CN106544440A - hsa‑let‑7家族miRNA及其靶基因在EBOV感染诊断和治疗中的应用 - Google Patents

hsa‑let‑7家族miRNA及其靶基因在EBOV感染诊断和治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了hsa‑let‑7家族miRNA及其靶基因在EBOV感染诊断和治疗中的应用。本发明公开的hsa‑let‑7家族miRNA为hsa‑let‑7a‑5p、hsa‑let‑7b‑5p、hsa‑let‑7c‑5p、hsa‑let‑7d‑5p和hsa‑let‑7f‑5p，hsa‑let‑7家族miRNA靶基因为MAB21L3基因、MEIS3基因、DPP6基因、IGDCC3基因、CHRD基因、FASLG基因、LIN28基因、E2F5基因、IL‑6基因和E2F6基因。hsa‑let‑7家族及其靶基因可作为生物分子标识用于诊断EBOV感染，也可作为生物靶标分子用于抗EBOV感染药物设计。

Description

hsa-let-7家族miRNA及其靶基因在EBOV感染诊断和治疗中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，hsa-let-7家族miRNA及其靶基因在EBOV感染诊断和治疗中的应用。
背景技术
埃博拉病毒病是由纤丝病毒科(filoviridae)的埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)所引起的一种急性出血性传染病。病死率很高，可达50％～90％。
埃博拉病毒基因组为单股负链RNA，约长19kb，能编码核蛋白(NP)及包膜蛋白(VP35、VP40、VP30、VP24)、糖蛋白(GP)和RNA聚合酶等7个结构蛋白，其中GP基因对EBOV复制有独特的编码和转录功能。病毒在感染细胞的胞质中复制、装配，以芽生方式释放。埃博拉病毒主要包括扎伊尔型(EBOV-Z)，苏丹型(EBOV-S)，科特迪瓦型(EBOV-C)及雷斯顿型(EBOV-R)等，不同亚型的特性不同，其中扎伊尔型毒力最强，苏丹型次之，两者对人类和非人灵长类的致死率很高。雷斯顿型和科特迪瓦型对人的毒力较低，表现为亚临床感染，但对非人灵长类具有致命性。
EBOV是一种人兽共患病毒，其传播途径尚不明确，通常由与人类密切接触到感染动物的血液、分泌物、器官或其他体液造成感染，而直接接触感染者的体液等均可造成人际传播。各种非人灵长类动物和人类普遍易感。因此，感染者家属、医务人员、检验人员、在埃博拉病毒流行现场的工作人员，感染动物接触者等均是高危人群。
EBOV是一种泛嗜性的病毒，可侵犯各系统器官，尤以肝、脾损害为重。本病的发生与机体的免疫应答水平有关。单核吞噬细胞系统尤其是吞噬细胞是首先被病毒攻击的靶细胞，随后成纤维细胞和内皮细胞均被感染，血管通透性增加，纤维蛋白沉着。感染后2天病毒首先在肺中检出，4天后在肝、脾等组织中检出，6天后全身组织均可检出。
目前许多关于病毒致病性的研究都是在动物模型和体外实验中进行的，而关于人体病毒感染的相关研究少。病毒感染机体的每个阶段，从病毒进入细胞、局部复制、传播(病毒血症)、在靶器官内繁殖、患者康复(但仍带毒)或死亡，均存在两种因素的相互制约：病毒感染和宿主机体应答与防御。研究EBOV对人类的致病机理和免疫逃逸机制，进而根据这些关键步骤，确定新型靶标位点，研发治疗药物，对于埃博拉出血热的综合防控具有重要意义。同时，研究人体感染EBOV的反应特征，发现感染和预后特征性的分子标识，对于建立快速诊断方法、建立及时有效干预方案可以提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诊断EBOV感染及如何设计治疗和/或预防EBOV感染的药物靶点。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述R1)-R8)中的任一应用：
R1)hsa-let-7家族成员作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
R2)所述hsa-let-7家族成员作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
R3)hsa-let-7家族成员靶基因作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
R4)hsa-let-7家族成员靶基因作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
R5)检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
R6)检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用；
R7)检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
R8)检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用。
上述应用中，所述检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统可为利用现有技术中的方法检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器，如利用高通量测序检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用定量PCR检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用northern杂交技术检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器，或利用基因芯片检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器。
上述应用中，所述高通量测序可利用Illumina测序平台进行。
上述应用中，所述检测hsa-let-7家族成员表达水平和所述检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统还均可包括数据处理系统，所述数据处理系统用来分析现有技术中的方法直接得到的结果，确定hsa-let-7家族成员表达水平和hsa-let-7家族成员靶基因表达水平。所述数据处理系统可为软件和/或模块。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1)-M4)中的任一应用：
M1)hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
M2)所述蛋白质作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
M3)检测所述蛋白质含量的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
M4)检测所述蛋白质含量的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用。
上述应用中，所述检测所述蛋白质含量的系统可为利用现有技术中的方法检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器，如利用质谱或其相关技术检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器，或利用免疫杂交技术检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器，或利用ELISA技术检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器，或利用蛋白芯片或试纸检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述N1)-N6)中任一所述应用：
N1)以hsa-let-7家族成员作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在下述a1)或a2)中的应用：
a1)制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品；
a2)诊断或辅助诊断EBOV感染；
N2)以hsa-let-7家族成员靶基因作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在上述a1)或a2)中的应用；
N3)以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在上述a1)或a2)中的应用；
N4)以hsa-let-7家族成员作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用；
N5)以hsa-let-7家族成员靶基因作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用；
N6)以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用。
N1)所述系统可为上文所述检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统。
N2)所述系统可为上文所述检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述W1)-W6)任一所述产品：
W1)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员为靶点；
W2)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员靶基因为靶点；
W3)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质为靶点；
W4)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统；
W5)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统；
W6)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质含量的系统。
为解决上述技术问题，本发明还提供了非诊断目的的EBOV感染相关分子特征谱的构建方法。
本发明所提供的非诊断目的的EBOV感染相关分子特征谱的构建方法，包括：分别对EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA或蛋白质进行定量分析，根据分析结果获得EBOV病毒载量相关分子特征谱；所述EBOV病毒载量相关分子特征谱为hsa-let-7家族成员、hsa-let-7家族成员靶基因或hsa-let-7家族成员靶基因编码的蛋白质。
上述方法中，所述对EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA或蛋白质进行定量分析具体还可包括：纯化EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA或蛋白质，利用Illumina测序平台检测RNA或蛋白质的含量。
所述纯化EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA或蛋白质可利用带有Oligo(dT)的磁珠进行。
所述利用Illumina测序平台检测RNA或蛋白质的含量可包括：将纯化后的RNA片段化，并以此为模板反转录合成双链cDNA：对所述双链cDNA进行末端修复补齐，使其5’端磷酸化，3’端加“A”；将带3’dTMP端的双链cDNA接头连到测序接头上，通过PCR扩增，利用AMPureXP磁珠富集纯化接头产物，得到文库；将构建好的文库用Illumina测序平台进行双末端测序，检测待测样本中RNA或蛋白质的含量。
上文中，所述hsa-let-7家族成员表达水平可为血液中hsa-let-7家族成员的表达水平。所述hsa-let-7家族成员靶基因表达水平可为血液中hsa-let-7家族成员靶基因的表达水平。所述hsa-let-7家族成员靶基因编码的蛋白质含量可为血液中hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质的含量。
上文中，所述治疗和/或预防EBOV感染产品可为药物或疫苗。所述诊断或辅助诊断EBOV感染产品可为医药和/或卫生器械，如试剂、试纸、材料或仪器。
上文中，所述hsa-let-7家族成员可为hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和/或hsa-let-7f-5p。
所述hsa-let-7家族成员靶基因可为MAB21L3基因、MEIS3基因、DPP6基因、IGDCC3基因、CHRD基因、FASLG基因、LIN28基因、E2F5基因、IL-6基因和/或E2F6基因。所述hsa-let-7家族成员靶基因编码的蛋白质可为MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和/或E2F6蛋白质。
其中，MAB21L3基因、MEIS3基因、DPP6基因、IGDCC3基因、CHRD基因、FASLG基因、LIN28基因、E2F5基因、IL-6基因和E2F6基因均为hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p的靶基因。
在实际应用中，可通过比较hsa-let-7家族中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)及其靶基因(MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和E2F6)在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：如待测对象的hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p中至少有一个的表达水平低于非EBOV感染者相应分子的1/4或MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和E2F6中至少有一个的表达水平高于非EBOV感染者相应分子的3倍，所述待测对象为或候选为EBOV感染者；如所述待测对象的hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p的表达水平均不低于非EBOV感染者相应分子的1/4且MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和E2F6的表达水平均不高于非EBOV感染者相应分子的3倍，所述待测对象为或候选为非EBOV感染者。
本发明通过分析EBOV感染者与非EBOV感染者差异表达miRNA，发现属于1个miRNA家族(hsa-let-7家族)中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)，在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达量显著下降(p<0.01)，而这5个miRNA的靶基因(MAB21L3基因、MEIS3基因、DPP6基因、IGDCC3基因、CHRD基因、FASLG基因、LIN28基因、E2F5基因、IL-6基因和E2F6基因)相应的显著增高(p<0.0001)。hsa-let-7家族miRNAs可以调控免疫应答相关分子IL-6、IGDCC3，肝损伤相关分子CHRD，细胞死亡相关分子DPP6、FASLG，细胞周期与发育相关分子E2F5、E2F6、MAB21L3、MEIS3，组织修复相关分子LIN28等的基因表达，表明hsa-let-7家族中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)及其靶基因(MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和E2F6)可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断，也可以作为生物靶标分子，用于抗EBOV感染药物的设计。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、参与EBOV感染患者细胞调控的宿主关键分子
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠吸附纯化总RNA中的mRNA，在加热条件下将mRNA片段化，并以此为模板反转录合成双链cDNA。对双链cDNA进行末端修复补齐，使其5’端磷酸化，3’端加“A”。将带3’dTMP端的双链cDNA接头连到测序接头上，通过PCR扩增，利用AMPure XP磁珠富集纯化接头产物，通过PCR反应鉴定文库。将构建好的文库用Illumina测序平台进行双末端测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(Q<＝20的碱基数占整条reads的50％以上的序列)、低复杂度序列。
使用Tophat软件将有效数据比对到人参考基因组上，Cutfflinks软件组装比对结果，通过Cutffdiff软件得出EBOV感染者(n＝22)与非EBOV感染者(n＝10)相比的差异表达基因，进一步通过相关性分析，发现与EBOV感染决定宿主细胞命运有关的生物分子。结果显示，22个宿主关键分子与EBOV感染导致的细胞通路调控密切相关(p<0.0001，差异表达倍数>2；TYRO3除外，TYRO3的p值为0.0024)，这22个分子分别为：细胞凋亡相关分子TNF，TP53，CASP9，CASP7，BAX，CASP6和CASP8；细胞坏死相关分子TNF，TRAF2，CIAPIN1和RIPK3；细胞吞噬相关受体TYRO3，MSR1，MARCO，HAVCR1，TPCN2和TPCN1；细胞自噬相关分子IRS1，AKT2，TP53，MTOR，ULK1，LRSAM1和LAMP2；其中，除了CASP8和LAMP2在EBOV感染者中呈现显著的表达下调外，其它分子在EBOV感染者中均出现显著的表达上调，具体结果如表1所示，表明这22个分子可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断。
表1决定EBOV病毒感染宿主细胞命运的关键生物分子
注：表1中列出了22个分子在EBOV感染者中相对于非EBOV感染者中表达差异倍数(中位数FKPM值)及差异统计学分析结果(P值)。其中，TRAF2为TNF receptor associatedfactor 2的简称，TP53为tumor protein p53的简称；CASP9为caspase 9的简称；RIPK3为receptor-interacting serine-threonine kinase3的简称；CASP7为caspase 7的简称；CIAPIN1为cytokine induced apoptosis inhibitor 1的简称；TNF为tumor necrosisfactor的简称；BAX为BCL2associated X的简称；CASP6为caspase 6的简称；TYRO3为TYRO3protein tyrosine kinase 3的简称；MSR1为macrophage scavenger receptor 1的简称；MARCO为macrophage receptor with collagenous structure的简称；HAVCR1为hepatitis A virus cellular receptor 1的简称；IRS1为insulin receptor substrate1的简称；LRSAM1为leucine rich repeat and sterile alpha motif containing 1的简称；TPCN2为two pore segment channel 2的简称；TPCN1为two pore segment channel 1的简称；ULK1为unc-51 like autophagy activating kinase 1的简称；AKT2为AKTserine/threonine kinase 2的简称；MTOR为mechanistic target of rapamycin的简称；CASP8为caspase 8的简称；LAMP2为lysosomal-associated membrane protein 2的简称。
在实际应用中，可通过比较TRAF2、TP53、CASP9、RIPK3、CASP7、CIAPIN1、TNF、BAX、CASP6、TYRO3、MSR1、MARCO、HAVCR1、IRS1、LRSAM1、TPCN2、TPCN1、ULK1、AKT2和MTOR以及CASP8、LAMP2在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：如待测对象的TRAF2、TP53、CASP9、RIPK3、CASP7、CIAPIN1、TNF、BAX、CASP6、TYRO3、MSR1、MARCO、HAVCR1、IRS1、LRSAM1、TPCN2、TPCN1、ULK1、AKT2和MTOR中至少有一个的表达水平高于非EBOV感染者相应分子的2倍或CASP8和LAMP2中至少有一个的表达水平低于非EBOV感染者相应分子的1/2，该待测对象疑似EBOV感染者；如待测对象的TRAF2、TP53、CASP9、RIPK3、CASP7、CIAPIN1、TNF、BAX、CASP6、TYRO3、MSR1、MARCO、HAVCR1、IRS1、LRSAM1、TPCN2、TPCN1、ULK1、AKT2和MTOR的表达水平均不高于非EBOV感染者相应分子的2倍且CASP8和LAMP2的表达水平均不低于非EBOV感染者相应分子的1/2，该待测对象为非EBOV感染者。
TRAF2、TP53、CASP9、RIPK3、CASP7、CIAPIN1、TNF、BAX、CASP6、TYRO3、MSR1、MARCO、HAVCR1、IRS1、LRSAM1、TPCN2、TPCN1、ULK1、AKT2和MTOR以及CASP8和LAMP2这22个分子在EBOV感染患者血液细胞的高表达能够诱导宿主细胞高效吞噬病毒颗粒，但是却没法快速清除病毒，使得病毒在细胞内成功复制，并通过坏死和凋亡使得复制的病毒在体内扩散。这些结果表明这些宿主细胞的关键分子参与并决定着EBOV感染患者机体细胞的命运，参与EBOV在机体中的感染过程，可以作为关键靶标分子，用于抗埃博拉病毒感染药物的设计和指导临床干预手段的策略选择。
本发明还另外选取了6个非EBOV感染者以及20例EBOV感染者的血液样本，利用定量RT-PCR技术检测了这22个分子中的RIPK3基因和Casp6基因在这些研究对象血液中的表达水平。其中，RIPK3基因的引物序列为5’-CGGGCGCAACATAGGAAGT-3’(序列1)和5’-CTTCTAGGCGCAGCACGAAT-3’(序列2)，Casp6基因的引物序列为5'-GTCAACTGTTAGCCACGCAGAT-3'(序列3)和5'-AACCAGGCTGTGACACTTGTCT-3'(序列4)。
结果发现，RIPK3基因和Casp6基因在EBOV感染者血液中的表达水平均显著低于非EBOV感染者血液中相应细胞因子表达水平(表2)，表明，RIPK3和Casp6是可以作为标志物辅助诊断EBOV感染者的，还可以作为关键靶标分子，用于抗埃博拉病毒感染药物的设计和指导临床干预手段的策略选择。
表2、细胞死亡相关基因(RIPK3,CASP6)RT-PCR实验结果
实施例2、参与EBOV感染损伤调控的小RNAs(sRNAs)
从EBOV感染者与非EBOV感染者全血中提取总RNA，利用15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)从总RNA中分离小片段(15-30nt)RNA，纯化后对分离的小片段RNA连接3’和5’端接头，再运用SuperScriptII反转录酶(Invitrogen产品)将连接有接头的RNA进行反转录，合成cDNA。然后，进行PCR扩增，扩增程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，14个循环，72℃延伸8min，由此构建文库。最后，扩展产物利用Illumina测序平台进行高通量测序。使用Perl脚本过滤测序产生的原始数据中的接头序列、两端低质量序列(sQ<＝5的碱基数占整条reads的50％以上的序列、N的比例大于10％的序列、polyA/T/G/C序列)。
使用bowtie软件将长度筛选后的sRNA有效数据比对到人参考基因组上，分析sRNAs在参考基因组上的分布和表达情况，将比对上的序列与miRBase序列进行比对，获得miRNA信息，同时尽可能的去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA。结合样本信息得出EBOV感染者(n＝12)与非EBOV感染者(n＝3)相比的差异表达miRNA，进一步通过相关性分析，发现与EBOV病毒感染相关的miRNA。结果显示，属于1个miRNA家族(hsa-let-7家族)中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)，它们在EBOV感染者中相对于非EBOV感染健康人中表达量显著下降(p<0.01，差异表达倍数>4)，而它们的靶基因相应的显著增高(p<0.0001，差异表达倍数>3)，具体结果如表3、表4所示。hsa-let-7家族miRNAs可以调控免疫应答相关分子IL6、IGDCC3，肝损伤相关分子CHRD，细胞死亡相关分子DPP6、FASLG，细胞周期与发育相关分子E2F5、E2F6、MAB21L3、MEIS3，组织修复相关分子LIN28等的基因表达，这些结果表明hsa-let-7家族中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)及其靶基因(MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL6和E2F6)可以作为生物分子标识，用于EBOV感染者的临床诊断，也可以作为生物靶标分子，用于抗EBOV感染药物的设计。
其中，MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL6和E2F6均为hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p的靶基因。
在实际应用中，可通过比较hsa-let-7家族中的5个miRNA(hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p)及其靶基因(MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL6和E2F6)在待测对象与非EBOV感染者血液中的表达水平来判断待测对象是否为EBOV感染者。具体的，根据上述结果得到的判断标准如下：如待测对象的hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p中至少有一个的表达水平低于非EBOV感染者相应分子的1/4或MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL6和E2F6中至少有一个的表达水平高于非EBOV感染者相应分子的3倍，该待测对象疑似EBOV感染者；如待测对象的hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和hsa-let-7f-5p的表达水平均不低于非EBOV感染者相应分子的1/4且MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL6和E2F6的表达水平均不高于非EBOV感染者相应分子的3倍，该待测对象为非EBOV感染者。
表3、参与EBOV感染损伤调控的miRNAs
注：表3中列出了hsa-let-7家族的5个miRNA在EBOV感染者和非EBOV感染者中的表达水平(中位数TPM值)及差异统计学分析结果(P值)。
表4、hsa-let-7家族miRNA的靶基因在EBOV感染者中差异表达
注：表4中列出了hsa-let-7家族miRNA的靶基因在EBOV感染者和非EBOV感染者中的表达水平(中位数FKPM值)及差异统计学分析结果(P值)。其中，MAB21L3为mab-21-like 3的简称；MEIS3为Meis homeobox3的简称；DPP6为dipeptidyl peptidase like 6的简称；IGDCC3为immunoglobulin superfamily,DCC subclass,member 3的简称；CHRD为chordin的简称；FASLG为Fas ligand的简称；LIN28为lin-28homolog的简称；E2F5为E2Ftranscription factor 5的简称；IL6为interleukin 6的简称；E2F6为E2F transcriptionfactor 6的简称。
<110> 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cgggcgcaac ataggaagt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cttctaggcg cagcacgaat 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gtcaactgtt agccacgcag at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
aaccaggctg tgacacttgt ct 22

Claims (9)

1.下述R1)-R8)中的任一应用：
R1)hsa-let-7家族成员作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
R2)所述hsa-let-7家族成员作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
R3)hsa-let-7家族成员靶基因作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
R4)hsa-let-7家族成员靶基因作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
R5)检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
R6)检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用；
R7)检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
R8)检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统为检测hsa-let-7家族成员表达水平所需的试剂和/或仪器；和/或，所述检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统为检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平所需的试剂和/或仪器。
3.下述M1)-M4)中的任一应用：
M1)hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为靶点在制备治疗和/或预防EBOV感染产品中的应用；
M2)所述蛋白质作为靶点在治疗和/或预防EBOV感染中的应用；
M3)检测所述蛋白质含量的系统在制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品中的应用；
M4)检测所述蛋白质含量的系统在诊断或辅助诊断EBOV感染中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测所述蛋白质含量的系统为检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器。
5.下述N1)-N6)中任一所述应用：
N1)以hsa-let-7家族成员作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在下述a1)或a2)中的应用：
a1)制备诊断或辅助诊断EBOV感染产品；
a2)诊断或辅助诊断EBOV感染；
N2)以hsa-let-7家族成员靶基因作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在上述a1)或a2)中的应用；
N3)以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为EBOV感染标志物的诊断或辅助诊断EBOV感染方法中所用的系统在上述a1)或a2)中的应用；
N4)以hsa-let-7家族成员作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用；
N5)以hsa-let-7家族成员靶基因作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用；
N6)以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质作为EBOV感染标志物在上述a1)或a2)中的应用。
6.下述W1)-W6)任一所述产品：
W1)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员为靶点；
W2)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员靶基因为靶点；
W3)治疗和/或预防EBOV感染产品，以hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质为靶点；
W4)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员表达水平的系统；
W5)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员靶基因表达水平的系统；
W6)诊断或辅助诊断EBOV感染产品，为检测hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质含量的系统。
7.根据权利要求1-5中任一所述应用或权利要求6所述产品，其特征在于：所述hsa-let-7家族成员靶基因表达水平为血液中hsa-let-7家族成员靶基因的表达水平；所述hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质含量为血液中hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质的含量。
8.根据权利要求1-5中任一所述应用，或权利要求6所述产品，或权利要求7所述的应用或产品，其特征在于：所述hsa-let-7家族成员为hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-5p和/或hsa-let-7f-5p；
和/或，所述hsa-let-7家族成员靶基因为MAB21L3基因、MEIS3基因、DPP6基因、IGDCC3基因、CHRD基因、FASLG基因、LIN28基因、E2F5基因、IL-6基因和/或E2F6基因；
和/或，所述蛋白质为MAB21L3、MEIS3、DPP6、IGDCC3、CHRD、FASLG、LIN28、E2F5、IL-6和/或E2F6蛋白质。
9.EBOV感染相关分子特征谱的构建方法，包括：分别对EBOV感染组和非EBOV感染组血液中的RNA或蛋白质进行定量分析，根据分析结果获得EBOV病毒载量相关分子特征谱；所述EBOV病毒载量相关分子特征谱为hsa-let-7家族成员、hsa-let-7家族成员靶基因或hsa-let-7家族成员靶基因编码蛋白质。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109512833A (zh) * 2018-12-04 2019-03-26 天津医科大学总医院 E2f6抑制剂的功能与用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUTCHINSON等: "Cytokine and Chemokine Expression in Humans Infected with Sudan Ebola Virus", 《THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES》 *
PENG YU等: "miR-208-3p promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion through regulating ARID2 expression", 《EXPERIMENTAL CELL RESEARCH》 *
VICTORIA WAHL-JENSEN等: "Role of Ebola Virus Secreted Glycoproteins and Virus-Like Particles in Activation of Human Macrophages", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
樊代明: "《肿瘤研究前沿》", 30 November 2016, 西安交通大学出版社 *
谢瑞莲等: "let-7及其与肺癌关系的研究现状", 《临床肿瘤学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109512833A (zh) * 2018-12-04 2019-03-26 天津医科大学总医院 E2f6抑制剂的功能与用途
CN109512833B (zh) * 2018-12-04 2020-10-30 天津医科大学总医院 E2f6抑制剂的功能与用途

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