산을 억제하였다(도 8c). 따라서, 호중구에서 발생하는 것과 유사한 MAP3K3에 의해 억제될 수 있는 ROS 생산 시스템이 개발되었다. 이러한 재구성된 시스템에서 WT 대신 포스포-모방 p47^phox S208E 돌연변이체가 사용되었을 때, WT p47^phox와 비교하여 ROS 생산이 현저히 감소하였다(도 7c). 비-인산화 가능한 S208A p47^phox 돌연변이체인 byontrast는 이러한 ROS 재구성 분석에서 WT p47^phox와 유사한 활성을 보였다(도 7c). 또한, MAP3K3의 발현은 WT p47^phox를 발현하는 세포에서 ROS 생산을 억제할 수 있었지만, 비-인산화 가능한 S208A p47^phox를 발현하는 세포에서는 그렇지 않았다(도 7d). 이러한 결과는 함께, S208에서 p47^phox의 인산화가 NADPH 산화효소 활성을 억제한다는 것을 나타낸다. Ser-208은 NADPH 산화효소 복합체의 활성화 동안 p22^phox와의 상호작용에 관여하는 p47^phox의 두 SH3 도메인 사이에 위치하기 때문에(도 8d), Ser-208에서의 인산화가 NADPH 산화효소 활성화의 중요한 단계인 이 상호작용을 방해할 수 있는 것으로 상정되었다. 실제로, 포스포모방체 Ser-208에서 Glu로의 돌연변이는 풀다운 분석에서 p47^phox와 p22^phox의 상호작용을 방해하였다(도 7e).

p47^phox가 MAP3K2 및 3에 의해 호중구에서 인산화되는지 여부를 검출하기 위해, 인산화된 Ser-208을 함유하는 p47^phox 펩티드로 면역화된 다클론 항체를 생성하였다. 항체는 Ser-208의 알라닌으로의 돌연변이가 MAP3K3을 과발현하는 세포에서 항체에 의한 검출을 현저히 감소시키기 때문에 비-인산화된 p47^phox보다 Ser-208-인산화된 p47^phox에 대한 선호를 보였다(도 8e). 항체를 사용하여, Ser-208에서 p47^phox 인산화의 시간-의존적 증가가 검출되었다(도 7f, 도 8f). 또한, MAP3K3 밴드 상향 이동이 전기영동에서 관찰되었으며(도 7f), 이는 fMLP에 의한 활성화를 반영한다. MAP3K3은 자가인산화를 통해 활성화한다. 중요하게는, 이 항체에 의해 검출된 p47^phox 인산화의 이러한 fMLP-유도된 증가는 MAP3K2/3이 결핍된 호중구에서 관찰되지 않았으며(도 7g, 도 8g), 이는 fMLP가 MAP3K2 및 3을 통해 Ser-208에서 p47^phox의 인산화를 유도함을 시사한다. 항-포스포-Ser-208 항체에 의해 DKO 호중구에서 검출된 밴드는 도 8e에 나타낸 바와 같이 항체에 의한 비-인산화된 p47^phox의 약한 검출을 반영할 수 있다. 이 데이터는 함께, MAP3K2 및 3이 p47^phox S208을 인산화하여 ROS 생산을 조절한다는 결론을 강력하게 뒷받침한다.

p47 ^phox 의 녹인 돌연변이는 ALI를 개선한다

ROS 생산 및 ALI에서 p47^phox Ser-208 인산화의 중요성을 추가로 평가하기 위해, p47^phox의 Ser-208이 알라닌으로 대체된 녹인(KI) 마우스 라인을 생성하였으며, p47^phox-KI로 지정된다. DNA 시퀀싱은 마우스 라인에 도입된 올바른 돌연변이를 확인시켜 주었다(도 8h). 또한, 웨스턴 분석은 fMLP가 WT 마우스로부터의 호중구와 비교하여 p47^phox-KI 마우스로부터 단리된 호중구에서 p47^phox S208 인산화를 증가시키지 못했음을 보여주었다(도 8i). p47^phox S208 인산화가 ROS 생산을 억제한다는 발상과 일치하게, p47phox-KI 마우스로부터의 호중구는 자극시 유의하게 더 많은 양의 ROS를 생산하였다(도 7h). 중요하게는, p47^phox-KI 마우스로부터 골수 전달을 받은 마우스는 또한 HCl-유도 폐 손상에서 WT 골수 전달을 받은 마우스와 비교하여 감소된 폐 투과성을 보였다(도 7i). 이러한 데이터는 호중구에서 MAP3K2/3에 의존하는 p47^phox S208 인산화가 ROS 생산을 억제하고, 이의 결핍이 ALI 동안 폐 투과성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

측분비 H ₂ O ₂ 는 내피 세포 장벽 기능을 향상시킨다

앞서 언급한 유전 데이터는 호중구 ROS가 폐 장벽 세포에 작용하여 이의 항-ALI 효과를 발휘해야 한다는 것을 나타낸다. 기저 메커니즘을 이해하기 위해, HCl-유도 ALI를 받은 WT 및 p47^phox-KI 폐로부터 분류된 CD45-음성 세포의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하였다. Pecam1 및 Cdh5의 높은 발현에 의해 내피 세포가 확인되었다(도 9a). 경로 농화 분석은 p47^phox KI에 의해 변경된 신호전달 경로 중 일부가 AKT 신호전달과 관련이 있음을 보여주었다(도 9b). scRNAseq 데이터와 일치하게, DKO(도 9c) 또는 p47^phox-KI 마우스(도 10a, 도 9d)로부터의 손상된 폐 절편의 면역형광 염색은 이들의 상응하는 WT 대조군과 비교하여 CD31로 표시된 폐 내피 세포에서 AKT 인산화 수준의 증가를 보여주었다. 또한 대조군과 비교하여 DKO 폐 추출물에서 AKT 인산화가 증가하였다(도 9e).

일단 골수성 세포로부터 방출되면 ROS는 폐에서 빠르게 H₂O₂로 전환된다. H₂O₂는 내피 세포에서 AKT 인산화를 자극하고, 내피 세포에서 ATK 활성화는 혈관 장벽 완전성을 강화하고 모세관 누출을 방지하고 폐포액을 제거함으로써 ALI의 뮤린 모델에서 보호 역할을 갖는다. 낮은 농도의 H₂O₂는 일차 배양된 마우스 폐 내피 세포의 TEER(trans-endothelial electric resistance)을 향상시키고 이들 세포에서 AKT 인산화를 자극한다(도 9f). H₂O₂가 내피 세포에 대한 MAP3K2/3 또는 p47^phox 인산화의 조혈 손실 작용을 매개하는지 알아보기 위해, WT 및 돌연변이 호중구와 뮤린 일차 폐 내피 세포의 공동-배양을 수행하였다. 활성화된 MAP3K2/3 DKO 호중구와 공동-배양된 마우스 일차 폐 내피 세포는 WT 호중구와의 공동-배양에 비해 AKT 인산화를 상승시켰다(도 10b, 도 9g). 이러한 포스포-AKT 상승은 카탈라제 또는 환원된 시토크롬 C의 존재에 의해 폐지될 수 있지만, 슈퍼옥시다제 디스뮤타아제(SOD)에 의해 폐지될 수는 없다(도 10b, 도 9g 및 9h). 카탈라제 및 환원된 시토크롬 C는 H₂O₂의 물로의 전환을 촉진하는 반면 SOD는 슈퍼옥사이드를 H₂O₂로 전환한다. 또한, 마우스 내피 세포와 활성화된 DKO 호중구의 공동-배양은 활성화된 WT 호중구보다 TEER을 증가시켰고, TEER의 이러한 차이는 카탈라제의 존재에 의해 폐지될 수도 있다(도 10c). AKT 인산화의 증가는 p47^phox-KI 호중구와 마우스 일차 폐 내피 세포의 공동-배양에서도 관찰되었다(도 10i). 따라서, 이러한 결과는 MAP3K2/3-결핍 또는 p47^phox-KI가 H₂O₂를 충분히 증가시켜 폐 내피 세포에서 AKT 활성화를 증가시켜 내피 접합 무결성을 향상시킨다는 결론을 종합적으로 뒷받침한다. 또한, 카탈라제 및 SOD 처리 결과는 유리 슈퍼옥사이드 라디칼보다는 세포외 H₂O₂가 AKT 활성화 및 내피 장벽 기능 향상에 직접적인 역할을 한다는 것을 나타낸다. 이러한 결론은 HCl-유도 ALI 모델에서 MAP3K2/3 DKO 및 상응하는 WT 대조군 마우스에 대한 페길화된 카탈라제의 정맥내 투여에 의해 추가로 확인된다. 페길화 카탈라제 처리는 폐 투과성 및 간질 부종을 증가시키고 생존을 감소시켰으며(도 10d, 도 9j-9l), ALI 보호에서 세포외 H₂O₂의 중요성을 확인시켜 주었다(도 10d). 보다 중요하게는, 페길화된 카탈라제 처리는 MAP3K2/3-결핍의 투과성 효과를 폐지하였으며, 이는 MAP3K2/3-결핍에 의해 제공되는 HCl-유도된 ALI 보호에서 세포외 H₂O₂의 중요성을 나타낸다(도 10d).

P47phox - KI는 폐 장벽 세포 미세환경을 개조한다

scRNAseq 데이터의 추가 분석은 내피 세포를 높은 Prx 발현을 위한 EC1 및 높은 Vwf 발현을 위한 EC2로 세분화하여 수행하였다(도 11a). EC1 세포는 모세혈관에서 유래할 것 같은 한 반면 EC2 세포는 더 큰 혈관에서 유래했을 가능성이 크다. 차등 발현된 유전자(표 1) 중에서, Pdgfb는 WT와 비교하여 p47^phox-KI 샘플의 두 EC 그룹 모두에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(도 10e). 내피 PDGF는 혈관주위세포에 작용하여 혈관 무결성을 향상시킨다. PDGF가 AKT를 자극할 수 있기 때문에, WT보다 p47^phox-KI 폐 절편에서 혈관을 둘러싼 혈관주위세포에서 증가된 AKT 인산화가 관찰되었다(도 10f, 도 11b). pdgfb 발현의 이러한 EC2 상향조절은, Notch 리간드 DLL4를 암호화하고 혈관주위세포 생존 및 내피 세포에 대한 접착을 촉진하는 Dll4(도 11c)의 EC2 상향조절과 함께, 상기 나타낸 간질 부종의 감소에 기여할 수 있다.

p47^phox-KI 내피 세포에는 다수의 하향조절된 신호전달 리간드 또는 수용체가 있었다: Ackr3(EC1 및 EC2 모두에서 하향조절됨, 도 10e), Il6st, Osmr, Il4ra, 및 Bmp6(EC2에서 하향 조절됨)(도 11d). Ackr3은 CXCL12에 대한 수용체인 CXCR7을 암호화하고, 이의 신호전달은 내피 장벽 기능을 방해한다. BMP6, IL6 수용체 베타(Il6st) 및 온코스타틴 수용체(Osmr)를 통해 신호전달하는 IL6, 및 IL4 수용체 알파(Il4ra)를 통해 신호전달하는 IL4는 내피 과투과성을 유도한다. 따라서, p47^phox 인산화의 조혈 손실의 결과로서의 ROS의 적당한 상승은 신호전달 리간드 및 수용체의 발현을 조절함으로써 폐 혈관계 미세환경을 변경하였다. 이러한 리간드 및 수용체로부터의 변경된 신호전달은 차례로 유전자 발현의 추가 변경을 초래하며, 이들 중 다수는 폐 혈관계 완전성의 향상과 관련이 있다(표 1). 그 중에는 특히 혈관계 장벽 기능의 핵심 역할을 하는 것으로 알려진 전사 인자 Klf2 및 Sox18(도 11e)이 있다.

PDGF 신호전달은 또한 폐 폐포 형성에 중요하며 타입 II 세포 증식을 자극한다. ALI 폐 절편의 면역염색에서는 또한 대조군 폐와 비교하여 p47^phox-KI 폐로부터의 ABCA3(도 10g, 도 12a)로 표시된 타입 II 상피 세포에서 AKT 인산화 수준이 증가된 것으로 나타났다. AKT 신호전달의 역할과 일치하게, 세포자멸사 마커 활성화된 카스파제 3의 감소된 수준 및 증가된 증식 마커 Ki67이 p47^phox-KI 폐 상피 세포에서 검출되었다(도 10h 및 10i, 도 12b 및 12c).

Epcam-높은 상피 세포의 두 하위-집단이 단일 세포 RNA 시퀀싱에 의해 확인되었다; 하나는 타입 I 폐포 세포에 대한 마커인 높은 Pdpn을 발현하였고, 다른 하나는 타입 II 세포에 대한 마커인 높은 Sftpc를 발현하였다(도 12d). 유의하게 차등적으로 발현된 유전자(표 1) 중에서, Kit1은 p47^phox-KI 상피 그룹 모두에서 상향조절된 신호전달 리간드 유전자이다(도 12e). Kitl은 SCF를 암호화하고 폐포 유지 및 폐 상피 세포 증식에 중요한 역할을 한다. p47^phox-KI와 WT 사이에서 유형 I 그룹에서 차등적으로 발현되는 유전자의 그룹이 또한 주목되었으며, 이들의 변화는 항-세포자멸사 쪽으로 편향되었다(도 12f). 비제한적인 측면에서, 이러한 변화는 AKT 인산화의 현저한 증가는 없으면서 p47phox-KI ALI 폐로부터의 이러한 타입 I 세포에서 감소된 활성화 카스파제 3 염색을 설명하는데 도움이 된다(도 12g). 이러한 모든 데이터는 호중구로부터의 ROS의 적당한 상승이 폐 장벽 세포에 매우 큰 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

표 1. 내피 세포에서 차등 발현된 유전자

파조파닙은 MAP3K2 /3의 기질 특이적 억제제이다

앞서 언급한 유전적 결과는 MAP3K2 및 3 키나제의 서브패밀리가 ALI을 치료하기 위한 잠재적인 치료 표적이 될 것임을 시사한다. MAP3K2 억제제에 대한 이전 스크린은 MEK5를 기질로 사용하여 분석할 때 >1μM IC₅₀을 갖는 다수의 소분자 억제제를 확인하였다(Ahmad, et al., 2013, J. Biomol. Screen. 18:388-399; Ahmad, et al., 2015, Biochem. Biophys. Res. Commun. 463:888-893). 수니티닙, 파조파닙, 보수티닙, 포나티닙, 이마티닙 및 닌테다닙을 포함한 이들 후보 중 6개를 시험관내 키나제 분석에서 시험하였다. 예기치 않게도, 다른 것은 그렇지 않지만 파조파닙은 낮은 nM IC₅₀ 값에서 MAP3K2 및 3에 의한 Ser-208에서 p47^phox 인산화를 억제하였다(도 13a 및 13b). 파조파닙은 VEGFR1 억제제이자 표적 암 치료법을 위한 FDA-승인된 약물이다. 파조파닙은 >1μM IC₅₀ 값에서 MAP3K2 또는 3에 의한 MEK5 인산화를 억제하였다(도 14a). 따라서, 파조파닙은 전례없는 기질 특이성을 가지며, 이는 MAP3K2/3에 의한 MEK5 인산화를 억제하여 MEK5에 의해 매개되는 의도하지 않은 효과를 유발하지 않기 때문에 유익한 약리학적 특징이 될 것이다.

파조파닙은 이후에 마우스 호중구에서 시험하였으며 Ser-208에서 p47^phox 인산화를 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 13c). 파조파닙은 또한 fMLP에 의해 유도된 MAP3K3 단백질 함량의 증가를 폐지하며(도 13c), 이는 이것이 호중구에서 MAP3K3 활성화를 억제함을 시사한다. 중요하게는, MAP3K2/3-결핍(도 13e) 마우스 호중구는 그렇지 않지만 WT(도 13d) 마우스 호중구를 파조파닙으로 처리하면 ROS 생산이 증가하였으며, 이는 파조파닙이 호중구에서 MAP3K2 및 3을 통한 ROS 생산을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 파조파닙은 마우스 호중구에서 ERK 또는 p38 인산화에 영향을 미치지 않았다(도 14b).

파조파닙은 ALI를 개선한다

파조파닙의 효과를 HCl- 및 LPS-유도된 ALI 모델 모두에서 시험하였다. 시험은 손상 유도 후 파조파닙을 비강내 제공하는 치료 양식을 사용하여 처음 수행하였다(도 15a 및 15b). 이 시험에서, 파조파닙 치료는 폐 투과성(도 15c 및 15d), 혈관주위 간질 부종 및 폐 손상 지수(도 15e 및 15f) 및 사망률(도 15g 및 15h)의 유의한 감소를 초래하였다. 또한, HCl 폐 손상을 받은 파조파닙-처리된 마우스의 BAL 및 폐의 호중구에서 상승된 ROS가 검출되었다(도 16a). MAP3K2/3-결핍에서 관찰된 골수 세포 침윤 및 사이토카인 함량에 대한 영향의 부족과 일관되게, 파조파닙은 이러한 경계에 영향을 미치지 않았다(도 16b-16d). 손상 유도 전에 약물을 경구 또는 비강내 투여하는 예방적 시험(도 16e 및 16f)에서, 파조파닙은 또한 폐 투과성과 사망률을 감소시켰다(도 16g-16j).

파조파닙이 MAP3K2/3-p47^phox 경로를 통해 작용하는지 여부를 알아보기 위해, 파조파닙의 효과를 DKO 마우스에서 시험하였다; 파조파닙은 DKO 마우스에서 폐 투과성에 대한 효과를 상실하였으며(도 17a), 이는 파조파닙의 작용이 MAP3K2 및 3에 의존함을 시사한다. 파조파닙이 p47^phox를 통해 폐 투과성을 조절하는지 여부를 시험하기 위해, 조혈 세포에서 p47^phox가 결핍된 마우스를 대상으로 파조파닙의 효과를 조사하였다. 마우스는 p47^phox-결핍 마우스로부터의 골수를 조사된 WT 마우스로 전달함으로써 생성되었다. 호중구 ROS가 ALI 억제에 유익한 효과를 제공한다는 가설과 일치하게, p47^phox의 조혈 결핍은 HCl-유도된 ALI에서 폐 투과성을 증가시켰다(도 17b). 중요하게는, 조혈 세포에서 p47^phox의 결핍은 투과성(도 17b) 및 생존(도 18a)에 대한 파조파닙의 효과를 없애며, 이는 파조파닙이 p47^phox를 통해 작용함을 시사한다. 파조파닙이 p47^phox 인산화를 통해 작용하는지 여부를 추가로 알아보기 위해, p47^phox-KI 호중구 및 마우스를 사용하여 파조파닙을 시험하였다. 파조파닙은 p47^phox-KI 호중구에서 ROS 생성을 증가시키지 못하거나(도 17c) HCl-유도된 폐 손상 후 p47^phox-KI 마우스에서 폐 투과성을 감소시키지 못하였으며(도 17d), 따라서 파조파닙이 Ser-208에서 p47^phox 인산화를 통해 작용함을 확인시켜 주었다. 이러한 결과는, 페길화된 카탈라제가 ALI 모델에서 파조파닙의 효과를 없앤다는 관찰(도 17e)과 함께, 파조파닙이 S208에서 p47^phox의 MAP3K2/3-매개 인산화의 억제를 통해 및 세포외 H₂O₂를 통해 작용하여 폐 투과성을 감소시킨다는 것을 입증한다.

MAP3K2/3의 유전적 불활성화와 일치하게, 파조파닙 처리는 ALI를 받은 폐 추출물에서 인산화된 AKT 수준의 증가를 초래하였다(도 18b). 중요하게는, AKT 억제제(MK-2206)로 마우스를 처리하면 HCl-유도된 ALI 모델에서 폐 투과성에 대한 파조파닙의 효과가 없어졌다(도 18c). 이러한 데이터는 함께, 파조파닙이 MAP3K2/3, p47^phox 및 AKT를 통해 작용하여 HCl-유도된 ALI 동안 폐 투과성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

MAP3K2 및 3 단백질은 모두 인간 호중구에서 발현된다. 파조파닙이 인간 호중구에서 ROS 생산을 증가시킨다는 관찰(도 19a)과 함께, 파조파닙은 인간에서 ALI/ARDS를 치료할 수 있는 진정한 잠재력을 갖는다. 따라서, 폐 이식(LT)을 받은 환자에서 파조파닙의 효과를 평가하기 위해 예비 인체 연구를 수행하였다. LT는 ALI에 대한 이상적인 인간 모델이며, 여기서 ALI/ARDS가 허혈 재관류에 의해 유발되고 호중구가 주요 플레이어이며 감염 및 질병 경과에 의해 혼동되지 않는다. 5쌍의 환자가 이 예비 임상 연구에 등록하였으며, 각 쌍은 동일한 기증자로부터 하나의 폐를 받았다. 한 쌍의 환자 중 한 명은 경구 용량의 파조파닙을 제공받은 반면 한 쌍 중 다른 환자는 치료를 받지 않았다. 치료군 및 대조군은 연령 및 성별 측면에서 유의한 차이가 없었다(도 19b). 치료군은 폐부종의 시각적 평가를 제공하는 X선 불투명도 점수가 첫날에 유의하게 낮았고(차이: 0.6, 95% CI 0.04-1.26, p=0.04), 마지막 날에도 유사한 차이가 유지되었다(0.7, 95% CI 0.1-1.3, p=0.04)(도 19c 및 19d). 평균적으로, 치료군은 대조군에 비해 0.5포인트 낮은 X선(p=0.02)을 나타냈다. 따라서, 파조파닙 치료는 폐 이식-유도된 손상에서 폐부종을 유의하게 감소시켰다.

선택된 논평

이 연구에서, FDA-승인된 항암 약물인 파조파닙이 이의 항암 작용과는 다른 메카니즘을 통해 마우스 및 인간에서 ALI 표현형을 감소시킨다는 증거가 제공된다. 파조파닙은 Ser-208에서 p47^phox의 MAP3K2/3-매개된 인산화에 대한 강력한 억제제인 것으로 나타났으며, 파조파닙이 티로신 키나제 수용체를 억제함에도 불구하고 주로 이러한 MAP3K2/3-p47^phox 경로를 통해 작용하여 ALI를 개선한다는 것을 입증하는 강력한 마우스 유전적 증거가 제시되었다. 이러한 FDA-승인된 약물은 암 치료를 위해 수년 동안 임상에서 사용되었으며 장기간 사용에도 내약성이 좋다. 이러한 안전성 프로파일은, 다른 MAP3K 기질 MEK5에 비해 p47^phox에 대한 파조파닙의 예상치 못한 기질 특이성과 함께, ALI/ARDS 치료를 위한 추가적인 안전성 우위를 이 약물에 부여한다. 따라서 이것은 ALI/ARDS의 약리학적 개입에 대한 충족되지 않은 의학적 요구를 충족시키는 ALI/ARD에 대한 최초의 치료제가 될 유망한 잠재력을 가지고 있다.

마우스 ALI 모델에서 작동하는 것으로 나타난 수많은 제제가 인간에서 실패하였다. 이전에 시험된 이러한 제제는 프로세스의 업스트림에서 작용하거나 면역 반응 및 염증성 사이토카인을 표적으로 한다. 반대로, 이 연구에서 기술된 파조파닙의 작용 기전은 호중구에서 폐 내피 및 상피 세포로의 측분비 메카니즘을 통해 인간과 마우스 사이에서 보존될 가능성이 높다. 파조파닙이 폐 이식-유도된 손상에서 폐부종을 감소시킨다는 것을 보여주는 인간 파일럿 연구는 종 간의 작용 메카니즘의 보존과 일치한다. 인체 연구는 정맥내 형태로의 파조파닙의 재조제 및/또는 연구 규모의 확대를 포함할 수 있다. 또한, 본 연구는 무균 환경에서 폐 손상의 급성기에 초점을 맞추고 있기 때문에, MAP3K2 및 3 억제가 박테리아 또는 바이러스 감염에 의해 유발된 ARDS에서 및/또는 ARDS의 회복기에 적용될 때 효과적인지 여부를 조사하기 위한 연구가 수행될 수 있다.

과도한 양의 ROS는 일반적으로 특히 ROS를 생산하는 세포에서 지질, 단백질 및 DNA에 손상을 유발한다. 그러나, 이 연구에서, 측분비 메카니즘을 통해 골수 세포로부터의 ROS 방출의 적당한 증가가 폐 혈관과 상피 세포 모두에 영향을 주어 장벽 기능의 향상을 돕는다는 것을 보여주는 강력한 증거가 제공된다. 공동-배양 실험은 호중구에서 MAP3K2/3 또는 p47^phox 인산화의 손실로 인한 ROS 방출의 변화가 AKT 인산화를 증가시키고 내피 세포의 장벽 기능을 향상시키는데 충분하다는 것을 입증하였다. 중요하게도, 이러한 효과는 카탈라제의 효과 때문에 유리 슈퍼옥사이드 라디칼보다는 세포외 H₂O₂에 의해 직접 매개되었다. AKT 활성화는 내피 세포에서 RAC1 활성화를 유도하여 F-액틴 재형성을 조절하고 혈관 무결성을 향상시켜, 내피 세포 무결성의 향상 및 투과성 감소에 대한 측분비 H₂O₂의 효과에 대한 설명을 제공한다. AKT 활성화의 중요성은 이의 억제제가 ALI에 대한 MAP3K2/3 억제의 유익한 효과를 없앤다는 관찰에 의해 더욱 확증되었다(도 18c).

측분비 H₂O₂의 영향은 폐 내피 세포에서 AKT 조절을 넘어선 것으로 보인다. scRNAseq 데이터는 장벽 기능과 상피 생존 및 증식의 향상쪽으로 편향된 폐 내피 및 상피 세포의 광범위한 전사 변화를 보여주었다. 이러한 결과는 면역조직염색 데이터와 함께, 호중구로부터 방출된 세포외 H₂O₂의 적당한 상승이 상이한 폐 세포 유형의 크로스토크 및 상호작용을 통해 폐 미세환경 재형성을 유발하여 급성 손상으로부터 폐를 보호한다는 것을 나타낸다. 이 연구에서는, 내피 및 상피 세포가 기여하는 잠재적인 크로스토크를 연구하였다. 이론에 의해 제한되기를 바라는 것은 아니지만, H₂O₂에 의한 AKT의 활성화를 설명할 PTEN과 같은 단백질의 산화는 H₂O₂가 신호전달 분자로 작용하여 폐 장벽 세포에 광범위한 영향을 발휘하는 메커니즘 중 하나일 수 있다고 믿어진다. 특정의 비제한적인 실시양태에서, LPS-유도된 모델에서 MAP3K-p47 인산화 축의 억제에 의한 증가된 ROS 생산의 ALI 보호 효과는 장벽 세포에서의 AKT 활성화 및 상승된 H₂O₂의 항염증성 효과 둘 다의 조합 때문일 수 있다.

실시예 3: 파조파닙 임상 시험

파조파닙 제형의 조성

비제한적인 제형은 정맥내(IV) 제형으로 제조된, 하이드록시프로필 베타덱스(HPB) 및 주사용수에 가용화된 파조파닙 염산염을 포함한다. 각 mL는 5mg의 파조파닙 염산염을 함유하며 200mg의 하이드록시프로필 베타덱스USP 및 주사용수 USP로 가용화된다. 바이알의 내용물은 주입 전에 24mL 0.9% 염화나트륨 주사액, USP(정상 염수) 또는 5% 글루코스 용액으로 희석된다. 한 바이알의 내용물은 30mg의 파조파닙 염산염을 공급할 것이다. 정성적 및 정량적 조성은 하기 표 2에 나타내어져 있다.

표 2. 파조파닙 염산염 주사용 성분 및 조성

*헤드스페이스를 최소화하기 위한 가공 보조제로 배합 및 바이알 충전 동안 사용됨

약물 성분 불순물(명칭, 구조, 기원, 및 한계)에 대한 예시적인 정보가 표 3에 제공되어 있다.

표 3. 파조파닙 HCl 불순물의 명칭, 구조, 기원 및 한계

표 4는 표 3에 열거된 불순물에 대한 화학명을 제공한다.

표 4. 관련 물질에 대한 화학명

HCl-유도된 마우스 급성 폐 손상 모델에서의 파조파닙 IV

파조파닙에 의한 Ser-208에서 p47^phox의 MAP3K2 및 MAP3K3 인산화의 억제에 대한 시험관내 결과에 기초하여, 파조파닙 IV의 효능을 1, 3 및 10mg/체중 kg의 용량에서 결정하였다. 8 내지 10주령의 BALB/c 마우스를 케타민/자일라진(100 및 10mg/kg)으로 마취시키고 케타민/자일라진을 사용하여 전체 절차 동안 마취하에 유지시켰다. 깊이 마취시킨 후(유해 자극, 예를 들어, 발가락 꼬집기를 가하고 반사 반응이 없고 호흡 속도나 특성의 변화가 없음을 관찰함으로써 평가됨), 마우스를 경구기관 점적을 위한 맞춤형 마운트에서 이들의 앞니로부터 수직으로 고정하였다. 22G 카테터를 성대 아래 1.5cm로 유도하고, 2.5μl/g의 0.05M HCl을 주입하였다. 투여 후, 호흡이 점차 정상으로 돌아올 때까지 마우스를 모니터링하였다. 그후 마우스를 가열 패드 상의 회복 케이지로 되돌려 마취 상태에 대해 모니터링하였다. 손상 유도 30분 전에, 파조파닙 IV, 1, 3 또는 10mg/체중 kg, 또는 비히클 대조군을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 전달하였다. 폐 손상 유도 4시간 후, 100μL의 FITC-표지된 알부민(10mg/mL)을 안와후 정맥을 통해 주사하였다. FITC-알부민 주사 2시간 후, 마우스를 안락사시키고, 폐에 PBS 1ml를 주입하여 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집하였으며, 이것은 기관 카테터를 통해 회수하였다. BAL의 녹색 형광을 플레이트 판독기로 측정하였다. 파조파닙-처리된 마우스로부터의 BAL 형광 강도를 비히클-대조군-처리된 마우스로부터의 강도에 대해 정규화하였다. 3mg/체중 kg의 파조파닙 IV에서 통계적으로 유의한 투과성 감소가 관찰되었다(P<0.0001)(도 20).

MHV -1 마우스 모델에서의 파조파닙 IV

폐 손상을 개선하는데 있어서의 파조파닙 IV의 효능을 HCl-유도된 ALI 마우스 모델에서 확립한 후, 코로나바이러스 감염-유도된 ALI 마우스 모델에서 폐 손상을 감소시키기 위한 이들의 가능성을 조사하였다. 뮤린 간염 바이러스 균주 1(MHV-1) 모델을 약리학 연구를 위해 채택하였다. 모든 MHV-1-감염된 A/J 마우스는 진행성 간질 부종(progressive interstitial edema), 호중구/대식세포 침윤(neutrophil/macrophage infiltrate) 및 유리질 막(hyaline membrane)이 발생하여, 모든 마우스가 사망하였다. 현재까지 2건의 연구가 완료되었다. 첫 번째 실험에서는, 바이러스 접종 후 6시간, 21시간 및 32시간에 연구 개입의 3회 용량 섭생을 마우스에 투여하였다. 두 번째에서, 접종 후 24시간 및 33시간에 2회 용량 섭생을 마우스에 투여하였다.

연구 1:

8-10주령의 A/J 마우스를 케타민/자일라진(100 및 10 mg/kg)으로 마취하고 케타민/자일라진을 사용하여 전체 절차 동안 마취하에 유지시켰다. 깊이 마취시킨 후(유해 자극, 예를 들어, 발가락 꼬집기를 가하고 반사 반응이 없고 호흡 속도나 특성의 변화가 없음을 관찰함으로써 평가됨), 마우스에 20μL 둘베코 개질된 이글 배지 중의 5000 PFU MHV-1의 비강내 접종을 제공하였다. 투여 후, 호흡이 점차 정상으로 돌아올 때까지 마우스를 모니터링하였다. 그후 마우스를 가열 패드 상의 회복 케이지로 되돌려 이들의 마취 상태를 모니터링하였다. 그후 3회 용량의 파조파닙 IV, 3mg/체중 kg 또는 비히클 대조군을 바이러스 접종 후 6, 21 및 32시간에 각각 1회씩 포함하여 안와후 정맥을 통해 마우스에 전달하였다. 3차 용량의 개립 후 15시간에 100μl의 FITC-표지된 알부민(10mg/mL)을 안와후 정맥을 통해 주사하였다. FITC-알부민 주사 2시간 후, 마우스를 안락사시키고, 폐에 PBS 1ml를 주입하여 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집하였으며, 이것은 기관 카테터를 통해 회수하였다. BAL의 녹색 형광을 플레이트 판독기로 측정하였다. 파조파닙-처리된 마우스로부터의 BAL 형광 강도를 비히클-대조군-처리된 마우스로부터의 강도에 대해 정규화하였으며, 여기서 더 높은 강도는 더 큰 투과성에 상응한다. 3mg/체중 kg의 파조파닙 IV에서 투과성의 유의한 감소가 관찰되었다(P=0.0235)(도 21).

연구 2:

8-10주령의 A/J 마우스를 케타민/자일라진(100 및 10 mg/kg)으로 마취하고 케타민/자일라진을 사용하여 전체 절차 동안 마취하에 유지시켰다. 깊이 마취시킨 후(유해 자극, 예를 들어, 발가락 꼬집기를 가하고 반사 반응이 없고 호흡 속도나 특성의 변화가 없음을 관찰함으로써 평가됨), 마우스에 20μL 둘베코 개질된 이글 배지 중의 6000 PFU MHV-1의 비강내 접종을 제공하였다. 투여 후, 호흡이 점차 정상으로 돌아올 때까지 마우스를 모니터링하였다. 그후 마우스를 가열 패드 상의 회복 케이지로 되돌려 이들의 마취 상태를 모니터링하였다. 그후 2회 용량의 파조파닙 IV, 3mg/체중 kg, 또는 비히클 대조군을 바이러스 접종 후 24 및 33시간에 각각 1회씩 포함하여 안와후 정맥을 통해 마우스에 전달하였다. 2차 용량의 연구 개립(파조파닙 IV 또는 위약) 후 16시간에, 100μl의 FITC-표지된 알부민(10mg/mL)을 안와후 정맥을 통해 주사하였다. FITC-알부민 주사 2시간 후, 마우스를 안락사시키고, 폐에 PBS 1ml를 주입하여 기관지폐포 세척액(BAL)을 수집하였으며, 이것은 기관 카테터를 통해 회수하였다. BAL의 녹색 형광을 플레이트 판독기로 측정하였다. 파조파닙-처리된 마우스로부터의 BAL 형광 강도를 비히클-대조군-처리된 마우스로부터의 강도에 대해 정규화하였으며, 여기서 더 높은 강도는 더 큰 투과성에 상응한다. 3mg/체중 kg의 파조파닙 IV에서 투과성의 유의한 감소가 관찰되었다(P=0.0001)(도 22).

임상 시험에서 최대 안전 시작 용량의 추정

마우스 코로나바이러스-유도된 폐 손상 모델에서, 유효 용량은 대략 3mg/kg이었고(섹션 8.2.1), 이는 3 x 0.08mg 또는 0.24mg/kg의 인간 등가 용량으로 해석된다. 인간의 평균 체중이 70kg이라고 가정하면, 예상 임상 유효 용량은 대략 16.8mg일 것이다. 20mg의 시작 용량이 아래 제시된 정당성에 근거하여 COVID-19 환자의 연구를 위해 제안된다. VOTRIENT®(파조파닙)는 진행성 신세포 암종(advanced renal cell carcinoma) 및 연조직 육종(soft tissue sarcoma)의 치료를 위해 2009년부터 경구 투여용 정제 형태로 승인되었다. 암 환자에서 1일 1회 경구로 파조파닙 800mg의 권장 용량은 내약성이 우수하였다. 파조파닙의 경구 생체이용률은 21.4%(13.5%에서 38.9%)이고 C_max는 43.9μg/mL이며 AUC는 806μg.h/mL인 것으로 보고되었다.

NOAEL 및 인간 등가 용량 계산

2주 GLP IV 주입(20분) 연구로부터, NOAEL(무독성 수치)이 랫트 및 원숭이 모두에서 10mg/kg/일인 것으로 결론내려졌다(표 5). 따라서, 랫트 및 원숭이에 대한 상응하는 인간 등가 용량(HED)은 각각 1.6 및 3.2mg/kg이 될 것이다. 인간의 체중이 70kg이라고 가정하면, 이것은 랫트 및 원숭이에 대해 각각 112 및 224mg HED에 상응한다. 따라서, 2주간의 랫트 및 원숭이 연구를 기반으로 한 안전 마진은 각각 5.6배 및 11.2배가 될 것이다(표 5).

표 5. MSSD 안전 마진 접근법(독성 연구로부터의 NOAEL의 HED)

*제안된 임상 용량이 20mg/일 또는 0.29mg/kg이라고 가정함.

임상 약동학 대 동물 독성역학

이러한 정당화는 랫트 및 원숭이에서 GLP 2주 IV 주입 독성학 및 독성역학 연구 결과를 기반으로 한다(표 6). 임상 PK 및 독성 결과에 기초하여, 20mg/대상체가 2상 임상 시험을 위한 안전한 시작 용량인 것으로 제안되었다. 5mg/대상체(N = 7)로 파조파닙의 IV 투여 후, AUC 및 C_max는 각각 20.4μg.h/mL 및 0.848μg/mL였다. 용량-선형성을 가정하면, AUC 및 C_max는 20mg/대상체의 IV 주사 후 각각 81.6μg.h/mL 및 3.4μg/mL일 것이다. 이러한 외삽 값은 과장되었을 가능성이 있으며 계산된 안전 마진은 그에 따라 더 높을 것이다.

2주 GLP 독성역학 연구로부터의 혈장 약물 농도 분석은 C_max 값이 수컷 및 암컷 랫트에서 각각 55 및 47μg/mL임을 보여주었다. 파조파닙(20mg)의 IV 투여 후 남성에서 C_max(3.4μg/mL)를 나누어 도출한 안전 마진은 수컷 및 암컷 랫트에서 각각 13.8배 및 16.2배인 것으로 계산되었다(표 6).

유사하게, 수컷 및 암컷 원숭이로부터의 C_max 값에 기반한 파조파닙의 안전 마진은 각각 25배 및 23배인 것으로 계산되었다. 그러나, AUC 값에 기반한 안전 마진은 <10배였다. 이것은 남성에서 파조파닙의 반감기(t_1/2)(27.5시간)가 랫트 및 원숭이에서 몇 시간의 t_1/2에 비해 상대적으로 길기 때문일 수 있다. 또한, 랫트 및 원숭이 연구에 기반한 안전 마진의 계산에 사용된 NOAEL은 연구의 파트 1에서 단일 주입으로 COVID-19 환자에게 투여될 20mg의 초기 임상 용량과 비교하여 14일간 IV 투여 후 결정되었다. 마지막으로, 암 환자에서 800mg 경구 1일 용량의 파조파닙(인간 최대 권장 용량, MRHD) 후 혈장 약물 농도는 GLP 랫트 및 원숭이 독성 연구에서 관찰된 것보다 유의하게 높았다. 파조파닙의 경구 생체이용률은 대략 20%이며, 이는 임상 시험에서 최대 160mg의 IV 용량이 허용될 수 있음을 의미한다. 상기 설명된 근거에 기반하여, COVID-19 환자에 대한 임상 2상 시험을 위해 제안된 20mg의 파조파닙 IV 시작 용량은 안전하고 내약성이 우수해야 하며 계획된 최대 임상 노출 수준은 FDA-승인된 VOTRIENT 제품의 라벨에 따라 MRHD에 대해 허용된 수준을 초과할 수 없는 것으로 결론내려 진다.

표 6. 임상 PK 및 2주 GLP 랫트 및 원숭이 TK 연구에 기반한 안전 마진

^a5mg/일의 파조파닙의 IV 투여 후 C_max는 0.85μg/mL이었고 AUC_(0-∞)는 20.4μg*h/mL였다.

^b용량-선형성을 가정하면, 20mg/kg에서 C_max 및 AUC_(0-∞)는 각각 3.4μg/mL 및 81.6μg*h/mL일 것이다.

^cFDA-승인된 VOTRIENT 제품의 라벨에서 얻은 정보.

전반적인 연구 설계

어떠한 임상 조사도 파조파닙 IV에 대한 개발 프로그램의 일부로 완료되었거나 진행 중이지 않다. 시작 연구는 COVID-19로 확인된 입원 환자를 대상으로 파조파닙 IV의 단일 및 다중 투여의 안전성, 내약성 및 PK를 조사하는 2상, 이중 맹검, 다기관, 2군, 무작위, 위약-대조, 2-파트 적응 시험이다. 파트 1은 다중-용량(MD) 섭생으로서 두 번째 파트(파트 2)에서 직접 사용될 잠재적 최적 용량을 확인하기 위해 의도된 단일 상승 용량(SAD) 설계를 따른다. 연구는 또한 이 집단에서 가스 교환의 개선을 나타내는 예비 효능 신호를 찾는다. 전체 디자인의 그래픽은 포괄적인 설명 및 통계적 방법과 함께 도 23에 나타내어져 있다. 약동학 평가는 연구의 두 파트 모두에서 수행된다. 이러한 조사로부터의 결과는 향후 연구에 정보를 제공하기 위해 COVID-19 환자에서 파조파닙 IV의 단일 용량 및 다중 용량 안전성 및 PK 프로필을 특성화하는데 도움이 된다.

스크리닝 기간은 1 내지 3일간 지속된다(연구 1일차 포함). 적격성을 결정하기 위해 포함 및 제외 기준에 따라 예상 후보자를 평가할 것이다.

그후 적격 후보자가 연구에 등록되고 실험군(파조파닙 IV) 또는 대조군(위약군) 아암에 각각 2:1 비율로 무작위로 할당된다. 인구 편향을 피하기 위해, 무작위 배정은 질병 중증도(ICU 대 비-ICU 입원)를 기반으로 한 계층화에 의해 제어된다. 두 아암 모두에 대해, 치료는 표준 치료와 함께 연구 개입을 포함한다. 연구의 파트 1(SAD)에서, 개입은 무작위 배정 후 단일 20분 주입(말초 또는 중앙 캐뉼러)으로 시행된다. 2회의 주입은 세 번째 용량(5일)에 대한 옵션으로 파트 2(1일 및 3일)에서 투여된다. 참가자는 일련의 입원 환자 연구 평가를 받는다. 달리 명시되지 않는 한 참가자가 병원에 남아 있는 동안 매일 평가가 수행된다. 퇴원 후, 매주 적절하게 지정된 요일에 통신을 통한 후속 조치를 취한다. 각 참가자의 전체 지속기간은 1- 내지 3-일차의 스크리닝 기간 및 30-일(±2일)의 관찰 기간을 포함하여 28 내지 34일이다.

연구 모집단

상기한 바와 같이, 마우스 ALI 모델에 대한 최근 연구들은 파조파닙이 ARDS 및 가능하게는 COVID-19 관련 ARDS의 발병의 핵심 요소인 호중구의 단백질 키나제 MAP3K2 및 MAP3K3을 억제함으로써 ALI 및 ARDS의 발병을 조절함을 시사한다. ALI/ARDS는 COVID-19의 병태생리학의 핵심이기 때문에, 연구 모집단은 임상적으로 관련성이 있고 조사 연구 약물의 평가에 의미가 있을 것으로 예상된다.

2상 연구의 주요 적격 기준은 확인된 SARS-CoV-2 감염 및 진행성 COVID-19를 시사하는 임상 징후가 있는 입원이다. 두 가지 추가 질병-관련 기준은 방사선 사진 및 혈액 가스 평가를 포함한다. 흉부 영상에 의해 불투명하게 시각화된 방사선학적 양자간 침윤물의 존재는 ARDS 및 COVID-19 환자의 일반적인 특징이다. 두 번째 자격 기준은 맥박 산소 측정기(SpO₂)에 의해 92% 혈액 O₂ 포화도를 유지하는데 필요한 산소 지원 수준이다. 필요조건은 적어도 5L 이상(40% FiO₂)이다. 이 값은 최대 귀속 PaO₂/FiO₂ 비율 160에 해당한다. 대안적으로, 적격 참가자는 스크리닝시 침습적 기계 환기를 받을 수 있다. 이 기준은 연구 모집단을 중등도 내지 중증 폐 손상을 가진 사람들로 제한한다(베를린 정의, 중등도 ARDS: 100 내지 200 [PEEP ≥5cm H₂O]). 제안된 MoA에 기반하여, 최적의 개입 창은 바이러스 감염이 중환자에서 유의적인 폐 손상 및 가스 교환 손상의 발병과 관련된 과염증 반응을 유발하는 시간이다. 따라서, 어떤 이론에 의해 제한되고자 함이 없이, 이 요법은 곧 침습적 기계 환기의 후보가 될 수 있거나 최근에 침습적 기계 환기로 진행될 정도로 폐 기능이 악화된 환자에게 유리한 위험/이점 프로파일을 가질 수 있다.

선택된 논평

파조파닙은 FDA가 진행성 신세포 암종(advanced renal cell carcinoma)의 치료제로 승인하였고 본원에서 COVID-19와 관련된 병태생리학에 효과적인 치료제로 입증된 혈관신생 억제제이다. 최근 COVID-19 대유행은 다장기 질환을 동반한 폐렴으로 인한 입원의 전 세계적으로 갑작스럽고 유의적인 증가를 초래하였다. 파조파닙 IV는 0.24mg/kg HED에 해당하는 3mg/kg의 IV 주사를 통해 코로나바이러스 감염-유도 마우스 모델 뿐만 아니라 산-유도 ALI 마우스 모델에서 효능을 입증하였다. 각 환자의 평균 체중이 70kg이라고 가정하면, 임상 유효 용량은 16.8mg/일(또는 대략 20mg/일)이 될 것으로 예상된다.

1일 1회 경구로 800mg의 VOTRIENT®(파조파닙)은 암 환자에서 내약성이 우수한 것으로 나타났다. 파조파닙의 경구 생체이용률은 대략 20%였으며, 이는 최대 160mg의 파조파닙의 IV 용량이 환자에서 내약성이 우수할 수 있음을 시사한다. 이것은 래트 및 원숭이에 대한 2주 IV 주입 연구에 의해 뒷받침되었다. 10mg/kg/일의 STD10/NOAEL 용량으로 IV 투여한 후 이러한 GLP 랫트 및 원숭이 연구로부터 유도된 혈장 약물 농도 및 독성역학 매개변수는 랫트 및 원숭이에게 경구 투여한 후 NOAEL 용량의 파조파닙의 공개된 전신 노출과 유사하였으며 800mg/일의 VOTRIENT®의 경구 투여 후 암 환자에서 관찰된 것 이하였다. 2주 원숭이 연구에서는 계획된 임상 시작 용량과 비교하여 11.2배의 안전 마진이 입증되었다. 이러한 안전 마진은 파조파닙 IV가 연속 5일 동안 매일 원숭이에게 투여되었을 때 이전의 IV 용량 범위 발견 연구에서 33.1배로 증가하였다.

열거된 실시양태

다음의 예시적인 실시양태가 제공되며, 이의 번호는 중요도를 지정하는 것으로 해석되어서는 안된다:

실시양태 1은 치료적 유효량의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈-재관류 손상(IRI)을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

실시양태 2는 치료적 유효량의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈로 인한 것이 아닌 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI) 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

실시양태 3은 대상체가 중환자실(ICU) 또는 응급실(ER)에 있는, 실시양태 1-2 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 4는 대상체가 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 및/또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 개선, 예방 및/또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제 및/또는 요법을 추가로 투여받는, 실시양태 1-3 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 5는 투여 경로가 경구, 두개내, 비강, 직장, 비경구, 설하, 경피, 경점막, 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 척추강내, 피하, 근육내, 피내, 동맥내, 정맥내, 기관지내, 흡입 및 국소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 실시양태 1-4 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 6은 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물이 약 1일 3회, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 격일, 약 3일마다, 약 4일마다, 약 5일마다, 약 6일마다 및 약 일주일에 한 번으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 빈도로 대상체에게 투여되는, 실시양태 1-5 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 7은 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물이 재관류가 발생한 후 대상체에게 투여되는, 실시양태 1-6 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 8은 대상체에 대한 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 투여가 암을 앓고 있는 대상체에 대한 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 투여와 관련된 적어도 하나의 유의적인 이상 반응, 부작용 및/또는 독성을 일으키지 않는, 실시양태 1-7 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 9는 적어도 하나의 이상 반응, 부작용 및/또는 독성이 간독성(hepatotoxicity), 연장된 QT 간격 및 다형성 심실 빈맥(torsade de pointes), 출혈성 사건, 응고의 감소 또는 방해, 동맥 혈전성 사건, 위장관 천공 또는 누공, 고혈압, 갑상선 기능 저하증, 단백뇨, 설사, 모발 색 변화, 메스꺼움, 식욕 부진 및 구토로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 실시양태 8의 방법을 제공한다.

실시양태 10은 대상체가 암을 앓고 있는 대상체가 암 치료를 위해 투여받는 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 양보다 적은 양의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여받는, 실시양태 1-9 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 11은 대상체가 포유동물인, 실시양태 1-10 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 12는 포유동물이 인간인, 실시양태 1-11 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 13은 대상체가 약 5mg 내지 약 100mg의 양의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 정맥내 투여받는, 실시양태 1-12 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 14는 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물, 어플리케이터, 및 이의 사용에 대한 설명 자료를 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 설명 자료는 대상체에서 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 설명서를 포함한다.

실시양태 15는 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 및/또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제를 추가로 포함하는, 실시양태 14의 키트를 제공한다.

실시양태 16은 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 호중구를 약물과 접촉시키는 단계 및 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준이 증가하면, 약물은 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI, 및/또는 ARDS을 치료하는데 효과적이다.

실시양태 17은 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 약물을 투여한 후 대상체에서 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계(여기서, 약물을 투여한 후 대상체의 호중구 ROS 생산 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 호중구 ROS 생산 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적이다); 또는 (ii) 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준을 측정하는 단계(여기서, 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적이다)를 포함한다.

실시양태 18은 코로나바이러스 감염이 COVID-19인, 실시양태 1-13, 16 및 17 중 어느 하나의 방법을 제공한다.

실시양태 19는 코로나바이러스 감염이 COVID-19인, 실시양태 14 또는 15의 키트를 제공한다.

본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 개시내용은 특정 실시양태를 참조하여 개시되었지만, 본 개시내용의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 개시내용의 다른 실시양태 및 변형이 당업계의 다른 숙련가들에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시양태 및 등가 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Yale University <120> Compounds, Compositions, and Methods for Treating Ischemia-Reperfusion Injury and/or Lung Injury <130> 047162-7261WO1(01261) <150> US 62/938,083 <151> 2019-11-20 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa = phosphoserine <400> 1 Lys Arg Gly Trp Val Pro Ala Xaa Tyr Leu Glu Pro Leu Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 2 ggttgggtcc ctgcatccta tctggagccc ctt 33 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 3 Gly Trp Val Pro Ala Ser Tyr Leu Glu Pro Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 4 ggttgggtcc ctgcagctta cctcgagccc ctt 33 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 5 Gly Trp Val Pro Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Leu 1 5 10

Claims (19)

1. 치료적 유효량의 파조파닙(pazopanib), 또는 이의 염 또는 용매화물을 대상체(subject)에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈-재관류 손상(IRI)을 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법.
2. 치료적 유효량의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 대상체에게 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중후 뇌 허혈로 인한 것이 아닌 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI) 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료, 개선(ameliorating) 및/또는 예방하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 중환자실(ICU) 또는 응급실(ER)에 있는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI, 및/또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 개선, 예방 및/또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제(agent) 및/또는 요법(therapy)을 추가로 투여받는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 투여 경로가 경구, 두개내, 비강, 직장, 비경구, 설하, 경피, 경점막, 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 척추강내, 피하, 근육내, 피내, 동맥내, 정맥내, 기관지내, 흡입 및 국소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물이 약 1일 3회, 약 1일 2회, 약 1일 1회, 약 2일마다, 약 3일마다, 약 4일마다, 약 5일마다, 약 6일마다 및 약 일주일에 한 번으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 빈도로 대상체에게 투여되는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물이 재관류가 발생한 후 대상체에게 투여되는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체에 대한 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 투여가 암을 앓고 있는 대상체에 대한 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 투여와 관련된 적어도 하나의 유의적인(significant) 이상 반응, 부작용 및/또는 독성을 일으키지 않는 방법.
9. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 이상 반응, 부작용 및/또는 독성이 간독성(hepatotoxicity), 연장된 QT 간격 및 다형성 심실 빈맥(torsade de pointes), 출혈성 사건, 응고의 감소 또는 방해, 동맥 혈전성 사건, 위장관 천공 또는 누공(fistula), 고혈압, 갑상선 기능 저하증, 단백뇨, 설사, 모발 색 변화, 메스꺼움, 식욕 부진 및 구토로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가, 암을 앓고 있는 대상체가 암 치료를 위해 투여받는 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물의 양보다 적은 양의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 투여받는 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 약 5mg 내지 약 100mg의 양의 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물을 정맥내 투여받는 방법.
14. 파조파닙, 또는 이의 염 또는 용매화물, 어플리케이터(applicator), 및 이의 사용에 대한 설명 자료(instructional material)를 포함하고, 여기서 설명 자료가 대상체에서 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 설명서를 포함하는 키트(kit).
15. 제14항에 있어서, IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 및/또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 적어도 하나의 추가 제제를 추가로 포함하는 키트.
16. 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법으로서, 상기 방법이 호중구를 약물과 접촉시키는 단계 및 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서, 접촉 후 호중구 ROS 생산 수준이 증가하면, 약물은 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI, 및/또는 ARDS을 치료하는데 효과적인 방법.
17. 허혈-재관류 손상(IRI), 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, 급성 폐 손상(ALI), 및/또는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 약물의 효능을 평가하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 약물을 투여한 후 대상체에서 호중구 ROS 생산 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 약물을 투여한 후 대상체의 호중구 ROS 생산 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 호중구 ROS 생산 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 IRI, 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적인 단계; 또는
    (ii) 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서 H₂O₂ 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 약물을 투여한 후 대상체의 폐에서의 H₂O₂ 수준이 약물을 투여하기 전 대상체의 폐에서의 H₂O₂ 수준보다 높으면, 약물은 대상체에서 코로나바이러스 감염과 관련된 폐 손상, ALI 또는 ARDS를 치료하는데 효과적인 단계를 포함하는 방법.
18. 제1항, 제2항, 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 COVID-19인 방법.
19. 제14항에 있어서, 코로나바이러스 감염이 COVID-19인 키트.

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