CN103260647A - 用于治疗心脏病的egfr拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂的用途及其用于治疗心脏病的方法和药物组合物。在本发明的一个实施例中，本发明的方法包括：(a)向患者施用EGFR拮抗剂；以及(b)抑制或大致上抑制EGFR信号传导级联。在本发明的另一个实施例中，本发明的方法可与其它心脏病疗法协同使用。

Description

用于治疗心脏病的EGFR拮抗剂
技术领域
本发明涉及表皮生长因子受体拮抗剂，特别涉及表皮生长因子受体拮抗剂用于治疗心脏病以及治疗、预防或最大限度地改善心脏病并发症的用途、方法和药物组合物。 
发明背景 
全球每年有大约1200万人死于心血管疾病，而心肌梗塞(MI)是其中致死的主要原因之一。心脏破裂、室性心律失常和心力衰竭是导致心肌梗塞的常见原因。心脏破裂指的是左心室的破裂，通常伴有急性心肌梗塞。如果不及时治疗，该病情可能会立即或在几天之内导致死亡，这取决于破裂的程度。据认为，在患有致死性急性心肌梗塞的人群中，有大约10%的患者会出现心脏破裂[38]。仅美国而言，每年有大约25,000人死于心肌破裂，它是继急性心肌梗塞之后导致死亡的最常见原因。 
临床研究已证明，在患有急性心肌梗塞而住院的所有患者中，有大约4-10%的患者出现心脏破裂，但是其导致溶血栓疗法[1,17,28,38]后高达12%的住院死亡率。尸检显示，在死于急性心肌梗塞的患者中，有大约31–65%的患者出现心脏破裂[18,27]。因此，研究导致心脏破裂的内在机制，将有助于开发可降低心肌梗塞死亡率的药物。 
心肌细胞外基质(ECM)对维持心脏的完整性和功能起到重要的作用[9]。心肌细胞外基质的主要成分是由拉伸胶原蛋白I(约80%)和胶原蛋白III(约10%)组成的原纤维胶原蛋白，其中伸胶原蛋白I对协调收缩功能起到关键作用，胶原蛋白III则提供弹性[3,9]。原纤维胶原蛋白被合成为前体肽，在被插入新生的原纤维之前，前体肽于氨基和羧基端被蛋白水解裂解[3]。转化生长因子-β(TGF-β)是成纤维细胞的胶原蛋白表达及合成的主要诱导剂之一[3]。心肌细胞外基质的重塑受基质金属蛋白酶(MMPs)及其内源抑制物–组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)的介导[2]。MMPs和TIMPs活性的不平衡会影响心肌梗塞的愈合并造成心脏破裂[16,30,39]。 
TIMPs仿佛是由4种同源蛋白组成的族，这些同源蛋白的表达皆发生在心脏中[9]。在各种组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)中，金属蛋白酶抑制物-3(TIMP-3)受ECM绑定，是所有已知的基质金属蛋白酶(MMPs)中较为有效的抑制物，而且在健康的心脏中具有较高的表达水平。然而，在患病的心脏中，受充血性心力衰竭患者的适应不良性心肌重塑的影响，TIMP-3的表达水平被降低[7]。此外，在没有施加压力或伤害的情况下，老年小鼠内TIMP-3表达水平的降低仍然触发了进行性心肌重塑和功能障碍[8]。在人体中，为金属蛋白酶抑制物-3编码的TIMP3基因似乎被定位于染色体22。 
适应不良性左心室重塑通常与心肌梗塞患者及慢性心力衰竭患者的预后不良有关[39]。 
心肌梗塞后，成纤维细胞趋化到损伤部位，转化为心肌成纤维细胞。随后增殖增加和分化为肌成纤维 细胞，并形成颗粒状疤痕[3]。接着，出现心肌细胞外基质(ECM)的重塑，并最终导致成熟疤痕组织的形成，其中该组织由胶原蛋白、成纤维细胞、新生的毛细管和巨噬细胞组成[4,31]。TIMP-3是一种心脏成纤维细胞增殖的有效诱导物[23]。此外，最近一项研究表明，TIMP-3-/-小鼠心肌梗塞后，心包出血(心脏破裂的迹象)的发病率增加[32]，暗示TIMP-3在梗塞疤痕愈合方面的潜在作用。 
心肌梗塞后的早期适应有益处并可提高生存率，然而，会伴有不良的长期血流动力学后果。在出现梗塞后的2年内，左心室出现长期进行性重塑，心室腔的大小增加，这可能与心血管病死率的增加有关，而重塑的轻微减少则与心力衰竭和心血管病死率的减少有关[53]。 
再灌注治疗、纤维蛋白溶解疗法、经皮冠状动脉介入治疗以及目前可用的药物治疗，例如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、β-阻断剂和醛固酮拮抗剂等，已被证明在某种程度上能抑制急性心肌梗塞患者的心功能不全和不良的左心室（LV）重塑。根据目前欧洲的治疗指导方针，建议在心肌梗塞后的早期施用ACEI和β-阻断剂[53]。尽管采用上述治疗方法，仍然观察到有相当大比例的患者出现适应不良性左心室重塑[39]。此外，大部分用于预防心肌梗塞后左心室重塑的药物会影响心肌梗塞愈合和胶原蛋白合成。因此，对于心肌梗塞后愈合过程中的不良左心室重塑，ACEI、ARBs和醛固酮拮抗剂等药物可能会延长心脏的“易损期”(time window of vulnerability)[53]。 
因此，仍然需要能够和现有疗法协同作用的新方法和新化合物，以预防或最大限度减少不良心脏重塑的“易损期”。 
因此，这就需要研发有效的化合物和治疗方法，用于抑制适应不良性心脏重塑、心脏破裂和其它与心脏病有关的疾病、症状、并发症和/或失调。 
最近的研究表明，通过抑制心脏内的基质金属蛋白酶(MMP)活性，TIMP-3可抑制表皮生长因子(EGF)/表皮生长因子受体(EGFR)的信号传导[15]。研究表明，EGF可抑制胶原蛋白合成[6,18,19]和TGF-β1[36]表达，其中TGF-β1是一种有效的胶原蛋白合成诱导剂[3,20,21]。 
研究表明，EGFR的激活有助于在急性心肌梗塞期间抑制胶原蛋白合成，这对心肌梗塞早期的梗塞疤痕愈合非常关键。到目前为止，在心肌梗塞的治疗方面，尚未有针对EGFR功能的方法或药物。 
发明内容
本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂的用途及其用于治疗心脏病的方法和组合物。本发明亦涉及用于预防或最大限度改善与心脏病有关的并发症的方法和组合物。 
因而，在本发明的一个实施例中，本发明提供一种用于治疗心脏病的药物组合物,该组合物包括EGFR拮抗剂和药学上可接受的载体。 
在本发明的另一个实施例中，本发明涉及一种用于促进疤痕愈合的药物组合物，该药物组合物包括 EGFR拮抗剂和药学上可接受的载体。 
在本发明的另一个实施例中，本发明提供一种使用EGFR拮抗剂治疗心脏病的用途。 
根据本发明的另一个实施例，本发明提供了一种EGFR拮抗剂协同至少一种其它心脏病疗法来治疗心脏病的用途。 
在本发明的另一个实施例中，本发明提供一种利用EGFR拮抗剂制备药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗心脏病。 
在本发明的另一个实施例中，本发明涉及一种治疗心脏病的方法，包括对患者施用EGFR拮抗剂。 
根据本发明的另一个实施例，本发明提供一种治疗心脏病的方法，该方法包括对患者施用EGFR拮抗剂并协同至少一种其它心脏病疗法。 
根据本发明的各个方面，所述至少一种其它心脏病疗法包括：小分子药物、补体抑制剂、β-阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、醛固酮拮抗剂、溶血栓疗法、机械性心脏再灌注、或其任何组合。 
根据本发明的各个方面，所述心脏病包括：急性心肌梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、收缩性或舒张性心力衰竭、高血压或糖尿病引起的心力衰竭、心肌病、缺血性心肌病或肥厚型心肌病。 
根据本发明的各个方面，所述心脏病是心肌梗塞，而且所述EGFR拮抗剂是施用于患有心肌梗塞的患者。 
根据本发明的各个方面，所述心脏病的治疗包括：治疗、预防或最大限度地改善与心脏病有关的并发症。与心脏病有关的并发症包括：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑和心脏破裂。 
根据本发明的各个方面，采用本发明之组合物和方法进行治疗的患者缺乏基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)。根据本发明的各个方面，所述TIMP为TIMP3。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、卡奈替尼(canertinib)、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是选自：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是选自：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗 (panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是通过注射的方法施用于患者。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是通过脂质体给药的方法施用于患者。 
根据本发明的各个方面，所述EGFR拮抗剂是通过植入式给药装置施用于患者，其中该装置具有EGFR拮抗剂缓释能力。 
附图说明
在阅读完下列描述及附图之后，所属领域的技术人员将对本发明的各个方面和目的有清晰的认识。其中： 
图1包括3个线图(图A、C和D)和一个照片(图B)，表示野生型(WT)和TIMP-3-/-小鼠在患有心肌梗塞(MI)之后的存活率和心脏破裂情况。其中，图A说明了患有心肌梗塞的野生型和TIMP-3-/-小鼠在分别采用和没有采用EGFR拮抗剂西妥昔单抗治疗的情况下的Kaplan-Meier生存曲线。与患有心肌梗塞的野生型小鼠相比，TIMP-3-/-小鼠的30天存活率和心肌梗塞被明显降低(*P<0.001)，这种缓解得益于西妥昔单抗(cetuximab)的使用(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000041
P<0.01)。图B分别说明了野生型小鼠左心室壁的典型示例，以及TIMP-3-/-小鼠左心室壁出现心脏破裂的情况(箭头部位)(苏木及伊红染色)。图C说明了在心肌梗塞后分别采用和不采用西妥昔单抗(cetuximab)进行治疗的情况下的心脏破裂发病率。柱状栏内数字表示破裂/总小鼠数量。图D表示测定诱导梗塞疤痕破裂所需的压力。在出现心肌梗塞5天后，梗塞疤痕被隔离并被用于拉伸实验(n=10-11每组)。误差线为±SEM;*P<0.05,**P<0.001vs.野生型。 
图2包括图A和图B，分别表示野生型(WT)和TIMP-3-/-小鼠中MMP活性和胶原蛋白含量的评价。其中，图A表示在出现心肌梗塞2天后采用荧光分析对梗塞周围的部分进行分析。图B表示在出现心肌梗塞5天后采用羟脯氨酸测定法对梗塞部分进行分析。数据为平均数±标准差。N=4-6个小鼠/组。*P<0.01vs.相同基因型的相应假手术组,
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000042
P<0.01vs.野生型心肌梗塞。 
图3包括图A、B、C、D和E，分别表示野生型(WT)和TIMP-3-/-小鼠在患有心肌梗塞5天后的假手术组左心室组织和梗塞部位的胶原蛋白含量、EGF和TGF-β1表达水平。其中，图A和B说明了通过实时荧光定量PCR技术测定的胶原蛋白I(图A)和III(图B)表达水平。图C说明了通过N端肽(PINP)ELISA试剂盒测定的胶原蛋白I合成水平。图D说明了通过ELISA试剂盒测定的EGF表达水平。图E说明了通过实时荧光定量PCR技术测定的TGF-β1表达水平。数据为平均数±标准差。N=4-6个小鼠/组。*P<0.01vs. 相同基因型的相应假手术组,P<0.01vs.野生型心肌梗塞。 
图4包括线图A、B、C和D，分别表示EGF对成年心脏肌成纤维细胞中胶原蛋白合成和TGF-β1表达水平的影响。其中，图A和B说明了通过实时荧光定量PCR技术测定的胶原蛋白I(图A)和III(图B)的表达水平。图C说明了通过PINP ELISA试剂盒测定的胶原蛋白I合成的水平。图D说明了通过实时荧光定量PCR技术测定的TGF-β1表达水平。5-7个独立实验所获得的数据为平均数±标准差。*P<0.05,**P<0.01vs.相同基因型的相应假手术组;
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000052
P<0.05,P<0.01vs.相应野生型。 
图5包括图A、B和C，分别表示TGF-β1对成年心脏肌成纤维细胞中胶原蛋白合成的影响。对经过2代培养的野生型和TIMP-3-/-成年心脏肌成纤维细胞施用1毫微克/毫升或10毫微克/毫升的人重组体TGF-β1，时间为48小时，然后通过实时荧光定量PCR技术分析胶原蛋白I(图A)和III(图B)的信使核糖核酸(mRNA)水平；胶原蛋白I合成则通过PINP ELISA试剂盒进行测定(图C)。数据来自3-6个独立实验，以平均数±标准差表示。*P<0.05,**P<0.01vs.相同基因型的相应假手术组;
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000054
P<0.05, 
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000055
P<0.01vs.相应野生型。 
图6包括图A、B、C和D，分别表示成年心脏肌成纤维细胞的体内和体外增殖。其中，图A说明了野生型(WT)和TIMP-3-/-小鼠在患有心肌梗塞5天后通过FSP-1染色(白色箭头)测定的(肌)成纤维细胞在梗塞心肌部位的增殖情况。图B表示在图A的每张图片中，(肌)成纤维细胞/平方毫米(n=6个/组)的总数。图C表示成年野生型和TIMP-3-/-小鼠培养所获得的Ki67阳性心脏肌成纤维细胞。图D表示在接种24小时和48小时后采用NucleoCounter细胞计数仪测定的肌成纤维细胞增殖情况。数据为平均数±标准差。在图C和D中，N分别=4个和3个独立实验。*P<0.05,**P<0.01vs.野生型(图A和C)或相同基因型的相应24小时(图D);
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000056
P<0.01vs.野生型48小时(图D)。 
详细说明 
定义 
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有所属领域的技术人员所共知的含义。并且，除非另有说明，“或”一词表示“和”和“或”，权利要求书部分除外。除非另有明确说明或上下文另外明确指出，非限制性词语不得被理解为限制性词语(例如，“含有”、“具有”和“包括”典型地表示“包括但不限于”)。在权利要求书中，单数形式(例如“一”、“一个”和“该”)包括相应复数形式的意思，除非另有明确说明。 
在本文中，“反义寡核苷酸”表示与其靶基因互补的核苷酸序列。 
“EGFR拮抗剂”表示能够抑制、消除或终止至少一种表皮生长因子受体-介导的生物活性的任何分子，例如减少、干扰、中断或预防天然或活性EFGR配位体(例如EFG)与EGFR的相互作用或绑定。 
“心脏病”包括：急性心肌梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、收缩性或舒张性心力衰竭、高血压或糖尿病引起的心力衰竭、心肌病、缺血性心肌病或肥厚型心肌病。 
“患者”或“有需要的患者”指的是患有或可能患有心肌梗塞的人或非人类哺乳动物。 
“治疗”指的是扭转、最大限度地减少、减轻、大致上抑制或预防某疾病的进展或该疾病的一种或多种症状。 
治疗方法和用途
本发明涉及表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂在治疗心脏病方面的方法、组合物和用途。 
因而，在本发明的一个实施例中，本发明提供一种治疗心脏病的方法，该方法可包括治疗、预防或最大限度改善与心脏病有关的并发症。该方法可包括对患者施用EGFR拮抗剂。采用该EGFR拮抗剂进行治疗，可抑制或大致上抑制EGFR信号传导级联，从而治疗该患者的心脏病。通过本发明之方法和组合物可治疗、预防或最大限度改善的与心脏病有关的并发症包括：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑和心脏破裂。 
本发明人惊喜地发现，EGFR拮抗剂可降低心脏破裂发病率和提高存活率，表明EGFR在急性心肌梗塞期间可作为一种新型的治疗靶。本发明人首次证明，EGFR拮抗剂能够降低心脏破裂发病率和提高心肌梗塞后的存活率。 
在本发明的一个实施例中，EGFR的抑制功能可协同现有疗法来降低心脏病(例如急性心肌梗塞)患者的发病率和死亡率。例如，人类研究表明，溶血栓疗法用于治疗心肌梗塞时，虽然可以降低总体的死亡率，但是该疗法可能与心脏破裂有关，可能会在实施溶血栓疗法后的24-48小时内导致6.1%-12.1%的死亡率[1]。因此，在本发明的一个实施例中，本发明提供一种治疗心脏病的方法，该方法可包括对患者施用EGFR拮抗剂并协同至少一种其它心脏病疗法。通过EGFR拮抗剂与至少一种其它心脏病疗法的协同作用，可提高心脏病疗法的效率。例如，对于心肌梗塞，亦可患者实施心肌梗塞疗法，例如小分子药物、补体抑制剂、β-阻断剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂(ARBs)、醛固酮拮抗剂、溶血栓疗法、机械性心脏再灌注、或其任何组合。 
本发明人进一步发现，不良的疤痕愈合(例如，心脏的适应不良性重塑)可能会增加心肌梗塞后的心脏破裂发病率。因此，本发明亦涉及一种治疗方法，该方法可预防或最大限度改善适应不良性心脏重塑。该方法可包括对患者施用有效量的EGFR拮抗剂。 
本发明人发现，EGF可减少心脏肌成纤维细胞内的胶原蛋白合成(如图4)，而TGF-B1则可激活胶原蛋白合成(如图5)。因此，本发明亦涉及一种增加胶原蛋白合成为肌成纤维细胞的方法。 
EGFR拮抗剂
在本发明的一个实施例中，可用于本发明的EGFR拮抗剂包括EGFR配位体的变体。EGFR配位体的变体可能是表皮生长因子的多肽变体，可抑制至少一种EGFR介导的生物活性，例如抑制受体的激酶的激活活性。这些多肽变体以及编码这些多肽变体的核酸，可用于抑制EGFR活性(见美国第7,470,769号专利的实施例)。 
在本发明的一个实施例中，所述EGFR拮抗剂可以是一种低分子量拮抗剂。例如，可用于本发明之方法和组合物的低分子量EGFR拮抗剂包括厄洛替尼(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000071
)和吉非替尼(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000072
)。其它EGFR拮抗剂可包括以下EGFR抑制剂：CI-1033(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000073
)(同物异名PD-183805)、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。 
在本发明的另一个实施例中，所述EGFR拮抗剂可包括抗EGFR配位体的抗体，其中该抗体可影响该配位体绑定到EGFR。在本发明的另一个实施例中，所述EGFR拮抗剂可包括抗EGFR的抗体，以影响EGFR介导的生物活性。例如，可用于本发明之方法和组合物的抗体包括：西妥昔单抗(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000074
),帕尼单抗(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000075
),贝伐单抗(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000076
),扎鲁木单抗(HuMax-EGFr),尼妥珠单抗(亦称BIOMab EGFR、Theracim,Theraloc或CIMAher)和马妥珠单抗(旧称EMD7000)等抗体。 
可通过对宿主动物(例如猪、牛、马、兔子、山羊、绵羊和老鼠等)施用抗原或抗原决定基的方法来培养抗EGFR抗体(或抗EGFR-配位体抗体)。可采用现有技术中已知的各种辅助剂来提高抗体的生产。尽管用于本发明的抗体可以是多克隆抗体，然后优选为单克隆抗体。任何采用传代细胞系来制备抗体分子的技术，皆可用于制备和分离出抗EGFR(或EGFR配位体)的单克隆抗体。所述制备和分离方法包括引用[40]所描述的杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(Cote等人,1983)以及EBV-杂交瘤技术[41]。另外，单链抗体的生产技术(例如，见美国第4,946,778号专利)亦适用于生产抗EGFR，或抗配位体单链抗体。可用于本发明的EGFR拮抗剂亦包括抗EGFR或抗配位体抗体片段，包括但不限于：通过完整抗体分子的胃蛋白酶消化来形成的F(ab′)2片段，以及通过减少F(ab′)2片段的二硫桥键来形成的Fab片段。此外，可通过构建Fab和/或scFv表达文库，来快速鉴别对EGFR或EGFR配位体具有特异性的片段。 
通常，具有蛋白质表达活性的细胞可直接培养，或从组织及细胞提取物中分离。含有EGFR的提取物或重组体蛋白提取物和弗氏佐剂混合，再注射到小鼠中。经过一周内9次注射后，去除小鼠的脾，然后悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。脾细胞充当了淋巴细胞的来源，其中部分淋巴细胞产生出具有所需特异性的抗体。然后它们与永久性生长的骨髓瘤伴侣细胞融合，再将融合的产品移入具有选择培养基(例如HAT)的多个组织培养孔。然后，进行筛选，以通过ELISA试剂盒识别出含有所需抗体的细胞。将新鲜的细胞铺到培养板上。经过一段时间的生长，再次筛选，以识别出可产生抗体的细胞。可进行若干个克隆程序，直至90％以上的培养孔含有适合进行抗体制备的单克隆。通过这样的程序可建立制备抗体的稳定克隆系。然后， 使用蛋白A或蛋白G琼脂糖，通过亲合色谱法对所获得的单克隆抗体进行纯化。 
西妥昔单抗(cetuximab)作为一种IgG1嵌合的单克隆抗体，以及帕尼单抗(panitumumab)作为一种完全人源化IgG2抗体，皆为EGFR-靶向单克隆抗体。西妥昔单抗和帕尼单抗目前皆用于转移性结直肠癌的二线或三线化学疗法。 
其它靶向EGFR的抗体包括：扎鲁木单抗(HuMax-EGFr)，一种完全人源化IgG1单克隆抗体(mAb)；尼妥珠单抗(BIOMAb EGFR,印度百康[2])；人源化单克隆抗体Theracim(古巴YM Biosciences公司)；Theraloc(欧洲Oncosciences公司)；CIMAher(古巴)，一种嵌合的单克隆抗体；以及马妥珠单抗(旧称EMD72000)，一种人源化单克隆抗体。 
在本发明的一个实施例中，所述EGFR拮抗剂可以是小干扰核糖核酸(siRNA)、核酶或反义寡核苷酸。 
反义寡核苷酸，包括与EGFR蛋白基因之核酸序列互补的反义RNA分子和反义DNA分子，可用于本发明的方法，以阻止EGFR mRNA的转译和抑制EGFR蛋白合成，或增加mRNA降解，从而降低EGFR蛋白水平以及在细胞中的活性。 
因此，本发明提供一种抑制EGFR效果的方法，该方法包括对有需要的动物施用有效量的反义寡核苷酸(反义寡核苷酸与EGFR蛋白基因的核酸序列互补)。 
通过化学合成和酶促连接反应，使用本领域中已知的方法，可构造出反义核酸分子。本发明中的反义核酸分子或其片段可采用天然存在的核苷酸或各种改性的核苷酸进行化学合成，以提高该分子的生物稳定性或增加双链体的物理稳定性，其中该双链体由mRNA或天然基因例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸形成。利用以重组质粒、噬菌粒或减弱病毒的形式导入细胞的表达载体，可通过生物方法制备反义序列，其中所述反义序列是在一个高效调节区的控制下制备的，其活性可通过被导入表达载体的细胞的类型来测定。 
小干扰核糖核酸(siRNA)是一种由双链RNA(dsRNA)触发的基因沉默。动植物中的siRNA序列特异性转录后基因沉默可能由双链RNA(dsRNA)引起，其中该双链RNA在序列上与被沉默的基因同源。小干扰核糖核酸(siRNA)是用于靶向和降解所需的mRNA(在这种情况下编码EGFR mRNA)，为了不表达所编码的蛋白质(即EGFR)。采用小干扰核糖核酸(siRNA)(或RNA干扰)来沉默秀丽线虫、果蝇、植物或哺乳动物的基因，属于所属领域已知的技术[42-52,WO0129058；WO9932619，其公开的内容全部并入本文中]。 
核酶亦可充当EGFR表达的抑制剂而用于本发明。核酶是酶RNA分子，能够催化RNA的特异性裂解。核酶的作用机制涉及核酶分子与互补的靶RNA的序列特异性杂交，然后是内切核苷酸裂解。基因工程发夹状或锤头状核酶分子可有效催化EGFR mRNA序列的内切核苷酸裂解，因而在本发明的范围内有用。在任何潜在RNA靶内的特异性核酶裂解位点最初是通过扫描靶分子来确定，一般包括以下序列：GUA、GuU和GUC。 一旦确定，即可评价15-20个核糖核苷酸分子(与含有裂解位点的靶基因的区域相对应)的短RNA序列是否符合预测的结构特征，例如二级结构(可呈现不适合的寡核苷酸序列)。对于候选靶的适用性，可通过测试其与互补寡核苷酸的杂交容易度来评价，例如采用核糖核酸酶保护实验。 
组合物
在本发明的一个实施例中，本发明提供一种治疗心脏病的组合物，其中该组合物可包括EGFR拮抗剂和药学上可接受的载体。根据本发明的各个方面，该组合物亦可用于治疗、预防或最大限度改善与心脏病有关的并发症。 
本发明人已识别出独特的组合物和方法，可用于抑制EGFR的信号传导。因而，本发明提供一种减少或抑制内源性EGFR活性的方法，从而最大限度地改善心脏肥大和适应不良性心脏重塑，以及缓解或抑制心脏破裂或其它与心脏病例如心肌梗塞有关的并发症、疾病或失调。 
在本发明的一个实施例中，本发明提供含有EGFR拮抗剂的药物组合物，以生物相容的形式施用于患者体内。“以生物相容的形式施用于患者体内”是指所施用的物质的治疗效果超过其任何毒副作用。在本发明中，对患者施用所述药物组合物的有效量，指的是施用量在一定时间内足以获得在人体内诱发免疫反应的期待效果。某物质的治疗有效量可取决于各种因素，例如受体的病状/健康、年龄、性别和体重，以及引起所需免疫反应的特殊多肽、核酸或重组病毒的固有能力。可对剂量方案进行调整，以获得最佳的治疗效果。例如，可每天或定期施用几个分开的剂量，和/或根据病情需要按比例地减少剂量。EGFR拮抗剂给药的量将依赖于EGFR拮抗剂，给药途径，给药时间和根据个体对象响应变化的性质。合适的给药途径可以是肌内注射，皮下注射，静脉内注射或腹膜内注射，口服和鼻内给药。在一个优选的实施例中，给药途径可以是静脉内注射。EGFR拮抗剂的用量将取决于EGFR拮抗剂的性质、给药途径、给药时间和患者的反应情况。给药途径可以是肌肉注射、皮下注射、静脉注射、腹膜内注射、口服或经鼻给药。在本发明的一个优选实施例中，采用静脉注射的给药途径。 
因而，在本发明的一个实施例中，本发明的EGFR拮抗剂可通过注射的方法施用。在本发明的另一个实施例中，本发明的EGFR拮抗剂可以生理盐水的形式进行静脉注射。在本发明的另一个实施例中，本发明的EGFR拮抗剂可通过脂质体给药的方法施用。在本发明的另一个实施例中，本发明的EGFR拮抗剂可通过植入式给药装置施用于患者，其中该装置具有EGFR拮抗剂缓释能力。例如，美国第20050208122号发明专利申请(通过引用方式并入本文)公开了一种生物可降解、生物相容的植入物，具有缓释有效治疗物质的能力，该植入物可用于施用本发明各实施例的EGFR拮抗剂。 
本文所描述的组合物可采用本身已知的方法进行制备，以便将有效量的活性物质(EGFR拮抗剂)与药学上可接受的载体混合，获得药学上可接受的组合物。合适的载体可参考《药品添加剂手册》(Handbook of  Pharmaceutical Additives.编辑:Michael和Irene Ash;高尔出版公司,英国奥尔德肖特(1995))。在此基础上，该组合物包括但不限于：将有效物质与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂结合而得的溶液，也可以包含在具有合适pH值和/或与生理性液体等渗的缓冲溶液中。这方面可参考美国第5,843,456号专利。 
药学上可接受的载体是所属领域的技术人员所共知的，例如：无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。 
此外，根据本发明的药物组合物可包括一种或多种稳定剂，例如含有山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖的碳水化合物、白蛋白或酪蛋白等蛋白质，以及碱性磷酸盐等缓冲液。 
本发明的一个主要优点在于预防心脏病患者的心力衰竭。本发明的一个优点包括在出现心肌梗塞后促进疤痕愈，从而预防心力衰竭。通过EGFR拮抗剂的功能和信号传导，可促进疤痕愈合，这是一种新型的心肌梗塞治疗靶。因而，在本发明的一个实施例中，本发明涉及药物组合物，该组合物含有用于促进疤痕愈合的EGFR拮抗剂。 
以上描述是本发明的一般性描述。参照以下具体实施例，可对本发明获得更完整的理解。这些实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代。虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。 
实施例
以下实施例意在描述本发明，而不是为了限制本发明的范围。 
实施例1 
本研究的目的是验证以下假设：TIMP-3通过表皮生长因子(EGF)/表皮生长因子受体(EGFR)信号传导增加心肌梗塞后的心脏破裂发病率，其中该信号传导下调了TGF-β1表达水平和胶原蛋白合成；采用西妥昔单抗(cetuximab)来抑制EGFR信号传导，从而预防心肌梗塞后出现心脏破裂。利用临床相关的小鼠心肌梗塞模型、细胞和分子技术，我们的研究表明，在EGF/EGFR信号传导下，患有心肌梗塞的TIMP-3-/-小鼠的心脏破裂发病率升高，其中EGF/EGFR信号传导下调了心肌梗塞位置的TGF-β1表达和胶原蛋白合成。采用西妥昔单抗(cetuximab)进行治疗，降低了心脏破裂发病率并提高了患有心肌梗塞的TIMP-3-/-小鼠的存活率。 
材料和方法 
动物 
具有C57BL/6遗传背景的野生型(WT)小鼠购自美国马萨诸塞州的查尔斯河实验室(Charles River  Laboratories)。TIMP3-/-小鼠的产生见参考文献[22]，并经过7代回交至C57BL/6背景。小鼠自由进食进水，并控制温度和湿度和保持12小时的光照和黑暗循环。通过育种获得本实验所需的成年动物。动物研究获得西安大略大学立实验动物使用与关爱委员会(University of Western Ontario Institutional Animal Care and Use Committee)的批准，并遵守美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》(NIH出版号：85-23，修订于1996年)。 
心肌梗塞 
心肌梗塞由左冠状动脉前降支的闭塞所致，见参考文献[10]。手术后5天或30天进行实验，分别模仿心脏衰竭的早期和晚期阶段。检测小鼠的存活率，并记录其心脏破裂发病率和左心室/体重比率。所有研究皆使用心肌梗塞面积为30-45％的小鼠。 
心脏破裂的评估 
死亡的小鼠在12小时内进行检查。打开胸腔，检查梗死区周围的出血情况。然后摘除心脏，用一个20G钝端IV导管经大动脉插入左心室并灌注200μL生理盐水，以确定是否梗死区域存在泄漏。通过组织学检查，确认心脏破裂的区域。简言之，在心肌梗塞死亡后，将野生型和TIMP-3-/-小鼠的心脏分离，并用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋。样品然后切片(5微米)，用苏木素/伊红染色，并使用蔡司显微镜(D1)进行观察，如我们之前的研究[11]。 
MMP活性 
根据厂家的使用说明，采用Sensolyte520通用MMP检测试剂盒(AnaSpec,CA)测定基质金属蛋白酶(MMP)活性。简言之，术后第2天，分别对假手术组的左心室组织和心肌梗塞周围的组织进行采样，然后均质，在用FAM/QXL520FRET底物在黑色96孔板中黑暗室温培养1小时。采用SpectraMax M5酶标仪，分别在490nm激发波长和520nm发射波长的条件下测量。利用5-FAM-Pro-Leu-OH将荧光值转化成被裂解的底物量，从而建立标准曲线。值表示为：皮摩尔裂解的底物/毫克蛋白。 
脯氨酸含量 
术后第5天，分别分离出假手术组的左心室组织和心肌梗塞部位的组织，干燥过夜，第二天早上称重和水解。脯氨酸浓度采用比色法测定，如Woessner[34]所描述，本研究稍作修改。利用L-脯氨酸将样品的比色值转化为脯氨酸的毫克，从而建立标准曲线。值表示为：毫克脯氨酸/每克干重。 
EGF水平的测定 
术后第5天，用PBS缓冲液分别对假手术组的左心室组织和小鼠心肌梗塞部位的组织进行均质，然后离心。收集上清液，并测定蛋白质浓度。根据厂家的指示，使用小鼠EGF Quantikine ELISA试剂盒(R＆D系统，MN)测定左心室的EGF蛋白水平。值表示为：皮克EGF/每毫克心肌组织。 
拉伸实验 
假手术和心肌梗塞手术后第5天，分离出左心室游离壁和心肌梗塞部位。切成2x5毫米的切片，一端连接到测力传感器，另一端连接到显微操作器。然后，增加对组织的拉伸力，并记录发生破裂时的力值。利用在蔡司显微镜下测定的组织尺寸，调整导致疤痕破裂的临界力值。 
成年心脏肌成纤维细胞的分离和培养 
采用野生型和TIMP-3-/-小鼠的心室制备心脏肌成纤维细胞培养物，见参考文献[14]。简单地说，无菌分离出成年小鼠的心脏。将心室切碎并用胶原酶和分散酶消化。将二代培养的成纤维细胞接种到培养板上，用于所有体外实验。第2代后，几乎所有的成纤维细胞分化为肌纤维母细胞[33]。通过FSP-1和α-平滑肌肌动蛋白双重染色法，验证肌成纤维细胞的纯度。通过Ki67和FSP-1双重染色法，评估细胞增殖的情况。 
为测定EGF和TGF-β1对胶原蛋白表达和合成的影响，对成年心脏肌成纤维细胞进行2代培养，然后置于低血清（5％FBS）24小时，随后在含有5%FBS的DMEM培养基中用重组体小鼠EGF(rEGF,加州R&D Applied Biosystems公司)处理并继续培养24小时，或者用TGF-β1(麻省Millipore公司)处理并继续培养48小时。然后收获细胞，并进行了实验。 
肌成纤维细胞的增殖 
利用成纤维细胞-特异性蛋白(FSP)-1对野生型和TIMP-3-/-小鼠心肌梗塞第5天的心脏组织切片进行免疫染色，从而测定体内(肌)成纤维细胞增殖。记录每平方毫米的FSP-1阳性细胞数量。通过两位独立的观察员得出细胞计数。 
胶原蛋白I的合成 
根据厂家的说明，采用大鼠/小鼠原胶原I N-端肽(PINP)ELISA试剂盒(IDS-MEDICORP，魁北克)，评价左心室以及为肌成纤维细胞收集的条件培养基中的胶原蛋白I合成。野生型和TIMP-3-/-小鼠心肌梗塞后的第五天，用PBS溶液对假手术组小鼠的左心室组织和梗塞部位的组织进行均质，然后离心。收集上清液，测定蛋白质浓度。对于组织，采用25μg的总蛋白；对于培养基，10μL的条件培养基用于试验。使用酶标仪M5酶标仪，测定波长为450nm的吸光度。值表示为：微毫克胶原蛋白/每毫克心肌组织，或微毫克胶原蛋白/每毫升条件培养基。 
实时RT-PCR 
利用Trizol试剂，从年培养的肌成纤维细胞、野生型和TIMP-3-/-小鼠假手术组的左心室组织以及心肌梗塞小鼠术后5天的梗塞部位提取总RNA，见参考文献[26,27]。使用M-MLV逆转录酶(Invitrogen公司)进行cDNA的合成。按照厂家的说明，利用加拿大ABM公司(Applied Biological Materials)的SYBR 绿色荧光标记产品进行实时定量PCR实验。28S rRNA基因(看家基因)作为加载控制，因为先前的研究已经表明，它是一种可靠的负荷控制，特别适用于缺氧[37]和心肌梗死[13]实验。 
血流动力学测定 
心肌梗塞后的第5和30天，采用米勒压力传感器导管(型号：SPR-839；尺寸1.4F)测定心脏功能，见参考文献[24]。测量包括动脉压、心率、左心室收缩和舒张末期压力、左心室压力上升(+dP/dt)的最大速率以及压力下降(-dP/dt)的最大速率。血流动力学测定和通过心重(毫克)/体重(克)比率来测定心脏肥大之后，将动物处死。 
采用西妥昔单抗(cetuximab)进行治疗 
心肌梗塞后，立即对野生型和TIMP-3-/-小鼠静脉注射西妥昔单抗(
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000131
,10毫克/千克)，然后分别在心肌梗塞后的第3天和第5天执行腹膜内注射。在心肌梗塞后的30天内，监测存活率。在心肌梗塞后的第5天和第30天，进行血流动力学测定。对死于心肌梗塞的所有小鼠执行尸检，以确定心脏破裂的情况。 
统计分析 
数据表示为：平均数±标准差。根据需要，采用未配对学生T-检验、卡方、一向或双向变量分析，然后进行事后邦费罗尼测试。P<0.05为差异有统计学意义。 
结果 
心肌梗塞后的存活率和心脏功能 
野生型(n=74)和TIMP-3-/-(n=81)小鼠进行心肌梗塞手术或假手术，然后在术后30天监测存活率。与假手术组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠组中心肌梗塞导致存活率明显降低(P<0.05,图1A)。另外，与野生型小鼠组相比，TIMP-3-/-小鼠组的心肌梗塞存活率明显降低，(P<0.001,图1A)。野生型和TIMP-3-/-小鼠的梗塞面积在心肌梗塞后的第5天(38.6±2.9%vs.38.3±3.3%)或第30天(37.9±2.0%vs.41.3±3.3%)没有明显的差异。为了确定TIMP-3-/-小鼠组的存活率降低是否由于心功能不全所致，在心肌梗塞后的第5天和第30天进行血液动力学分析。为此，我们利用米勒尖端压力换能导管测定了心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压力(LVEDP)以及左心室压力的最大正向和最小负向一阶导数(+dP/dtmax和–dP/dtmin)。我们的数据表明，野生型和TIMP-3-/-小鼠组之间在假手术或心肌梗塞手术后的任何参数上没有显著性差异(P=n.s.,见表1)。另外，在心肌梗塞后的第30天，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在心脏肥大(通过心/体重比率测定)方面没有显著性差异(3.6±0.19vs.3.4±0.21毫克/克,P=n.s.)。这些数据表明，TIMP-3-/-小鼠组中的死亡率升高不是由于心功能不全所致。 
心肌梗塞后的心脏破裂 
为确定心肌梗塞后导致TIMP-3-/-小鼠组死亡率升高的可能原因，进行了尸体剖检。组织学检查证实，除了梗塞部位的出血和灌注泄漏迹象，在两组中都发现左心室游离壁位置的心脏破裂。图1B(箭头部位)说明了梗塞破裂的一个典型示例。与野生型小鼠组比较，TIMP-3缺陷导致心肌梗塞后的心脏破裂发病率增加四倍(P<0.001,图1C)。为确定诱导梗塞疤痕破裂所需的力，进行了拉伸实验。我们的研究结果表明，TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后诱导疤痕破裂所需的力明显低于野生型小鼠组(P<0.05,图1D)。假手术后，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在诱导破裂所需的力方面无显著性差异(15.7±1.9vs.16.4±2.5克,P=n.s.)。 
西妥昔单抗(cetuximab)对心脏破裂、功能和存活率的影响 
在心肌梗塞后即时施用西妥昔单抗(10毫克/千克)以及在第3天和第5天施用西妥昔单抗，可显著地降低TIMP-3-/-小鼠的心脏破裂发病率(12%vs.34%,P<0.05,见图1C)。在心肌梗塞后的第5天，心脏功能无显著性差异，但是在心肌梗塞后的第30天施用西妥昔单抗后，TIMP-3-/-小鼠的LVSP和LV+dP/dt明显地增加，表明显著的心脏收缩功能改善。另外，西妥昔单抗的使用显著地提高了TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后30天内的存活率(62.5%vs.22.7%,P<0.01,见图1A)。然而，然而，西妥昔单抗治疗对野生型小鼠的心脏破裂、功能或存活率没有任何显著的效果(P=n.s.,表1,见图1A和C)。 
心肌梗塞后的ECM重塑、EGF和TGF-β1表达 
为确定TIMP-3-/-小鼠组的心脏破裂的潜在机制，我们测定了MMP活性和胶原蛋白含量。在心肌梗塞后的第2天，进行了MMP活性的测定，因为之前的研究表明MMP活性在心肌梗塞后不久便会出现升高[9]。在心肌梗塞后的第5天，测定了胶原蛋白含量，存活率曲线(图1A)显示这个时间点的死亡率是最高的。我们的研究结果表明，与假手术对照组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的MMP活性显著增加。此外，和野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组的MMP活性明显更高(P<0.01,见图2A)。和假手术组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的胶原蛋白含量(通过羟脯氨酸测定法测定)皆明显增加。然而，TIMP-3-/-小鼠组的梗塞部位的胶原蛋白含量明显低于野生型小鼠组(P<0.01,见图2B)。另外，通过实时荧光定量PCR技术测定的胶原蛋白表达水平表明，与假手术对照组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在梗塞部位的胶原蛋白I和III mRNA水平增加。然而，与野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组的胶原蛋白表达水平明显较低(P<0.01,见图3A和3B)。而且，由于胶原蛋白I是心脏的主要胶原蛋白异构体[3,9]，我们利用ELISA试剂盒测定了其合成水平，该试剂盒可分析胶原蛋白I N端肽(PINP)的水平。我们的研究数据显示，与假手术组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的胶原蛋白I合成皆获得明显提高；然而，TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的原蛋白I合成明显低于野生型小鼠组(P<0.01,图3C)。 
由于EGF抑制胶原蛋白的合成[18,19]和调节TGF-β1的表达[36]，其中TGF-β1是一种重要的胶原 蛋白生产诱导物[3,20,21]，而且由于我们最近证明TIMP-3可抑制心脏内的EGF信号传导[15]，因此我们野生型和TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的EGF和TGF-β1表达水平。我们的研究结果表明，与野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组的梗塞部位的EGF水平显著增加(P<0.05，见图3D)，而TGF-β1水平则显著下降(P<0.01,见图3E)。这些数据表明，TIMP-3可抑制EGF，但同时促TGF-1表达。此外，EGF水平与胶原蛋白和TGF-1表达呈负相关关系(图.3A-E)。 
EGF对成年心脏肌成纤维细胞中胶原蛋白合成和TGF-β1表达的影响 
为了进一步证明EGF对胶原蛋白和TGF-β1表达的负面影响，我们培养了成年心脏肌成纤维细胞，因为这些细胞提供了心脏的大部分胶原蛋白[3]。当采用1毫微克/毫升EGF(低浓度)处理成年心脏肌成纤维细胞时，对胶原蛋白I或III表达的影响不大。然而，当采用10毫微克/毫升的EGF(高浓度)进行处理时，皆导致野生型和TIMP-3-/-组的胶原蛋白I和III表达水平明显降低(P<0.01,见4A和4B)、胶原蛋白I合成明显减少(P<0.01,见图4C)以及TGF-β1表达水平降低(P<0.01,见图4D)。当与野生型比较时，TIMP-3-/-组分别表现出胶原蛋白I表达(47%vs38%)、胶原蛋白III表达(51%vs41%)、胶原蛋白I合成(39%vs28%)和TGF-β1表达(43%vs22%)的明显降低(P<0.01,见图4A-D)。这些数据表明，EGF抑制胶原蛋白I和III，以及心脏肌成纤维细胞中的TGF-β1表达。 
TGF-β1对成年心脏肌成纤维细胞中胶原蛋白合成的影响 
为证明TGF-β1和胶原蛋白合成之间的因果关系，我们采用了从野生型和TIMP-3-/-小鼠中培养获得的成年心脏肌成纤维细胞。当采用1毫微克/毫升的TGF-β1(低浓度)对成年心脏肌成纤维细胞进行处理后，胶原蛋白I和III表达水平显著增加(P<0.05,见图5A和B)。当采用10毫微克/毫升的TGF-β1(低浓度)进行处理后，胶原蛋白I表达水平和合成进一步增加(P<0.01,见图5A和C)，但是与对照组比较对胶原蛋白III无影响(P=n.s.,见图5B)。和野生型肌成纤维细胞比较，TIMP-3-/-组的TGF-1影响明显减少(P<0.01,见图5A-C)。这些结果表明，TGF-β1促进心脏肌成纤维细胞中的胶原蛋白合成。 
TIMP-3的缺乏减少了成年心脏肌成纤维细胞的增殖 
先前的研究已经表明，使用腺病毒结构的TIMP-3的过度表达导致心脏成纤维细胞的增殖增加[23]，我们希望确定TIMP-3-/-组中的胶原蛋白合成减少是否在某种程度上因为(肌)成纤维细胞增殖的减少。为此，在心肌梗塞后的第5天，我们采样成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1)对野生型和TIMP-3-/-小鼠的左心室组织切片进行免疫染色(图6A)，以成纤维细胞和肌成纤维细胞的核和细胞质表示[25]。我们的数据表明，与心肌梗塞后的野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组中的梗塞部位的(肌)成纤维细胞数量明显减少(P<0.01,见图6B)。为进一步研究TIMP-3对心脏肌成纤维细胞增殖的作用，我们分离出成年心脏肌成纤维细胞并进行2代培养。通过FSP-1的免疫染色(图未示)，该培养物纯度为99%。我们亦对α-平滑肌 肌动蛋白(图未示)进行了染色，其中α-平滑肌肌动蛋白是在肌成纤维细胞中而不是在成纤维细胞中表达的标记物。我们的研究结果表明，α-平滑肌肌动蛋白和FSP-1双重染色法证实几乎所有第2代细胞是肌成纤维细胞。这与以前的研究发现一致:大部分成纤维细胞在第2代培养中分化成肌成纤维细胞[33]。我们通过Ki67和FSP-1双重染色法(图未示)对肌成纤维细胞的增殖进行了评价，并且采用NucleoCounter细胞计数仪在接种后的第24小时和48小时测定细胞计数(图6D)。我们的数据表明，TIMP-3的缺乏导致心脏肌成纤维细胞的增殖明显减少(图6C和6D)。 
讨论 
心脏破裂是心肌梗塞后的一种致命并发症，但其分子机制尚未完全清楚[30]。本研究表明，TIMP-3的缺乏导致心肌梗塞后心脏破裂死亡率和发病率明显升高。另外，TIMP-3缺乏会提高EGF水平，减少肌成纤维细胞的增殖，并减少TGF-β1和胶原蛋白合成，从而减少了梗塞部位的总体胶原蛋白含量。重要的是，我们首次证明，西妥昔单抗(cetuximab)可降低心脏破裂发病率，改善TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的心脏功能和提高存活率。 
TIMP-3已被证明在心脏内起到非常重要的生理作用。即使没有施加压力，TIMP-3在老年小鼠(21-23月)中的缺乏仍触发进行性心肌重塑和功能障碍，其特征基质的降解、细胞因子的激活和心肌细胞凋亡和人类心力衰竭类似[7,8]。我们的数据表明，和野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的死亡率明显增加。TIMP-3-/-小鼠组中被观察到的死亡大部分发生在心肌梗塞后的第5天。为了确定心功能不全是否影响了TIMP-3-/-小鼠组的死亡率升高，我们在假手术和心肌梗塞手术后对野生型和TIMP-3-/-小鼠进行了血液动力学分析。重要的是，我们在研究中采用的所有小鼠的年龄为2-6个月，以尽量减少年龄对本研究的影响。我们的数据表明，在心肌梗塞后的第5天或第30天，野生型和TIMP-3-/-组在心脏功能方面没有显著性差异。另外，在心肌梗塞后的第30天，野生型和TIMP-3-/-组在心脏肥大方面没有显著性差异。因此，与Tian等人的研究结果[32]不同，我们的研究结果表明，TIMP-3-/-组的死亡率升高并非心功能不全所致。对于我们的研究结果和Tian等人的研究结果的不一致的原因，尚不完全清楚，但有可能是心肌梗塞模型的严重程度的不同所致。在我们的研究中，心肌梗塞面积为30-45％，而Tian等人[32]并未测量其研究中的梗塞面积。在我们的研究中，与野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组的存活率大约降低50%，然而在他们的研究中只降低大约20%，表明我们的心肌梗塞模型更为严重。因而，严重的心肌梗塞会导致两组中的心脏功能明显降低，从而难以判断野生型和TIMP-3-/-小鼠组之间的差异性。 
为了探明TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后死亡率升高的可能原因，我们进行了尸体剖检。组织学检查证实，心脏破裂是被认为是导致死亡的首要原因。接着，进行拉伸实验，以确定TIMP-3-/-小鼠的疤痕组织是否变弱。我们的研究结果表明，与野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后诱导疤痕破裂所需的 力明显较低。这些数据表明，TIMP-3-/-小鼠中出现不良的疤痕愈合。为了进一步研究TIMP-3-/-小鼠中导致疤痕组织变弱的潜在机制，我们进行了MMP活性和胶原蛋白含量的测定。结果表明，TIMP-3-/-小鼠组的MMP活性明显提高，而胶原蛋白含量则明显降低。这些结果与之前的研究结果一致：心肌梗塞后TIMP-3-/-心肌中胶原蛋白含量降低而MMP活性升高[32]。此外，胶原蛋白表达的测定结果显示，与假手术对照组比较，野生型和TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的胶原蛋白I和III含量增加。我们在研究中特别发现，TIMP-3-/-小鼠组的胶原蛋白表达和合成水平明显低于相应的野生型小鼠组。因而，通过测定脯氨酸含量来评估胶原蛋白含量的降低不仅仅是由于我们之前认为的基质降解的增加，而且是由于胶原蛋白合成的减少。 
最近，我们证明TIMP-3可抑制心脏中的EGF/EGFR信号传导[15]。EGF已被证明能够调节TGF-β1的表达水平，其中TGF-β1是一些胶原蛋白的主要诱导物[5,36]。然而，EGF对心脏中的TGF-β1表达和胶原蛋白合成的影响尚未有报道。因此，我们测量了心肌梗塞心肌中的EGF和TGF-β1水平。我们的研究结果表明，与野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-小鼠组在心肌梗塞后的心肌EGF水平明显升高，而TGF-β1水平则明显减少。为了进一步研究EGF和TGF-β1对胶原蛋白表达的影响，我们培养了成年心脏肌成纤维细胞，并采用重组体EGF或TGF-β1进行处理。我们的数据表明，用重组体EGF处理对心脏肌成纤维细胞中的胶原蛋白合成和TGF-β1表达具有显著的抑制作用，而对胶原蛋白合成的相反效果则在TGF-β1处理后进行观察。 
TIMP-3已被证明能促进肌成纤维细胞增殖[23,35]，其中肌成纤维细胞是心脏中胶原蛋白的主要制造者[3]。在本研究中，我们希望确定胶原蛋白合成的减少是否可以在某种程度上用TIMP-3-/-小鼠中肌成纤维细胞增殖的减少来解释。我们的结果表明，和野生型小鼠组比较，TIMP-3-/-组在心肌梗塞后的肌成纤维细胞数量明显减少。此外，对TIMP-3-/-小鼠的成年心脏肌成纤维细胞的原始培养亦验证了增殖的减少。综合考虑，我们的数据表明，TIMP-3的缺乏通过EGFR的信号传导减少了心肌梗塞部位的心脏肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成。 
为了进一步研究EGFR信号传导对心肌梗塞后愈合的影响，我们采用了西妥昔单抗(cetuximab)，一种抗EGFR的嵌合单克隆抗体。采用西妥昔单抗进行治疗后，降低了心脏破裂发病率，并且显著地改善了TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的心脏功能和存活率。这些数据表明，EGFR信号传导对TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的心脏破裂和高死亡率起到关键作用。需要注意的是，西妥昔单抗对野生型小鼠的心脏破裂、功能和存活率没有任何影响。其中的原因并不完全清楚。TIMP-3和MMP的活性对ECM重塑和梗塞疤痕愈合起到非常关键的作用。在野生型小鼠组中，TIMP-3和MMP的活性比较平衡，因为心肌梗塞后较低的心脏破裂发病率证明了这点。此外，TIMP-3可抑制MMP活性和减少EGF配位体的脱落，因为和心肌梗塞后的TIMP-3-/-小鼠组比较，野生型小鼠组中的EGF水平明显较低。另外，我们的体外研究表明，采用低剂量的EGF处理 心脏肌成纤维细胞对胶原蛋白表达的影响不大，只有高剂量的EGF才会降低TGF-β1表达水平和胶原蛋白I合成。这些数据表明，野生型小鼠组中的EGF/EGFR活性远低于TIMP-3-/-小鼠组。因此，西妥昔单抗治疗似乎对野生型小鼠没有影响。由于C57BL/6野生型小鼠的心脏破裂发病率如此低，难以证明西妥昔单抗对这些动物的影响。有趣的是，研究表明，129sv小鼠在心肌梗塞后的心脏破裂发病率超过C57BL/6小鼠的两倍[57]。这种129sv小鼠因而可用于将来研究西妥昔单抗的影响。 
总之，本研究结果显示，TIMP-3缺乏会通过EGF/EGFR信号传导和下调心肌梗塞部位TGF-β1表达和胶原蛋白合成，从而增加心肌梗塞后的心脏破裂几率。通过西妥昔单抗抑制EGFR可预防心脏破裂并提高TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后的存活率。我们的研究表明，西妥昔单抗对预防心肌梗塞后的心脏破裂具有潜在的疗效，特别是采用溶血栓疗法的患者，因为其中的心脏破裂风险特别高[1]。 
表1:对野生型(WT)和TIMP-3-/-小鼠在心肌梗塞后分别采用和不采用西妥昔单抗(Cetux)治疗的血液动力学变化 
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000191
缩写:MAP：平均动脉压；LVSP：左心室收缩压；LVEDP：左心室舒张末期压力； 
数据为平均数±标准差，*P<0.05vs.相同基因型的假手术组.
Figure DEST_PATH_GDA00003310585000192
P<0.05vs.TIMP-3-/-小鼠的心肌梗塞。 
实施例2 
如前所述，用于防止心肌梗塞后左心室重塑的大部分的常用药物(例如ACEI、ARB和醛固酮拮抗剂)都会影响愈合和胶原蛋白的合成。因此，这些药物往往在心肌梗塞愈合期间延长了不良心脏重塑的“易损期”[53]。因此，需要建立优化愈合的新方法。 
建议西妥昔单抗(cetuximab)和其它EGFR拮抗剂相结合，将对心肌梗塞后采用ACE抑制物对野生型小鼠的治疗具有更多益处。由于野生型小鼠的心脏破裂发病率较低，西妥昔单抗和ACE抑制剂的结合将显示出西妥昔单抗对心脏重塑的益处。将西妥昔单抗与β-阻断剂、血管紧张素受体抑制剂(ARBs)和醛固酮拮抗剂相结合预计有类似的结果，已知道这些物质都对心脏重塑有益处。 
将成年雄性C57BL6小鼠随机分配到西妥昔单抗治疗组(10毫克/千克,静脉注射，每周两次)、依那普利治疗组(10毫克/公斤/日，口服)、或西妥昔单抗+依那普利治疗组(n=30个小鼠/组)。结扎小鼠的左前降冠状动脉以诱导心肌梗塞。冠状动脉结扎后，立即采用西妥昔单抗、依那普利、或西妥昔单抗+依那 普利进行治疗30天。在心肌梗塞后的30天观察存活率。在心肌梗塞后的第5天和第30天进行血流动力学测定。为确定心脏破裂的情况，对心肌梗塞后死亡的小鼠进行尸检。另外，测定心肌梗塞部位的TGF表达水平、MMP活性和胶原蛋白合成。为评估心脏重塑，对梗塞面积、左心室大小、非心肌梗塞部位的肥大以及心肌细胞的大小进行测定。 
采用其它EGFR拮抗剂进行类似的实验。 
与单独采用西妥昔单抗或依那普利治疗比较，预计EGFR拮抗剂(例如西妥昔单抗)和依那普利的相结合将显著减少适应不良性心脏重塑，并改善心肌梗塞后的心脏功能和提高存活率。 
实施例3 
有趣的是，和C57BL/6小鼠比较，129sv小鼠已被证明在心肌梗塞后具有更高的心脏破裂发病(56,57)。因而，129sv小鼠适用于研究西妥昔单抗对心肌梗塞所引发的心脏破裂的影响。 
将成年雄性129sv小鼠随即分配到载体对照组和西妥昔单抗(10毫克/千克,静脉注射)治疗组(n=50个小鼠/组)。结扎小鼠的左前降冠状动脉以诱导心肌梗塞。冠状动脉结扎后，立即采用载体或西妥昔单抗(10毫克/千克,静脉注射)进行治疗。分别在心肌梗塞后的第3天和第5天实施静脉注射。在心肌梗塞后的30天内观察存活率。在心肌梗塞后的第5天和第30天进行血流动力学测定。为确定心脏破裂的情况，对心肌梗塞后死亡的小鼠进行尸检。另外，测定心肌梗塞部位的TGF表达水平、MMP活性和胶原蛋白合成。 
采用其它非西妥昔单抗的EGFR拮抗剂进行类似的实验。 
预计EGFR拮抗剂治疗能显著降低心脏破裂发病率，并改善129sv小鼠在心肌梗塞后的心脏功能和提高存活率。 
以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代。虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 
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Claims (70)

1.一种用于治疗心脏病的药物组合物，其特征在于该药物组合物包括有效量的表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂以及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述心脏病包括：急性心肌梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、收缩性或舒张性心力衰竭、高血压或糖尿病引起的心力衰竭、心肌病、缺血性心肌病或肥厚型心肌病。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述心脏病是心肌梗塞，而且其中所述药物组合物用于治疗患有心肌梗塞的患者。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗包括治疗、预防或最大限度地改善与心脏病有关的并发症,其中该并发症选自由下列各项组成的组：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑、心脏创伤愈合以及心脏破裂。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物是用于治疗缺乏基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)之患者的心脏病。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述TIMP为TIMP3。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、PD-183805、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成一种可注射组合物。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被制成脂质体给药系统。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物被制成具有EGFR拮抗剂缓释能力的植入式给药装置。
15.一种使用EGFR拮抗剂治疗心脏病的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中该EGFR拮抗剂与至少一种其它心脏病疗法协同使用。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述至少一种其它心脏病疗法包括：小分子药物、补体抑制剂、β-阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、醛固酮拮抗剂、溶血栓疗法、机械性心脏再灌注、或其任何组合。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述心脏病包括：急性心肌梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、收缩性或舒张性心力衰竭、高血压或糖尿病引起的心力衰竭、心肌病、缺血性心肌病或肥厚型心肌病。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述心脏病是心肌梗塞,而且其中所述EGFR拮抗剂是用于治疗所述心肌梗塞。
20.根据权利要求15所述的用途，其中所述治疗包括治疗、预防或最大限度地改善与心脏病有关的并发症,其中该并发症选自由下列各项组成的组：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑、心脏创伤愈合以及心脏破裂。
21..根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是用于治疗缺乏基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)之患者的心脏病。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述TIMP为TIMP3。
23.根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。
24.根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
25.根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
26.根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、PD-183805、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。
27.根据权利要求15所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。
28.根据权利要求15所述的用途，其中所述心脏病是心脏破裂而所述EGFR拮抗剂是西妥昔单抗(cetuximab)。
29.一种利用EGFR拮抗剂制备药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗心脏病。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述治疗包括预防与心脏病有关的并发症,其中该并发症选自由下列各项组成的组：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑、心脏创伤愈合以及心脏破裂。
31.根据权利要求29所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
32.根据权利要求29所述的用途，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
33.一种用于促进疤痕愈合的药物组合物，其中该药物组合物包括EGFR拮抗剂和药学上可接受的载体。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。
35.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
36.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
37.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、PD-183805、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。
38.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。
39.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成一种可注射组合物。
40.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物被制成脂质体给药系统.
41.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物被制成具有EGFR拮抗剂缓释能力的植入式给药装置。
42.一种利用EGFR拮抗剂制备药物组合物的用途，该药物组合物用于促进疤痕愈合。
43.一种治疗心脏病的方法，包括对患者施用表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中该患者亦被施以至少一种其它心脏病疗法。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述至少一种其它心脏病疗法包括：小分子药物、补体抑制剂、β-阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、醛固酮拮抗剂、溶血栓疗法、机械性心脏再灌注、或其任何组合。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述心脏病包括：急性心肌梗塞、心肌梗塞、心力衰竭、收缩性或舒张性心力衰竭、高血压或糖尿病引起的心力衰竭、心肌病、缺血性心肌病或肥厚型心肌病。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述心脏病是心肌梗塞，而且其中所述EGFR拮抗剂是用于治疗患有心肌梗塞的患者。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗包括治疗、预防或最大限度地改善与心脏病有关的并发症,其中该并发症选自由下列各项组成的组：心脏肥大、适应不良性心肌重塑、长期心脏重塑、心脏创伤愈合以及心脏破裂。
49.根据权利要求43所述的方法，其中所述患者缺乏基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述TIMP为TIMP3。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。
52.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
53.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
54.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、PD-183805、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。
55.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。
56.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过注射的方法施用于该患者。
57.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过脂质体给药的方法施用于该患者。
58.根据权利要求43所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过植入式给药装置施用于该患者，其中该装置具有EGFR拮抗剂缓释能力。
59.一种促进疤痕愈合的方法，其中该方法包括向患者施用有效量的EGFR拮抗剂。
60.根据权利要求59所述的方法，其中该方法是一个最大限度减少适应不良性心脏重塑的方法。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述患者缺乏基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP).
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述TIMP为TIMP3。
63.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是一种EGFR配位体的变体，能够抑制至少EGFR介导的生物活性。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：抗EGFR抗体、抗EGFR抗体片段、抗EGFR配位体抗体或抗EGFR配位体抗体片段。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab)。
66.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是选自由下列各项组成的组：厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、PD-183805、PD169540、PD-158780、AG1478、PD153035、CGP59326、PKI166、EKB569或GW572016。
67.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是小干扰核糖核酸(siRNA)、小分子核糖核酸(miRNA)、核酶或反义寡核苷酸。
68.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过注射的方法施用于该患者。
69.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过脂质体给药的方法施用于该患者。
70.根据权利要求59所述的方法，其中所述EGFR拮抗剂是通过植入式给药装置施用于该患者，其中该装置具有EGFR拮抗剂缓释能力。
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