CN109512833A

CN109512833A - E2f6抑制剂的功能与用途

Info

Publication number: CN109512833A
Application number: CN201811473833.4A
Authority: CN
Inventors: 康春生; 江涛
Original assignee: 天津医科大学总医院; 北京市神经外科研究所
Current assignee: Beijing Jindai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: WO2020113877A1; CN109512833B

Abstract

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及E2F6的功能与用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，E2F6可作为能够增加替莫唑胺的敏感性的靶点，替莫唑胺用于治疗胶质母细胞瘤，E2F6抑制剂和替莫唑胺治疗可以增加对胶质母细胞瘤的治愈性。因此，本发明从临床病人样品水平、细胞功能水平和分子水平对胶质母细胞瘤的发病机理及胶质母细胞瘤的临床治疗提供有力的科学证据。

Description

E2F6抑制剂的功能与用途

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及E2F6抑制剂的功能与用途。

背景技术

胶质母细胞瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，其增殖和侵袭能力强，并且容易术后复发。胶质母细胞瘤生长速度快，70％～80％患者病程在3～6个月，病程超过1年者仅10％。病程较长者可能由恶性程度低的星形细胞瘤演变而来。由于肿瘤生长迅速，脑水肿广泛，颅内压增高症状明显，所有患者都有头痛、呕吐症状。视盘水肿有头痛、精神改变、肢体无力、呕吐、意识障碍与言语障碍。肿瘤浸润性破坏脑组织，造成一系列的局灶症状，患者有不同程度的偏瘫、偏身感觉障碍、失语和偏盲等。神经系统检查可发现偏瘫、脑神经损害、偏身感觉障碍与偏盲。癫痫的发生率较星形细胞瘤和少枝胶质细胞瘤少见，部分患者有癫痫发作。部分患者表现为淡漠、痴呆、智力减退等精神症状。

虽然目前很多化疗药物，如替莫唑胺，亚硝基脲类和顺铂已经显示对胶质母细胞瘤患者的临床获益，但是这些药物治疗效果仍不甚满意，主要是因为内在的或获得的耐药性。替莫唑胺是一种对于新诊断胶质母细胞瘤患者标准化治疗的烷化剂，它被证明可以造成细胞在G2/M期阻滞并介导DNA损伤和接下来的凋亡。虽然口服替莫唑胺增加了胶质母细胞瘤患者的总体生存期，但是癌细胞诱导产生的耐药性终止了进一步的治疗。因此，克服胶质瘤细胞产生耐药性和完全治疗胶质母细胞瘤仍是目前医学的一大挑战。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供E2F6抑制剂在胶质母细胞瘤中的功能与用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了E2F6抑制剂用于制备替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤增效药物或用于与替莫唑胺联合制备胶质母细胞瘤治疗药物的用途。

在用于与替莫唑胺联合制备胶质母细胞瘤治疗药物的用途中，所述胶质母细胞瘤治疗药物至少具有以下功用之一：能够抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和增殖、促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡、抑制胶质母细胞瘤细胞成瘤能力、抑制胶质母细胞瘤组织生长。

进一步的，所述E2F6抑制剂是指对于E2F6或NF-κB具有抑制效果的分子。

E2F6是通过EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB通路调控的，并且，替莫唑胺诱导DNA损伤后的NF-κB磷酸化激活也是增加E2F6表达的重要组成部分。因此，可以通过抑制NF-κB实现对E2F6的抑制。

所述E2F6基因的Genbank登陆号为NM_198256.3。核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

所述NF-κB基因的Genbank登陆号为NM_021975.3。核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

对于E2F6或NF-κB具有抑制效果包括但不限于：所述E2F6抑制剂抑制E2F6活性，或者抑制E2F6基因转录或表达，或者抑制NF-κB活性，或者抑制NF-κB基因转录或表达。

所述E2F6抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述E2F6抑制剂可以为siRNA。所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-3任一种所示。

所述胶质母细胞瘤治疗药物必然包含E2F6抑制剂和替莫唑胺，并以E2F6抑制剂和替莫唑胺作为前述功用的有效成分。

所述胶质母细胞瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为E2F6抑制剂和替莫唑胺，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

所述胶质母细胞瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述胶质母细胞瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供一种治疗胶质母细胞瘤的方法，为向对象联合施用E2F6抑制剂和替莫唑胺，或向对象施用包括E2F6抑制剂和替莫唑胺的组合药物。

所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的胶质母细胞瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述胶质母细胞瘤细胞可为离体胶质母细胞瘤细胞，包括但不限于U87或U87EGFRvIII。

所述对象可以是罹患胶质母细胞瘤的患者或期待治疗胶质母细胞瘤的个体，或者所述对象为胶质母细胞瘤患者或期待治疗胶质母细胞瘤的个体的离体胶质母细胞瘤细胞。

所述E2F6抑制剂和替莫唑胺，或E2F6抑制剂和替莫唑胺的组合药物可以在接受胶质母细胞瘤治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供了一种胶质母细胞瘤治疗药物组合，包括有效量的E2F6抑制剂和有效量的替莫唑胺。

所述胶质母细胞瘤治疗药物组合至少具有以下功用之一：能够抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和增殖、促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡、抑制胶质母细胞瘤细胞成瘤能力、抑制胶质母细胞瘤组织生长。

所述胶质母细胞瘤治疗药物组合必然包含E2F6抑制剂和替莫唑胺，并以E2F6抑制剂和替莫唑胺作为前述功用的有效成分。

对于E2F6或NF-κB具有抑制效果包括但不限于：所述E2F6抑制剂抑制E2F6活性，或者抑制E2F6基因转录或表达，或者抑制NF-κB活性，或者抑制NF-κB基因转录或表达。所述E2F6抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述E2F6抑制剂可以为siRNA。所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3任一种所示。

所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：(1)将E2F6抑制剂和替莫唑胺分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(2)将E2F6抑制剂和替莫唑胺配制成复方制剂。

进一步的，所述胶质母细胞瘤治疗药物组合还包括至少一种其他胶质母细胞瘤治疗药物作为前述功用的有效成分。

所述其他胶质母细胞瘤治疗药物是指除了E2F6抑制剂和替莫唑胺以外的胶质母细胞瘤治疗药物。

进一步的，所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：(1)将E2F6抑制剂、替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(2)将E2F6抑制剂、替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂；(3)将替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将E2F6抑制剂配制成独立制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(4)将替莫唑胺和E2F6抑制剂配制成复方制剂，将其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成独立制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(5)将E2F6抑制剂和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将替莫唑胺配制成独立制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

本发明第四方面，提供了一种胶质母细胞瘤治疗方法，为向对象施用有效量的E2F6抑制剂和替莫唑胺，以及向对象施用有效量的其他胶质母细胞瘤治疗药物和/或向对象实施其他胶质母细胞瘤治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的E2F6抑制剂和替莫唑胺和至少一种有效量的其他胶质母细胞瘤治疗药物。

所述其他胶质母细胞瘤治疗药物包括但不限于：抗肿瘤抗体、化疗药物或靶向型药物等。

基于E2F6为本发明首次发现的能够增强治疗胶质母细胞瘤的替莫唑胺的耐药性相关基因，本发明的第五方面，提供E2F6的其他新用途，所述E2F6抑制剂至少具有以下功用之一：能够增加替莫唑胺敏感性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，E2F6可作为能够增加替莫唑胺的敏感性的靶点，替莫唑胺用于治疗胶质母细胞瘤，联合E2F6抑制剂和替莫唑胺治疗可以增加对胶质母细胞瘤的治愈性。因此，本发明从临床病人样品水平、细胞功能水平和分子水平对胶质母细胞瘤的发病机理及胶质母细胞瘤的临床治疗提供有力的科学证据。

附图说明

图1：TMZ作用于U87细胞的IC50，其中(LogIC50为2.528，Hillslope为1.329,IC50为337.4)。

图2：CCK8检测U87抑瘤生长的TMZ浓度。

图3：sgRNA在各样本中的相对counts分布。图中横坐标代表样本，纵坐标为Relative Log2(CPM)，其中CPM＝counts per million(类似测序结果中常见的RPKM)；中间的贯穿线代表所有样本的Relative Log2(CPM)的平均值；每个盒状上下部横线分别代表上下90％置信区间，盒状上下边缘表示上下四分位点，中间的黑线表示中位数。

图4：RNAseq挑选EGFRvIII相关耐药基因。(A)RNAseq显示升高EGFRvIII表达量可增加E2F6 mRNA水平表达。(B)组成分分析显示TMZ治疗后的各组细胞与为治疗组明显不同。(C)RNAseq显示TMZ治疗后E2F6升高。(D)RNAseq显示TMZ治疗14天较7天的E2F6表达升高。

图5：TCGA RNAseq和Rembrandt组用于显示WHOII-IV神经胶质瘤中的E2F6表达水平。E2F6与神经胶质瘤WHO分级正相关。

图6A：蛋白质印迹分析提供了关于通过EGFRvIII和TMZ处理增加的E2F6表达的证据，GAPDH作为阴性对照。

图6B：使用qRT-PCR显示由EGFRvIII和TMZ处理增加的E2F6 mRNA水平，GAPDH作为阴性对照。

图6C：进行细胞活力测定以显示E2F6的获得或丧失不影响GBM细胞的增殖，但E2F6通过TMZ处理作为TMZ抗性。

图6D：通过TMZ处理使用集落形成测定来显示较长时间的增殖。过表达E2F6的对照细胞和E2F6沉默EGFRvIII细胞用TMZ处理14天，表明E2F6是TMZ抗性中的关键因子。

图6E：γ-H2AX用于评估由TMZ使用免疫荧光测定引起的DNA损伤。功能实验的获得或失去表明E2F6对DNA损伤具有抗性。

图7A：Western印迹分析显示E2F6表达与NF-κB活化呈正相关。GAPDH作为阴性对照。

图7B：qRT-PCR显示E2F6mRNA水平与NF-κB活化呈正相关。

图7C：Western印迹显示EGFRvIII和TMZ处理增加了p-NF-κB的表达。GAPDH作为阴性对照。

图7D：使用IGV显示ChIP-seq数据(GSE46016)，U87EGFRvIII细胞中的E2F6启动子与U87细胞中的H3K4me3更好地富集。

图7E：ChIP-PCR分析显示H3K4me3和p-NF-κB通过EGFRvIII增加其与E2F6启动子的结合。

图7F：ChIp-PCR分析表明H3K4me3和p-NF-κB通过MK-2206处理降低其与E2F6启动子的结合。

图7G：EGFRvIII/PI3K/AKT途径对E2F6调节机制的示意图。EGFRvIII/PI3K/AKT和TMZ通过转录调控E2F6表达激活NF-κB。并且通过EGFRvIII/PI3K/AKT途径诱导的H3K4me3修饰增加的E2F6启动子区域上的结合进一步激活E2F6转录。

图8A：E2F6鉴定为体内TMZ抗性因子的示意图。小鼠同位素注射U87，U87E2F6，U87EGFRvIII或U87EGFRvIII+E2F6KD细胞。这些组中的每一组腹膜内注射5mg/kg/d的DMSO或TMZ，2天休息两天5天。每7天检测一次生物发光，并且每2天测量一次小鼠体重。

图8B：在U87，U87E2F6及其TMZ治疗组中每7天植入颅内肿瘤的小鼠的体外成像荧光。

图8C：在U87EGFRvIII，U87EGFRvIII+E2F6KD及其TMZ治疗组中每7天植入颅内肿瘤的小鼠的体外成像荧光。

图8D：每2天测量U87，U87E2F6及其TMZ治疗组小鼠的体重。

图8E：每2天测量U87EGFRvIII，U87EGFRvIII+E2F6KD及其TMZ处理组小鼠的体重。

图8F：Kaplan-Meier曲线显示，当增加E2F6表达时，TMZ处理总体存活时间减少。图8G：Kaplan-Meier曲线显示，当沉默E2F6表达时，通过TMZ处理增加总体存活时间。

图8H：来自U87，U87E2F6及其TMZ处理组的裸鼠的肿瘤中EGFRvIII，p-NF-κB和E2F6的代表性免疫染色结果。比例尺：50μm。

图8I：来自U87EGFRvIII，U87EGFRvIII+E2F6KD及其TMZ治疗组的裸鼠的肿瘤中的EGFRvIII，p-NF-κB和E2F6的代表性免疫染色结果。比例尺：50μm。

附图中，*表示p<0.05，***表示p<0.01，****表示p<0.001，ns表示不显著。

具体实施方式

本发明在研究中发现，E2F6可作为能够增加替莫唑胺的敏感性的靶点，替莫唑胺用于治疗胶质母细胞瘤，联合E2F6抑制剂和替莫唑胺治疗可以增加对胶质母细胞瘤的治愈性。

E2F6抑制剂

所述E2F6抑制剂是指对于E2F6或NF-κB具有抑制效果的分子。

所述E2F6抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

抑制E2F6活性是指使E2F6活力下降。优选地，相比抑制前，E2F6活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制E2F6基因转录或表达是指：使E2F6的基因不转录，或降低E2F6的基因的转录活性，或者使E2F6的基因不表达，或降低E2F6的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对E2F6的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

E2F6的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，E2F6基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地E2F6基因完全没有表达。

抑制NF-κB活性是指使NF-κB活力下降。优选地，相比抑制前，NF-κB活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制NF-κB基因转录或表达是指：使NF-κB的基因不转录，或降低NF-κB的基因的转录活性，或者使NF-κB的基因不表达，或降低NF-κB的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对NF-κB的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

NF-κB的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，NF-κB基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地NF-κB基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

E2F6抑制剂制备药物

以E2F6抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与E2F6抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

治疗药物组合和施用方法

当所述治疗药物组合只有E2F6抑制剂和替莫唑胺两种有效成分时，所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(1)将E2F6抑制剂和替莫唑胺分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；

(2)将E2F6抑制剂和替莫唑胺配制成复方制剂。

当所述治疗药物组合有多种有效成分时，所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将E2F6抑制剂和替莫唑胺及其他胶质母细胞瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

二)将E2F6抑制剂和替莫唑胺及其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂。在将E2F6抑制剂和替莫唑胺药物及其他胶质母细胞瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配制成复方制剂的形式。

三)将有效成分中的部分配制成复方制剂，部分配制成独立的制剂。例如，将替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将E2F6抑制剂配制成独立制剂；或将替莫唑胺和E2F6抑制剂配制成复方制剂，将其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成独立制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(5)将E2F6抑制剂和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将替莫唑胺配制成独立制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

可以同步的或顺序地给予有效量的E2F6抑制剂和替莫唑胺药物及有效量的其他胶质母细胞瘤治疗药物。使用时，可将有效量的E2F6抑制剂和替莫唑胺药物及有效量的其他胶质母细胞瘤治疗药物同时使用，也可将有效量的E2F6抑制剂和替莫唑胺药物及有效量的其他胶质母细胞瘤治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

化疗药物包括烷化剂(如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等)、抗代谢药(如去氧氟鸟苷、多西弗鸟啶、氟尿嘧啶、巯嘌呤、甲氨蝶呤等核苷酸类似物)、抗肿瘤抗生素(如放线菌素D、阿霉素和柔红霉素等抗生素)、抗肿瘤动植物成分药(如长春瑞滨、紫杉醇、三尖杉酯碱、伊立替康、泰索帝和长春碱等)、抗肿瘤激素药(如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦和他莫昔芬等)以及如顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌和丙卡巴肼等常用化疗药。

靶向型药物包括EGFR阻断剂如吉非替尼(Gefitinib、Iressa和易瑞沙)和埃罗替尼(Erlotinib、Tarceva)、特定细胞标志物的单克隆抗体如西妥昔单抗(Cetuximab、Erbitux)和抗HER-2单抗(赫赛汀，Trastuzumab、Herceptin)、酪氨酸激酶受体抑制剂如克唑替尼(Crizotinib、Xalkori)、抗肿瘤血管生成药物如Bevacizumab、endostatin和Bevacizumab等、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂如Imatinib和Dasatinib、抗CD20单抗如Rituximab、IGFR-1激酶抑制剂如NVP-AEW541、mTOR激酶抑制剂如CCI-779、泛素-蛋白酶体抑制剂如Bortezomib等。

其他胶质母细胞瘤治疗手段可选自手术切除、射频消融、氩氦超导手术治疗、激光消融治疗、高强度聚焦超声以及放射治疗包括X-刀、R-刀、3D-CRT和IMRT中的一种或多种。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

TMZ是指替莫唑胺。GBM是指胶质母细胞瘤。

实施例1

1.1细胞培养

人类胶质瘤细胞U87从ATCC购买(美国ATCC公司)，N5，N9和N33原代细胞从胶质瘤患者手术切下的胶质瘤组织中培养所得。手术切下的胶质瘤被迅速的盛于不含血清的培养基中，冰浴保存。无菌操作台中将组织剪成0.5mm³小块，置于含血清的培养基中生长，待肿瘤细胞脱落并贴壁后，按肿瘤细胞培养。细胞培养在含有10％热失活的小牛血清(FBS，美国Hyclone公司)的DMEM培养液中。各EGFRvIII细胞系来自于通过含有表达EGFRvIIIcDNA的GV341质粒构建的慢病毒转染，然后嘌呤霉素筛选7天而成。所有这些细胞都生长在恒温37℃，5％CO₂的潮湿温箱中。过表达E2F6和敲低E2F6慢病毒购自吉凯基因。

GeCKO质粒文库是基因组范围的CRISPR敲除文库，可在人基因组内敲除任何编码基因和miRNA。文库含有针对每个编码基因的6个sgRNA和针对每个miRNA的4个sgRNA，以及1000个非靶向性的对照sgRNA。HEK293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

表1 E2F6干扰RNA序列

干扰RNA	序列	序列号
			E2F6siRNA#1	5'-GAGGAACUUUCUGACUUAU-3'	SEQ ID NO:1
E2F6siRNA#2	5'-AUGUCUAUUUGUGUGAAGU-3'	SEQ ID NO:2
			E2F6siRNA#3	5'-ACUUAGAUUACUGAGUAAU-3'	SEQ ID NO:3

1.2质粒转染

1.转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x10⁶细胞/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；

2.转染前2h更换为无血清培养基；

3.向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(穿梭质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1mL，室温静置15min；

4.混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；

5.培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10mL的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；

6.缓慢加入含10％血清的细胞培养基20mL，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48-72h。1.3慢病毒浓缩与纯化

1.根据细胞状态，分别收收集转染后24h、48h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液，4℃保存；

2.将收集到的上清转移至0.22μm滤器内进行抽滤，除去细胞碎片等；

3.将步骤2中收集到的样品流经切向流过滤系统，在浓缩病毒的同时，极大程度地去除DNA和蛋白残留；

4.使用AKATA阴阳离子层析系统对样品进行进一步纯化，收集样品，4℃保存；

5.将步骤5中操作回收的病毒样品装入超滤浓缩管中，于4℃、5500rpm离心，根据毒液浓缩的速度调节每轮离心的时间，直至浓缩到目标体积准备样品待检测；

6.将浓缩后病毒液收集于1.5mL离心管中，11000rpm离心5min；

7.用2mL针管吸取上清，通过0.22μm(PVDF)进行纯化，按照一定的规格分装入库；

8.准备样品待检测。

1.4病毒滴度检测

1.感染前24h，对HEK293T贴壁细胞进行传代、计数，接种于96孔板中，铺板密度为4×10⁴个细胞/孔，体积100μL；

2.根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的1.5mL EP管，每管中加入90μL无血清培养基；3.取待测病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；

4.选取所需的细胞孔，弃去90μL培养基，加入90μL稀释好的病毒溶液，在细胞培养箱中进行培养；

5.培养24h后，加入完全培养基100μL；

6.感染后72h加入抗性药物puromycin，维持药物浓度5μg/mL，继续培养24h，观察细胞生长状况。

7.通过感染后的活细胞数量来计算病毒滴度。例如在加入1E-5μL病毒原液的孔中观察到3个细胞存活，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，病毒滴度＝活细胞数/病毒原液量，即3/(1E-5)＝3E+5(TU/μL)，为3E+8TU/mL。

表2构建病毒所用试剂

试剂名称	试剂来源	Cat.No.
			台盼兰	SIGMA	72-57-1
胎牛血清FBS	上海微科生化试剂有限公司	A11-102
			DMSO	上海试一化学试剂有限公司	130701
DMEM	Hyclone	SH30022.01B

1.5使用CCK-8法检测TMZ的IC50

1.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。

2.根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为4000cell/well)，每孔100μl，每组3-5孔重复，根据实验设计决定铺板数量(如检测5天，则铺5张96孔板)。

3.统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现Con组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。

4.第二天按实验设计加药，不加药组无需处理。

5.按照实验设计时间，培养终止前2～4h加入10μLCCK-8试剂于孔中，无需换液。

6.4h后96孔板置于振荡器上振荡2-5min，酶标仪450nm检测OD值。

7.数据分析。

1.6 CCK8检测U87抑瘤生长的TMZ浓度

1.将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；

2.根据药物的杀伤效果决定铺板细胞密度(针对IC70药物浓度，细胞铺板数在50万左右，密度大于50％，针对IC20～IC30药物，细胞密度在20万左右，密度在20％左右)，每个药物浓度一个孔，设置一个不加药组，培养体系为2ml/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，37℃、5％CO₂培养箱培养；

3.待不加药组细胞生长至80％左右时，进行消化计数，记录下各组细胞总量；

4.根据计数情况，按照一定比例进行传代,记录下传代比例；

5.传代后第二天，待细胞贴壁后，进行换液；

6.待空细胞生长至80％左右后，按照3～5步骤重复进行，直至培养满10～14天；

7.最后将初始细胞量和每次计数的细胞总量进行汇总统计，得出各组细胞的生长曲线，并计算出加药组相对于未加药组的抑制率。

1.7 sgRNA测序

通过引物从目标序列中扩增出目的片段，然后利用高通量测序技术测定目的片段的序列，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸突变位点(SNV)，插入缺失位(Insertion/Deletion，InDel)、结构变异(Structure Variation，SV)，并通过生物信息手段，分析不同个体基因组间的突变差异，同时完成注释。

1.8蛋白质免疫印迹实验(Western blot)

细胞准备完毕，弃去培养基，用预冷的4℃PBS清洗细胞3次，弃净PBS后将培养皿置于冰上。RIPA细胞裂解液与PMSF以100：1混合，冰上预冷。10cm大皿加200μl裂解液，将细胞刮下，将细胞和裂解液转移至1.5mlEP管，冰上裂解30min。于4℃下12000rpm离心15min。将上清移至另一1.5ml EP管。BCA蛋白浓度检测：按照BCA试剂盒说明制作标准曲线。BCA和CuCl₂以50：1混合均匀，每个副孔加入混合好的BCA溶液200μl。收集的蛋白用PBS稀释至1/10，每个副孔加入20μl。蛋白和BCA混合均匀和置于37℃恒温箱30min，酶标仪在562nm处检测吸光度。利用标准曲线计算蛋白浓度。将剩下的蛋白上清加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，-20℃保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制10％的聚丙烯酰胺凝胶配方如表3所示：

表3 10％的聚丙烯酰胺凝胶成分

分离胶	20ml	压缩胶	5ml
				ddH2O	8ml	ddH2O	6.89ml
30％丙烯酰胺	6.66ml	30％丙烯酰胺	1.7ml
				Tris缓冲液(PH8.8)	5ml	Tris缓冲液(PH6.8)	1.25ml
10％过硫酸铵(AP)	200μl	10％过硫酸铵(AP)	100μl
				10％SDS	100μl	10％SDS	50μl
TEMED	8μl	TEMED	10μl

每孔加入20-40μg蛋白，80V电泳40min，后改为150V电泳至上样缓冲液至胶底，终止电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，100V转膜约60min。5％BSA封闭PVDF膜1h，一抗封闭过夜(抗p-NF-κB，p-AKT抗体(CST,1:1000稀释)，抗E2F6(Gene，1:1000稀释)，抗GAPDH抗体(Millipore，1:2000稀释))。第二天将PVDF膜在常温下复温1h，弃去抗体，PBST洗3遍，每次10min。使用相应抗鼠或是抗兔结合辣根过氧化氢酶的二抗常温下孵育2h，再次使用PBST洗3遍，每次10min。使用G:BOXF3凝胶成像系统(英国Syngene)免疫成像。

1.9实时定量PCR(qRT-PCR)

细胞准备完毕，弃去培养基，用预冷的4℃PBS清洗细胞3次，弃净PBS后将培养皿置于冰上。按照TRIzol试剂盒说明使用TRIzol试剂从细胞提取总RNA。首先，六孔板细胞加入1ml TRIzol，吹打均匀，盛于1.5ml无RNA酶的EP管中，常温下放置15min，加入200μl氯仿，上下颠倒混匀，12000g于4℃离心15min，将清澈透明上清转移至另一个无RNA酶的EP管中。加入等体积的异丙醇，混合均匀后，12000g于4℃离心15min。弃上清，可见EP管底部沉淀。使用75％乙醇1ml清洗，12000g于4℃离心15min。弃上清后再用无水乙醇1ml清洗，12000g于4℃离心15min。弃上清后将EP管放于超净台开盖晾干，得到的沉淀用50μl DEPC处理的水溶解，冻于-80℃备用。取2μg总RNA作为模板用于反转录，反转录体系如表4所示：

表4 RNA逆转录体系

总RNA	Xμl
		OligodT	1μl
ddH<sub>2</sub>O	(10-X)μl
		MgCl<sub>2</sub>	5μl
5*buffer	2μl
		RNA酶抑制剂	1μl
RNA反转录酶	1μl
		总共	20μl

逆转录体系在42℃1h，70℃15min后得到cDNA，将2μl反转录所得的cDNA用于PCR扩增，反应体系如表5所示，引物如表6所示：

表5 qPCR反应体系

表6使用的引物序列

引物	序列	序列号
			E2F6-Forward	5'-TCAGCAAAGTGAAGAATTGC-3'	SEQ ID NO:4
E2F6-Reverse	5'-CGAGAGCACTTCATGGATAA-3'	SEQ ID NO:5
			GAPDH-Forward	5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCATG-3'	SEQ ID NO:6
GAPDH-Reverse	5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'	SEQ ID NO:7

qPCR反应体系配好后，在CFX96_TMPCR仪(Bio-Rad，美国)内运行。PCR工作流程为：第一步95℃5min变性，第二步95℃15s，53-58℃1min工作40循环，第三步72℃10min延伸。qRT-PCR反应的特异性由溶解曲线确定，所得产物使用加入GelRed荧光染料(Biotium，美国)1.2％的琼脂糖凝胶电泳再次确认。mRNA使用GAPDH校正，而microRNA使用U6校正。基因相对表达量使用公式2^-ΔΔCt计算倍数变化。

1.10 RNA测序

将U87细胞和U87EGFRvIII细胞，与转染sgRNA文库后分别使用替莫唑胺处理0，7和14天的U87细胞和U87EGFRvIII细胞分别进行RNA测序，观察mRNA变化。细胞准备好后，弃去培养基，用预冷的4℃PBS清洗细胞3次，弃净PBS后将培养皿置于冰上。按照TRIzol试剂盒说明使用TRIzol试剂从细胞提取总RNA。首先，10cm培养皿细胞(1*10⁷)加入1ml TRIzol，吹打均匀，盛于1.5ml无RNA酶的EP管中，常温下放置15min，加入200μl氯仿，上下颠倒混匀，12000g于4℃离心15min，将清澈透明上清转移至另一个无RNA酶的EP管中。加入等体积的异丙醇，混合均匀后，12000g于4℃离心15min。弃上清，可见EP管底部沉淀。使用75％乙醇1ml清洗，12000g于4℃离心15min。弃上清后再用无水乙醇1ml清洗，12000g于4℃离心15min。弃上清后将EP管放于超净台开盖晾干，得到的沉淀用50μlDEPC处理的水溶解，总RNA被用于RNA测序检测。将总RNA反转录构建cDNA文库，然后使用深圳华大基因的BGI500测序平台进行测序检测。高质量的测序读数使用Bowtie2根据人类参考基因组(GRCh38)进行匹配，并将匹配好的基因转录的mRNA通过外显子模型的每千碱基片段每百万映射读数(FPKM)进行归一化处理。所得的测序结果可进行下一步的分析计算。

1.11临床样本收集和免疫组织化学

胶质瘤标本和相应临床信息从河北大学附属医院收集。胶质瘤手术切除后，使用福尔马林固定，石蜡包埋并切片。

免疫组化操作步骤

脱蜡：脱蜡前将组织切片在60℃温箱中烘烤1小时，后用二甲苯(I)和(II)中各浸泡20min；水化：无水乙醇(I)，(II)各10min，后95％，80％乙醇各10min，蒸馏水5min；

抗原修复：将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液(PH＝7.4)中煮沸至95℃15min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5min；

阻断：0.3％H₂O₂处理10min以灭火内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，每次5min

穿孔：1％tritonX-100室温处理10min裂解细胞膜，PBS冲洗3次，每次5min；

封闭：滴加正常山羊血清封闭液，37℃孵育40min，甩去多余液体；

一抗孵育：滴加一抗(1：100，抗体稀释液稀释)50μl，4℃过夜。次日在37℃复温45min，PBS冲洗3次，每次5min；

二抗孵育：滴加生物素标记的二抗(1：100，PBS稀释)50μl，37℃孵育1h，PBS冲洗3次，每次5min；

三抗孵育：滴加三抗(辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素1：100，PBS稀释)50μl，37℃孵育40min，PBS冲洗3次，每次5min；

显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度；

终止：自来水冲洗，终止反应；

负染：苏木素负染10min，盐酸酒精分化2下，氨水返蓝40s；

脱水：按顺序80％，95％乙醇各浸泡10min，无水乙醇(I)，(II)各10min，二甲苯(I)(II)

各20min，树脂封片。

1.12患者胶质瘤组织芯片数据

从3个独立的人胶质瘤数据库中选择691例标本：中国胶质瘤基因组图谱数据库(CGGA，http://www.cgcg.org.cn/)248例，美国国家癌症研究所分子脑肿瘤资料库(Rembrandt，https://gdoc.georgetown,edu/gdoc)180例，和基因表达综合网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,GSE16011)263例。对于CGGA数据库，248例冰冻胶质瘤标本是由北京天坛医院胶质瘤中心从2006年至2009年间的病人中收集而来。手术之前接受过放化疗的患者被该研究剔除。所有患者的肿瘤组织学均由两位神经病理学专家根据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准独立确定。研究也由天坛医院研究伦理委员会同意，并获得患者或家属的知情同意。由于CGGA中Ⅲ级胶质瘤标本含量较少，只采用了Ⅱ级和Ⅳ级数据进行相应研究。

1.13细胞增殖实验

细胞增殖实验使用CCK8试剂盒(日本DojindoLaboratories)按操作说明书进行。简单来说，在96孔板中每孔种2000细胞，每个处理组三个副孔，细胞在相应的培养基中生长0-96小时，在相应的时间，每孔100μl培养基中加入10μlCCK8溶液培养2h，然后所得溶液的吸光度使用450nm酶标仪检测。

1.14染色质免疫共沉淀(ChIP)和ChIP-qPCR实验

ChIP实验使用一种可商业购买的ChIP试剂盒(中国碧云天)。首先，大皿细胞使用PBS清洗两遍，加入1％的福尔马林将蛋白和染色质在37℃交联10min，然后使用甘氨酸于室温中和5min。所有细胞用冷的PBS清洗，刮下，收集并置于冰上。接下来，细胞使用Scientz-IID超声匀浆机(Scientz)超声10s，间隔20s共20个循环超声裂解。等量的染色质和至少1.5μg抗体免疫共沉淀过夜。抗体为：H3K4me3,NF-κB(美国CST)和正常鼠IgG(美国Millipore)。免疫沉淀产物与蛋白A+G包被的磁珠孵育，将磁珠清洗，再将其结合的染色质用ChIP洗脱缓冲液洗脱。混合液中的蛋白使用蛋白酶K在45摄氏度水浴消化4h。使用DNA纯化试剂盒(中国碧云天)纯化DNA。免疫共沉淀结束后，使用qPCR检测E2F6结合区，并使用总染色质(InPut)标准化。正常鼠IgG组作为阴性对照。检测引物序列如下：

引物1正向：5'-CGGTGTGTTGCCTTTTTATT-3'(SEQ ID NO:8)，

反向：5'-AACAACGTCCAATTTCAGTG-3'(SEQ ID NO:9)；

引物2正向：5'-CACTGAAATTGGACGTTGTT-3'(SEQ ID NO:10)，

反向：5'-AGGTCAGTGTTGATGCTTAG-3'(SEQ ID NO:11)；

引物3正向：5'-ATCTCTGCGGCTCAGAACTT-3'(SEQ ID NO:12)，

反向：5'-AGGGAACAGGGGTGAGAGAA-3'(SEQ ID NO:13)；

引物4正向：5'-TTTCCTTTGCCAGCCTCTCC-3'(SEQ ID NO:14)，

反向：5'-ACGCAGACGGAAAAAGAGGA-3'(SEQ ID NO:15)。

使用三步法进行qPCR实验，反应条件分别为95℃3min变性，接着40循环的95℃15s，57℃30s，72℃30s退火，最后72℃5min延伸。PCR产物最后使用含GelRed的2％琼脂糖凝胶电泳。

1.15免疫荧光实验和共聚焦成像

所有使用的细胞系都种在10％胶原包被的盖玻片上。细胞使用预冷的多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，每次5min。0.5％TritonX-100透膜，再用1％BSA封闭1h。使用相应的一抗(γ-H2AX(abcam)(1:200稀释))结合过夜。第二天将细胞在37℃复温1h，PBS清洗3遍，每次10min。将结合AlexaFluor488的二抗(美国生命技术公司，1：100稀释)和TRITC标记的鬼笔环肽一起室温孵育细胞2h，然后使用DAPI染细胞核，PBS清洗3遍，每次10min。防淬灭剂封片，置于奥林巴斯FluoView1200系统下成像。为了客观比较不同处理组免疫荧光不同，所有共聚焦扫描参数都保持不变，为保持数据的真实性图片几乎不经处理。

1.16原位肿瘤实验

五周大的雌性裸鼠(中国医学科学院肿瘤研究所)被用来建立颅内原位胶质瘤肿瘤模型。向颅内注射胶质瘤细胞之前，我们将U87细胞转染过表达E2F6的慢病毒并进行嘌呤霉素筛选，构建稳定的U87E2F6细胞；同时将将U87EGFRvIII细胞转染过表达E2F6siRNA的慢病毒并进行嘌呤霉素筛选，构建稳定的U87vIIIE2F6si细胞。然后我们将U87细胞，U87E2F6细胞，EGFRvIII细胞和EGFRvIIIE2F6si细胞作为制作小鼠颅内肿瘤实验的细胞模型。弃去培养基，用PBS清洗细胞，每个大皿加入约0.5ml含EDTA的胰酶消化2分钟，显微镜下观察细胞完全从培养皿上脱离，加入含血清的培养基终止消化，将细胞计数。1000转/分钟离心5分钟，弃去上清，将沉淀的细胞在适量的PBS中分散，并置于冰上。每组每只裸鼠在立体定向仪指导下颅内种植50万细胞，肿瘤生长一周后，经腹腔以5mg/Kg/d的量注射替莫唑胺，治疗5天，停止治疗2天，共持续2周。肿瘤生长第7，14，21和28天分别进行体外成像检测肿瘤大小，每只小鼠的体外成像荧光都以起始的荧光结果进行归一化处理。每两天测量并记录小鼠的体重，并以曲线图记录，图中误差值表示标准差(SD)。记录小鼠生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。替莫唑胺治疗后和实验终止时，将小鼠颅内异体肿瘤取出，PBS清洗，福尔马林浸泡24小时，石蜡包埋后切片进行免疫组织化学检测。HE染色和抗EGFRvIII，抗p-NF-κB和抗E2F6抗体检测相应的蛋白表达。

1.17平板克隆形成实验

1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3.经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

1.19结果分析

1.E2F6作为GBM细胞的TMZ耐药性耐药基因

比较EGFRvIII过表达U87细胞中的mRNA。E2F6是EGFRvIII过表达后增加的唯一基因，同时对TMZ有抗性(图4A)。主成分分析比较TMZ治疗前后的细胞，显示这两组完全不同(图4B)。尽管治疗7或14天，但TMZ治疗的EGFRvIII细胞中的E2F6表达增加(图4C)。TMZ治疗14天较7天中的E2F6表达增加(图4D)

2.E2F6表达与经典型胶质瘤和WHO分级相关

我们利用TCGA RNAseq数据和Rembrandt数据来显示E2F6是否与胶质瘤级别相关。选择WHOII，III或IV级神经胶质瘤进行我们的进一步的研究。如图5所示，E2F6表达与肿瘤级别显着相关(P<0.0001)。

3.E2F6在体外作为TMZ抗性基因

EGFRvIII通过加速修复DNA双链断裂(DSBs)来加强对抗辐射的杀伤作用。为了鉴定由EGFRvIII引起的化疗耐药机制，GBM细胞在长时间暴露于TMZ中进行并发现EGFRvIII细胞中的E2F6水平增加，并且TMZ刺激也可增加E2F6表达，这与我们之前的观察结果一致，表明E2F6在TMZ抗性中发挥中心作用(图6A和图6B)。然后，设计编码E2F6和E2F6siRNA的慢病毒以进行功能实验的获得或丧失。计算我们设计的三种siRNAs的量，siRNA#1在敲低E2F6(E2F6KD)方面具有很高的效率，所以我们使用这种siRNA作为我们的工具来执行我们的后续实验。CCK8活力测定证实了EGFRvIII细胞对TMZ的抗性，并且E2F6的过表达增加了对TMZ的抗性，而沉默E2F6降低了EGFRvIII细胞对TMZ的抗性(图6C)。此外，我们应用集落形成试验延长了两周内GBM细胞暴露于TMZ，类似的结果表明E2F6在TMZ抗性中起主要作用(图6D)。使用γ-H2AX(反映DNA损伤的磷酸化蛋白)来测量由TMZ处理引起的染色体断裂的反映。在TMZ处理下，E2F6分子的增加或减少使得γ-H2AX的荧光下降或上调，表明E2F6抑制TMZ引起的DNA损伤(图6E)。总之，通过抑制DNA损伤应答，E2F6在TMZ抗性中作为EGFRvIII细胞中的关键因子起作用。

4.E2F6受EGFR/PI3K/AKT途径中的H3K4me3和NF-κB调节

使用过表达NF-κB和JSH-23分别处理对照组和EGFRvIII细胞48h后，采用Westernblot和qRT-PCR方法收集总蛋白和mRNA，检测E2F6的表达。在蛋白质(图7A)和mRNA水平(图7B)中，E2F6与GBM细胞中NF-κB活化呈正相关，表明E2F6可能在EGFRvIII/PI3K/AKT/NF-κB通路中受到调节。通过用EGFRvIII和TMZ处理，发现NF-κB被激活(图7C)，这意味着E2F6可能被EGFRvIII和TMZ诱导的NF-κB活化所激活。

为了研究E2F6如何受AKT调节，评估GBM中由EGFRvIII调控的E2F6启动子的染色质状态细胞系。使用针对H3K4me3和p-NF-κB(p-p65)的抗体和4对E2F6启动子特异性基因组PCR引物进行了ChIP-PCR分析。结合启动子区域的H3K4me3和NF-κB的量增加(图7E)。相反，使用MK-2206阻断AKT产生了完全不同的结果(图7F)。这些研究揭示E2F6转录在EGFRvIII/PI3K/AKT途径中受H3K4me3和NF-κB调节(图7G)。

5.E2F6是一种增加TMZ敏感的治疗靶点

首先将编码E2F6和U87EGFRvIII细胞的慢病毒与编码E2F6siRNA#1(E2F6KD)的慢病毒一起转导U87细胞。通过颅内注射这四组细胞来构建原位小鼠模型。每组用5mg/kg/d的DMSO或TMZ治疗，2天后停药5天，持续两周(图8A)。进行生物发光成像测定以显示在E2F6过表达后U87细胞显示出对TMZ的高度抗性(图8B)，而U87EGFRvIII细胞在E2F6的敲低后显示出对TMZ的显着敏感性(图8C)。过表达或沉默E2F6不影响这些小鼠的体重或总体存活时间。然而，由TMZ治疗的E2F6过表达组的小鼠在其总体存活时间期间以更慢的速率降低体重(图8D)，而TMZ治疗的U87EGFRvIII的E2F6沉默在它们的期间以更快的速率总生存时间(图8E)。值得注意的是，Kaplan-Meier生存曲线分析显示E2F6过表达的肿瘤患者预后较差(图8F)，TMZ治疗后E2F6沉默的肿瘤预后较好(图8G)，表明E2F6起关键作用在TMZ抵抗中。然后我们通过免疫组化检测到p-NF-κB和E2F6的表达，p-NF-κB和E2F6在EGFRvIII中增加甚至被TMZ处理。综上所述，这些数据显示E2F6是与TMZ抗性GBM相关的易感性，靶向E2F6是TMZ耐药性GBM患者的治疗策略。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 天津医科大学总医院

北京市神经外科研究所

<120> E2F6抑制剂的功能与用途

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaggaacuuu cugacuuau 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

augucuauuu gugugaagu 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acuuagauua cugaguaau 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagcaaagt gaagaattgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgagagcact tcatggataa 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggtatcgt ggaaggactc atg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgctgtag ccaaattcgt tgt 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggtgtgttg cctttttatt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacaacgtcc aatttcagtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cactgaaatt ggacgttgtt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtcagtgt tgatgcttag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctctgcgg ctcagaactt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agggaacagg ggtgagagaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttcctttgc cagcctctcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgcagacgg aaaaagagga 20

<210> 16

<211> 3246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgcgcagag gggggcggtg tactgcgcat gcgggaagat ggcgggccgg gcgacttgag 60

atccgcgggt ctccctcctc tttttccgtc tgcgtcggga gctcccgggc acgtgaggcc 120

gtgccgcgtt tactggcggg cgggacggcc tagccgggcg gcgcctcgga ggaagccgcg 180

gaccccttag gtgctgggcc cttggaaatc ggcgcgtggg gggcggtgct cgagctgagc 240

gcgagagggc gggagagctc gtggggtgcg aggggagcag gacgcccggc cgggcagcat 300

gagtcagcag cggccggcga ggaagttacc cagtctcctc ctggacccga cggaggagac 360

ggttcgccgt cggtgccgag accccatcaa cgtggagggc ctgctgccat caaaaataag 420

gattaattta gaagataatg tacaatatgt gtccatgaga aaagctctaa aagtgaagag 480

acctcgtttt gatgtatcgc tggtttattt aactcgaaaa tttatggatc ttgtcagatc 540

tgctcccggg ggtattcttg acttaaacaa ggttgcaacg aaactgggag tccgaaagcg 600

gagagtgtat gacatcacca atgtcttaga tggaatcgac ctcgttgaaa agaaatccaa 660

gaaccatatt agatggatag gatctgatct tagcaatttt ggagcagttc cccaacaaaa 720

gaagctacag gaggaacttt ctgacttatc agcaatggaa gatgctttgg atgagttaat 780

taaggattgt gctcagcagc tgtttgagtt aacagatgac aaagaaaatg aaagactagc 840

atatgtgacc tatcaagaca ttcatagcat tcaggccttc catgaacaga tcgtcattgc 900

agttaaagct ccagcagaaa ccagattgga tgttccagct cccagagaag actctatcac 960

agtgcacata aggagcacca acggacctat cgatgtctat ttgtgtgaag tggagcaggg 1020

tcagaccagt aacaaaaggt ctgaaggtgt cgggacctct tcatctgaga gcactcatcc 1080

agaaggccct gaggaagaag aaaatcctca gcaaagtgaa gaattgcttg aagtaagcaa 1140

ctgatggcat ttgagaattt atgtatcact gagttttttg ggaatatctt cgtggagaat 1200

tacgcatcaa atttgattct cagagcaata aattatccat gaagtgctct cgttctcagt 1260

agcggcatca tggccagtag tgtctttgag gagttcacca cttagattac tgagtaattg 1320

tggtttccac atttgaaaac aactcctttt ataattattc actgcttttt gtcagtgaaa 1380

tagacatctt gcctcctgaa gtagcttcat cacagagtgt catgaagaca gacagtcagg 1440

ctgaaatgga cagttctttg tggactctac ccttcccttc aaggagtatg tcatatatca 1500

caaaagaaat tgccttacac tggttcatgt ttgcagttac tgttgtacat tgcatagatg 1560

tacacacgaa tttaaatgtg atgtctttgt atatatctgt ataatgttga gattacttac 1620

gaaatatgtc tgagtgacac ttttcaccct tgtacagcca aaataatgta tatatggaaa 1680

gtgacagaca aattctctaa tctctttggt acctataact tattagaatc ctctggatga 1740

gggttagaag agactttttc caaacttcta catgtagaag tatcataaat gtgctacaca 1800

tttatgtttg tggatttaat taaagtattt taatatggtt ttcagtgcta aaattggagt 1860

cagatacttc ttggttttaa gctgtctacc taattgctgt ctcccagcag actggtggca 1920

tgcccagtgg ctttgggggc aaggatagaa atgccatcag gaaatagctg aattcattgt 1980

gaaacatgaa ttcagtcatg gtgataattg gaaactcctt tcaggttttt gcaagtagat 2040

tttgtaatgt ttgtgtatgc agccttgctg ttgagtcagt ccaaggggtt ttacttagga 2100

caagttgtac cttgccctct ctccagctct gctcccacat tttcacatac ctagctgttt 2160

ctacctcatt gggtaagtca tttaccactc tgtgcctcag tttactctgt agtttaccat 2220

tagactgtga gctccttgag ggactttgtc ataatcactg ttacatccca gtgcctcaca 2280

ccatgcctgg cccttaagaa gtgctcaata aatgtctgaa caaataagtg agtggagtga 2340

gtgaattgta agatcagaat aataatattt ggtttgtcta tcgtacaaga ttcctgtatc 2400

gtttgaatat tgcttttaaa gaaatatttg aagcgacttc aaattcagac tgtgtttaaa 2460

aagatttaaa atcggaatcc aaaatcaaag tattaaaaaa taatgctgag tgtttaggat 2520

tcacatacct ctgagctctg gtggcttttg ccagtcctgt ccctctgctg agcaccagcc 2580

cttcctgcag cagtcctgcc ggtgtgtttc tgtgcacctg gggatgaagt gtgctcctcc 2640

cccagcggtt agcctcaatg cttttcctcc ctctgtttta ttatttgaaa ttagccaaag 2700

aaaagctgca gggggcactg ctgatcatca ctggactggt gggtcgtact gtttgacaga 2760

atagggaata caggaggagg agcaagccta gggtaaaact taggtttggg acatgcttga 2820

tgaaagcaag agttgagcag gttgttgtgt gtatgtaggt caggtgctca gcggaaaagt 2880

ctgagctgtg tagtacgtca ggcagatgtc agtttagatg cgatagttta agccacaaga 2940

gtaggagagg tcatctaaag agtacagcag gcctaagggc atctatattt aaggagaaat 3000

acagaagaag tctcctgaga aggaataatg gggcgggtgg ggagggagaa ggcagtgtcc 3060

caaaaaccaa caaaggtttt accaaaggta ataccatcat ttctgagcag cagttcctta 3120

acttgtgaat gtggcaaatg ttctccttta caaattgttc tgaaggtaaa atgagatcat 3180

gtaaacgaaa atcctttgta aattacagat gtgtgttata aatgaagtat ctctcgagtc 3240

actcca 3246

<210> 17

<211> 2595

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcgcgcagg cgcggccgga ttccgggcag tgacgcgacg gcgggccgcg cggcgcattt 60

ccgcctctgg cgaatggctc gtctgtagtg cacgccgcgg gcccagctgc gaccccggcc 120

ccgcccccgg gaccccggcc atggacgaac tgttccccct catcttcccg gcagagccag 180

cccaggcctc tggcccctat gtggagatca ttgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct 240

tccgctacaa gtgcgagggg cgctccgcgg gcagcatccc aggcgagagg agcacagata 300

ccaccaagac ccaccccacc atcaagatca atggctacac aggaccaggg acagtgcgca 360

tctccctggt caccaaggac cctcctcacc ggcctcaccc ccacgagctt gtaggaaagg 420

actgccggga tggcttctat gaggctgagc tctgcccgga ccgctgcatc cacagtttcc 480

agaacctggg aatccagtgt gtgaagaagc gggacctgga gcaggctatc agtcagcgca 540

tccagaccaa caacaacccc ttccaagttc ctatagaaga gcagcgtggg gactacgacc 600

tgaatgctgt gcggctctgc ttccaggtga cagtgcggga cccatcaggc aggcccctcc 660

gcctgccgcc tgtcctttct catcccatct ttgacaatcg tgcccccaac actgccgagc 720

tcaagatctg ccgagtgaac cgaaactctg gcagctgcct cggtggggat gagatcttcc 780

tactgtgtga caaggtgcag aaagaggaca ttgaggtgta tttcacggga ccaggctggg 840

aggcccgagg ctccttttcg caagctgatg tgcaccgaca agtggccatt gtgttccgga 900

cccctcccta cgcagacccc agcctgcagg ctcctgtgcg tgtctccatg cagctgcggc 960

ggccttccga ccgggagctc agtgagccca tggaattcca gtacctgcca gatacagacg 1020

atcgtcaccg gattgaggag aaacgtaaaa ggacatatga gaccttcaag agcatcatga 1080

agaagagtcc tttcagcgga cccaccgacc cccggcctcc acctcgacgc attgctgtgc 1140

cttcccgcag ctcagcttct gtccccaagc cagcacccca gccctatccc tttacgtcat 1200

ccctgagcac catcaactat gatgagtttc ccaccatggt gtttccttct gggcagatca 1260

gccaggcctc ggccttggcc ccggcccctc cccaagtcct gccccaggct ccagcccctg 1320

cccctgctcc agccatggta tcagctctgg cccaggcccc agcccctgtc ccagtcctag 1380

ccccaggccc tcctcaggct gtggccccac ctgcccccaa gcccacccag gctggggaag 1440

gaacgctgtc agaggccctg ctgcagctgc agtttgatga tgaagacctg ggggccttgc 1500

ttggcaacag cacagaccca gctgtgttca cagacctggc atccgtcgac aactccgagt 1560

ttcagcagct gctgaaccag ggcatacctg tggcccccca cacaactgag cccatgctga 1620

tggagtaccc tgaggctata actcgcctag tgacaggggc ccagaggccc cccgacccag 1680

ctcctgctcc actgggggcc ccggggctcc ccaatggcct cctttcagga gatgaagact 1740

tctcctccat tgcggacatg gacttctcag ccctgctgag tcagatcagc tcctaagggg 1800

gtgacgcctg ccctccccag agcactgggt tgcaggggat tgaagccctc caaaagcact 1860

tacggattct ggtggggtgt gttccaactg cccccaactt tgtggatgtc ttccttggag 1920

gggggagcca tattttattc ttttattgtc agtatctgta tctctctctc tttttggagg 1980

tgcttaagca gaagcattaa cttctctgga aaggggggag ctggggaaac tcaaactttt 2040

cccctgtcct gatggtcagc tcccttctct gtagggaact ctggggtccc ccatccccat 2100

cctccagctt ctggtactct cctagagaca gaagcaggct ggaggtaagg cctttgagcc 2160

cacaaagcct tatcaagtgt cttccatcat ggattcatta cagcttaatc aaaataacgc 2220

cccagatacc agcccctgta tggcactggc attgtccctg tgcctaacac cagcgtttga 2280

ggggctggcc ttcctgccct acagaggtct ctgccggctc tttccttgct caaccatggc 2340

tgaaggaaac cagtgcaaca gcactggctc tctccaggat ccagaagggg tttggtctgg 2400

gacttccttg ctctccctct tctcaagtgc cttaatagta gggtaagttg ttaagagtgg 2460

gggagagcag gctggcagct ctccagtcag gaggcatagt ttttactgaa caatcaaagc 2520

acttggactc ttgctctttc tactctgaac taataaatct gttgccaagc tggctagaaa 2580

aaaaaaaaaa aaaaa 2595

Claims

1.E2F6抑制剂用于制备替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤增效药物或用于与替莫唑胺联合制备胶质母细胞瘤治疗药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述E2F6抑制剂是指对于E2F6或NF-κB具有抑制效果的分子。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述E2F6抑制剂抑制E2F6活性，或者抑制E2F6基因转录或表达，或者抑制NF-κB活性，或者抑制NF-κB基因转录或表达。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述E2F6抑制剂为siRNA、shRNA、抗体、或小分子化合物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3任一序列所示。

6.一种胶质母细胞瘤治疗药物组合，包括有效量的E2F6抑制剂和有效量的替莫唑胺。

7.如权利要求6所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述E2F6抑制剂是指对于E2F6或NF-κB具有抑制效果的分子。

8.如权利要求6或7所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述E2F6抑制剂抑制E2F6活性，或者抑制E2F6基因转录或表达，或者抑制NF-κB活性，或者抑制NF-κB基因转录或表达。

9.如权利要求8所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述E2F6抑制剂为siRNA、shRNA、抗体、或小分子化合物。

10.如权利要求9所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3任一序列所示。

11.如权利要求6-10任一所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：(1)将E2F6抑制剂和替莫唑胺分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；(2)将E2F6抑制剂和替莫唑胺配制成复方制剂。

12.如权利要求6-10任一所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述胶质母细胞瘤治疗药物组合的有效成分还包括至少一种其他胶质母细胞瘤治疗药物。

13.根据权利要求12所述的胶质母细胞瘤治疗药物组合，其特征在于，所述治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：(1)将E2F6抑制剂、替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦相同或不同；(2)将E2F6抑制剂、替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂；(3)将替莫唑胺和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将E2F6抑制剂配制成独立制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦相同或不同；(4)将替莫唑胺和E2F6抑制剂配制成复方制剂，将其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成独立制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦相同或不同；(5)将E2F6抑制剂和其他胶质母细胞瘤治疗药物配制成复方制剂，将替莫唑胺配制成独立制剂，制剂的剂型相同或不同，给药途径亦相同或不同。