TW202131923A - 用於治療局部缺血-再灌注損傷及/或肺損傷的化合物、組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本揭示包括使用MAP3K2/MAP3K3抑製劑預防、改善、及/或治療缺血-再灌注損傷(IRI)(包括，但不限於腦中風後)的方法。在另一方面，本揭示係關於使用MAP3K2/MAP3K3抑製劑來預防或治療與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的方法。在本揭示進一步包含組成物及包含於本揭示中有用之組成物的套組。

Description

用於治療局部缺血-再灌注損傷及/或肺損傷的化合物、組成物及方法

本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)主張美國臨時申請案第62/938,083號(2019年11月20日申請)之優先權，本文藉由引用將其整體併入。

本發明根據HL135805下由政府支持及美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)獎勵下製成，美國政府擁有本發明的特定權利。

本案關於用於治療局部缺血-再灌注損傷及/或肺損傷的化合物、組成物及方法。

缺血期過後恢復血液供應時會發生缺血-再灌注損傷(IRI)，在腦中風的情況中，可藉由溶血栓試劑(例如組織纖蛋白溶酶原活化劑(tissue plasminogen activator，tPA))觸發的血栓溶解或藉由機械去除血栓來實現再灌注。缺血性中風後也發生自發性再灌注。再灌注對於受影響組織恢復氧氣供應，但不幸的是，與永久性缺血相比，這是有害的作用。

缺血性中風後的再灌注損傷是一個複雜的病理生理性過程，涉及許多機制，例如但不限於，釋放興奮性胺基酸、離子失衡、氧化緊迫、炎症、凋亡誘導及/或壞死。隨著血管內治療(包括血栓切除術 及血栓破壞)的最新進展，再灌注損傷已成為中風治療中越來越關鍵的挑戰。因此，至關重要的是了解腦中缺血-再灌注損傷的機制，及如何在不造成不必要之細胞和組織損傷的情況下對此過程進行治療性管理。

2019年12月，一種新型冠狀病毒已成為一種傳染原，困擾著中國武漢的大多數人。該病毒已被指定為嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，其為2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)的病原體，此疾病在世界迅速蔓延至大流行程度。

上呼吸道及肺是SARS-CoV-2病毒進入及復製的主要地點，且呼吸系統疾病是相關病症COVID-19的主徵，亦為主要死因，儘管其他器官系統亦會受到影響。隨著COVID-19的進展，通常會出現嚴重的肺水腫，急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的一種表現，並可進一步發展為嚴重的低血氧症及急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。值得注意的是，ALI的發生及嚴重性已顯示出與受SARS-CoV-2感染個體的預後相關，據報導，ALI/ARDS對COVID-19進展為多器官功能障礙及死亡的病理生理學至關重要。已報導與COVID-19相關的ARDS的一些明顯表現，例如在嚴重低血氧症存在時相對正常的肺順從性。然而，該差異可能被認為反映該徵候群本身的廣泛異質性，並且已建議有新的證據表明，歷史性及冠狀病毒感染相關的ARDS在呼吸系統機制方面具有廣泛的相似性。因此，在冠狀病毒感染已發展為ALI/ARDS的患者中及在冠狀病毒感染影響肺及/或呼吸道但尚未發展為ALI/ARDS的患者中，對於ALI/ARDS具有潛在臨床益處的治療有望降低冠狀病毒(例如COVID-19)感染的嚴重性，並改善受影響病患的整體存活。

急性肺損傷(ALI)及其更嚴重的急性呼吸窘迫症候群(ARDS)是由於直接或間接侵害肺引起的，可能與冠狀病毒感染或其他原因有關，例如但不限於，脂多醣(LPS)誘導的ALI/ARDS、抽吸引起的ALI/ARDS、缺血再灌注引起的ALI/ARDS及/或細菌/病毒性ALI/ARDS。無論是ALI/ARDS病因如何，此肺損傷都代表著嚴重的 健康問題且死亡率很高。據報導，美國每年ALI/ARDS的發病率約為20萬人，且死亡率約為40%，目前尚無針對該疾病的藥理學干預措施，這些症狀的照護很大程度上取決於支持措施。在罹患ALI/ARDS病患中測試過的藥理學療法未能顯示出療效。因此，對於此疾病的治療干預存在明顯尚未滿足的醫學需求。

MAP3K及MAP3K3為MAP3K超家族的MEK激酶(MEKK)亞群的兩個高度保守的成員，它們在C端包含一個激酶結構域，在N端附近包含一個PB1結構域。MAP3K2及MAP3K3的激酶結構域共享94%的序列同一性，且這兩種激酶被預期共享基質。激酶在活體外的瞬時表現導致其等的自動活化及ERK1及ERK2、p38、JNK及ERK5的活化。在小鼠中，這些激酶參涉及心血管發育、淋巴細胞分化及NF-κB調節。然而，尚未探討其等在其他生理事件中所扮演的角色。

本技術領域對於確定在患病的受試者中可用於治療、改善及/或預防缺血-再灌注損傷、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷及/或急性呼吸窘迫症候群的新型治療方法有所需求。在某些實施方式中，患有缺血-再灌注的受試者罹患缺血性中風。在某些實施方式中，與冠狀病毒感染有關之肺損傷已進展為急性肺損傷及/或急性呼吸窘迫症候群。在其他實施方式中，與冠狀病毒感染有關之肺損傷未進展至急性肺損傷及/或急性呼吸窘迫症候群。本揭示解決並滿足此一需求。

本揭示提供一種在所需受試者中治療、改善及/或預防中風後腦缺血-再灌注損傷(IRI)的方法。在某些實施方式中，該方法包含投予該受試者治療有效量之帕唑帕尼(pazopanib)及/或其鹽及/或溶劑合物。

本揭示進一步提供一種在所需受試者中治療、改善及/或預防非由中風後腦缺血所引起之缺血-再灌注損傷(ischemia- reperfusion injury，IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的方法。在某些實施方式中，該方法包含投予該受試者治療有效量之帕唑帕尼及/或其鹽及/或溶劑合物。

本揭示進一步提供一種評估藥物在治療缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之療效的方法。在某些實施方式中，該方法包含將嗜中性球與藥物接觸並測量接觸後嗜中性球ROS產生的水平，其中，若接觸後嗜中性球ROS產生的水平增加，則該藥物可有效治療IRI、與冠狀病毒感染有關的肺損傷、ALI及/或ARDS。

本揭示進一步提供一種評估方法藥物在治療罹患缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之受試者的療效的方法。在某些實施方式中，該方法包含(i)在受試者投予藥物後，測量嗜中性球ROS生產水平，其中，若在受試者投予藥物後之嗜中性球ROS生產水平高於受試者投予藥物前之嗜中性球ROS生產水平，則該藥物為有效治療受試者的IRI、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS；及/或(ii)在投予藥物後，測量受試者肺臟中H₂O₂水平，其中，若在投予藥物後受試者肺臟中之H₂O₂水平高於投予藥物前受試者肺臟中之H₂O₂水平，則該藥物為有效治療受試者的與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS。

當結合所附圖式，將更佳理解本揭示的特定實施方式的以下詳細描述。為了說明本發明的目的，在圖式中描述特定實施方式。然而，本揭示不限於圖式中所描述之實施方式的精確配置和手段。

圖1說明帕唑帕尼降低血管腔內中大腦動脈(MCA)阻塞性腦中風小鼠模型的大腦IRI。在允許血液再灌注之前，對於13隻雌 性C57bl小鼠(9週齡)進行60分鐘的阻塞。再灌注後30分鐘，通過眼眶後靜脈注射將60μg帕唑帕尼投予其中的7隻。在對動物實施安樂死之前24小時對牠們的神經系統損傷進行評分(右下方的長條圖)。然後藉由以TCC染色大腦切片來評估腦梗塞，顯示TCC染色的圖像並定量梗塞大小，及顯示在右上方的長條圖。

圖2說明若再灌注時投予帕唑帕尼，帕唑帕尼無法降低血管腔內中大腦動脈(MCA)阻塞性腦中風小鼠模型的腦IRI。在允許血液再灌注之前，對六隻雌性C57bl小鼠(9週齡)進行60分鐘的閉塞。再灌注後，其中3隻立即通過眼眶後靜脈注射投予60μg帕唑帕尼。神經損傷評分(右下方的長條圖)，TCC染色的大腦切片影像及腦梗塞大小量化顯示在右上方。

圖3A-3F描述MAP3K2/3-無嗜中性球顯示出除ROS(活性含氧物)生成以外的正常功能。圖3A：DKO嗜中性球中MAP3K2及3種蛋白質的缺失。分別使用MAP3K2及3特異性抗體藉由Western分析骨髓嗜中性球。圖3B：在存在1μM fMLP的情況下，ROS從WT及MAP3K2/3-缺失的骨髓嗜中性球中釋放。圖3C：如B中所示，從刺激後5分鐘的跡線下面積計算出的單離嗜中性球的ROS量(數據表示為平均值±sem，單向變異數分析；n=5)，K2及K3分別代表Map3k2 ^-/- 及Map3k3 ^-/- 。圖3D：MAP3K2/3-缺乏會增加由兩劑量fMLP及由MIP2(以μM為單位)刺激的小鼠嗜中性球產生的ROS，數據表示為平均值±sem(***，p<0.001；司徒頓t試驗(Student's t-test)；n=3)。圖3E：使用細胞色素C測定測量經1μM fMLP刺激的骨髓嗜中性球產生的ROS。圖3F：WT MAP3K3的表現，但非其激酶死亡突變體，抑制DKO嗜中性球中的ROS產生，以GFP、MAK3K3-GFP或與GFP融合的MAP3K3激酶失活(激酶dead，KD)質粒瞬時轉染嗜中性球。次日，將GFP陽性細胞分選並用於ROS釋放測定，數據表示為平均值±sem(單向變異數分析測試，n=3)。

圖4A-4P描述MAP3K2及3-缺失對嗜中性球功能的影 響。圖4A-4D：嗜中性球在fMLP刺激下經歷唐納隔室趨化作用(Dunn chamber chemotaxis)，代表性的細胞遷移軌跡示於(圖4A和4B)。(圖4C)和(圖4D)中顯示有關細胞移動速度及它們遵循化學吸引因數梯度的易位性和方向性參數，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n>50)。DKO，Map3k2 ^-/- ，Map3k3 ^-/- 。圖4E：在剪切流動室中測驗嗜中性球對內皮細胞的粘附。圖4F-4G：在以fMLP刺激的嗜中性球上，LFA-1及MAC-1整聯蛋白的細胞表面表現。圖4H：嗜中性球與ICAM-1結合，其反映經fMLP活化後嗜中性球上整聯蛋白的結合性。圖4I：嗜中性球滲入發炎的腹膜。圖4J-4K：刺激後從嗜中性球顆粒中釋放出MMP及MPO。圖4L：在緩衝液中使用發光胺(luminol)測量由1μM fMLP刺激的嗜中性球產生的ROS(0.25% BSA於具有Ca²⁺及Mg²⁺之HBSS中，10mM異發光胺，100u/ml HRP)。圖4M及4N：使用EasySep^TM小鼠嗜中性球富集套組(Stemcell Tech)自腹膜和骨髓中分離嗜中性球，並使用1μM fMLP刺激，然後使用異發光胺測量ROS。圖4O：使用異發光胺測量200nM PMA刺激而自嗜中性球產生的ROS，在圖4E-4O中的數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。圖4P：藉由Western分析檢測MAP3K3及其突變體的表現以支持圖3F。

圖5A-5G描述造血細胞中MAP3K2的喪失及骨髓細胞中MAP3K3的喪失改善了急性肺損傷。圖5A及5D：DKO小鼠的肺穿透性降低。將DKO及對照WT小鼠接受HCl或LPS誘導的ALI，然後進行肺通透性測量，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n=8)。圖5B及5E：損傷的肺的代表性組織學。Br，支氣管；V，血管；黃色圓圈表示血管周圍間質性水腫的區域。血管周圍間質水腫及ALI指數的定量顯示在圖6A中。圖5C及5F：DKO小鼠顯示延長生存期(Mantel-Cox Log-Rank測試；n=5；p=0.004)。圖5G：來自HCl-損傷的肺及DKO小鼠的BAL的嗜中性球產生的ROS量比WT小鼠更大。數據(平均螢光強度)表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n=4)。

圖6A-6F描述MAP3K2及3-缺失對ALI的影響。圖 6A：定量圖5A-5G的血管周圍間質性水腫和肺損傷指數。圖6B：HCI誘導性ALI模型中，MAP3K2(K2)或MAP3K3(K3)缺失對肺穿透性的影響。圖6C：於DAL和WT小鼠的經HCl損傷的肺的BAL中存在骨髓細胞，顯示了絕對細胞數。圖6D：DKO和WT小鼠的經HCl損傷的肺中骨髓細胞浸潤，在流量分析之前，用PBS灌注肺臟並用膠原酶消化，顯示的數據預以CD45預先閘控，顯示了絕對細胞數。圖6E：經HCl誘導的ALI後，DKO和WT小鼠中循環血細胞的數量。圖6F：在DKO和WT小鼠的經HCl損傷的肺BAL中的細胞因子水平。圖6A-6F中的數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。

圖7A-7I：描述MAP3K3在S208處磷酸化p47^phox以抑制NADPH氧化酶活性。圖7A：MAP3K3磷酸化p47^phox。使用純化的重組MAPK3K3和免疫沉澱的NADPH氧化酶次單元進行活體外激酶測定。NADPH氧化酶次單元在帶有HA標籤的HEK293細胞中瞬時表現，並使用抗HA抗體進行免疫沉澱。圖7B：MAP3K3磷酸化p47^phox的S208，使用重組MAP3K3及GST-p47SH3(WT)或含S208E突變(SE)的GST-p47SH3執行活體外激酶測定。GST-p47SH3為麩胺基硫S-轉移酶-融合p47^phox片段(殘基151-286)，其含有二個SH3域(domain)。圖7C：p47^phox的Ser-208的擬磷酸化突變導致重構ROS生產測定法活性降低，COS-7細胞以質體一併與WT p47^phox或其S208A(SA)或S208E(SE)突變體一起共轉染p22^phox、p67^phox及p97^phox。顯示經PMA誘導的ROS生產，數據表示為平均值±sem(兩端單因子變異數分析，n=4)。圖7D：WT p47^phox，但非其S208A突變體，被MAP3K3抑制，在MAP3K3存在或不存在下，COS-7細胞以質體一併與WT p47^phox(左圖)或其S208A突變體(右圖)共轉染p22^phox、p67^phox及p97^phox，顯示經MA誘導的ROS產生。數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。圖7E：p47^phox的Ser-208的擬磷酸化突變削弱與p22^phox的相互作用。以GST-p47SH3 S208A或S208E突變體及p22^phox(p22C)之經MBP融合C端(殘基96-164)執行GST 下拉測定法(GST pull-down assat)。西方(Western)分析用於檢測蛋白質。圖7F：p47^phox的Ser-208的磷酸化經fMLP刺激，以fMLP(1μM)刺激嗜中性球不同的持續時間，然後進行西方分析。圖7G：經FMLP刺激的p47^phox磷酸化取決於MAP3K2/3。圖7H：來自p47^phox-KI小鼠的嗜中性球釋放的ROS比野生型更多。數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n>5)。圖71：p47^phox-KI小鼠已誘導肺穿透性經HCl誘導後ALI，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n>4)。β

圖8A-8I描述MAP3K2/3藉由p47^phox的磷酸化調節NADPH氧化酶複合物2。圖8A-8B：如圖所示，以質體轉染COS-7細胞的NADPH氧化酶次單元，並以或不以PMA處理，測定ROS產生和蛋白質表現。圖8C：WT MAP3K3，而非其激酶活性喪失突變體，在重構COS-7系統中可抑制ROS生產，數據表示為平均值±sem(單因子變異數分析，LacZ為n=4且其他為n=3)。圖8D：示意圖模型描述MAP3K2/3如何抑制ROS產生，MAP2K2/3在Ser-208處磷酸化p47^phox，磷酸化干擾p47^phox與p22^phox之間的相互作用，因此抑制NADPH氧化酶活性及ROS生產。圖8E：抗磷酸S208 p47^phox抗體的驗證。將HEK293細胞與WT和WT或S208A p47^phox一起共轉染，次日執行西方分析。圖8F-8G：圖7F及7G中的西方墨點法定量。數據由p-p47相對於總p47的標準化數值表示，n=3。圖8H-8I：藉由DNA定序(圖8H；頂部，SEQ ID NO：2-3；底部，SEQ ID NO：4-5)和西方分析(圖8I)驗證p47^phox S208 A敲入。以fMLP(1μM)刺激來自WT和p47^phox-KI(KI)小鼠的嗜中性球達到所指示的時間，並藉由圖8I中的西方墨點進行分析。

圖9A-9L描述p47^phox-KI對肺微環境的改變。圖9A：肺CD45陰性細胞的單細胞RNA定序的t-SNE圖。圖9B：內皮細胞的途徑富集分析，僅顯示與Akt傳訊相關者。圖9C：對來自WT和MAP3K2/3 DKO小鼠的肺切片進行磷酸化S473 AKT(pAKT)和CD31染色，經HCl誘導ALI後6小時收集樣品。圖9D：對於圖10A經 CD31染色所標記的內皮細胞p-AKT染色的定量。各基準點為來自一隻小鼠8個以上血管切片的平均。圖9E：與WT小鼠相比，DKO小鼠的經HCl損傷的肺部蛋白質萃取物中在S308處的AKT磷酸化增加，定量被顯示為平均±sem(司徒頓t試驗)。圖9F：在初代小鼠肺內皮細胞中，低濃度的H₂O₂會增強TEER並刺激AKT。圖9G：定量圖10B。圖9H：藉由共培養MAP3K2/3缺乏嗜中性球(DKO)，減少的細胞色素C在內皮細胞中增加AKT磷酸化。圖9I：相較於fMLP刺激的WT嗜中性球，fMLP刺激的p47^phox-KI的共培養在肺內皮細胞中引起更大的AKT磷酸化。圖9J-9L：在HCl誘導的ALI之前立即經由尾靜脈靜脈注射聚乙二醇過氧化氫酶(Cat；2000U/小鼠)，可增加穿透性、間質性水腫和WT小鼠的死亡率。除了模擬以外，還使用加熱去活化(iCat)作為對照，數據表示為平均值±sem，在圖9D-9G、9I、9J和9L中的數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。

圖10A-10I描繪p47^phox-KI對肺臟微環境的改變。圖10A and 10F-10I：如圖所示，將來自WT和p47^phox-KI小鼠的肺切片進行對磷酸化-S473 AKT(pAKT)、CD31、平滑肌肌動蛋白(SMA)、ABCA3，活化的半胱天冬酶3(activated caspase 3，CASP3)及/或Ki67的染色。HCl誘導ALI後6小時收集樣品，除圖10I外，其在損傷後24小時收集。顯示代表性的共焦影像。定量顯示於在圖9D、11B、12A-12C中。圖10B：與經fMLP刺激的WT嗜中性球相比，經fMLP刺激的MAP3K2/3-缺失嗜中性球(DKO)的共培養造成更大的AKT磷酸化，且過氧化氫酶(Cat)的存在，但不是過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，消除了在AKT磷酸化中的此種差異。定量示於圖9G。圖10C：在存在或不存在SOD的情況下，與經fMLP刺激的WT或DKO嗜中性球共培養的小鼠肺內皮細胞的TEER測量。圖10D：在HCl滴注之前藉由尾靜脈靜脈投予聚乙二醇化過氧化氫酶(2000U/小鼠)會增加穿透性，並消除MAP3K2/3缺失對HCl誘導的穿透性變化的影響。數據表示為平均值±sem(雙向變異數分析；ns，不顯著)。圖 10E：使用單細胞RNA定序，比較p47^phox-KI(KI)和WT樣品的基因表現的小提琴圖(Violin plot)。EC1和EC2是兩個內皮細胞亞組。

圖11A-11E描繪p47^phox-KI對肺內皮微環境的影響。圖11A：肺CD45陰性細胞的單細胞RNA定序的t-SNE圖。圖11B：圖10F的經SMA染色標記的p-AKT染色的定量，各基準點為來自一隻小鼠的8個以上血管切片的平均。圖11C、11D、11E：比較來自p47^phox-KI和WT肺的肺CD45陰性細胞的單細胞RNA定序的基因表現之小提琴圖，圖11B中的數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。

圖12A-12G描述p47^phox-KI對肺上皮微環境的改變。圖12A-12C：圖10G、10H和10I的ABCA3陽性細胞中p-AKT、Ki67或CASP3染色的定量，各基準點為來自一隻小鼠的大於30個ABCA3-陽性細胞的平均。圖12D：肺CD45陰性細胞的單細胞RNA定序的t-SNE圖。圖12E-12F：比較來自p47^phox-KI和WT肺的肺CD45陰性細胞的單細胞RNA定序的基因表現的小提琴圖。圖12G：用PDPN和活化的半胱天冬酶3(CASP3)抗體染色的ALI肺切片的共聚焦影像。圖12A-12C及12G中的數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。

圖13A-13E描述帕唑帕尼對MAP3K2/3和嗜中性球對p47^phox磷酸化的影響。圖13A-13B：在S208，使用抗磷酸-p47^phox測定不同劑量的帕唑帕尼對於MAP3K2或3在活體外代謝測定中對p47^phox磷酸化的影響，數據表示為平均值±sem(n=3個獨立實驗；單因子變異數分析)。圖13C：帕唑帕尼抑制經fMLP(1μM)刺激的嗜中性球中p47^phox的Ser-208磷酸化。圖13D-13E：，帕唑帕尼增加經fMLP(1μM)刺激的嗜中性球的ROS釋放依賴於MAP3K2/3。數據表示為平均值±sem(雙向變異數分析測試，n=4)。

圖14A-14B描述帕唑帕尼對磷酸化和人類嗜中性球的影響。圖14A：在活體外激酶測定中，帕唑帕尼在MAP3K2或3對MEK5磷酸化的影響，數據表示為平均值±sem(單向變異數分析)。圖14B：帕唑帕尼對小鼠嗜中性球ERK和p38磷酸化的影響。

圖15A-15H描述帕唑帕尼改善ALI。圖15A及15B：治療方法形態的示意圖示，小鼠(C57B1雌性，8週)經鼻內以1.5mg/Kg帕唑帕尼治療。圖15C-15F：損傷後檢查肺穿透性和組織學(數據表示為平均值±sem；司徒頓t試驗，n=10)。血管周圍間質性水腫的定量以間質性水腫面積和血管面積之比進行。亦顯示肺損傷的定量，從每隻小鼠的肺相同肺葉中定量超過8個切片。數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗；n=5)。圖15G-15H：帕唑帕尼的治療性處理可降低ALI模型的死亡率(Mantel-Cox Log-Rank測試；n=8)。

圖16A-16J描述帕唑帕尼改善ALI。圖16A：使用DCFDA測量接受或不接受帕唑帕尼治療來自的HCl肺損傷小鼠的BAL和肺的嗜中性球的ROS，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n=4)。圖16B-16D：帕唑帕尼顯示對BAL和肺中的嗜中性球浸潤或對BAL細胞因子含量無明顯影響，數據表示為平均值±sem。模擬與帕唑帕尼治療之間沒有重要性(司徒頓t試驗；n=5)。圖16E-16F：預防形式的示意圖示，在LPS模型中，藉由強飼法持續三天以60mg/Kg/天的帕唑帕尼治療小鼠(C57Bl雌性，8週)，而在HCl模型中，小鼠經鼻內以1.5mg/Kg的帕唑帕尼至療一次。圖16G-16H：損傷後檢查肺穿透性，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗；n=5)。圖16I-16J：使用Mantel-Cox Log-Rank測試分析死亡率。

圖17A-17E描述帕唑帕尼透過MAP3K2/3-p47^phox途徑作用。圖17A、17B及17D：對小鼠進行圖15A中所述的治療，然後進行肺穿透性測量。圖17C：p47^phox S208A的敲入增加ROS的產生並消除帕唑帕尼對嗜中性球的作用，在不存在20nM帕唑帕尼的情況下，以fMLP(1μM)刺激WT或p47^phox-KI小鼠的嗜中性球。圖17E：在滴注HCl之前經由尾靜脈投予聚乙二醇化過氧化氫酶(2000U/小鼠)可增加穿透性，並消除帕唑帕尼在HCl誘導性穿透性變化中的作用。在圖17A-17E中的數據表示為平均值±sem(雙向變異數分析；ns，不顯著)。

圖18A-18C描述帕唑帕尼的作用機制。圖18A：在缺少p47^phox的小鼠中，帕唑帕尼無法增加存活率。圖18B：帕唑帕尼增加ALI肺萃取物中S473處的AKT磷酸化，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗)。圖18C：AKT抑制劑(MK-2206)消除帕唑帕尼對經HCl傷害之肺的保護作用。

圖19A-19D描述帕唑帕尼改善人類受傷的肺部水腫。圖19A：在100nM fMLP存在下，帕唑帕尼對人類嗜中性球產生ROS的影響，數據表示為平均值±sem(司徒頓t試驗，n=12)。圖19B：5對LT(肺移植)接受者的病患訊息。圖19C：帕唑帕尼對肺性水腫的作用。*p<0.05(線性混合模型重複測量分析)。圖19D：代表性的胸部X射線照片。術後第1天和第2天進行胸部X光檢查，從同一捐贈者中，病患# 1a接受左肺，紅色輪廓標記，未接受藥物治療，而病患# 1b接受了右肺，綠色輪廓標記，並接受帕唑帕尼。病患# 1b在第1天表現出的肺渾濁程度低於病患# 1a，到第2天有明顯改善。值得注意的是，病患# 1b的手術時間較病患# 1a晚，而且缺血時間更長。

圖20描繪在HCl誘導性ALI模型中對於帕唑帕尼IV的非限制性穿透性百分比。

圖21描繪MHV-1小鼠模型中對於帕唑帕尼IV的非限制性穿透性百分比(研究1)。

圖22描繪MHV-1小鼠模型中對於帕唑帕尼IV的非限制性穿透性百分比(研究2)。

圖23描繪用於2部分的2期研究之非限制性設計圖，其中Pts係指參與者，QXT-101係指帕唑帕尼IV。

本揭示部分關於不可欲其之發現，即MAP3K2及/或MAP3K3抑制可用於治療、緩解及/或預防缺血-再灌注損傷(IRI)、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。

中風期間有大量的嗜中性球累積，且再灌注血栓溶解後進一步活化嗜中性球，嗜中性球遷移至腦實質中並釋放其豐富的蛋白酶通常被認為是神經元細胞死亡的主要原因，並有助於破壞血腦屏障(blood brain barrier，BBB)、腦性水腫和腦損傷。此外，ALI的標誌之一是肺中大量存在嗜中性球，它們在抵抗微生物感染的先天免疫中起重要作用，促成與炎症相關的組織損傷，且顯然與肺水腫形成有關，嗜中性球在ALI/ARDS中炎性組織損傷的擴大和屏障功能的破壞中起主要作用，且這些白血球似乎也能放大COVID-19中的肺損傷，其受到嗜中性球過多症是COVID-19患者ARDS發生和從ARDS到死亡發展的危險因子的發現所支持。另外，嗜中性球水平的升高已顯示出此族群的疾病嚴重程度。

嗜中性球主要通過吞噬細胞NADPH氧化酶產生活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)，其為NOX家族的成員。它由四個細胞溶質組分(p47^phox、p67^phox、p40^phox及Rac)與二個膜次單元(gp91^phox/NOX2及p22^phox)所組成。在細胞活化後，將細胞溶質組分招集至膜組分上以形成活性全酶來產生ROS。關鍵的活化事件之一為細胞溶質p47^phox次單元被包括PKC在內的蛋白激酶磷酸化，磷酸化破壞涉及內部SH3域的自抑制分子內相互作用，導致其與激活NADPH氧化酶所需的p22^phox相互作用，MAP3K2和MAP3K3是嗜中性球NADPH氧化酶的負調節劑，其藉由在絲胺酸208處磷酸化p47^phox來實現，與先前已知的p47^phox中的磷酸化位點相反，這種磷酸化可防止p47^phox與p22^phox相互作用，而導致抑制NADPH氧化酶活性和抑制ROS產生。MAP3K2/3的遺傳缺失或其藥理抑製作用會導致嗜中性球中ROS的產生增加，從嗜中性球釋放的ROS被轉化為H₂O₂，其作用於內皮細胞以增強其屏障功能、抑制炎症反應並提供有益的治療作用。

如本文中所證實的，抑制MAP3K2/3活性的帕唑帕尼增加嗜中性球中ROS的產生並改善腦IRI。使用腔內細絲或中大腦動脈閉塞縫合線模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)發現帕唑 帕尼治療在再灌注後0.5小時靜脈內給藥時顯示出較小的梗塞面積並改善神經功能缺損評分。如本文進一步證實的，帕唑帕尼增加骨髓細胞中ROS的產生並改善急性肺損傷，發現帕唑帕尼增強肺血管系統的完整性並促進肺上皮細胞的存活和增殖，從而導致肺屏障功能的增強和對ALI的抵抗力。此外，發現帕唑帕尼可降低ALI死亡率並減少水腫，因此，顯示帕唑帕尼可概括2種小鼠ALI模型中MAP3K2/3缺失的作用，即減少肺穿透性和間質性水腫並提高生存率。此外，在冠狀病毒誘發的小鼠肺損傷模型中、鼠類肝炎病毒株1(MHV-1)以帕唑帕尼治療提供顯著降低的肺穿透性，

以前沒有藥物被證實在ALI或ARDS病患的生存率上有任何顯著改善，且目前還沒有批准用於SARS CoV-2感染病患之肺損傷(ALI或ARDS)的治療藥物。此外，ALI中帕唑帕尼的MoA(作用機制)是獨特的，且與迄今已在ALI/ARDS病患中進行臨床評估的其他藥物截然不同，其亦與對於COVID-19的其他針對免疫反應不同方面的「免疫抑制」藥物不同。使用免疫抑製劑需要在抑制病理性免疫反應和保持免疫介導的病毒清除率之間取得平衡。在一方面，基於新發現的ALI/ARDS中帕唑帕尼的潛在機制，預期不會有免疫抑製作用，因此，該藥物為患有冠狀病毒感染(例如COVID-19)的病患提供更有利的替代療法。

本揭示提供一種在受試者中治療、改善及/或預防IRI、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI及/或ARDS的方法，其包含投予該受試者治療有效量之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。在某些實施方式中，帕唑帕尼或其或溶劑合物在再灌注發生後投予受試者。

定義

除另有定義外，否則所有本文使用的技術和科學術語具有與本揭示所屬技術領域中具有通常知識者所能理解的涵義相同。儘管與本文描述者類似或等同的任何方法和材料都可以用於本揭示的實施或測試中，但仍描述較佳的方法和材料。

如本文所使用，以下各術語在本章節中具有與其相關的含義。

本文所使用之冠詞「一」及「一種」係指一個或多於一個(即至少一個)本文的語法對象。舉例而言，「一元件」係指一個元件或多於一個元件。

如本文所使用，當提及例如數量、時間長度等可測量值時，「約」意指包括該特定值的±20%或±10%，更佳為±5%，甚佳為±1%，且最佳為±0.1%的變化，因此這些變化適於進行所揭示的方法。

如果疾病或病症的症狀嚴重性、罹患疾病或病症的症狀頻率降低，或兩者均降低，則「疾病或病症」得到「緩解」。

在一態樣中，與受試者相關的術語「共投予的(co-administered)」及「共同投予(co-administration)」係指對受試者投予本揭示之化合物或其鹽連同亦可治療本文所考量之疾病或病症的化合物。在某些實施方式中，共投予的化合物係分別投予，或以任何種類的組合作為單一治療方法中的一部分。共同投予的化合物在各種固體、凝膠及液體調配物下可以各種組合調配成固體及液體的混合物，及調配成溶液。

如本文所使用，術語「組成物」或「醫藥組成物」係指至少一種可用於本揭示中的化合物與醫藥上可接受的載劑的混合物，該醫藥組成物有助於將化合物投予受試者。本領域存在多種投予化合物的技術，包括但不限於靜脈內、口服、經氣霧劑、經腸胃道外、經眼、經鼻、經肺和局部投予。

如本文所使用之「疾病」是動物的健康狀態，其中該動物不能維持體內恆定，且其中若疾病未得到改善，則受試者的健康狀況將會繼續惡化。

如本文所使用於動物的「失調」是一種健康狀態，其中該動物能夠維持體內恆定，但其中動物的健康狀況不如沒有病症時的情況下有利。若不治療，失調並不必然會導致動物的健康狀況的進一步下降。

如本文所使用，術語「有效量」、「藥學有效量」及「治療有效量」係指無毒但足以提供所需生物學結果的藥劑量。該結果可能是減輕及/或緩和一種或多種體徵、徵狀或病因，或生物系統的任何其他所需改變。在任何個體的情況中，本技術領域中具有通常知識者可使用常規實驗確定適當的治療量。

本文使用的「指導性材料」包括出版物、紀錄、圖表或任何其他表達媒體，可用於傳達套組中本揭示的組成物及/或化合物的有用性。套組的指導性材料可例如固定在裝有本揭示之化合物及/或組成物的容器上，或與裝有化合物及/或組成物的容器一起運輸。或者，指導性材料可與容器分開運輸，目的是使接收者配合使用指導性材料與化合物。指導性材料的遞送可例如藉由出版物的物理遞送或傳達套組有用性的其他表達媒體來進行，或可替代地藉由電子傳輸來實現，例如藉由電腦，例如以電子郵件或自網站中下載。

術語「病患」、「受試者」或「個體」在本文可互換使用，且係指適合本文所述方法的任何動物或其細胞，無論是活體外或活體內。在一非限制性實施方式中，病患、受試者或個體為人類。

如本文所使用，術語「帕唑帕尼」係指5-((4-((2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-2-甲基苯磺醯胺、或其 鹽、互變異構體及/或溶劑合物：

。

如本文所使用，術語「醫藥上可接受」係指一種物質(例如載劑或稀釋劑)不會消除化合物的生物活性或性質，且相對是無毒的，即該物質可投予個體而不引起非所欲的生物學效果，或以有害的方式與包含其之組成物中的任何組分相互作用。

如本文所使用，術語「醫藥上可接受的載劑」意指醫藥上可接受物質、組成物或載劑，例如液體或固體填充劑、穩定劑、分散劑、懸浮劑、稀釋劑、賦形劑、增稠劑、溶劑或包封材料，涉及在病患體內攜帶或運輸本揭示中有用的化合物，或將其攜帶或運輸至病患，使其可 進行其預期的功能。通常，這種構造體從一個器官或身體的一部分被攜帶或輸送到另一器官或身體的一部分，在與調配物的其他成分相容的意義上，每種載劑必須是「可接受的」，包括在本揭示中有用的化合物，且對病患無害。可作為醫藥上可接受的載劑的物質的一些實例包括：糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉類，例如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和纖維素乙酸酯；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油類，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；界面活性劑；褐藻糖酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏(Ringer)液；乙醇；磷酸鹽緩衝液溶液；和醫藥調配物中所使用的其他無毒相容物質。如本文所使用的，術語「醫藥上可接受載劑」亦包含任何及所有的塗層、抗細菌及抗真菌劑以及吸收延遲劑等，其與本揭示中可用的化合物的活性相容，並對於受試者是生理上可接受的。補充活性化合物亦可以納入組成物中。「醫藥上可接受載劑」可進一步包括可用於本揭示之化合物的醫藥上可接受的鹽類。可以包含於用於實施本發明醫藥組成物的其它額外成分在本領域中是已知的，例如在Remington's Pharmaceutical Sciences(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)中所述，其藉由引用併入本文所揭露之一部分。

如本文所使用的術語「預防」、「避免」或「防止」意指在開始投予藥劑或化合物時在尚未出現此類徵狀的受試者中避免或延緩與疾病和症狀有關的一種或多種徵狀的發作。

如本文所使用，術語「再灌注損傷」或「缺血-再灌注損傷」或「IRI」或「再氧化損傷」是當一段時間缺血或缺氧(缺氧或低氧)後，血液供應返回組織時引起的組織損傷。在缺血期間血液中氧氣和營養物質的缺乏創造了一種循環的恢復通過誘導氧化緊迫而導致炎症及氧化損傷的狀況，而不是(或與之一起)恢復正常功能。缺血組織的再灌 注通常與微血管損傷有關，特別是由於微血管和小動脈的穿透性增加，導致跨組織擴散和液體過濾增加。再移植損傷在中風時缺氧性腦損傷的生物化學過程中扮演重要的部分。逆轉心臟驟停後的腦衰竭也涉及類似的衰竭過程。反復發作的缺血和再灌注損傷亦被認為是導致慢性傷口形成和治療失敗的因素，如褥瘡和糖尿病性足潰瘍。持續的壓力限制了血液供應並導致缺血，且在再灌注期間發生炎症。隨著這一過程的重複，它最終會損害組織，足以引起傷口。此外，再灌注損傷是移植手術(例如但不限於肝、肺、心臟和腎臟)的常見併發症。

如本文所用，術語「ROS」是指活性含氧物。ROS的非限制性實例為過氧化物、超氧化物、羥基自由基及/或單重態氧(singlet oxygen)。

術語「鹽」包括在本揭示的方法中有用的游離酸及/或游離鹼的加成鹽類。術語「醫藥上可接受的鹽」係指在藥物應用中有用的範圍內具有毒性輪廓的鹽類。然而，醫藥上不可接受的鹽類可具有諸如高結晶度的性質，其在本揭示的實施中具有實用性，例如有用於本揭示方法中的合成方法、純化或調配化合物及/或組成物。適當的醫藥上可接受的酸加成鹽類可由無機酸或有機酸製備。無機酸的實例包括氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、碳酸、硫酸(包括硫酸鹽和硫酸氫鹽)及磷酸(包括磷酸氫鹽及磷酸二氫鹽)。適當的有機酸可選自脂肪族、脂環族、芳香族、芳脂族、雜環、羧酸及磺酸類有機酸，其實例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、葡萄醣醛酸、馬來酸、丙二酸、糖精、富馬酸、丙酮酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯甲酸、鄰胺苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯乙酸、杏仁酸、撲酸(embonic)(或撲酸(pamoic))、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羥基乙磺酸、對甲苯磺酸、三氟甲磺酸、對胺基苯磺酸、環己基胺基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羥基丁酸、水楊酸、半乳糖二酸及半乳醣醛酸。本揭示化合物及/或組成物適當的醫藥上可接受的鹼加成鹽包括例如金屬鹽類，包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及過渡金屬鹽等金屬鹽，例如鈣鹽、 鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽及鋅鹽。醫藥上可接受的鹼加成鹽亦包括由鹼性胺製成的有機鹽類，例如N,N'-二芐基乙烯基-二胺基、氯普魯卡因(chloroprocine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、葡胺(meglumine)(亦稱為N-甲基葡糖胺)及普魯卡因。所有這些鹽類可由對應的化合物藉由例如使適當的酸或鹼與化合物反應來製備。

如本文所使用，化合物的「溶劑合物」係指藉由化合物與一個或多個溶劑分子締合而形成的實體。溶劑合物包括水、醚(例如四氫呋喃，甲基三級丁基醚)或醇(例如乙醇)溶劑合物、乙酸鹽等。在某些實施方式中，本文所述的化合物與例如水和乙醇之溶劑一併以溶劑合物形式存在。在其他實施方式中，本文所述的化合物以非溶劑合物形式存在。

如本文所使用，術語「特異性結合」或「特異性地結合」意指第一分子優先結合至第二分子(例如，特定的受體或酶)，但不一定僅結合該第二分子。

「治療」處理為對表現出病理跡象的受試者進行的治療，目的是減少或消除這些跡象。

如本文所使用，術語「治療」或「處理」被定義為為了治癒、癒合、緩和、減輕、改變、補救、改善、健全或影響本文所考量之症狀及/或本文所考量之症狀的一種或多種徵候的目的，施用或投予治療劑(即本揭示之化合物(單獨或合併其他治療藥劑)至病患，或施用或投予治療劑至分離自具有本文所考量的症狀及/或本文所考量之症狀的一種或多種徵候之病患的組織或細胞株(例如用於診斷或離體施用)。基於從藥物基因組學領域獲得的知識，此類治療可特定地定製或修改。

本文使用下列非限制性縮寫：MAP3K2或MEKK2，促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2；MAP3K3或MEKK3，促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3；MEK，促分裂原活化蛋白激酶激酶；MEKK，MEK激酶；RBC，紅血球；ROS，活性含氧物。

貫穿本揭示內容，本揭示的各個態樣可以範圍的形式呈 現。應理解的是，範圍形式的描述僅是為了方便及簡潔，且不應被解釋為對本揭示範圍的不靈活限制。因此，範圍的描述應被視為已具體揭示所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如，從1至6的範圍描述應被認為已特定揭示子範圍，例如從1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在該範圍內的單一及部分數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.1、5.3、5.5及6。無論範圍的寬度如何皆適用。

化合物及組成物

在某些實施方式中，帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物用於本揭示之方法。在其他實施方式中，用於本揭示之化合物及/或組成物敘述於美國專利號7,105,530；7,262,203；7,858,626；及8,114,885；其全部藉由引用其全文而併入本文。包含帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的組成物亦在本揭示的考量之內。

方法

預防、改善及/或治療再灌注損傷、缺血-再灌注損傷及/或再氧化損傷的方法

本揭示包括在所需受試者中預防、改善及/或治療再灌注損傷、缺血-再灌注損傷及/或再氧化損傷的方法。本揭示包括在罹患缺血性中風之受試者中預防、改善及/或治療缺血-再灌注損傷的方法。本揭示包括在罹患缺血性中風之受試者中預防、改善及/或治療缺血-再灌注損傷的方法。

在某些實施方式中，該方法包含投予受試者治療有效量之帕唑帕尼及/或其鹽及/或溶劑合物。在其他實施方式中，投予途徑為口服。在其他實施方式中，投予途徑為非經腸胃道。在另一實施方式中，投予途徑選自口服、非經腸胃道、經鼻、吸入、氣管內、肺內和支氣管內。

在某些實施方式中，投予受試者本揭示之組成物約一天三次、約一天兩次、約一天一次、約每隔一天、約每三天、約每四天、約每五天、約每六天及/或約每週一次。

在某些實施方式中，灌注發生後，投予本揭示之組成物至受試者。

在某些實施方式中，在受試者中治療IRI所需之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物之劑量低於在受試者中口服治療癌症(例如但不限於晚期腎細胞癌)所需之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物之劑量。在其他實施方式中，本揭示方法中所使用之劑量與口服治療癌症所需之劑量相比，以帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的質量計，每受試者體重約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：85、1：90、1：95或1：100。在另一實施方式中，藥物劑量約5-200mg/天。

在某些實施方式中，投予化合物及/或組成物不會引起明顯的與投予化合物及/或組成物治療癌症有關的不良反應、副作用及/或毒性。不良反應、副作用及/或毒性的非限制性實例包括，但不限於肝毒性(可以藉由血清轉胺酶水平和膽紅素的升高來證明及/或檢測到)、延長的QT間隔和多型性心室心律不整(torsades de pointes)、出血性事件、凝血減少或阻礙、動脈血栓形成事件、胃腸道穿孔或瘻管、高血壓、甲狀腺功能減退、蛋白尿、腹瀉、髮色變化(色素沉著)、噁心、厭食和嘔吐。

在某些實施方式中，受試者在加護病房(intensive care unit，ICU)中進行治療。在其他實施方式中，受試者在急診室(emergency room，ER)中進行治療。在其他實施方式中，受試者戴有呼吸器。

在某些實施方式中，進一步投予受試者至少一種治療、預防、改善和/或減輕一種或多種IRI症狀的藥物。

在某些實施方式中，受試者為哺乳動物。在其他實施方式中，該動物為人類。

本揭示進一步提供一種評估藥物在治療IRI中功效的方法。在某些實施方式中，該方法包含以藥劑接觸嗜中性球並測量接觸後 的嗜中性球ROS生產水平。若接觸後的嗜中性球ROS生產水平增加，則該藥劑對於治療IRI是有效的。

本揭示進一步提供一種評估藥物在治療罹患IRI之受試者中的功效的方法。在某些實施方式中，該方法包含在投予藥劑後測量受試者中嗜中性球ROS生產水平，若受試者在投予該藥劑後的嗜中性球ROS生產水平高於受試者在投予該藥劑前嗜中的性球ROS生產水平，則該藥劑對於治療受試者之IRI是有效的。

預防、改善及/或治療肺損傷的方法

在另一方面，本揭示係關於在所需受試者中預防、改善及/或治療與冠狀病毒感染有關之肺損傷或急性肺損傷的方法。在某些實施方式中，該方法包含投予受試者治療有效量之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。

在某些實施方式中，該與冠狀病毒感染有關之肺損傷已發展成急性肺損傷。在某些實施方式中，該與冠狀病毒感染有關之肺損傷未發展成ALI。在某些實施方式中，該冠狀病毒感染為COVID-19。在某些實施方式中，該急性肺損傷為ARDS。在某些實施方式中，該ALI/ARDS為脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)-誘導性ALI/ARDS。在某些實施方式中，該ALI為吸入-誘導性ALI/ARDS。在某些實施方式中，罹患吸入-誘導性ALI/ARDS的受試者是意識障礙之受試者(例如，但不限於藥物過量、癲癇發作、腦血管意外、鎮靜、麻醉程序)或體弱老年受試者。在某些實施方式中，肺損傷為缺血再灌注引起之ALI/ARDS。在某些實施方式中，該方法可治療、改善及/或預防與肺移植相關之缺血再灌注損傷所引起的ALI/ARDS。在某些實施方式中，該急性肺損傷為病毒及/或細菌感染引起的ARDS。在某些實施方式中，該ALI/ARDS與冠狀病毒感染有關。在某些實施方式中，該冠狀病毒感染為COVID-19。

在某些實施方式中，帕唑帕尼鹽為帕唑帕尼鹽酸鹽。在某些實施方式中，帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物以包含熟悉技術者已知之任 何額外成分的組成物或調配物方式投予。在某些實施方式中，含帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的組成物或調配物包含羥丙基β-環糊精(hydroxypropyl betadex，HPB)。在某些實施方式中，含帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的組成物或調配物為一種含帕唑帕尼鹽酸鹽、HPB及注射用水的靜脈內注射組成物。

帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物可以熟悉技術者已知之任何方式投予。在某些實施方式中，投予途徑為口服。在某些實施方式中，投予途徑為經鼻。在某些實施方式中，投予途徑為靜脈內。在其他實施方式中，投予途徑選自口服、經腸胃道外(例如，但不限於靜脈內)、經鼻、吸入、氣管內、肺內和支氣管內所組成之群組。

在某些實施方式中，本揭示之化合物及/或組成物在與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS發生前投予受試者。在某些其他實施方式中，本揭示之化合物及/或組成物在與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS發生後投予受試者。在某些實施方式中，投予受試者本揭示之組成物約一天三次、約一天兩次、約一天一次、約每隔一天、約每三天、約每四天、約每五天、約每六天及/或約每週一次。在某些其他實施方式中，在發生可能導致與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS發生的事件之前，例如鎮靜，麻醉程序或肺移植，投予本揭示之化合物及/或組成物一短暫期間。在某些實施方式中，該短暫期間包含介於可能導致與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS的發生前約一個月至約一天之間。在某些實施方式中，在可能導致與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS的發生之日投予本揭示之化合物及/或組成物至受試者，其中化合物及/或組成物可以在當天的任何時間給藥，直至可能導致與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS發生之前。

在某些實施方式中，在受試者中治療與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS所需之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物之劑量低於在受試者中口服治療癌症(例如但不限於晚期腎細胞癌)所需之帕唑 帕尼或其鹽或溶劑合物之劑量。在其他實施方式中，本揭示方法中所使用之劑量與口服治療癌症所需之劑量相比，以帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的質量計，每受試者體重約1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：85、1：90、1：95或1：100。在另一實施方式中，藥物劑量約5-500mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-450mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-400mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-350mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-300mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天、40mg/天、45mg/天、50mg/天、55mg/天、60mg/天、65mg/天、70mg/天、75mg/天、80mg/天、85mg/天、90mg/天、95mg/天、100mg/天、105mg/天、110mg/天、115mg/天、120mg/天、125mg/天、130mg/天、135mg/天、140mg/天、145mg/天、155mg/天、160mg/天、165mg/天、170mg/天、175mg/天、180mg/天、185mg/天、190mg/天、195mg/天、200mg/天、205mg/天、210mg/天、215mg/天、220mg/天、225mg/天、230mg/天、235mg/天、240mg/天、245mg/天、250mg/天、255mg/天、260mg/天、265mg/天、270mg/天、275mg/天、280mg/天、285mg/天、290mg/天、295mg/天或300mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量等於或大於約5mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天、40mg/天、45mg/天、50mg/天、55mg/天、60mg/天、65mg/天、70mg/天、75mg/天、80mg/天、85mg/天、90mg/天、95mg/天、100mg/天、105mg/天、110mg/天、115mg/天、120mg/天、125mg/天、130mg/天、135mg/天、140mg/天、145mg/天、155mg/天、160mg/天、165mg/天、170mg/天、175mg/天、180mg/天、185mg/天、190mg/天、195mg/天、200mg/天、205mg/天、210mg/天、215mg/天、220mg/天、225mg/天、230mg/天、 235mg/天、240mg/天、245mg/天、250mg/天、255mg/天、260mg/天、265mg/天、270mg/天、275mg/天、280mg/天、285mg/天、290mg/天、295mg/天或300mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量等於或低於約5mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天、40mg/天、45mg/天、50mg/天、55mg/天、60mg/天、65mg/天、70mg/天、75mg/天、80mg/天、85mg/天、90mg/天、95mg/天、100mg/天、105mg/天、110mg/天、115mg/天、120mg/天、125mg/天、130mg/天、135mg/天、140mg/天、145mg/天、155mg/天、160mg/天、165mg/天、170mg/天、175mg/天、180mg/天、185mg/天、190mg/天、195mg/天、200mg/天、205mg/天、210mg/天、215mg/天、220mg/天、225mg/天、230mg/天、235mg/天、240mg/天、245mg/天、250mg/天、255mg/天、260mg/天、265mg/天、270mg/天、275mg/天、280mg/天、285mg/天、290mg/天、295mg/天或300mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-250mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-200mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-150mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約5-100mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約200mg/天。在某些實施方式中，藥物之經鼻或經口劑量約200mg/天。在某些實施方式中，藥物劑量約80mg/天。在某些實施方式中，藥物之靜脈內劑量約80mg/天。在某些實施方式中，藥物之靜脈內劑量約80mg/天的帕唑帕尼鹽酸鹽組成物/調配物，進一步含HPB和注射用水。

在某些實施方式中，投予化合物及/或組成物不會引起明顯的與投予化合物及/或組成物治療癌症有關的不良反應、副作用及/或毒性。不良反應、副作用及/或毒性的非限制性實例包括，但不限於肝毒性(可以藉由血清轉胺酶水平和膽紅素的升高來證明及/或檢測到)、延長的QT間隔和多型性心室心律不整(torsades de pointes)、出血性事件、凝血減少或阻礙、動脈血栓形成事件、胃腸道穿孔或瘻管、高血壓、甲 狀腺功能減退、蛋白尿、腹瀉、髮色變化(色素沉著)、噁心、厭食及/或嘔吐。

在某些實施方式中，受試者在加護病房(intensive care unit，ICU)中進行治療。在其他實施方式中，受試者在急診室(emergency room，ER)中進行治療。在其他實施方式中，受試者戴有呼吸器。在某些實施方式中，受試者正在接受包括鎮靜或麻醉治療。在某些實施方式中，受試者正在進行肺移植。在某些實施方式中，受試者正在進行冠狀病毒感染治療。在某些實施方式中，受試者正在進行COVID-19治療。

在某些實施方式中，進一步投予受試者至少一種治療、預防、改善和/或減輕一種或多種ALI/IRI徵狀的額外藥劑。例示性的藥劑包括，但不限於醣皮質素、表面活性劑、N-乙醯半胱胺酸、吸入性一氧化氮、脂質體PGE 1、磷酸二酯酶抑製劑(例如利索茶鹼(lisofylline)，配妥西菲林(pentoxifylline))，沙丁胺醇IV(salbutamol IV)、前半胱氨酸(procysteine)、活化蛋白C、吸入性沙丁胺醇、抗真菌劑、利尿劑或其等之組合。在某些實施方式中，提供受試者一種治療、預防、改善和/或減輕一種或多種ALI/IRI徵狀的處置。例示性的處置包括，但不限於呼吸氣支持、俯臥位、體外膜氧合(extracorporeal membrane oxygenation)或其等之組合。

在某些實施方式中，進一步投予受試者至少一種用於冠狀病毒感染之額外藥劑處置及/或療法。處置及/或療法可包括非處方藥，例如乙醯胺酚(acetaminophen)，以緩解症狀；機械通氣；抗病毒藥；以及血漿療法。例示性抗病毒藥物包括，但不限於巴卡韋(abacavir)、阿昔洛韋(acyclovir)、阿德福韋(adefovir)、金剛烷胺(amantadine)、安普利近(ampligen)、安普那韋(amprenavir)、阿比朵爾(arbidol)(umifenovir)、阿紮那韋(atazanavir)、阿曲派拉(atripla)、巴洛沙韋瑪波西酯(baloxavir marboxil)、必妥維(biktarvy)、波西普韋(boceprevir)、佈列維特(bulevirtide)、西多福韋(cidofovir)、考比司 他(cobicistat)、卡貝滋(combivir)、達卡他韋(daclatasvir)、地瑞納韋(darunavir)、地拉夫定(delavirdine)、達可揮(descovy)、地達諾新(didanosine)、二十二醇(docosanol)、度魯特韋(dolutegravir)、多拉維林(doravirine)、依度尿苷(edoxudine)、依法韋侖(efavirenz)、埃替格韋(elvitegravir)、恩曲他濱(emtricitabine)、恩夫韋地(enfuvirtide)、恩替卡韋(entecavir)、衣曲韋林(etravirine)、泛昔洛韋(famcyclovir)、福米韋生(fomivirsen)、福沙那韋(fosamprenavir)、膦甲酸鈉(foscarnet)、更昔洛韋(ganciclovir)、伊巴他濱(ibacitabine)、衣必珠單抗(ibalizumab)、碘苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、伊木那韋(imunovir)、茚地那韋(indinavir)、拉米呋定(lamivudine)、萊莫維韋(letermovir)、洛匹那韋(lopinavir)、洛韋胺(loviride)、馬拉韋羅(maraviroc)、甲吲噻腙(methisazone)、嗎啉脈(moroxydine)、奈非那韋(nelfinavir)、奈韋拉平(nevirapine)、雷沙韋(nexavir)、硝唑尼特(nitazoxanide)、利托那韋(norvir)、奧司他韋(oseltamivir)、噴昔洛韋(penciclovir)、帕拉米韋(peramivir)、普可那利(pleconaril)、普達非倫毒素(podophyllotoxin)、拉替拉韋(raltegravir)、瑞德西韋(remdesivir)、利巴韋林(ribavirin)、利匹韋林(rilpivirine)、金剛乙胺(rimantadine)、利托那韋(ritonavir)、沙奎那韋(saquinavir)、司美匹韋(simeprevir)、索非布韋(sofosbuvir)、司他夫定(stavudine)、他巴韋林(taribavirin)、特拉匹韋(telaprevir)、替比夫定(telbivudine)、替諾福韋胺基磷酸酯(tenofovir alafenamide)、替諾福韋二吡呋酯(tenofovir disoproxil)、替諾福韋、替拉那韋(tipranavir)、三氟胸苷(trifluridine)、三澤維爾(trizivir)、醋胺金剛烷(tromantadine)、特魯瓦達(truvada)、阿比朵爾(umifenovir)、伐昔洛韋(valacyclovir)、纈更昔洛韋(valgancyclovir)、維克韋羅(vicriviroc)、阿糖腺苷(vidarabine)、扎西他濱(zalcitabine)、紮那米韋(zanamivir)、齊多夫定(zidovudine)及其等之組合。在某些實施方式中，該處置及/或療法包含有助於治療，改善和/或預防冠狀病毒感染(例如SARS-CoV-2)的醫 藥上活性化合物。被認為有助於治療、改善及/或預防冠狀病毒感染的例示性化合物包括，但不限於：氯喹(chloroquine)、阿奇黴素(azithromycin)、托西雷德韋(tociliremdesivir)、地塞米松(dexamethasone)、羥基氯喹(hydroxychloroquine)、人源化單抗(zumab)、阿卡替尼(acalabrutinib)、托法替布(tofacitinib)、魯索替尼(ruxolitinib)、巴利西尼(baricitnib)、阿那金拉(anakinra)、卡那奴單抗(canakinumab)、阿米司特(apremilast)、馬里尼單抗(marillimumab)、薩林魯單抗(sarilumab)、洛匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)、奧司他韋(oseltamivir)、法維拉韋(favipiravir)、阿比朵爾(umifenovir)、加利地韋galidesivir)、秋水仙素(colchicine)、艾弗麥克素(ivermectin)、維生素D及其等之組合。在某些實施方式中，被確診為冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)感染之受試者或被診斷為冠狀病毒(例如COVID-19)引起之感染或疾病的受試者被隔離或被要求自我隔離。

在某些實施方式中，受試者為哺乳動物。在其他實施方式中，該動物為人類。

本揭示進一步提供一種評估藥物在治療與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS中功效的方法。在某些實施方式中，該方法包含以藥劑接觸嗜中性球並測量接觸後的嗜中性球ROS生產水平。若接觸後的嗜中性球ROS生產水平增加，則該藥劑對於治療與冠狀病毒感染有關之肺損傷及/或ALI/ARDS是有效的。

本揭示進一步提供一種評估藥物在治療罹患冠狀病毒相關之肺損傷及/或ALI/ARDS之受試者中的功效的方法。在某些實施方式中，該方法包含在投予藥物後測量受試者之嗜中性球ROS生產水平。若受試者在投予該藥物後的嗜中性球ROS生產水平高於受試者在投予該藥物前嗜中的性球ROS生產水平，則該藥物對於治療受試者之冠狀病毒相關性肺損傷及/或ALI/ARDS是有效的。在其他實施方式中，該方法包含在投予藥物後測量受試者肺中H₂O₂的水平。若在投予藥物後 受試者肺中H₂O₂的水平高於在投予藥物前受試者肺中H₂O₂的水平，則該藥物對於治療受試者之冠狀病毒相關性肺損傷及/或ALI/ARDS是有效的。

儘管不希望受到理論的限制，但據信投予受試者治療有效量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物會造成MEK激酶MAP3K2和MAP3K3的抑制，其中MAP3K2和MAP3K3的抑制導致嗜中性球的ROS增加。假設ROS在肺部被轉化為H₂O₂，其刺激內皮細胞中AKT磷酸化，導致更強的血管屏障完整性，防止微血管滲漏並清除肺中的肺泡液。還據信低濃度的H₂O₂增強肺內皮細胞的跨內皮阻性，並刺激這些細胞中的AKT磷酸化。因此，假設投予受試者治療有效量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物造成增強的肺管脈系統的完整性，並促進肺上皮細胞的存活和增殖，從而導致肺屏障功能增強以及對冠狀病毒感染及/或ALI/ARDS的抵抗力。在某些實施方式中，該冠狀病毒感染為COVID-19。

套組

本揭示包括一種套組，其包含帕唑帕尼及/或其鹽及/或溶劑合物、施用器及使用的指導性材料。該包括在套組中的指導性材料包含用於預防、改善及/或治療IRI、冠狀病毒相關性肺損傷、ALI/ARDS或本揭示中所考量之任何其他疾病或病症的說明書。指導性材料指導性材料敘述應投予受試者之帕唑帕尼及/或其鹽及/或溶劑合物的用量及使用頻率。在某些實施方式中，該套組進一步包含至少一種治療、改善、預防及/或減輕一種或多種IRI、冠狀病毒感染及/或ALI/IRI徵狀的額外藥劑。在某些實施方式中，該套組進一步包含用於提供受試者據信可治療、改善、預防及/或減少ALI/ARDS及/或冠狀病毒感染的一種或多種徵狀的處置的說明書。例示性治療在本文他處描述。

組合療法

在某些實施方式中，本揭示之化合物合併至少一種額外化合物用於本揭示之方法及/或用於治療、改善及/或預防IRI、冠狀病毒 感染或ALI/ARDS的療法。此額外化合物可包含本文所定義的化合物或化合物，例如，可商購之化合物，已知用於治療、改善、預防及/或減輕一種或多種IRI、冠狀病毒感染及/或ALI/ARDS的症狀。

本揭示所涵蓋的其他療法的非限制性實例包括消炎類固醇或非類固醇藥物。

例如，可以使用適當方法來計算協同效應，舉例而言，例如，Sigmoid-E_max方程式(Holford & Scheiner,19981,Clin.Pharmacokinet.6：429-453)、Loewe相加理論方程式(Loewe & Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326)及中位效應方程式(median effect equation)(Chou & Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22：27-55)。上述提及之每個方程式都可應用於實驗數據，以生成對應的圖表來幫助評估藥物組合的效果。與上述方程式相關的對應曲線分別是濃度-效果曲線、等效線圖(isobologram)曲線及組合指數曲線。

給藥/劑量/調配物

治療方案可影響有效量的組成。治療調配物可在本揭示所考量之疾病或失調發作之前或之後投予受試者。此外，可以每日或依序投予若干分開的劑量以及交錯的劑量，或該劑量可被連續輸注，或可為快速推注(bolus injection)。此外，可視治療或預防情況的緊急程度，按比例增加或減少治療調配物的劑量。

用於本本揭示之方法的醫藥組成物可被製備、包裝或出售成以適於眼科、口服、經直腸、經陰道、經腸胃道外、局部、經肺、經鼻、經口腔或另一途徑給藥的調配物。其他考量的調配物包括預計納米顆粒、脂質體製劑、含有活性成分的重新包封紅血球及基於免疫學的調配物。

可使用已知的程序、劑量及時間期間投予本揭示之組成物於病患，較佳為哺乳動物，更佳為人類，以有效治療本揭示所考量之疾病或病症。達到治療效果所必需的治療化合物有效量可根據許多因素而 變化，例如被治療之病患的疾病或病症的狀態、年齡、性別及體重；以及治療化合物治療本揭示所考量的疾病或病症的能力。可調整劑量方案以提供優化的治療反應。例如，可每日投予若干分開的劑量，或劑量可該視如治療情況的緊急程度而按比例減少。本發明治療化合物的有效劑量範圍的非限制性實例為約為每日0.01至5,000mg/kg體重。本領域中具有通常知識者將能研究相關因素，並在不進行過度實驗的情況下確定治療化合物的有效量。

可改變本揭示之醫藥組成物中活性成分的實際劑量水平，以便獲得對於特定病患、組成物及投予模式可有效達到所需治療反應而對患者無毒性的活性成分的量。

本揭示之化合物的治療有效量或劑量取決於病患的年齡、性別和體重，病患的當前醫療狀況及本揭示中所考量之疾病或病症的進展。

本技術領域中具有通常知識的醫師，例如，內科醫師或獸醫師可容易地確定及囑咐所需醫藥組成物的有效量。例如，內科醫師或獸醫師可從低於欲達到治療效果所需之劑量水平的用於醫藥物組成物的本揭示之化合物劑量開始，並逐漸增加劑量，直到達到所需的效果。

本揭示之化合物的適當劑量可在每日約0.01mg至約5,000mg的範圍內，例如每日約0.1mg至約1,000mg，例如約1mg至約500mg，例如約5mg至約250mg。劑量可單劑量或多劑量投予，例如每日1至4次或更多次。當使用多劑量時，每種劑量的量可相同或不同，例如，每天1mg的劑量可作為兩個0.5mg劑量以約12小時之間隔投予。

本揭示之化合物可在下列範圍內投予：約1μg至約10,000mg、約20μg至約9,500mg、約40μg至約9,000mg、約75μg至約8,500mg、約150μg至約7,500mg、約200μg至約7,000mg、約3050μg至約6,000mg、約500μg至約5,000mg、約750μg至約4,000mg、約1mg至約3,000mg、約10mg至約2,500mg、 約20mg至約2,000mg、約25mg至約1,500mg、約30mg至約1,000mg、約40mg至約900mg、約50mg至約800mg、約60mg至約750mg、約70mg至約600mg、約80mg至約500mg，及其等之間的所有或部分或全部增加量。

在某些實施方式中，本揭示之化合物的劑量為約1mg至約2,500mg。在某些實施方式中，用於本文所述之組成物的本揭示之化合物的劑量小於約10,000mg、或小於約8,000mg、或小於約6,000mg、或小於約5,000mg、或小於約3,000mg、或小於約2,000mg、或小於約1,000mg、或小於約500mg、或小於約200mg、或小於約50mg。相似地，在某些實施方式中，本文所述之第二化合物的劑量小於約1,000mg、或小於約800mg、或小於約600mg、或小於約500mg、或小於約400mg、或小於約300mg、或小於約200mg、或小於約100mg、或小於約50mg、或小於約40mg、或小於約30mg、或小於約25mg、或小於約20mg、或小於約15mg、或小於約10mg、或小於約5mg、或小於約2mg、或小於約1mg、或小於約0.5mg及其任何及所有全部或部分增加量。

在某些實施方式中，以每天投予病患1至5次或更多次之劑量的本揭示之組成物。在某些實施方式中，本揭示之組成物以一劑量範圍投予病患，包括，但不限於每天一次、每兩天、每三天至每週一次及每兩週一次。對於本領域技術人員而言顯而易見的是，本揭示組成物的各種組合的給藥頻率因個體而異，取決於許多因素，包括但不限於年齡、疾病或待治療的疾病、性別、整體健康狀況和其他因素。因此，本揭示不應被解釋為限於任何特定的劑量方案，且要投予任何病患的精確劑量和組成物是由主治醫師在考慮病患所有其他因素的情況下確定的。

可理解的是，可以每日投予化合物的量來給藥，在非限制性實例中可為每天、每隔一日、每2日、每3日、每4日或每5日給藥。例如，每隔一日投予一次，可在星期一開始施用一日5毫克的劑量，在星期三再施用一日5毫克的劑量，然後再於星期五繼續施用一日5毫 克的劑量，依此類推。

在病患狀態確實有所改善的情形中，根據醫生的判斷，本揭示的抑製劑可選擇地持續給予；或者，被投予的藥物之劑量暫時減少或暫時停止一段時間(即「停藥期」)。停藥期的長度可選擇地在2天到1年之間變化，僅以舉例之方式包括2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日或365日。停藥期期間的劑量減少包括10%-100%，僅以舉例之方式包括10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

一旦病患病情得到改善，必要時投予維持劑量。隨後，劑量或給藥頻率或兩者皆以疾病或病症的函數降低至保持改善疾病的水平。在某些實施方式中，病患在任何徵候及/或感染復發時需要長期間歇性治療。

用於本揭示之方法的化合物可調配成單位劑型。術語「單位劑型」係指物理上離散的單位，適合作為接受治療之病患的統一劑量，每個單位均包含經計算可產生所欲之治療效果的預定量活性物質，可選擇地與適當醫藥載劑結合使用。單位劑型可用於單次日劑量或多次日劑量(例如每日約1至4次或更多次)中的一劑。當使用多次日劑量時，單位劑型對於每一劑量可為相同或不同。

此類治療方案的毒性和治療功效可選擇地在細胞培養物或實驗動物中確定，包括，但不限於測定LD₅₀(對50%的群體致死之劑量)及ED₅₀(對50%的群體治療有效之劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其表示為LD₅₀和ED₅₀之間的比率。從細胞培養測定及動物研究所獲得的數據可選擇地用於調配用於人類的劑量範圍。此類化合物的劑量較佳位於循環濃度範圍內，包括具有最小毒性的ED₅₀。劑量可選擇地在此範圍內變化，這取決於所用的劑型和所用的給藥途徑。

在某些實施方式中，使用一或多種醫藥上可接受的賦形劑或載劑來調配本揭示之組成物。在某些實施方式中，本揭示之醫藥組成物包含治療有效量的本揭示化合物及醫藥上可接受的載劑。

載劑可為溶劑或是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇等)、其適合的混合物及植物油等之分散介質。可例如藉由使用如卵磷脂的包覆、藉由在分散的情況下維持所需的粒徑及藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性。可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉等來防止微生物的作用。在許多情況下，在組成物中較佳可包括等滲劑，例如糖類、氯化鈉或多元醇(如甘露醇及山梨醇)。

在某些實施方式中，本揭示涉及經包裝的醫藥組成物，其包含容納治療有效量的本揭示化合物的容器，該化合物單獨或與第二藥劑組合；及使用該化合物治療、預防、改善及/或減輕本揭示所考量之疾病或病症的一或多種徵狀的說明書。

調配物可與習知賦形劑(即，適用於本領域已知的任何適當給藥模式的醫藥上可接受之有機或無機載劑物質)混合使用。醫藥製劑可經滅菌，且如果需要可與輔助劑混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓緩衝液的鹽類、著色劑、調味劑及/或芳香物質等。如果需要，其等亦可與其它活性劑組合。

任何本揭示之組成物的投予途徑包括口服、經鼻、經直腸、非經腸胃道、舌下、經皮或經黏膜(例如，舌下、舌側、(經)口頰、(經)尿道、陰道(例如，經陰道及經陰道周圍)、鼻腔(內)及(經)直腸)、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、皮下、肌肉內、皮內、腹膜內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入及局部投予。

適合的組成物及劑型包括例如錠劑、膠囊、膠囊型錠劑、丸劑、軟膠囊(gel caps)、口含劑、分散劑、懸浮劑、溶液、糖漿、顆粒、珠劑、經皮貼劑、凝膠、粉末、粒劑、乳漿劑、菱形錠、乳霜、膏劑、硬膏劑(plasters)、洗劑、盤劑(discs)、栓劑、用於鼻或口服投予之 液體噴霧劑、用於吸入的乾粉或霧化調配物、用於膀胱內投予的組成物及調配物等。可用於本揭示之調配物及組成物不限於本文所述的特定調配物及組成物。

如本文所使用，醫藥組成物的「非腸胃道投予」包括任何投予途徑，其特徵在於對受試者組織的物理破壞及透過組織中的裂口投予醫藥組成物。因此，非腸胃道投予包括，但不限於經由注射組成物、透過手術切口施用組成物、透過穿透組織的非手術傷口施用組成物來投予醫藥組成物等。具體而言，非腸胃道投予包括，但不限於眼內、玻璃體內、皮下、腹膜內、肌內、胸骨內注射、腫瘤內及腎臟透析輸注技術。

適於非腸胃道投予的醫藥組成物的調配物包含與醫藥上可接受的載劑(例如無菌水或無菌等滲鹽水)組合的活性成分，此類調配物可以適於推注投予或連續投予的形式製備、包裝或銷售。可注射調配物可以單位劑型製備、包裝或銷售，例如以含有防腐劑的安瓿或多-劑量容器形式。用於非腸胃道投予的調配物包括，但不限於懸浮液、溶液、在油性或水性媒劑中的乳劑、膏劑及可植入性緩釋或生物可降解調配物。此類調配物可進一步包含一或多種額外成分，包括，但不限於懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於非腸胃道投予之調配物的某些實施方式中，活性成分以乾燥形式(即粉末或顆粒)提供，並在非腸胃道投予之前以適當媒劑(例如無菌無熱原水)回溶組成物。

額外給藥型式

本揭示之額外劑型包括美國專利號6,340,475；6,488,962；6,451,808；5,972,389；5,582,837；及5,007,790中所述之劑型。本揭示之額外劑型亦包括美國專利申請號20030147952；20030104062；20030104053；20030044466；20030039688；及20020051820中所述之劑型。本揭示之額外劑型亦包括PCT申請號WO 03/35041；WO 03/35040；WO 03/35029；WO 03/35177；WO 03/35039；WO 02/96404；WO 02/32416；WO 01/97783；WO 01/56544；WO 01/32217；WO 98/55107；WO 98/11879；WO 97/47285；WO 93/18755；及WO 90/11757中所述之劑型。

控制釋放調配物及藥物遞送系統

在某些實施方式中，本揭示的調配物可為短期、快速補充及受控制的，例如緩釋、延遲釋放及脈衝釋放(pulsatile release)調配物，但不以此為限。

術語持續釋放以其習知含義使用，係指在延長的時間區段內提供藥物的逐漸釋放的藥物調配物，且雖非必要，但可在延長的時間區段期間造成藥物在血中濃度基本上恆定。這段期可長達一個月或更長，且其應為一種比以推注形式投予相同量之藥劑更長的釋放。

為了持續釋放，該化合物可與提供持續釋放性質於化合物的適當聚合物或疏水性材料配製。因此，用於本揭示之方法的化合物可以微粒的形式投予，例如藉由注射或藉由植入晶片(wafers)或盤劑(discs)的形式投予。

在本揭示之某些實施方式中，本揭示之化合物單獨或與另一種藥劑組合，使用緩釋調配物投予至病患。

術語延遲釋放在本文中以其習知含義使用，係指在藥物投予後延遲一段時間後才提供藥物的初始釋放的藥物調配物，且雖非必要，但包括約10分鐘至最多約12個小時的延遲。

術語脈衝釋放在本文中以其習知含義使用，係指一種提供藥物釋放以便在藥物投予後產生藥物的脈衝式血漿輪廓的藥物調配物。

術語立即釋放以其習知含義使用，係指在藥物投予後立即提供藥物釋放的藥物調配物。

如本文所使用，短期係指在藥物施用後直至包括約8小時、約7小時、約6小時、約5小時、約4小時、約3小時、約2小時、約1小時、約40分鐘、約20分鐘或約10分鐘，以及其任何、全部或部分時間增加量的任何期間。

如本文所使用，快速補充係指在藥物施用後直至包括約8小時、約7小時、約6小時、約5小時、約4小時、約3小時、約2小 時、約1小時、約40分鐘、約20分鐘或約10分鐘，以及其任何、全部或部分時間增加量的任何期間。

本領域熟悉技術者將認識到或能使用不超過常規實驗來判明本文所述的具體程序、實施方式、申請專利範圍和實施例的許多等效物，這些等效物被認為在本揭示之範圍內，且由後附之申請專利範圍所涵蓋。例如，應當理解，以本領域公認的替代方案並且僅使用常規實驗修改反應及/或治療條件皆在本案的範圍內。

應理解的是，無論在本文何處提供之數值和範圍，這些數值及範圍所涵蓋的所有數值及範圍皆包括在本揭示的範圍內。此外，落入這些範圍內的所有數值以及數值範圍的上限或下限亦被本申請案所預期。

下列實施例進一步說明本揭示之態樣。然而，其並非是對於本文所述之本揭示的教示或揭示內容的限制。

實施例

本揭示現以參照下列實施例敘述，這些實施例之提供僅用於說明之目的，且本揭示不受這些實施例之限制，而是涵蓋因本文所提供之教示而顯見的所有變化。

實施例1：帕唑帕尼改善大腦缺血-再灌注損傷

方法：

血管腔內中大腦動脈(MCA)閉塞：

藉由以尼龍絲進行血管腔內中大腦動脈(MCA)閉塞產生暫時性局部缺血。此為中風研究中使用最廣泛的方法之一。此模型在一定程度上模擬自發的或治療性的干預(例如，tPA給藥)以溶解人類血栓栓塞後的血流恢復。

以含2.5%異氟烷的70%N₂O/30% O₂混合物麻醉小鼠。中線頸切開後，小心地分離左頸總動脈、外頸動脈和內頸動脈。將左頸總動脈及頸外動脈的近端結紮。通過總頸動脈的小動脈切開術將矽橡膠塗覆的尼龍單絲(0.23mm，Yushun Bio)導入至內頸動脈遠端，並向 MCA的起點推進8~9mm，直到將MCA阻塞。插入後1小時，在麻醉下從頸動脈撤出縫線，以便能再灌注。然後，縫合傷口。將小鼠在24小時的再灌注期間保持在25℃的空調室內。

神經功能缺損評分之評估：

已進行中風手術的小鼠的神經缺損的程度為0-4。閉塞1小時和再灌注24小時後，對動物的神經損傷評分如下：0=正常自發移動；1=前肢伸展失敗；2=患側盤旋；3=患側部分麻痺；4=無自發運動活動。

確定梗塞大小：

再灌注24小時後，將小鼠以CO₂安樂死。立即將大腦切除並切分成五個冠狀切片。將腦切片在2% 2,3,5-三苯基四唑氯單水合物(TTC)中於37℃溫育15分鐘，然後在4%的多聚甲醛中溫育隔夜。對腦切片拍照，並藉由成像分析系統(NIH Image)測量局部缺血性損傷的面積。以下列公式計算腦梗塞的百分比：%=梗塞體積/腦總體積。

藥物製備及投予：

將帕唑帕尼溶於HP-β-CD(2-羥丙基)-β-環糊精)至8.6mg/ml作為儲備溶液，將其於食鹽水中稀釋至1.2mg/ml，經眼眶後IV注射投予50μl/小鼠，

測試帕唑帕尼對腦缺血-再灌注損傷的功效。為了測試治療衝擊，將帕唑帕尼以靜脈注射給予，選擇兩個時點，(1)在缺血性中風的急性期及(2)再灌注後0.5小時。當再灌注後0.5給予時，帕唑帕尼治療顯示較小的梗塞大小(圖1)。若在局部缺血性階段給予該藥物，則大腦的梗塞大小或神經學評分並沒有改善(圖2)。

實施例2：帕唑帕尼藉由抑制MAP3K2及3減輕急性肺損傷

材料及方法：

材料

以下試劑購自Sigma：N-甲醯基-L-甲硫胺醯基-L-白胺醯基-L-苯丙胺酸(fMLP)、佛波醇12-肉豆蔻醯-13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、脂多醣(LPS)、脫脂酸卵磷脂(Lysolecithin)、三聚甲醛(PFA)、FITC白蛋白、辣根過氧化物酶(HRP)、異發光胺。Percoll購自GE Healthcare(Uppsala,Sweden)，牛血清白蛋白(BSA)購自American Bio(Natick,MA)，GMCSF購自Peprotech，Lipofectamine套組及細胞微量染料購自Thermo Fisher。以下材料購自GIBCO：Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM),Hanks Balanced Salt Solution(HBSS),Phosphate Buffered Saline(PBS)。

研究中使用的商業抗體為：GST抗體(2624，Cell Signaling)、His抗體(2366，Cell Signaling)、HA抗體(MMS-101R，Covance)、Myc抗體(MMS-150R，Covance)、抗-磷-AKT抗體(4060及2965，Cell Signaling)、抗-AKT抗體(9272，Cell Signaling)、抗-MEKK2(19607，Cell Signaling)、抗-MEKK3抗體(5727，Cell Signaling)、抗-p47^phox抗體(17875，Santa Cruz)、抗-CD31抗體(102502，BioLegend)、抗-α-平滑肌肌動蛋白抗體(ab8211，Abcam)、抗-ABCA3抗體(ab24751，Abcam)、抗-平足蛋白(podoplanin)抗體(AF3244-SP，R&D)、抗-4羥基壬烯醛抗體(ab46545，Abcam)、抗-分裂半胱天冬酶3抗體(9661，Cell Signaling)、抗-Ki67抗體(9129，Cell Signaling)、抗Rac1抗體(ab33186，Abcam)、抗-活性Rac1抗體(26903，NewEast)及抗-β-肌動蛋白(4967，Cell Signaling)。兔多株抗-S208 p47^phox在Abiocode由合成肽製成(KRGWVPApSYLEPLD；SEQ ID NO：1)。

蛋白質A/g PLUS-瓊脂糖珠購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。用於細胞因子測量的ELISA套組購自eBioscience(San Diego，CA)。用於MAP3K3及p67^phox的cDNA獲自ADDGENE，且用於p47^phox及gp91^phox的cDNAs獲自Open Biosystems。

HEK293及Cos-7細胞購自ATCC。細胞已常規檢測黴 漿菌且均為陰性。

小鼠

Map3k2 ^-/-小鼠先前序述於Guo,et al.,2002,Mol Cell Biol 22：5761-5768，而Map3k3 ^f1/f1小鼠序述於Wang,et al.,2009,J Immunol 182：3597-3608。Map3k2 ^-/-及Map3k3 ^f1/f1二者回交(backcross)至C57Bl/6N背景中。p47^phox-缺失小鼠(B6N.129S2-Ncf1^tm1Sh1/J)與WT對照小鼠一起獲自JAX，用於所有涉及p47^phox-缺失小鼠的實驗。藉由異種交配Map3k3 ^f1/f1 及/或Map3k2 ^f1/f1 小鼠與Lyz-Cre小鼠，生成骨髓特異性MAP3K3 KO、MAP3K2 KO及DKO小鼠，這些小鼠皆在C57Bl/6N背景中。p47^phox S208A敲入小鼠品系經Cyagen Biosciences在C57Bl/6N背景下由CRISPR/Cas生成。

骨髓移植

將WT和突變體小鼠同窩仔畜的骨髓移植到購自Envigo(East Millstone，NJ)的野生型受體C57Bl/6N小鼠中，該小鼠接受1000cGy X射線照射。八週後，將移植的小鼠用於實驗。

嗜中性球製備及轉染

自長骨分離小鼠骨髓嗜中性球。在以ACK緩衝液(155mM NH₄Cl、10mM KHCO₃及127μM EDTA)裂解紅血球細胞(RBC)後，在由81%、62%和45% Percoll組成的不連續Percoll梯度上分離骨髓細胞。在81%和62%Percoll之間的中相間收集嗜中性球，在HBSS中洗滌，並用於測定。

為了嗜中性球轉染，將嗜中性球(3x10⁶個細胞/100μl)與1.6μg DNA混合於提供的核酸轉染溶液中，並使用Nucleofector裝置(Lonza，Switzerland)進行電穿孔。然後在測定前，將細胞在37℃的培養基(RPMI 1640、10%FBS(V/V)、GMCSF 25ng/ml)中，在具有5%CO₂的潮濕空氣中於37℃培養8-24小時。

鄧恩(Dunn)腔室趨化測定

如前所述，使用鄧恩腔室進行趨化測定，藉由以不同的示 踪染料標記細胞，同時分析野生型和突變體嗜中性球，在研究中交替使用標記的基團，以完全消除染料所產生之任何影響的可能性。以間隔30秒歷時30分鐘獲取延時影像系列，並使用MetaMorph影像分析軟體分析，如前所述。獲得兩個參數來量化嗜中性球的趨化性：平均方向誤差和運動性，平均方向誤差測量細胞遷移方向與梯度方向之間的角度，並反映細胞遵循梯度的程度，運動性是細胞遷移的速度。

整聯蛋白表現測定

將骨髓來源的嗜中性球再懸浮於流式細胞測量術緩衝液(含1%BSA的PBS)中，以fMLP(1μM)刺激指定的持續時間，以4% PFA固定，然後以FITC標記的抗LFA-1或抗Mac-1染色，樣品以BD LSR II流式細胞儀分析。

ICAM-1結合測定

如前所述進行測定，藉由在PBS中於4℃溫育Cy5-共軛AffiniPure山羊抗人類Fcγ片段特異性IgG F(ab')2片段(Jackson Immunobiology)與ICAM-1-Fc(100μg/ml,R&D)30分鐘，生成ICAM-1-Fc-F(ab')2複合物。將嗜中性球以0.5×10⁶細胞/ml再懸浮於含0.5% BSA、0.5mM Mg²⁺及0.9mM Ca²⁺之PBS，在fMLP(1μM)存在或不存在下，與ICAM-1-Fc-F(ab')2複合物混合5分鐘，藉由添加4%三聚甲醛終止反應。5分鐘後，藉由添加3ml冰冷的FACS緩衝液終止固定，將細胞沉澱，再懸浮於300μl FACS緩衝液中，並在流式細胞儀上分析。

嗜中性球滲入發炎腹膜和流動腔室黏連測定

對於腹膜炎浸潤模型，分別以2.5μM CFSE[5-(及-6)-羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯]和2.5μM Far-Red DDAO SE標記純化的野生型和突變體嗜中性球，反之亦然。將具有不同螢光標記的WT及突變體細胞以1：1之比例混合，並注入野生型同窩仔畜的眼眶後靜脈竇中，並在兩個小時前注入2ml的3%巰基乙酸鹽(TG)。一個半小時後，對小鼠實施安樂死。收集其腹膜中的細胞，並藉由細胞計數 和流式細胞測量術進行分析，呈現的數據是實驗與交互螢光標記的組合。

為了檢測在剪切應力下嗜中性球對內皮細胞的黏附，將小鼠內皮細胞在經10μg/ml纖維結合素(fibronectin)包覆的玻片上培養至匯合，並以50ng/ml TNFα處理4小時。以PBS洗滌含有內皮細胞層的玻片，並置於流動腔室社備(GlycoTech)中。將上述經不同螢光標記物標記的WT和突變體細胞以1：1的比例混合，並以1dyn/cm²的剪切流速流入腔室中。然後檢查黏附細胞並在螢光顯微鏡下計數。

ROS釋放測定

為了測量細胞外ROS的釋放，將分離的嗜中性球置入反應緩衝液(含0.25% BSA之具有Ca²⁺及Mg²⁺的HBSS、10mM異發光胺、100u/ml HRP)，並以fMLP或PMA刺激。為了測量總ROS的產生，將嗜中性球與反應緩衝液(含0.25% BSA之具有Ca²⁺及Mg²⁺的HBSS、10mM發光胺、100u/ml HRP)溫育，然後進行刺激。在培養盤讀取器(Perkin Elmer)中連續讀取化學發光。對於COS-7細胞中的重構ROS生產系統，使用PMA(2μM)進行刺激。

亦藉由細胞色素C測定法測量小鼠初代嗜中性球中超氧化物的產生。簡而言之，將細胞色素C(100μM，Sigma C2506)添加至小鼠初代嗜中性球懸浮液，然後，將90μl等分試樣(1x10⁶個細胞)轉移至96孔盤中的個別的小孔中，並在540nm(細胞色素C的等吸光點)和550nm(SpectraMax iD3；Molecular Devices)上進行基礎讀取。隨後藉由添加10μl fMLP(終濃度4μM)引發氧化爆發。每隔14秒記錄一次540nm和550nm處的吸光度，持續30分鐘，藉由標準化在540nm處獲得的信號來計算信號。

嗜中性球去顆粒化測定

將一百萬個嗜中性球與10μM CB在37℃下溫育5分鐘，然後再以fMLP(500nM)刺激10分鐘，藉由置於冰上來終止反應，並將該懸浮液在4℃下以500g離心5分鐘。分別使用EnzChek Myeloperoxidase Activity Asssyed Kit及EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit(Life Technologies,Grand Island,NY)測定上清液中MPO和MMP的含量。

LPS-誘導性肺損傷

以氯胺酮/甲苯噻嗪(Xylazine)(100mg/kg和10mg/kg)麻醉小鼠，將22G導管(Jelco，Smiths Medical)導入聲帶下方1.5cm，並滴入LPS(50μl，1mg/ml，大腸桿菌011：B4)，同時保持小鼠姿勢直立。誘導損傷後22小時，通過眼眶後靜脈注射100μl FITC標記白蛋白(10mg/ml)，並在誘導損傷後24小時對小鼠實施安樂死以收集樣品。為了獲得支氣管肺泡灌洗液，將1ml PBS滴入肺中並經由氣管導管回收。對於基線穿透性測量，以相同的方式投予不含LPS的食鹽水，在提供的數據中減去基線穿透性測量值。

在存活實驗中，首先眼眶後投予小鼠100μl的10μg/ml alpha-GalCer。12小時後，經口氣管投予LPS(50μl，30mg/ml，大腸桿菌055：B5)。

酸吸入-誘導性肺損傷

藉由氯胺酮/甲苯噻嗪(1gm/kg和100mg/kg)麻醉小鼠，並從門齒垂直固定在定制的支架上，以進行口氣管滴注。將22G導管(Jelco，Smiths Medical)導入聲帶下方1.5cm，並滴入2.5μl/g的0.05M HCl。誘導損傷後四小時，經由眼眶後靜脈注射100μl FITC標記的白蛋白(10mg/ml)。誘導損傷後6小時，對小鼠實施安樂死以收集樣品。對於基線穿透性測量，以相同的方式投予不含HCl的食鹽水，在提供的數據中減去基線穿透性測量值。

在存活實驗中，小鼠經口氣管接受2.5μl/g的0.1M HCl，觀察期延長至30小時。

肺組織切片定量

使用HE染色的肺切片定量急性肺損傷指數，以血管周圍間質性水腫面積與血管面積之比進行血管周圍間質性水腫面積的定量， 從肺臟中相同肺葉取得超過8個切片用於每隻小鼠的定量。

受傷肺嗜中性球中ROS的測定

HCl ALI誘導後15分鐘，自肺中收集BAL。然後將小鼠的肺機械性分離，並通過40μm濾網過濾以產生單細胞懸浮液，並溶解紅血球。將BAL細胞沉澱並再懸浮，並將全肺細胞在37℃以1μM CM-H2-DCFDA(C6827，Invitrogen)標記30分鐘。然後標記細胞的表面標記(CD45；BD Bioscience 564279；Ly-6G；BD Bioscience 560602)。在BD LSRII上進行流式細胞測量術。

GST拉下測定(GST pulldown assay)

重組蛋白在大腸桿菌中表現，並藉由親和層析純化，然後將蛋白質在200μl結合緩衝液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，1% Triton，0.12% SDS，1mM二硫蘇糖醇，10%甘油，1×蛋白酶抑製劑混合物)中，於4℃、震盪器上溫育隔夜。第二天早上，將麩胺基硫珠添加至蛋白質混合物中另2小時。大量洗滌後，珠子上的蛋白質藉由SDS/PAGE分離，並以Western Blot檢測。

活體外激酶測定

在50μl反應緩衝液(100mM Tris-HCl pH 7.4,50mM EGTA，100mM MgCl₂)中，在冷的ATP(50μM)及/或[γ-³³P]-ATP(10μCi)存在下，將購自ThermoFisher Scientific的MAP3K3及/或MAP3K2蛋白質與免疫沉澱基質蛋白質或重組His標記p47^phox在37℃溫育30分鐘。藉由添加SDS上樣緩衝液終止反應。將樣品煮沸5分鐘，藉由SDS-PAGE分離蛋白質，並藉由磷光板影像分析進行可視化及定量，或藉由西方墨點法分析。

人類嗜中性球

根據製造商的規程，使用EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit(Stemcell Technologies)，對人類血液樣品的膚色血球層(buffy coat)進行嗜中性球富集。簡而言之，將缺乏抗體的混合物與膚色血球層混合，然後與磁性顆粒一起溫育。然後使用EasySep Magnet固定不需要的細胞，因為將無標籤的嗜中性球倒入另一個錐形管中。將富集的嗜中性球沉澱並再懸浮於測定緩衝液(具有Ca²⁺及Mg²⁺的Hanks緩衝液，0.25%BSA)中，用於ROS生成測定或Western分析。

嗜中性球與內皮細胞的雙層共培養

首先，將小鼠初代肺內皮細胞(MLEC)平盤培養於Transwell插入物(24孔型，0.4μm孔徑，Corning，Inc.353095)的聚碳酸酯膜(25,000個細胞/cm²)的外側，並上下翻轉放置在培養盤的孔中。細胞黏附後，將Transwell插入物倒置，然後重新插入盤的孔中。接種後24小時，以無血清培養基替換培養基。2小時後，將SOD(60U/ml)、過氧化氫酶(100U/ml)或模擬物添加至底部腔室30分鐘，然後將用5μM fMLP刺激的小鼠嗜中性球平盤培養在插入物的頂表面(6×10⁶個細胞/cm²)上30分鐘。在溫育期結束時，用棉花棒去除插入物頂部的嗜中性球，並用SDS-PAGE樣品緩衝液裂解插入物另一側的內皮細胞用於Western分析。

跨內皮電阻(Trans-endothelial electrical resistance，TEER)測量

將ECIS 8W10E+陣列(Applied BioPhysics)以10μg/ml的聚D-離胺酸(PDL)塗覆，並以無菌水洗滌，將完整的EBM-2培養基(300μl)加入每個孔中，用於快速阻抗背景檢查。隨後，將永生的小鼠肺血管內皮細胞以60,000個細胞/孔的密度接種在塗覆陣列中的300μl EBM-2培養基中，並將其培養在37℃的CO₂培養箱中。在ECIS系統(Applied BioPhysics)上連續記錄細胞層的電阻，直到達到約600-700歐姆的穩定電阻為止，然後從孔中取出培養基，並用100μl測定緩衝液(具有Ca²⁺及Mg²⁺之Hanks緩衝液，0.25% BSA)置換。使細胞在37℃下再平衡2小時，然後將1μl SOD(60U/ml)、過氧化氫酶(100U/ml)或模擬物添加至孔中30分鐘，然後添加50μl小鼠嗜中性球至含5μM fMLP的測定緩衝液中。在整個實驗過程中即時收集數據。在4kHz的AC頻率下分析所有ECIS測量，通過在整體頻率範圍 (1kHz-64kHz)內進行頻率掃描，該頻率被確定為此細胞類型最敏感的頻率。將TEER值與模擬物處理的WT嗜中性球共培養的值進行標準化。

用於單細胞RNA定序的樣品製備

用PBS灌注肺以移除血液，並用剪刀切碎，然後在37℃輕輕攪拌下，將預熱的膠原酶溶液(2mg/ml於含Ca²⁺/Mg²⁺之PBS中)溫育1小時。將所得的單細胞懸浮液通過40μm的尼龍細胞過濾器過濾，並使用裂解緩衝液裂解紅血球。將細胞再懸浮於冷的0.1% BSA/PBS中，以存活力染料(Fixable Viability Dye eFluor 506，eBioscience)進行存活/死亡染色後，將細胞與Fc阻斷劑(BD Biosciences)在4℃溫育5分鐘，並在4℃與抗CD45.2 mAb-PE-Cy7抗體溫育1小時，然後使用100μm噴嘴和40psi壓力(FACSAria instrument，BD Biosciences)對細胞進行分選。

單細胞RNA-seq

使用Chromium Single Cell V3 Reagent Kit及Controller(10X Genomics)，製備單細胞3'RNA-seq庫，評估庫的品質，然後在HiSeq 4000儀器(Illumina)上定序，使用Cell Ranger 2.0版管線(10X Genomics)執行初始數據處理。小鼠數據集的Loupe Browser檔案是在具有對映射讀取標準化的Cell Ranger管線中使用聚合函數生成，並可使用Single Cell Browser(10x Genomics)進行查看。使用Seurat套裝軟體V2.3.4和R 3.5.3執行後處理，包括按每個細胞表現的基因數量進行過濾，之後以t-隨機鄰近嵌入法(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE)進行聚類和可視化，在標記基因指導下對最終比對的對象進行細胞叢的鑑定。對來自WT和KI小鼠的細胞之間的每個叢執行差異基因表達分析，使用Seurat生成t-SNE圖和小提琴圖，使用GSEA軟體(Broad Institute 3.0版)和MSigDB 6.2版，對基因表達數據進行富集分析。RNA定序數據存放在Gene Expression Omnibus(GEO；接取號：GSE134365，代號為 「ypglyscoxhizron」)。

病患、干預和數據收集

對5對接受單次LT的肺移植病患進行一項前導性臨床試驗，以驗證帕唑帕尼的治療潛力(成對的接受者均從同一供者獲得一個肺)，這些代表所有有資格獲得單次LT病患，並同意在2018年3月1日至2018年8月31日之間參與研究。成對病患分別在手術前和無干預的情況下隨機接受帕唑帕尼200mg，收集LT後5天內的基線特徵、手術訊息、在ICU停留期間的醫療記錄以及呼吸器參數、動脈血液氣體分析和胸部X光檢查結果。這五位捐贈者全部都參加了自願器官捐贈計劃，死於意外或疾病。

在下列方式中獲得胸部X光評分：以心臟視野為中心，將肺視野劃分為四個象限，非不透明區域0分；不透明區域限制在1/4肺區域，1分；限制在2/4肺區域，2分；限制在3/4肺區域，3分；在所有肺野中，4分。由對治療不知情的臨床醫生和放射科醫生獨立收集分數，並使用平均值，若兩個評估者之間的差異大於1分，則進行討論以達成共識。低血氧症指數=PaO₂/FiO₂，藉由動脈血液氣體分析測量。

統計分析和研究設計

對於小鼠研究，藉由使用DSS Researcher's Toolkit的功效計算(α為0.05，功效為0.8)來確定研究的最小組數，對動物進行非盲分組，但為隨機分組，對於大多數資格性實驗，研究人員並不知情，沒有樣品或動物被排除在分析之外。在進行統計試驗之前，檢測關於數據假設的適當性，包括正態分佈和實驗組別之間的類似變化，兩組之間的平均值比較是藉由非配對的雙尾t檢驗(two tailed t-test)進行。使用單因子變異數分析執行兩組以上的比較，反之，使用Prism 8.0軟體(GraphPad)，藉由雙向ANOVA進行兩個或多個獨立變量因子的比較。對於Kaplan Meier生存分析，使用對數秩檢驗(log rank test)。統計測試使用生物複製品。P<0.05被認為具有統計學上之意義。

在前導性臨床研究中，執行線性混合模型重複測量分析， 以比較兩組之間隨時間推移的低血氧症和X射線評分，以說明受試者內相關性和成對接受者的相關性。該模型中包括按組互動的時間，以檢測兩組之間的結果軌跡差異，線性對比用於比較移植後各天的差異以及各組之間的總體平均差異。以SAS 9.4版(SAS Inc.，Cary，NC)進行分析，顯著性設定為p<0.05，雙側。

結果：

MAP3K2和MAP3K3抑制嗜中性球產生ROS

在小鼠中，Map3k3基因在各種造血細胞中大量表現，在骨髓細胞中表現最高。此外，其緊密同源物Map3k2也在小鼠骨髓細胞中表現，Western分析(圖3A)可輕易地在嗜中性球中檢測到MAP3K2和MAP3K3蛋白質。為了理解此MEKK次家族在調節嗜中性球功能中的作用，使用從Map3k2 ^-/- Map3k3 ^f/f LyzCre小鼠所分離的MAP3K2/3-缺失嗜中性球執行一系列功能測試。MAP3K2/3-缺失不影響活體外嗜中性球趨化性(圖4A-4D)、嗜中性球在剪切流下與內皮細胞的黏附(圖4E)，或β2整聯蛋白的表現或活化(圖4F-4H)。一致地，在活體內嗜中性球招募模型(圖4I)中，缺失並沒有顯著影響嗜中性球浸潤至發炎的腹膜。此外，MAP3K2/3-缺失並沒有顯著改變嗜中性球去顆粒化(圖4J和4K)。然而，MAP3K2/3-缺失導致經fMLP(圖3B-3E，圖4L-4N)、MIP2(圖3D)或PMA(圖4O)刺激後從嗜中性球釋放的總ROS(藉由發光胺測量)或釋放的ROS(藉由異發光胺或細胞色素C測量)。儘管個別MAP3K基因剔除在ROS產生中有顯著增加，但它們的作用似乎小於雙重基因剔除(圖3C)，這與這兩種激酶具有功能多重的想法一致。在MAP3K2/3-缺失嗜中性球中，野生型(WT)但非活性喪失(kinase-dead，KD)的MAP3K3的表現可抑制ROS釋放，表明激酶活性在調節ROS釋放中的重要性(圖3E和圖4P)。

MAP3K2/3-缺失保護小鼠免於ALI

鑑於嗜中性球在ALI中的重要性，在小鼠ALI模型中評估缺少這兩種MAP3K的影響。為了限制非造血細胞的作用，從 Map3k2 ^-/- Map3k3 ^f/f LyzCre小鼠品系執行過繼性骨髓轉移，以致死劑量照射WT接受體小鼠，所產生的小鼠被指定為DKO，其在所有造血細胞中缺乏MAP3K2，在骨髓細胞中缺乏MAP3K3。從WT同窩仔畜接受骨髓轉移的DKO及其對照小鼠首先經由經口氣管滴入LPS接受LPS誘導性ALI，此ALI模型概括了感染後炎症引起的肺損傷，並具有人類ALI的許多特徵，包括嗜中性球流入肺泡腔、肺水腫及肺穿透性增加伴隨高死亡率。DKO小鼠的肺穿透性和血管周圍間質性水腫明顯低於對照小鼠(圖5A和5B、圖6A)，與WT對照小鼠(圖5C)相比，DKO小鼠亦顯示出顯著降低的死亡率。

然後測試藉由經口氣管滴加HCl所誘導的不同ALI模型。HCl模型概括了人類的酸吸入性誘導的ALI/ARDS，此情況亦稱為吸入性肺炎，是由於肺部對胃的酸性內容物的吸入所引起。此情況常發生在意識障礙(例如藥物過量、癲癇發作、腦血管意外、鎮靜、麻醉程序)和虛弱的老年人中，並且佔全身麻醉死亡總數的30%。在酸誘導性ALI模型中，亦觀察到DKO小鼠的肺穿透性和血管周圍間質性水腫明顯低於對照小鼠(圖5D和5E、圖6A)，且與WT對照小鼠(圖5F)相比顯著降低的死亡率。由於酸誘導性ALI是直接侵害肺屏障細胞的結果而沒有LPS誘導性ALI中所涉及的復雜炎症反應，因此將酸ALI模型用於進一步的機制研究。

生成骨髓特異性MAP3K2 KO(Map3k2 ^f/f LyzCre)及MAP3K2/3 DKO(Map3k2 ^f/f Map3k3 ^f/f LyzCre)小鼠。與單離嗜中性球(圖3C)產生的ROS一致，骨髓特異性DKO似乎比HCl ALI模型中的每個個別骨髓特異性KO對穿透性的影響更大(圖6B)。檢查骨髓細胞數量，並觀察到在DKO與野生型對照小鼠之間，在損傷的肺、支氣管肺泡灌洗液或循環中的骨髓細胞數量並無顯著差異(圖6C-6E)。此外，支氣管肺泡灌洗液中的TNFα或IL-6含量並無顯著差異(圖6F)。這些結果共同表明，骨髓細胞中MAP3K2和3的缺乏主要影響肺穿透性，而不是在損傷肺中的骨髓細胞浸潤或細胞因子產生。

鑑於一般認為ROS對組織損傷有害，因此並不會預期骨髓特異性MAP3K2及/或3-缺失對於急性肺損傷的有益作用。為了確認缺乏MAP3K2/3的嗜中性球的確在損傷的肺中產生更多的ROS，藉由流式細胞法測量BAL及受HCl損害的肺中嗜中性球的ROS，並與WT嗜中性球相比，在受傷的肺中觀察到在MAP3K2/3-缺失的嗜中性球中升高的ROS(圖5G)。

在Ser208處的MAP3K2/3磷酸化p47^phox

接下來研究MAP3K2和3如何調節嗜中性球中ROS的產生。由於Nox2複合物為自嗜中性球釋放之ROS的主要來源，因此研究激酶是否磷酸化Nox2複合物的次單元之一。執行活體外激酶測定，並發現p47^phox，而不是p22^phox,p67^phox(圖7A)、gp91^phox或p40^phox(數據未顯示)可被MAP3K3磷酸化。儘管MAP3K3的磷酸化位點共有序列是未知的，但使用Scansite運行並使用報告的肽陣列數據對相關激酶MAP3K5進行p47^phox序列分析，以鑑定可能的磷酸化位點。此分析預測p47^phox的Ser-208是先前觀察到的最佳得分位點。當此位點在p47^phox的片段(圖7B)中發生突變時，MAP3K3介導的磷酸化顯著降低，表明此殘基可能被MAP3K3磷酸化。

為了確定此磷酸化對NDAPH氧化酶活性的影響，藉由表現NADPH氧化酶次單元p47^phox、p67^phox、p40^phox、NOX2及p22^phox，在COS-7細胞中進行NADPH氧化酶活性的測定，這些蛋白質在COS-7細胞中未表現或表現不足。加入PMA後，可從重構COS-7細胞中檢測到ROS的產生，而此ROS的產生完全取決於p47phox的外源表現(圖8A及8B)。重要的是，在此系統中，表現WT MAP3K3，但非其之無激酶活性突變體，在此系統中抑制ROS的產生(圖8C)。因此，開發一種可被MAP3K3抑制的ROS生產系統，類似於嗜中性球中所發生的。當在此重構系統中使用磷模擬的p47^phox S208E突變體替代WT時，相較於WT p47^phox，ROS的產生顯著減少(圖7C)。相比之下，不可磷酸化的S208A p47^phox突變體在此ROS重建測定中顯示出與WT p47^phox相似的活性(圖7C)。再者，MAP3K3的表現能夠抑制表現WT p47^phox之細胞中的ROS產生，而不是表現不可磷酸化的S208A p47^phox之細胞中的ROS產生(圖7D)。這些結果一起表明在S208處的p47^phox磷酸化抑制NADPH氧化酶活性。由於Ser-208位於p47^phox的兩個SH3域之間，在NADPH氧化酶複合物(圖8D)活化期間與p22^phox相互作用，因此推測在Ser-208處的磷酸化可能會干擾這種相互作用，這是NADPH氧化酶活化的關鍵步驟。實際上，擬磷酸化Ser-208-Glu突變在下拉測定中阻礙p47^phox與p22^phox的相互作用(圖7E)。

藉由MAP3K2和3檢測p47^phox是否在嗜中性球中被磷酸化，生成一種用含磷酸化Ser-208的p47^phox肽免疫的多株抗體，該抗體表現出對Ser-208-磷酸化優先於非磷酸化的p47^phox的抗體，因為Ser-208突變為丙胺酸會明顯減少該抗體在過表現MAP3K3之細胞中的檢測(圖8E)，使用該抗體，檢測到Ser-208處p47^phox磷酸化的時間依賴性增加(圖7F，圖8F)。此外，在電泳(圖7F)中觀察到MAP3K3條帶上移，這反映它被fMLP活化，MAP3K3經由自磷酸化而活化。重要的是，在缺乏MAP3K2/3的嗜中性球中未觀察到此抗體所檢測到的在p47^phox磷酸化之fMLP誘導性增加(圖7G，圖8G)，這表明fMLP可以通過MAP3K2及3誘導在Ser-208處的p47^phox磷酸化。如圖8E所示，在DKO嗜中性球中，經抗磷酸-Ser-208抗體所檢測到的條帶可反映該抗體弱的未磷酸化p47^phox的檢測。這些數據一起強有力地支持MAP3K2及3磷酸化p47^phox S208調節ROS產生的結論。

p47^phox的敲入突變改善ALI

為了進一步評估p47^phox Ser-208磷酸化在ROS產生和ALI中的重要性，生成一種敲入(KI)小鼠品系，其中p47^phox的Ser-208被丙胺酸替代，稱為p47^phox-KI，DNA定序確認正確的突變引入小鼠品系(圖8H)。此外，Western分析顯示，相較於WT小鼠，fMLP未能增加自p47^phox-KI小鼠分離出的嗜中性球中的p47^phox S208磷酸化(圖8I)。與p47^phox S208磷酸化抑制ROS產生的想法一致，來自p47phox- KI小鼠的嗜中性球在刺激時產生顯著較多量的ROS(圖7H)。重要的是，相較於在HCl誘導性肺損傷中接受WT骨髓移植的小鼠，從p47^phox-KI小鼠接受骨髓移植的小鼠亦顯示出降低的肺穿透性(圖7I)。這些數據表明，依賴於嗜中性球中MAP3K2/3之p47^phox S208磷酸化抑制了ROS的產生，而其缺乏則降低了ALI期間的肺穿透性。

旁分泌(Paracrine)H₂O₂增強內皮細胞屏障功能

上述遺傳數據表明，嗜中性球ROS必須作用於肺屏障細胞才能發揮其抗ALI的作用。為了理解潛在的機制，對於分選自受HCl誘導性ALI的WT及p47^phox-KI肺臟之CD45陰性細胞的單細胞RNA定序進行了研究，藉由Pecam1及Cdh5(圖9A)的高表現鑑定內皮細胞。途徑富集分析表明，經p47^phoxKI改變的一些傳訊途徑與AKT傳訊有關(圖9B)。與scRNAseq數據一致，來自DKO(圖9C)或p47^phox-KI小鼠(圖10A，圖9D)的受損肺切片的免疫螢光染色顯示，相較於對應的WT對照，藉由CD31標記的肺內皮細胞中的AKT磷酸化水平增加。相較於對照，DKO肺萃取物中AKT磷酸化亦升高(圖9E)。

ROS一旦從骨髓細胞中釋放，就會在肺部迅速轉化為H₂O₂，H₂O₂刺激內皮細胞中的AKT磷酸化，而內皮細胞中的ATK活化增強血管壁屏障並藉由預防微血管滲漏和清除肺泡液在ALI鼠類模型產生起保護作用，低濃度的H₂O₂增強初代培養的小鼠肺內皮細胞的跨內皮電阻(TEER)，並刺激這些細胞中的AKT磷酸化(圖9F)。為了確定H₂O₂是否介導MAP3K2/3或p47^phox磷酸化對內皮細胞造血損失的作用，執行WT和突變體嗜中性球與小鼠初代肺內皮細胞的共培養。相較於與WT嗜中性球共培養，與活化的MAP3K2/3 DKO嗜中性球共培養的小鼠初代肺內皮細胞具有更高的AKT磷酸化(圖10B，圖9G)。藉由過氧化氫酶或還原的細胞色素C的存在，以消除這種磷酸化AKT的升高，但超氧化物歧化酶(SOD)則不能(圖10B，圖9G和9H)。過氧化氫酶和還原的細胞色素C促進H₂O₂轉化為水，而SOD將超氧化物轉化為H₂O₂。此外，活化的DKO嗜中性球與小鼠內皮細胞的共培養 比活化的WT嗜中性球的情況增加了TEER，且過氧化氫酶的存在亦可消除TEER的這種差異(圖10C)。p47^phox-KI嗜中性球與小鼠初代肺內皮細胞(圖10I)的共培養亦觀察到AKT磷酸化的增加。因此，這些結果共同支持的結論為：MAP3K2/3-缺失或p47^phox-KI引起H₂O₂充分增加，從而增加了肺內皮細胞中的AKT活化，導致內皮細胞接合完整性的增強。此外，過氧化氫酶及SOD處理結果表明，細胞外的H₂O₂而不是游離的超氧化物自由基，在AKT活化和內皮屏障功能增強中產生直接作用。藉由在HCl誘導性ALI模型中對MAP3K2/3 DKO及對應之WT對照小鼠靜脈內投予聚乙二醇化過氧化氫酶進一步證實此結論。聚乙二醇化過氧化氫酶處理可增加肺部穿透性和間質性水腫並降低存活率(圖10D，圖9J-9L)，證實細胞外H₂O₂在ALI保護中的重要性(圖10D)。更重要的是，聚乙二醇化過氧化氫酶處理消除了MAP3K2/3-缺失的穿透性作用，表明細胞外H₂O₂在藉由MAP3K2/3-缺失所提供的HCl誘導性ALI保護中的重要性(圖10D)。

P47phox-KI重塑肺屏障細胞微環境

藉由將內皮細胞細分為高Prx表現的EC1和高Vwf表現的EC2，對scRNAseq數據執行進一步分析(圖11A)，EC1細胞可能來自微血管，而EC2細胞可能源自較大的血管。在差異表現基因中(表1)，相較於WT，p47^phox-KI樣品的兩個EC組中Pdgfb均被上調(圖10E)，內皮PDGF作用於外被細胞以增強血管完整性。由於PDGF可刺激AKT，因此與WT相比，在p47^phox-KI肺切片的血管週圍的外被細胞中觀察到AKT磷酸化的增加(圖10F，圖11B)，此pdgfb表現的EC2上調，再加上可編碼Notch配體DLL4並促進外被細胞存活和黏附於膀胱細胞的Dll4的EC2上調(圖11C)，可助於減少上述間質性水腫。

在p47^phox-KI腎細胞中有許多下調的傳訊配體或受體：Ackr3(在EC1及EC2中均下調，圖10E)、Il6st、Osmr、Il4ra及Bmp6(在EC2中下調)(圖11D)，Ackr3編碼CXCR7(一種CXCL12的受 體)，且其傳訊破壞內皮屏障功能。BMP6、IL6(其通過IL6受體β(Il6st)和抑癌蛋白受體(Osmr)發出信號)及IL4(其通過IL4受體α(Il4ra)發出信號)誘導內皮的高度穿透性。因此，由於p47^phox磷酸化的造血功能喪失導致ROS的適度升高，藉由調節傳訊配體及受體的表現改變了肺部治療及/或療法的微環境。來自這些配體及受體之改變的傳訊，進而導致基因表現的進一步改變，其中許多與增強肺部治療及/或療法完整性有關(表1)，其中尤為重要的是轉錄因子Klf2及Sox18(圖11E)，它們是治療及/或療法屏障功能的關鍵參與者。

PDGF傳訊對於肺泡的形成亦為重要，並刺激第II型細胞的增殖。相較於對照肺的情況，在經來自p47^phox-KI肺的ABCA3(圖10G，圖12A)所標記的第II型上皮細胞中，ALI肺切片的免疫染色亦顯示AKT磷酸化水平增加。與AKT傳訊的角色一致，在p47^phox-KI肺上皮細胞中檢測到細胞凋亡標記活化半胱天冬酶3的水平降低及增殖標記Ki67的升高(圖10H和10I，圖12B和12C)。

藉由單細胞RNA定序鑑定兩個Epcam-高上皮細胞亞群；一個亞群表現高Pdpn(一種第I型肺泡細胞的標誌物)，另一個亞群表現高Sftpc(一種第II型細胞的標誌物)(圖12D)。在顯著差異表現的基因中(表1)，Kitl是在兩個p47^phox-KI上皮組別中均上調的傳訊配體基因(圖12E)，Kitl編碼SCF且在肺泡維持及肺上皮細胞增殖中具有重要作用。亦注意到一組在p47^phox-KI與WT之間的第I型組別中差異表現的基因，其變化傾向於抗細胞凋亡(圖12F)。在非限制性方面，這些變化有助於解釋來自p47phox-KI ALI肺臟(圖12G)的這些第I型細胞中活化的半胱天冬酶3染色減少，而AKT磷酸化卻沒有明顯增加。所有這些數據共同表明，從嗜中性球中適度升高ROS對肺屏障細胞發揮非常廣泛的作用。

帕唑帕尼為一種MAP3K2/3的基質特異性抑製劑

前述的遺傳結果表明，MAP3K2及3激酶的次家族將成為治療ALI的潛在治療目標。以前的MAP3K2抑製劑篩選已鑑定出以MEK5為基質測定時的許多小分子抑製劑的IC₅₀>1μM(Ahmad,et al.,2013,J.Biomol.Screen.18：388-399；Ahmad,et al.,2015,Biochem.Biophys.Res.Commun.463：888-893)。在活體外激酶測定中測試了其中的六個候選藥物，包括舒尼替尼(Sunitinib)、帕唑帕尼、博舒替尼(Bosutinib)、波納替尼(Ponatinib)，伊馬替尼(Immatinib)和尼達替尼(Nintedanib)。不可預期的是，帕唑帕尼而非其他化合物，在低nM IC₅₀值下藉由MAP3K2和3抑制Ser-208處的p47^phox磷酸化(圖13A和13B)。帕唑帕尼為一種VEGFR1抑製劑及FDA批准的靶向癌症治療藥物，帕唑帕尼在大於1μM的IC₅₀值下藉由MAP3K2或3抑制MEK5磷酸化(圖14A)。因此，帕唑帕尼具有前所未有的基質特異性，這將是有益的藥理學特徵，因為它不會抑制MAP3K2/3引起的MEK5磷酸化，從而引起由MEK5介導的意外作用。

隨後在小鼠嗜中性球中測試帕唑帕尼，並發現其在Ser-208處抑制p47^phox磷酸化(圖13C)。帕唑帕尼亦消除經fMLP(圖13C)誘導的MAP3K3蛋白含量的增加，表明其抑制嗜中性球中MAP3K3的活化。重要的是，以帕唑帕尼處理WT(圖13D)而非MAP3K2/3-缺失(圖13E)小鼠嗜中性球，會導致ROS產生的增加，表明帕唑帕尼經由MAP3K2及3增加嗜中性球中ROS的產生。此外，帕唑帕尼並不影響小鼠嗜中性球中的ERK或p38磷酸化(圖14B)。

帕唑帕尼改善ALI

在HCl誘導性和LPS誘導性ALI模型上測試帕唑帕尼的作用。首先使用治療形式執行該試驗，在損傷誘導後鼻內給予帕唑帕尼(圖15A和15B)。在此測試中，帕唑帕尼治療產生顯著降低肺穿透性(圖15C和15D)、血管周圍質性水腫和肺損傷指數(圖15E和15F)及死亡率(圖15G和15H))。此外，在受HCl肺損傷的帕唑帕尼治療小鼠的BAL及肺中的嗜中性球中，檢測到ROS的升高(圖16A)。與以MAP3K2/3-缺失對於骨髓細胞浸潤和細胞因子含量欠缺影響一致，帕唑帕尼對這些界限並沒有影響(圖16B-16D)。在一項預防性試驗中，在損傷誘導之前口服或鼻內給藥(圖16E和16F)，帕唑帕尼亦減少肺穿透性和死亡率(圖16G-16J)。

為了確定帕唑帕尼是否通過MAP3K2/3-p47^phox途徑產生作用，在DKO小鼠中測試了帕唑帕尼的作用；帕唑帕尼在DKO小鼠中對肺穿透性失去了作用(圖17A)，表明帕唑帕尼的作用取決於MAP3K2及3。為了測試帕唑帕尼是否通過p47^phox調節肺穿透性，以缺乏p47^phox的小鼠試驗帕唑帕尼在造血細胞中的作用。藉由將骨髓p47^phox-缺失小鼠轉移到受輻射的WT小鼠中生成小鼠。與嗜中性球ROS對控制ALI上提供有益作用的假設一致，p47^phox的造血功能缺失會增加HCl誘導性ALI中的肺穿透性(圖17B)，重要的是，造血細胞中欠缺p47^phox減弱帕唑帕尼在穿透性(圖17B)及\和存活率(圖18A)上的作用，表明帕唑帕尼通過p47^phox產生作用。為了進一步確定帕唑帕 尼是否通過p47^phox磷酸化產生作用，以p47^phox-KI嗜中性球及小鼠測試帕唑帕尼。在HCl誘導性肺損傷後，帕唑帕尼未能提高p47^phox-KI嗜中性球中的ROS產生(圖17C)，或未能降低p47^phox-KI小鼠中的肺穿透性(圖17D)，因此確認帕唑帕尼通過Ser-208處的p47^phox磷酸化起作用。這些結果，加上觀察到聚乙二醇化的過氧化氫酶消除ALI模型中帕唑帕尼的作用(圖17E)，表明帕唑帕尼通過抑制MAP3K2/3介導的S208處的p47^phox磷酸化而產生作用，以及通過細胞外H₂O₂來減少肺穿透性。

與MAP3K2/3的基因失活相一致，帕唑帕尼治療導致接受ALI的肺部萃取物中磷酸化的AKT水平升高(圖18B)。重要的是，在HCl誘導性ALI模型中，以AKT抑製劑(MK-2206)治療小鼠消除了帕唑帕尼對肺穿透性的影響(圖18C)。這些數據共同表明，帕唑帕尼通過MAP3K2/3、p47^phox和AKT來減少HCl誘導性ALI期間的肺穿透性。

MAP3K2及3蛋白質均在人類嗜中性球中表現，連同觀察到帕唑帕尼會增加人類嗜中性球中ROS的產生(圖19A)，帕唑帕尼具有治療人類ALI/ARDS的真正潛力。因此，進行一項初步人體研究以評估帕唑帕尼對接受肺移植(LT)之病患的影響。LT為一種ALI的理想人體模型，其中ALI/ARDS是由嗜中性球扮演關鍵角色的缺血再灌注引起的，且不受感染和疾病進程的干擾。在此初步臨床研究中招募五對病患，其中每對病患均接受同一供體的一個肺，一對病患中的一位接受口服帕唑帕尼的治療，而另一位病患未經治療，治療組和對照組在年齡和性別方面無顯著差異(圖19B)。治療組在第一天具有顯著較低的X光不透明性評分，可視覺評估肺水腫(差異：0.6，95% CI 0.04-1.26，p=0.04)，而在最後一天仍保持相似的差異(0.7，95% CI 0.1-1.3，p=0.04)(圖19C和19D)。平均而言，相較於對照組，治療組具有0.5分較低的X光(p=0.02)。因此，帕唑帕尼治療顯著減少肺移植誘導性損傷中的肺水腫。

選擇的評論

在此研究中，提供證據證明FDA批准的抗癌藥帕唑帕尼經由不同於其抗癌作用的機制在小鼠和人類中減輕ALI表現型。其顯示，帕唑帕尼為一種在Ser-208處p47^phox的MAP3K2/3介導性磷酸化的有效抑製劑，且具有強而有力的小鼠遺傳學證據證實帕唑帕尼主要通過MAP3K2/3-p47^phox途徑產生作用，以改善ALI，儘管它也抑制酪胺酸激酶受體。此經FDA批准的藥物已在臨床上用於癌症治療多年，即使長期使用也具有良好的耐受性，這種安全性輪廓，再加上帕唑帕尼對p47^phox相對於其他MAP3K基質MEK5的不可預期的基質特異性，使得該藥物在治療ALI/ARDS方面具有額外的安全性優勢。因此，它有潛力成為ALI/ARD的第一種治療藥物，以滿足對於ALI/ARDS藥理干預尚未得到滿足的醫療需求。

多種在小鼠ALI模型中顯示出作用的藥物在人類中都失敗了，這些先前測試的藥物在過程的上游起作用，或者靶向免疫反應及炎性細胞因子。相反地，本研究中所描述的帕唑帕尼的作用機制可能通過從嗜中性球到肺內皮和上皮細胞的旁分泌機制，在人和小鼠之間是守恒的，前導性人體研究表明，帕唑帕尼在肺移植誘導性損傷中降低肺水腫，這與物種間作用機制的守恒是一致的。人體研究可包括將帕唑帕尼重新調配為靜脈注射形式及/或擴大研究規模。此外，由於本研究聚焦於無菌環境下肺部損傷的急性期，因此可執行研究以探討MAP3K2及3抑制在細菌或病毒感染所引起的ARDS中及/或在ARDS的恢復期施用是否有效。

過量的ROS通常會損壞脂質、蛋白質和DNA，特別是在產生ROS的細胞中。然而，在此研究中，提供有力的證據顯示，經由旁分泌機制，從骨髓細胞釋放的ROS的適度增加會影響肺血管及上皮細胞，促進屏障功能的增強。共培養實驗證實，嗜中性球中MAP3K2/3或p47^phox磷酸化的喪失導致ROS釋放的變化足以增加AKT磷酸化並增強內皮細胞的屏障功能。重要的是，由於過氧化氫酶的作用，這些作 用是直接藉由細胞外H₂O₂而不是游離的超氧自由基介導的。AKT活化導致內皮細胞中的RAC1活化，從而調節F-肌動蛋白重塑並增強血管的完整性，此解釋了旁分泌H₂O₂對內皮細胞完整性的增強和穿透性降低的作用。藉由觀察到AKT活化的抑製劑消除ALI上MAP3K2/3抑制的有益作用，進一步證實AKT活化的重要性(圖18C)。

旁分泌H₂O₂的影響似乎超出了肺膀內皮細胞中AKT的調節範圍，scRNAseq數據揭示肺內皮和上皮細胞的廣泛轉錄變化，傾向於增強屏障功能及上皮存活和增殖。這些結果連同免疫組織染色數據表明，嗜中性球釋放的細胞外H₂O₂的適度升高通過串擾(crosstalk)和不同類型肺細胞的相互作用觸發肺微環境重塑，導致保護肺部免於急性損傷。在此研究中，研究了藉由內皮和上皮細胞促成的潛在串擾。儘管不希望受到理論的限制，但據信蛋白質(如PTEN)的氧化(其可解釋H₂O₂對AKT的活化)可能是H₂O₂作為傳訊分子如何對肺屏障細胞產生廣泛影響的機制之一。在某些非限制的實施方式中，在LPS誘導性模型中，藉由抑制MAP3K-p47磷酸化軸來增加ROS產生的ALI保護作用可能是由於屏障細胞中的AKT活化與升高的H₂O₂抗炎作用二者的結合所致。

實施例3：帕唑帕尼臨床試驗

帕唑帕尼調配物組成物

一種非限制性調配物，其包含溶於羥丙基β環糊精(HPB)的帕唑帕尼鹽酸鹽及注射用水，製成靜脈注射(IV)調配物。每毫升含5mg帕唑帕尼鹽酸鹽，並溶於200mg羥丙基β環糊精USP和注射用水USP中。輸液前，將小瓶中的內容物稀釋到24mL 0.9%氯化鈉注射液，USP(生理鹽水)或5%葡萄糖溶液中，一小瓶的內容物將提供30mg帕唑帕尼鹽酸鹽。定性及定量組成物顯示於下表2中。

*在配料混合及小瓶填充過程中用作為加工助劑，以最大程度地減少頂部空隙。

表3提供原料藥雜質(名稱、結構、來源及限制)的說明性信息。

表4提供表3所列出之雜質的化學名稱。

HCl誘導性小鼠急性肺損傷模型中的帕唑帕尼IV

基於帕唑帕尼在Ser-208處抑制p47^phox的MAP3K2和MAP3K3磷酸化的活體外結果，以1、3及10mg/kg體重的劑量確定帕唑帕尼IV的功效。以氯胺酮/甲苯噻嗪(100及10mg/kg)麻醉8至10週齡BALB/c小鼠，並在整個過程中使用氯胺酮/甲苯噻嗪維持麻醉，在深度麻醉後(藉由施加嫌惡刺激，例如腳趾捏，觀察不到反射反應，並且沒有觀察到呼吸頻率或呼吸特性的變化)，將小鼠從門齒垂直固定在定制的支架上，以進行口氣管滴注，在聲帶下方1.5cm處引導22G導管，並滴入2.5μL/g的0.05M HCl。給藥後，監測小鼠直至其呼吸逐漸恢復正常。然後將小鼠放回到恢復籠的加熱墊上，並監測其麻醉狀態。誘導損傷前半小時，經由帕唑帕尼尾靜脈IV將1、3，或10mg/kg體重或媒劑對照遞送至小鼠。肺損傷誘導後四個小時，經眼眶後靜脈注射100μL FITC標記的白蛋白(10mg/mL)。FITC-白蛋白注射後兩小時，對小鼠實施安樂死，並經由向肺中滴入1ml PBS收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，並經由氣管導管取回。BAL的綠色螢光通過培養盤讀取器測量，以經媒劑對照處理小鼠的BAL螢光強度將經帕唑帕尼處理的小鼠的BAL螢光強度標準化，以3mg/kg體重之帕唑帕尼IV時觀察到穿透性的統計學顯著降低(P<0.0001)(圖20)。

MHV-1小鼠模型中的帕唑帕尼IV

在HCl誘導性ALI小鼠模型中建立帕唑帕尼IV改善肺損傷的功效後，研究其在冠狀病毒感染誘導的ALI小鼠模型中減少肺損傷的潛力。採用鼠類肝炎病毒株1(MHV-1)模型用於藥理研究，所有感染MHV-1的A/J小鼠都會發展為進行性間質性水腫，嗜中性球/巨噬細胞浸潤和透明膜，從而導致所有小鼠死亡。迄今為止，已經完成了兩項研究，在第一項研究中，小鼠在接種病毒後的6、21和32小時內投予3劑量方案的研究干預。在第二項研究中，小鼠在接種24及33小時後投予2劑量方案。

研究1：

以氯胺酮/甲苯噻嗪(100及10mg/kg)麻醉8至10週齡 A/J小鼠，並在整個過程中使用氯胺酮/甲苯噻嗪維持麻醉，在深度麻醉後(藉由施加嫌惡刺激，例如腳趾夾痛，觀察不到反射反應，並且沒有觀察到呼吸頻率或呼吸特性的變化)，小鼠接受了20μL的鼻內接種5000 PFU MHV-1 Dulbecco改良Eagle培養基。給藥後，監測小鼠直至其呼吸逐漸恢復正常，然後將小鼠放回到恢復籠的加熱墊上，並監測其麻醉狀態。然後，在接種病毒後的6、21和32小時，三劑量之帕唑帕尼IV(3mg/kg體重)或媒劑經由眼眶後靜脈遞送至小鼠。第三次劑量干預後15小時，經由眼眶後靜脈注射100μl FITC標記的白蛋白(10mg/mL)。FITC-白蛋白注射後兩小時，對小鼠實施安樂死，並經由向肺中滴入1mL PBS收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，並經由氣管導管取回。BAL的綠色螢光通過培養盤讀取器測量，以經媒劑對照處理小鼠的BAL螢光強度將經帕唑帕尼處理的小鼠的BAL螢光強度標準化，其中較高的強度對應較大的穿透性。以3mg/kg體重之帕唑帕尼IV時觀察到穿透性的顯著降低(P=0.0235)(圖21)。

研究2：

以氯胺酮/甲苯噻嗪(100及10mg/kg)麻醉8至-10週齡A/J小鼠，並在整個過程中使用氯胺酮/甲苯噻嗪維持麻醉，在深度麻醉後(藉由施加嫌惡刺激，例如腳趾捏，觀察不到反射反應，並且沒有觀察到呼吸頻率或呼吸特性的變化)，小鼠接受了20μL的鼻內接種6000PFU MHV-1 Dulbecco改良Eagle培養基。給藥後，監測小鼠直至其呼吸逐漸恢復正常，然後將小鼠放回到恢復籠的加熱墊上，並監測其麻醉狀態。然後，在接種病毒後的24和33小時，二劑量之帕唑帕尼IV(3mg/kg體重)或媒劑經由眼眶後靜脈遞送至小鼠。第二次劑量研究干預(帕唑帕尼IV或安慰劑)後16小時，經由眼眶後靜脈注射100μL FITC標記的白蛋白(10mg/mL)。FITC-白蛋白注射後兩小時，對小鼠實施安樂死，並經由向肺中滴入1mL PBS收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，並經由氣管導管取回。BAL的綠色螢光通過培養盤讀取器測量，以經媒劑對照處理小鼠的BAL螢光強度將經帕唑帕尼處理的小鼠 的BAL螢光強度標準化，其中較高的強度對應較大的穿透性。以3mg/kg體重之帕唑帕尼IV時觀察到穿透性的顯著降低(P=0.0001)(圖22)。

在臨床試驗中估算最大安全起始劑量

在小鼠冠狀病毒誘導性肺損傷模型中，有效劑量約為3mg/kg(見第8.2.1節)，相當於人類等效劑量3 x 0.08mg或0.24mg/kg，假設一個人的平均體重為70公斤，則預計的臨床有效劑量約為16.8毫克，根據以下提出的理由，建議在COVID-19患者中研究20mg的起始劑量。自2009年以來，VOTRIENT®(帕唑帕尼)已被批准以錠劑形式口服用於治療晚期腎細胞癌和軟組織肉瘤，癌症病患每天口服一次800毫克帕唑帕尼的推薦劑量具有良好的耐受性。據報導，帕唑帕尼的口服生物可利用性為21.4%(13.5%至38.9%)，C_max為43.9μg/mL，AUC為806μg.h/mL。

NOAEL和人體等效劑量計算

從為期2週的GLP IV輸注(20分鐘)研究中得出的結論是，大鼠和猴的NOAEL(未觀察到不良反應水平)均為10mg/kg/天(表5)。因此，大鼠和猴的對應人類當量劑量(human equivalent dose，HED)分別為1.6及3.2mg/kg，假設人的體重為70千克，則分別相當於大鼠和猴的112和224mg HED。因此，基於為期2週的大鼠和猴研究得出的安全界限分別為5.6倍和11.2倍(表5)。

*假設建議的臨床劑量為20mg/天或0.29mg/kg。

臨床藥物動力學與動物毒性動力學

此調整系基於在大鼠和猴中所進行的GLP 2-週IV輸液毒理學和毒性動力學研究的結果(表6)。基於臨床PK和毒理學結果，建議20mg/受試者是第2期臨床試驗的安全起始劑量。IV投予帕唑帕尼5mg/受試者(N=7)後，AUC及C_max分別為20.4μg.h/mL及0.848μg/mL。假設劑量線性，IV注射20mg/受試者後，AUC和C_max分別為81.6μg.h/mL及3.4μg/mL，這些外推值可能會被誇大，因此計算出的安全範圍會更高。

在為期2週的GLP毒性動力學研究中進行的血漿藥物濃度分析顯示，雄性和雌性大鼠的C_max值分別為55和47μg/mL。在IV投予帕唑帕尼(20mg)後，藉由除以人的C_max(3.4μg/mL)所得出的安全界限分別為雄性和雌性大鼠的13.8倍和16.2倍(表6))。

相似地，基於來自雄猴和雌猴的C_max值計算的帕唑帕尼的安全界限分別為25倍和23倍。然而，基於AUC值的安全界限小於10倍，此可能是由於帕唑帕尼在人中相對較長的半衰期(t_1/2)(27.5小時)，而在大鼠及猴中t_1/2則是數小時。此外，相較於大鼠和猴的20mg臨床起始劑量，IV給藥14天後確定基於大鼠和猴子研究計算的安全界限時所使用的NOAEL，該劑量將在研究的第1部分中投予COVID-19病患作為單次輸注。最後，在癌症病患中每天口服800毫克帕唑帕尼後的血漿藥物濃度(最大推薦人類劑量，MRHD)顯著高於GLP大鼠和猴子毒理學研究中所觀察到的濃度，帕唑帕尼的口服生物可利用性約為20%，這意味著在臨床試驗中可耐受高達160mg的IV劑量。基於上述理由，得出的結論是，對於COVID-19病患的第2期臨床試驗，建議的20mg帕唑帕尼IV起始劑量應是安全且耐受性良好的，並且計劃的最大臨床暴露水平不超過FDA所批准的VOTRIENT產品標籤上的 MRHD允許量。

^aIV投予5mg/天的帕唑帕尼後的C_max為0.85μg/mL，AUC_(0-∞)為20.4μg *h/mL。

^b假設劑量線性，在20mg/kg時C_max和AUC_(0-∞)分別為3.4μg/mL及81.6μg *h/mL。

^c自FDA批准的VOTRIENT產品標籤上所獲得之訊息。

總體研究設計

對於帕唑帕尼IV，沒有任何臨床研究已經完成或正在進行作為任何開發計劃的一部分。開始研究是在已確診COVID-19的住院參與者中的第2期，雙盲，多中心，雙臂，隨機，安慰劑對照，二部分，適應性試驗，研究帕唑帕尼IV單次或多次給藥的安全性、耐受性和PK。egimen.第1部分遵循單次遞增劑量(SAD)設計，旨在確定於第二部分(第2部分)中直接作為多劑量(MD)方案使用的潛在最佳劑量。該研究亦尋找表明此族群中氣體交換改善的初步功效信號。總體設計的圖形以及全面的描述和統計方法如圖23所示。在研究的兩個部分均進行藥物動力學評估。這些研究的結果有助於特徵化COVID-19病患中帕唑帕尼IV的單劑量和多劑量安全性及PK輪廓，以為將來的研究提 供參考。

篩選期持續1至3天(包括研究第1天)，預期的候選者將根據納入和排除標准評估以確定資格。

然後將合格的候選人納入研究，並以2：1的比例分別分配給實驗組(帕唑帕尼IV)或對照組(安慰劑)，為避免族群偏倚，基於疾病的嚴重程度(ICU與非ICU住院)藉由分層控制隨機化。關於雙臂，治療包括研究干預措施和護理標準。在研究的第1部分(SAD)中，隨機分配後以20分鐘的單次輸注(周邊或中央導管)形式投藥干預。在第2部分(第1天和第3天)中投予兩次輸液，並可選擇投予第三劑(第5天)。參加者要進行一系列的住院研究評估。除非另有說明，否則在參與者仍留在醫院的同時進行每日評估，出院後，將在指定的日期安排以電訪每週追蹤，每個參與者的總持續時間為28至34天，其中包括1至3天的篩選期和30天(±2天)的觀察期。

研究族群

如上所述，最近在小鼠ALI模型中進行的研究表明，帕唑帕尼藉由抑制嗜中性球中的蛋白質激酶MAP3K2和MAP3K3來調節ALI和ARDS的發展，這是ARDS發生和可能的COVID-19相關性ARDS的關鍵因素。由於ALI/ARDS對COVID-19的病理生理至關重要，因此預期研究族群對於評估試驗研究藥物具有臨床相關性及意義。

第2期研究的主要入選標準為住院，確認為SARS-CoV-2感染及暗示進行性COVID-19的臨床症狀，另外兩個與疾病相關的標準包括放射線攝影及血液氣體評估。存在放射線攝影的雙側浸潤，藉由胸部成像可見到混濁，這是ARDS和COVID-19病患的共同特徵。第二個合格標準是藉由脈搏血氧飽和度(SpO₂)維持92%的血液O₂飽和所需的氧氣支持水平，要求至少為5L(40% FiO₂)或更大，這些值對應於最大推算的PaO₂/FiO₂比為160。或者，合格的參與者可能在篩選時接受侵入性機械換氣，這些標準將研究族群限制成為罹患中度至重度肺損 傷的病患(柏林(Berlin)定義，中度ARDS：100至200[PEEP

5cm H₂O])。根據擬議的MoA，最佳干預窗口是病毒感染觸發高炎症反應的期間，該期間與病情較重的病患出現明顯的肺損傷和氣體交換障礙有關。因此，在不希望受到任何理論限制的情況下，對於肺功能惡化至可能很快成為有侵入性機械換氣的候選者或最近發展為有侵入性機械換氣的病患，該療法可具有良好的風險/益處。

選擇的評論

帕唑帕尼是一种血管生成抑製劑，其已被FDA批准用於治療晚期腎細胞癌，並已在本文中證實對於與COVID-19相關的病理生理學是有效治療方法。最近發生的COVID-19大流行導致全球多器官疾病性肺炎的住院治療突然大量增加，經由IV注射3mg/kg(相當於0.24mg/kg HED)，帕唑帕尼IV已被證實在冠狀病毒感染誘導性小鼠模型中以及酸誘導性ALI小鼠模型中的功效，假設每位病患的平均體重為70公斤，則臨床有效劑量預計為16.8mg/天(或約20mg/天)。

每天口服一次800毫克的VOTRIENT®(帕唑帕尼)已顯示對癌症病患良好的耐受性，帕唑帕尼的口服生物可利用性為20%，表明高達160mg IV劑量的帕唑帕尼對於病患可很好地耐受，此可被大鼠和猴中的2週IV輸注研究所支持。在IV投予10mg/kg/天之STD10/NOAEL劑量後，這些源自GLP大鼠和猴研究的血漿藥物濃度和毒物動力學參數相似於已公開的大鼠和猴子口服NOAEL劑量後帕唑帕尼的全身暴露，且低於口服VOTRIENT® 800mg/天後在癌症病患中所觀察到的。這項為期2週的猴類研究表明，相較於計劃的臨床起始劑量，安全界限為11.2倍。當帕唑帕尼IV連續5天每天投予猴類時，在先前的IV劑量範圍研究中，此安全界限增加到33.1倍。

列舉的實施方式

提供下列例示性實施方式，其編號不應解釋為指定重要性程度。

實施方式1提供一種在所需受試者中治療、改善及/或預 防中風後腦缺血-再灌注損傷(IRI)的方法，該方法包含投予該受試者治療有效量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。

實施方式2提供一種在所需受試者中治療、改善及/或預防非由中風後腦缺血所引起之缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的方法，該方法包含投予該受試者治療有效量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。

實施方式3提供任一實施方式1至2的方法，其中受試者在加護病房(ICU)或急診室(ER)。

實施方式4提供任一實施方式1至3的方法，其中進一步投予該受試者至少一種治療、改善、預防及/或減輕IRI、與冠狀病毒感染相關的肺損傷、ALI及/或ARDS的一種或多種症狀的額外藥劑及/或療法。

實施方式5提供任一實施方式1至4的方法，其中該投予途徑選自下列所組成之群組：口服、顱內、經鼻、經直腸、非經腸胃道、舌下、經皮或經黏膜、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、皮下、肌肉內、皮內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入及局部投予。

實施方式6提供任一實施方式1至5的方法，其中帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物以選自下列所組成群組之頻率投予受試者：約一天三次、約一天兩次、約一天一次、約每隔一天一次、約每三天一次、約每四天一次、約每五天一次、約每六天一次及/或約每週一次。

實施方式7提供任一實施方式1至6的方法，其中帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物在再灌注發生後投予該受試者。

實施方式8提供任一實施方式1至7的方法，其中投予帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物並不會引起至少一種與投予帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物至離患癌症之受試者相關的重大不良反應、副作用及/或毒性。

實施方式9提供實施方式8的方法，其中該至少一種重大 不良反應、副作用及/或毒性系選自下列所組成之群組：肝毒性、延長的QT間隔和多型性心室心律不整、出血性事件、凝血減少或阻礙、動脈血栓形成事件、胃腸道穿孔或瘻管、高血壓、甲狀腺功能減退、蛋白尿、腹瀉、髮色變化、噁心、厭食和嘔吐。

實施方式10提供任一實施方式1至9的方法，其中投予該受試者之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的量係低於將帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物投予罹患癌症病患用於癌症治療之用量。

實施方式11提供任一實施方式1至10的方法，其中該受試者為哺乳動物。

實施方式12提供任一實施方式1至11的方法，其中該哺乳動物為人類。

實施方式13提供任一實施方式1至11的方法，其中該受試者以約5mg至約100mg之間的量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物靜脈內給藥。

實施方式14提供一種包含帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物、施用器及使用的指導性材料的套組，其中該指導性材料包含對於在受試者中治療、改善及/或預防缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的指示。

實施方式15提供實施方式14的套組，其進一步包含用於治療、預防或減少IRI、與冠狀病毒感染相關的肺損傷、ALI及/或ARDS之一種獲多種症狀的至少一種額外藥劑。

實施方式16提供一種評估藥物在治療缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)中功效的方法，該方法包含將嗜中性球與該藥物接觸，並量測接觸後嗜中性球ROS生產水平，其中，若該嗜中性球ROS生產水平在接觸後增加，則該藥劑對治療IRI、與冠狀病毒感染之肺損傷、ALI及/或ARDS有關是有效的。

實施方式17提供一種評估藥物在治療罹患缺血-再灌注 損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之受試者中的功效的方法，該方法包含(i)在投與該藥物後，測量受試者的嗜中性球ROS生產水平，其中，若在投與該藥物後該受試者之嗜中性球ROS生產水平高於投與該藥物前該受試者之嗜中性球ROS生產水平，則該藥物對於治療該受試者之IRI、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS是有效的；或(ii)在投與該藥物後，測量受試者肺中H₂O₂的水平，其中，若在投與該藥物後該受試者肺中H₂O₂的水平高於在投與該藥物前該受試者肺中H₂O₂的水平，則該藥物對於治療該受試者之與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS是有效的。

實施方式18提供任一實施方式1至13、16及17的方法，其中該冠狀病毒感染為COVID-19。

實施方式19提供實施方式14或15的套組，其中該冠狀病毒感染為COVID-19。

本文中所引用之每一個及各個專利案、專利申請案及公開文獻的揭示內容藉由引用其全文而併入本文中。

本發明雖已參照特定實施方式進行揭示，但對於其他本發明所屬技術領域具有通常知識者而言，很明顯地在不背離本發明真實精神與範圍之下，可設計出其他實施方式與變形。後附之申請專利範圍意在被解釋為包括所有此類實施方式及等效的變形。

<110> 耶魯大學

<120> 用於治療局部缺血-再灌注損傷及/或肺損傷的化合物、組成物及方法

<130> 047162-7261TW1(01279)

<150> US 62/938,083

<151> 2019-11-20

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=磷絲胺酸

<400> 1

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成

<400> 3

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成

<400> 4

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 化學合成

<400> 5

Claims (19)

1. 一種在所需受試者中治療、改善及/或預防中風後腦缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的方法，該方法包含投予該受試者治療有效量的帕唑帕尼(pazopanib)或其鹽或溶劑合物。
2. 一種在所需受試者中治療、改善及/或預防非由中風後腦缺血所引起之缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的方法，該方法包含投予該受試者治療有效量的帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。
3. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該受試者在加護病房(intensive care unit，ICU)或急診室(emergency room，ER)。
4. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中進一步投予該受試者至少一種治療、改善、預防及/或減輕IRI、與冠狀病毒感染相關的肺損傷、ALI及/或ARDS的一種或多種症狀的額外藥劑及/或療法。
5. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該投予途徑選自下列所組成之群組：口服、顱內、經鼻、經直腸、非經腸胃道、舌下、經皮或經黏膜、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、皮下、肌肉內、皮內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入及局部投予。
6. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物以選自下列所組成群組之頻率投予受試者：約一天三次、約一天兩次、約一天一次、約每隔一天一次、約每三天一次、約每四天一次、約每五天一次、約每六天一次及/或約每週一次。
7. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物在再灌注發生後投予該受試者。
8. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中投予該帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物並不會引起至少一種與投予帕唑帕尼或其鹽 或溶劑合物至罹患癌症之受試者相關的重大不良反應、副作用及/或毒性。
9. 如請求項8所述的方法，其中該至少一種不良反應、副作用及/或毒性系選自下列所組成之群組：肝毒性、延長的QT間隔和多型性心室心律不整、出血性事件、凝血減少或阻礙、動脈血栓形成事件、胃腸道穿孔或瘻管、高血壓、甲狀腺功能減退、蛋白尿、腹瀉、髮色變化、噁心、厭食和嘔吐。
10. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中投予該受試者之帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物的量係低於將帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物投予罹患癌症病患用於癌症治療之用量。
11. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該受試者為哺乳動物。
12. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該哺乳動物為人類。
13. 如請求項1至2中任一項所述的方法，其中該受試者以約5mg至約100mg之間的量靜脈內給予帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物。
14. 一種包含帕唑帕尼或其鹽或溶劑合物、施用器及使用指導性材料的套組，其中該指導性材料包含對於在受試者中治療、改善及/或預防缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)及/或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)的指示。
15. 如請求項14所述的套組，其進一步包含用於治療、預防或減少IRI、與冠狀病毒感染相關的肺損傷、ALI及/或ARDS之一種或多種症狀的至少一種額外藥劑。
16. 一種評估藥物在治療缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)中功效的方法，該方法包含將嗜中性球與該藥物接觸，並量測接觸後嗜中性球ROS生產水平，其中，若該嗜中性球ROS生產水平在 接觸後增加，則該藥劑對治療IRI、與冠狀病毒感染之肺損傷、ALI及/或ARDS有關是有效的。
17. 一種評估藥物在治療罹患缺血-再灌注損傷(IRI)、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之受試者的功效的方法，該方法包含

    (i)在投與該藥物後，測量受試者的嗜中性球ROS生產水平，其中，若在投與該藥物後該受試者之嗜中性球ROS生產水平高於投與該藥物前該受試者之嗜中性球ROS生產水平，則該藥物對於治療該受試者之IRI、與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS是有效的；或

    (ii)在投與該藥物後，測量受試者肺中H₂O₂的水平，其中，若在投與該藥物後該受試者肺中H₂O₂的水平高於在投與該藥物前該受試者肺中H₂O₂的水平，則該藥物對於治療該受試者之與冠狀病毒感染有關之肺損傷、ALI或ARDS是有效的。
18. 如請求項1、2、16及17中任一項所述的方法，其中該冠狀病毒感染為COVID-19。
19. 如請求項14所述的套組，其中該冠狀病毒感染為COVID-19。

Images