CN102146474B - 人猴通用2型糖尿病检测引物组、pcr芯片及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能同时用于分析人类和食蟹猴2型糖尿病相关基因表达状态的PCR引物组、荧光定量PCR检测芯片及检测方法。一种人猴通用T2DM检测引物组，包括分别用于扩增与T2DM疾病相关的蛋白基因ACE、ACLY、G6PD、GSK3B、HMOX1、IDE、PRKCB1、PYGL、AQP、CCR2B、CEACAM1、CTLA4、GCGR、ICAM1、NSF、RAB4A、SELL、SNAP23B、STX4、STXBP2、TNFRSF1A、VAMP3、VAPA、IFNG、INS、TGFB1、TNFA、IGFBP5、INPPL1、PIK3C2B、PIK3R1、IKBA、NEUROD1、NFKB1、PPARGC1A、AGT的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-72所示的核苷酸序列。本发明还提供了包含有上述PCR引物组的荧光定量PCR检测芯片及检测方法。本发明的有益效果是能够同时对人和猴T2DM疾病相关的基因进行准确定量、检测，对于促进糖尿病的基础研究、预防检测和临床治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及用于分析人类和食蟹猴2型糖尿病相关基因表达状态的PCR引物组、荧光定量PCR检测芯片及检测方法。
背景技术
2型糖尿病（简称T2DM）是糖尿病的一种,又称非胰岛素依赖型糖尿病，其并发症（如糖尿病酮症酸中毒、糖尿病非酮症性高渗综合征、乳酸性酸中毒、高血压、糖尿病足、眼部病变、肾脏病变、神经病变等）发病率以及致残、致死率高；以前曾认为糖尿病是一种中老年性疾病，而近年发现随着儿童及青少年肥胖病的增多，糖尿病发病呈年轻化趋势。
近年来,随着人民生活水平的提高,糖尿病的发病率正逐年升高,糖尿病已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三个严重危害人类健康的非传染性疾病，糖尿病的防治已成为科学工作者的一个重要课题。T2DM是由遗传因素和环境因素共同作用引起，属于多基因疾病。T2DM患者的病情一般比较缓和，如果对糖尿病不能早期诊断并给以恰当的防治，可能出现各种慢性并发症。研究资料表明，在未出现表型症状之前，某些相关基因的表达状态就已在疾病的发生发展中产生了显著变化，因此，通过糖尿病PCR芯片分析糖尿病发病进程各个阶段基因的表达变化，阐明相关基因在糖尿病发生、发展中的表达规律对研究糖尿病的发病机理是非常必要的，同时也利于对糖尿病早发现、早防治。
在糖尿病的研究中，糖尿病实验猴模型尤其是糖尿病食蟹猴模型是重要的研究人类T2DM发生、发展以及治疗的模型，应用广泛。市场上已有的糖尿病PCR芯片主要是对人类、大鼠和小鼠，尚无食蟹猴的PCR芯片，研制食蟹猴模型的糖尿病PCR芯片，对于促进糖尿病的基础研究、预防检测和临床治疗具有重要意义。目前还未见能同时分析人类和食蟹猴T2DM相关基因表达状态的荧光定量PCR芯片，主要困难在于未能获得在同样条件下扩增并用于分析人类和食蟹猴T2DM相关基因表达情况的引物组。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明一方面提供了能够在同样条件下扩增并用于分析人类和食蟹猴T2DM相关基因表达情况的引物组，另一方面还提供了包含有上述引物组的荧光定量PCR检测芯片；同时本发明还提供了上述引物组进行T2DM基因表达情况进行检测的方法。
本发明通过比对人和食蟹猴T2DM疾病相关的蛋白基因在GeneBank中公布的序列，针对共有的特异性序列分别设计引物，通过筛选最终获得本发明的能够在同样条件下扩增，且相互之间扩增效率相近的，能够用于分析人类和食蟹猴T2DM相关基因表达状态的引物组。
所述与人和食蟹猴T2DM疾病相关蛋白包括与糖尿病代谢相关的蛋白：
所述相关蛋白还包括与受体和信号通路相关的蛋白：
所述相关蛋白还包括与分泌因子相关的蛋白：
所述相关蛋白还包括与信号转导相关的蛋白：
所述相关蛋白还包括与转录因子相关的蛋白。
本发明的目的之一在于提供一种人猴通用T2DM相关基因检测引物组，包括分别用于扩增与T2DM相关的基因ACE、ACLY、G6PD、GSK3B、HMOX1、IDE、PRKCB1、PYGL、AQP、CCR2B、CEACAM1、CTLA4、GCGR、ICAM1、NSF、RAB4A、SELL、SNAP23B、STX4、STXBP2、TNFRSF1A、VAMP3、VAPA、IFNG、INS、TGFB1、TNFA、IGFBP5、INPPL1、PIK3C2B、PIK3R1、IKBA、NEUROD1、NFKB1、PPARGC1A、AGT的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-72所示的核苷酸序列。
各基因的扩增引物对对应的核苷酸序列如表1所示。
优选的，所述的人猴通用T2DM检测引物组，还包括分别用于扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物对中的至少两对，所述GAPDH基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；所述YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：75-76所示的核苷酸序列；所述ACTB基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：77-78所示的核苷酸序列；所述B2M基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：79-80所示的核苷酸序列；所述RPL13A基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：81-82所示的核苷酸序列。GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因均为管家基因。
优选的，还包括用于检测PCR效率的扩增引物对，该扩增引物对序列能够扩增在人和食蟹猴中均表达的管家基因的特异性序列。
更优选的,所述用于检测PCR效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列。
优选的，还包括用于检测反转录效率的扩增引物对，该扩增引物对序列能够扩增在人和食蟹猴中均表达的管家基因的特异性序列。
更优选的,所述用于检测反转录效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；
优选的，还包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：83-84所示的核苷酸序列。
本发明的目的之二在于提供一种包括上述任一方案中的人猴通用T2DM相关基因检测引物组的荧光定量PCR检测芯片。
优选的，所述扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的孔中。
更优选的，所述与T2DM相关的基因的扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片还包括用于扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物对中的至少两对，所述GAPDH基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；所述YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：75-76所示的核苷酸序列；所述ACTB基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：77-78所示的核苷酸序列；所述B2M基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：79-80所示的核苷酸序列；所述RPL13A基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：81-82所示的核苷酸序列。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片包括用于扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物对，这些引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
优选的，还包括用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC），该引物对单独存在于96孔PCR板的6个孔中；还包括用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC），该引物对单独存在于96孔PCR板的6个孔中；还包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC），该引物对该单独存在于96孔PCR板的2个孔中，该引物对序列为SEQ ID NO：83-84所示的核苷酸序列。
更优选的，所述用于检测PCR效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；所述用于检测反转录效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列。
更优选的，还包括阳性RNA对照，与用于检测反转录效率的扩增引物对配合使用，检测反转录的效率；还包括阳性PCR对照，与用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC）配合使用。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片中各基因引物在96孔PCR板中的位置如图1所示。
上述各方案保存在96孔PCR板中的引物对可以是液体也可以是粉末。
更优选的，每个96孔PCR板孔中的引物对总量为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同。优选保存在2-8℃。
本发明的目的之三在于提供一种T2DM相关基因表达情况的检测方法，所述方法为利用上述人猴通用T2DM相关基因检测引物组方案中的任一种进行荧光定量PCR检测。通过对T2DM相关基因表达情况的检测，可对人类和食蟹猴外周血糖尿病基因的表达差异比较，对不同阶段人类或食蟹猴外周血糖尿病相关基因的表达情况进行分析，从而确定与T2DM最为相关的基因。
优选的，所述引物组中的各扩增引物对分别在96孔PCR板的各个孔中进行单重荧光定量PCR反应。
更优选的，所述检测方法中还设有管家基因对照，所述管家基因为GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A。该管家基因对照为上述管家基因中的至少两个。各管家基因对照所使用的扩增引物对如下：所述GAPDH基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；所述YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：75-76所示的核苷酸序列；所述ACTB基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：77-78所示的核苷酸序列；所述B2M基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：79-80所示的核苷酸序列；所述RPL13A基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：81-82所示的核苷酸序列。
更优选的，所述管家基因对照分别在于96孔PCR板的2个孔中进行。
更优选的，检测方法中还设有分别用于检测PCR效率、用于检测反转录效率和用于检测是否有DNA污染的对照。
其中，用于检测PCR效率的对照所用的扩增引物对（PPC）单独存在于96孔PCR板的6个孔中，该引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列。
其中，用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC）单独存在于96孔PCR板的6个孔中，该引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列。
其中，用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC）单独存在于96孔PCR板的2个孔中，该引物对序列为SEQ ID NO：83-84所示的核苷酸序列，该引物对能特异性的扩增人或食蟹猴的非转录基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染。
优选的，所述荧光定量PCR反应的条件为：（1）95℃变性30s；（2）95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环。（3）熔解曲线分析，95℃，15s；60℃，1min；按0.3℃/s的升温速度升到95℃；95℃，15s。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明一方面提供了能够在同样条件下扩增并用于分析人类和食蟹猴T2DM相关基因表达情况的引物组，该引物组能够在同一PCR条件下分别高效、特异性的扩增相关基因序列；同时本发明还提供了包含有上述引物组的荧光定量PCR检测芯片，该芯片能够对T2DM疾病相关的蛋白基因表达情况进行准确定量、检测，重复性好，可信度高，且能在仪器中直观的分析基因的扩增效率，对于促进糖尿病的基础研究、预防检测和临床治疗具有重要意义；另外本发明还提供了利用上述荧光定量PCR引物组进行T2DM检测的方法，该方法简单，实验效率高。
附图说明
图1是本发明实施例6中提供的一种人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片上各基因的排布顺序图。
图2是本发明T2DM相关蛋白基因引物组中部分引物对的扩增效率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
试验用仪器：高速低温离心机（eppendorf）、荧光定量PCR仪（Applied Biosystems StepOne™ Software v2.1）、ABI常规PCR仪。
试验用试剂：
（1）红细胞裂解液(TransGen Biotech)；
（2）TRIZOL(TaKaRa，D9108A)；
（3）淋巴细胞提取液——Ficoll-PaqueTM
PREMIUM（GE，17-5442-02）；
（4）cDNA反转录试剂盒——EasyScript First-Strand
cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，AE301)；
（5）2×SYBR® Premix Ex TaqTM
10μL (TaKaRa Perfect Real
Time;Code:DRR041a)。
实施例
1.
白细胞的提取。
①采集静脉血于抗凝管中，分别标号；其中样品1-5，26-32健康猴样品；样品6-10为模型初期食蟹猴样品；样品11-15为模型中期食蟹猴样品；样品16-20临床前期食蟹猴样品；样品21-25，33-39为临床期食蟹猴样品；样品40-46为健康人样品；样品47-53为糖尿病人样品。
②于25ml离心管中加入1ml淋巴细胞提取液。
③于装有10mL全血的抗凝管中缓慢加入等体积的PBS缓冲液（1×），混匀。
④用移液器将③的混合液缓慢加入②中，尽量不要使混合液沉入②的底部，使其悬浮在淋巴细胞分离液的上面。
⑤于冷冻离心机上离心，4℃，1700g，15min。
⑥取出离心管，将中间层白细胞用移液器小心移取到2ml离心管中，4℃，7000g，10min，弃上清，沉淀即为白细胞。
⑦用1mL 1×PBS洗涤白细胞，4℃，7000g，10min，弃上清。
⑧重复洗涤两次后，将白细胞转移到冷冻管中，倒置冷冻管于干净的吸水纸上，待干燥后将白细胞保存于液氮中保存。
实施例
2.RNA
的提取。
①将实施例1所得白细胞从液氮中取出，室温静置，指弹管壁能将其弹散，每个冷冻管中加入1ml TRIzol,充分混匀。
②分层：样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。4℃,15000g离心10min取上清。上清中加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min。
③RNA沉淀：4℃，15000g离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μl）转移到新管中。小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃，15000g离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
④在RNA沉淀中加入1mL 75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃,1700g-6800g离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2分钟晾干沉淀。RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
⑤沉淀中加入10-20μL RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-80℃或液氮保存。经常更换手套，RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和吸头都是RNase-free的。
实施例
3.cDNA
反转录。
使用Transgene的cDNA反转录试剂盒——EasyScript First-Strand
cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，AE301)将实施例2提取的RNA反转录为cDNA，具体方法可参考说明书进行，在20µL的反转录体系中，总RNA的量约为0.25-0.5µg。
实施例
4.RNA
的质量的检测。
常规PCR扩增，间接检测RNA的质量，取PCR反应管一支，在管壁上做好标记，反应体系如下：
已提取的待测样品cDNA
2μL（含cDNA 50-100ng）；
Taq酶（5U/μl）
0.5μL；
dNTP（各2.5 mM）
1μL；
10×PCR
buffer
2.5μL；
GAPDH上游引物（SEQ ID NO:73）
0.5μL（10μM）；
GAPDH下游引物（SEQ ID NO:74）
0.5μL（10μM）；
灭菌去离子水
18μL；
共计25μL。
在ABI常规PCR仪上按下述条件进行PCR扩增，95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸45s，36个循环；72℃延伸10min。用2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，结果显示所提取的RNA质量良好。
实施例
5.
人猴通用
T2DM
引物组的确定。
通过对Genebank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中公布的与人和恒河猴T2DM相关的基因序列，针对共有的特异性序列分别设计引物，并通过相关实验筛选得到能够同时用于分析各T2DM相关基因的扩增引物组。相关扩增引物对信息如表2-1、表2-2、表2-3所示。
GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因均为管家基因，它们的表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，同时表达变化很小。为了使上述引物组在使用时能够更准确反映人和食蟹猴T2DM相关的基因的表达情况，本发明进一步针对GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因设计筛选扩增引物对，相关扩增引物对信息如表2-4所示。在使用过程中，可根据实际情况选择上述管家基因引物对中的两对或多对与表2-1、表2-2和表2-3中的引物对配合使用。
另外，为了更为准确分析人和猴T2DM相关蛋白基因的表达情况，可在使用上述引物组的同时使用用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC）、用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC）、用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC）。其中PPC优选SEQ ID NO:73-74所示的核苷酸序列对；RTC优选SEQ ID NO:73-74所示的核苷酸序列对。用于检测是否有DNA污染的扩增引物对的信息如表2-5所示。
由表2-1、表2-2、表2-3、表2-4、表2-5可知，本发明提供的各引物组PCR所得产物大都在200bp左右，引物组中上下游引物的Tm值均在60℃左右。
（
1
）各引物对分别单独扩增对应基因的扩增效率实验。
纯化通过正常人样本40抽提所得RNA逆转录所得的cDNA，浓度为5ng/μL，按10倍梯度稀释成5个梯度，以这5个梯度的cDNA为模板，上述的引物对分别进行荧光定量PCR。
每个引物对的荧光定量PCR反应体系如下：
2×SYBR® Premix Ex TaqTM
10μL；
cDNA模板
2μL；
灭菌去离子水
7μL；
上游引物
0.5μL（10µM）；
下游引物
0.5μL（10µM）；
共计20μL。
荧光定量PCR反应的条件为：（1）95℃变性30s；（2）95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环。
结果如表3——各T2DM相关蛋白基因引物对的扩增效率表、图2——T2DM相关蛋白基因引物组中部分引物对的扩增效率图所示。由表3和图2可知，本发明设计的引物对的引物扩增效率高，并且各引物对的扩增效率相当（且和内参的扩增效率差不多，数据未完全显示），保证实验的可靠性，说明可以在同一PCR条件下使用这些引物进行荧光定量PCR实验，从而分析各T2DM相关蛋白基因的表达情况。
图2中T2DM相关基因引物组中部分引物对分别为上述对应T2DM相关基因ACE、AQP、GCGR、ICAM1、INPPL1、NFKB1、PIK3R1、ACTB、IKBA、TGFB1的引物对。
（
2
）
T2DM
相关蛋白基因引物对扩增特异性实验。
按实施例2方法抽提正常食蟹猴样本1得RNA，然后按实施例3方法逆转录得cDNA，以此cDNA为模板，利用表2-1、表2-2、表2-3、表2-4中的引物对分别进行扩增，将这41个基因的82个PCR产物进行测序，在NCBI数据中进行BLAST，结果表明其与人和恒河猴中相应基因的cDNA同源性均超过93%，说明了本发明提供的T2DM相关蛋白基因引物对能用于人和猴T2DM相关基因表达状态分析，部分比对数据见表4。
实施例
6.
人猴通用
T2DM
荧光定量
PCR
检测芯片的制备。
将表2-1、表2-2、表2-3所示的引物对分别保存在96孔PCR板中，上述引物可以是液体也可以是粉末。
人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片，还可以包括表2-4所示的引物对，即将表2-4所示的引物对也分别保存在96孔PCR板的孔中。
人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片，还可以包括表2-5所示的引物对，即将表2-5所示的引物对也分别保存在96孔PCR板的孔中。
其中，优选表2-1、表2-2、表2-3、表2-4所示的引物对分别保存在96孔PCR板的2个孔中，PPC引物对（SEQ ID NO:73-73）单独保存在96孔PCR板的6个孔中，RTC引物对（SEQ ID NO:73-73）单独保存在96孔PCR板的6个孔中，表2-5中的GDC单独保存在96孔PCR板的2个孔中。同时人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片还包括阳性RNA对照，与用于检测反转录效率的扩增引物对配合使用，检测反转录的效率。
这些引物对在96孔PCR板中的排列方式可如图1所示。当利用这块96孔PCR板（即人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片）检测样品时，我们可根据5个管家基因和PPC、RTC、GDC引物对的扩增情况，非常准确的同时得到36个与糖尿病相关的基因表达情况，从而对该样本来源的人或猴的T2DM进展情况做出准确的预测。这块96孔PCR板一次能够同时检测两个样品，或者对一个样品同时检测2次。
每个96孔PCR板孔中的引物对总量优选为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同。优选保存在2-8℃。
实施例
7.
利用人猴通用
T2DM
引物组进行检测。
（1）以实施例3所得的cDNA为模板，实施例5中的人猴通用T2DM引物组进行荧光定量PCR反应，反应体系如下：
2×SYBR® Premix Ex TaqTM
10μL；
cDNA模板
2μL；
灭菌去离子水
7μL；
上游引物（10μM）
0.5μL；
下游引物 （10μM）
0.5μL；
共计20μL；不同的T2DM相关的基因分别在各自的反应体系中进行单重PCR扩增。T2DM相关基因上下游引物的相关信息见表2-1、表2-2、表2-3。还可根据实际情况加入相关的参照，参照所使用的PCR引物对如表2-4和表2-5所示。
（2）使用如图1所示人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片，若芯片中的引物对均为粉末，引物对总量为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同，此时只需在各96孔PCR板中加入2×SYBR® Premix Ex TaqTM
10μL；cDNA模板2μL；灭菌去离子水8μL。
（1）或（2）在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，反应条件如下：
A.95℃变性30s；
B.95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环；
C. 熔解曲线分析，95℃，15s；60℃，1min；按0.3℃/s的升温速度升到95℃；95℃，15s。
（3）结果分析。
ABI StepOne Software v2.1对荧光定量PCR结果进行初步分析，首先调整阈值和基线，将阈值设置在指数期的初期，同一个基因阈值统一。然后去除无表达，熔解曲线较差，且Ct<8或Ct>35及△Ct>10的反应。然后通过输出窗口将数据结果以EXCEL形式输出，用比较Ct法（△△Ct）计算基因的相对表达量。首先优化内标基因和目的基因扩增条件，分别测定内参基因和目的基因的Ct值，取平均值，然后通过内标基因对目的基因进行校正得到△△Ct，最后通过2－△△ Ct估算目的基因的相对表达量和系统误差。在计算相对表达量时，分别以正常对照组样本为参照，即将其值转换成１，糖尿病组再与其比较，获得相对表达值。两组之间利用独立样本T检验进行分析（independent sample T-Test），P＜0.05为差异有统计学意义。
其中利用实施例6中提供的一种人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片(如图1所示)，对不同阶段食蟹猴外周血糖尿病相关基因的相对表达情况进行检测，每个阶段选用5只食蟹猴，样品分别为食蟹猴样品6-25，另以正常食蟹猴样品1-5为对照。结果见表5-1、表5-2、表6。表明利用该芯片可以初步判断糖尿病相关基因在食蟹猴糖尿病发生发展过程中的表达趋势，可为疾病的预防和治疗提供依据。
糖尿病模型各期食蟹猴外周血细胞中有效表达基因的相对表达量见表5-1和表5-2。
注：表5-1和表5-2中数值分别为其相对于对照的表达量，数据用±S表示，采用SPSS17.0 One-Way ANOVA分析组间差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01；N/A表示在本研究中未检测到有表达。
正常猴中不表达基因在糖尿病模型各期食蟹猴外周血细胞中的相对表达量见表6。
注：此表基因的表达量分别为其相对于模型初期的表达量，数据用
±S表示，采用SPSS17.0中的One-Way ANOVA分析组间差异，*表示P<0.05,**表示P<0.01；N/A表示在本研究中未检测到有表达。
利用实施例6中提供的一种人猴通用T2DM荧光定量PCR检测芯片(如图1所示)，检测糖尿病人（样品47-53）、正常人（样品40-46）、糖尿病猴（样品26-32）和正常猴（样品33-39）的外周血白细胞糖尿病相关基因表达，41个基因的差异表达情况见表7。
注：表7中数值分别为病患相对于正常个体的表达量，数据用±S表示，采用SPSS17.0 One-Way ANOVA分析组间差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
实验表明，该芯片能灵敏的检测到糖尿病人和健康人、糖尿病猴和健康猴之间的基因表达差异，证明该芯片可应用于人类和食蟹猴外周血糖尿病基因的表达差异比较。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>
广东蓝岛生物技术有限公司
<120>
人猴通用2型糖尿病检测引物组、PCR检测芯片及检测方法
<130>
<160>
84
<170>
PatentIn version 3.3
<210>
1
<211>
20
<212>
DNA
<213>
人工序列
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1
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20
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2
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2
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人工序列
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6
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13
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DNA
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16
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17
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人工序列
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DNA
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19
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人工序列
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26
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人工序列
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29
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DNA
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c
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DNA
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人工序列
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DNA
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人工序列
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人工序列
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DNA
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人工序列
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DNA
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人工序列
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DNA
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人工序列
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tcgctggtgg
20
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20
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DNA
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人工序列
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20
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DNA
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人工序列
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人工序列
<400>
67
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DNA
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人工序列
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68
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DNA
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人工序列
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人工序列
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人工序列
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76
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人工序列
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78
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aggtctcaaa
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DNA
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DNA
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DNA
<213>
人工序列
<400>
84
ggggtcattg
atggcaacaa
20
Claims (6)
1.一种人猴通用2型糖尿病相关基因检测引物组，其特征在于：包括分别用于扩增与2型糖尿病相关的基因ACE、ACLY、G6PD、GSK3B、HMOX1、IDE、PRKCB1、PYGL、AQP、CCR2B、CEACAM1、CTLA4、GCGR、ICAM1、NSF、RAB4A、SELL、SNAP23B、STX4、STXBP2、TNFRSF1A、VAMP3、VAPA、IFNG、INS、TGFB1、TNFA、IGFBP5、INPPL1、PIK3C2B、PIK3R1、IKBA、NEUROD1、NFKB1、PPARGC1A、AGT的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-72所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的人猴通用2型糖尿病相关基因检测引物组，其特征在于：还包括分别用于扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物对中的至少一对，扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物组序列分别为SEQ ID NO：73-82所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人猴通用2型糖尿病相关基因检测引物组，其特征在于：还包括用于检测PCR效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；还包括用于检测反转录效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：73-74所示的核苷酸序列；还包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：83-84所示的核苷酸序列。
4.一种荧光定量PCR检测芯片，其特征在于，包括：权利要求1至3任一所述的人猴通用2型糖尿病相关基因检测引物组。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测芯片，其特征在于：所述扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的孔中。
6.根据权利要求5所述的病荧光定量PCR检测芯片，其特征在于：所述与2型糖尿病相关的基因的扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于扩增GAPDH、YWHAZ、ACTB、B2M、RPL13A基因的扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于检测PCR效率的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的6个孔中；用于检测反转录效率的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的6个孔中；用于检测是否有DNA污染的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP3130678A1 (en) * | 2015-08-11 | 2017-02-15 | Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz | In-vitro methods for the detection of autoimmune diseases or conditions |
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