CN102146473B - 人猴通用动脉粥样硬化检测引物组、检测芯片及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能用于分析人类和食蟹猴动脉粥样硬化相关基因表达情况的检测引物组、PCR检测芯片及检测方法。人猴通用动脉粥样硬化相关基因检测引物组，包括分别用于扩增动脉粥样硬化相关基因ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF、TNFRSF1B的扩增引物对，上述扩增引物对序列分别为SEQIDNO：1-84所示的核苷酸序列。本发明还提供了包含上述引物组的PCR检测芯片及检测方法。本发明能对人猴动脉粥样硬化相关基因的表达情况进行准确定量、检测，对于促进动脉粥样硬化的基础研究、预防检测和临床治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及能用于分析人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中动脉粥样硬化相关基因表达情况的检测引物组、荧光定量PCR检测芯片及检测方法。
背景技术
基因诊断诞生于20世纪70年代末，基因诊断是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，其优点主要体现在以下几个方面：可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测；也可以结合常规的临床诊断指标在临床诊断和预后评价中起重要作用；此外基因诊断指标还可用于新药评价。
美国SuperArray公司新近推出的第二代功能分类基因芯片（Real-time PCR芯片）基于第一代功能分类Oligo基因芯片，结合了实时定量PCR和第一代功能分类基因芯片的优点，可在一次实验中准确定量检测上百个基因的mRNA表达水平，不仅克服了实时定量PCR检测基因表达工作量大、耗时久的缺点，而且将基因芯片的检测精度提高到了与实时定量PCR相当的水平。
动脉粥样硬化存在着发生与发展的自然病程，在其发生、发展的过程中动脉粥样硬化相关基因的表达变化往往要早于传统的风险因素，且更能揭示疾病自然病程的本质。美国SuperArray公司研究人员已经开发出人和小鼠的动脉粥样硬化PCR芯片，目前，该芯片已经广泛应用于动脉粥样硬化临床诊断和研究当中。
但是上述动脉粥样硬化PCR芯片都有以下不足之处：
1．上述动脉粥样硬化PCR芯片没有明确适用于那种组织，考虑到基因表达的时空性，我们利用这些芯片进行高流通量检测时会有较大浪费；
2．目前尚缺乏适用于猴的动脉粥样硬化PCR芯片，这为我们利用猴，特别是模型猴作为实验动物进行动脉粥样硬化基因诊断研究带来不便。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明一方面提供了一种能用于分析人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中动脉粥样硬化相关基因表达情况的PCR检测引物组；另一方面还提供了包含有上述引物组的荧光定量PCR检测芯片；同时本发明还提供了利用上述引物组对人和/或猴外周静脉血白细胞中动脉粥样硬化相关基因表达情况进行检测的方法。
本发明通过相关实验确定了人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因，然后通过比对人和食蟹猴的上述基因在GeneBank中公布的序列，针对共有的特异性序列分别设计引物，通过筛选最终获得本发明的能够在同样条件下扩增并用于分析人类和/或食蟹猴外周静脉血白细胞中动脉粥样硬化相关基因表达情况的引物组。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因包括应激反应相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括粘附分子相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括血栓相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括细胞外基质相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括脂代谢相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括血液循环相关基因。
所述人类和食蟹猴外周静脉血白细胞中均能有效和特异性表达的动脉粥样硬化相关基因还包括凋亡相关基因。
本发明的目的之一在于提供一种人猴通用动脉粥样硬化相关基因检测引物组，包括分别用于扩增动脉粥样硬化相关基因ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF、TNFRSF1B的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-84所示的核苷酸序列。
各基因的扩增引物对对应的核苷酸序列如表1所示。
优选的，还包括分别用于扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对中的至少一对；所述GAPDH基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：85-86所示的核苷酸序列；所述RPL13A基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：87-88所示的核苷酸序列；所述YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：89-90所示的核苷酸序列。GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因均为管家基因。
优选的，还包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC），该扩增引物对能够扩增人和食蟹猴外周静脉血白细胞中共有的非转录的基因组DNA重复片段。
更优选的，所述用于检测是否有DNA污染的扩增引物对序列为SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列。
优选的，还包括用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC），该扩增引物对能够扩增人和食蟹猴外周静脉血白细胞中共有的管家基因序列，主要用于检测不同批次间反转录实验的反转录效率是否一致，如果反转录效率不一致会导致实验结果出现误差。
更优选的，所述用于检测反转录效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列。
优选的，还包括用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC），主要用来检测荧光定量PCR仪和PCR试剂在不同批次的实验中是否稳定。
更优选的，所述用于检测PCR效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列。
本发明的目的之二在于提供一种包括上述任一方案中的人猴通用动脉粥样硬化相关基因检测引物组的荧光定量PCR检测芯片。
优选的，所述荧光定量PCR检测芯片还包括96孔PCR板，所述引物组中的各扩增引物对分别单独保存在于96孔PCR板的孔中。
更优选的，各扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
优选的，所述荧光定量PCR检测芯片包括分别用于扩增人和食蟹猴GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对中的至少一对。
其中，用于扩增人和食蟹猴GAPDH基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：85-86所示的核苷酸序列。
其中，用于扩增人和食蟹猴RPL13A基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：87-88所示的核苷酸序列。
其中，用于扩增人和食蟹猴YWHAZ基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：89-90所示的核苷酸序列。
GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因均为管家基因。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片包括用于扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对，这些引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
优选的，所述荧光定量PCR检测芯片包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC），该扩增引物对能够扩增人和食蟹猴外周静脉血白细胞中非转录的基因组DNA重复片段。
更优选的，所述用于检测是否有DNA污染的扩增引物对序列为SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列。
优选的，还包括用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC），该扩增引物对能够扩增人和食蟹猴外周静脉血白细胞中共有的管家基因序列，主要用于检测不同批次间反转录实验的反转录效率是否一致，如果反转录效率不一致会导致实验结果出现误差。同时所述荧光定量PCR检测芯片还包括逆转录后与RTC配合使用的RNA。
更优选的，所述用于检测反转录效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列；所述RNA含有SEQ ID NO：98（R-GAPDH）所示的核苷酸序列。
优选的，还包括用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC），该扩增引物对主要用来检测荧光定量PCR仪和PCR试剂在不同批次的实验中是否稳定。同时荧光定量PCR检测芯片还包括与PPC配合使用的质粒。
更优选的，所述用于检测PCR效率的扩增引物对序列为SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列；所述质粒含有SEQ ID NO：97（Z-SRV-ENV）所述的核苷酸序列。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片包括用于检测是否有DNA污染的扩增引物对、用于检测反转录效率的扩增引物对、用于检测PCR效率的扩增引物对，且这些扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
更优选的，所述荧光定量PCR检测芯片中各基因扩增引物对在96孔PCR板中的位置如图1所示。
上述各方案保存在96孔PCR板中的引物对以干粉或溶液形式保存。
更优选的，每个96孔PCR板孔中的引物对总量为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同。优选保存在2-8℃。
本发明的目的之三在于提供利用上述任一种人猴通用动脉粥样硬化相关基因检测引物组进行人猴通用动脉粥样硬化基因表达情况检测的方法。过对动脉粥样硬化相关基因表达情况的检测，可对人类和食蟹猴外周血动脉粥样硬化相关基因的表达差异比较，对不同阶段人类或食蟹猴外周血动脉粥样硬化相关基因的表达情况进行分析，从而确定与动脉粥样硬化最为相关的基因。
优选的，所述引物组中的各扩增引物对分别在96孔PCR板的各个孔中进行单重荧光定量PCR反应。
更优选的，所述检测方法中还设有管家基因对照，所述管家基因为GAPDH、RPL13A、YWHAZ，该管家基因对照为上述管家基因中的至少一个。
其中，所述GAPDH基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：85-86所示的核苷酸序列；所述RPL13A基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：87-88所示的核苷酸序列；所述YWHAZ基因的扩增引物对优选如SEQ ID NO：89-90所示的核苷酸序列。
更优选的，所述管家基因对照分别在于96孔PCR板的2个孔中进行反应。
更优选的，检测方法中还设有分别用于检测PCR效率、用于检测反转录效率和用于检测是否有DNA污染的对照。
其中，用于检测PCR效率的对照所用的扩增引物对（PPC）单独存在于96孔PCR板的2个孔中。该引物对序列优选为SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列，该引物对能与具有SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列的质粒配合使用。
其中，用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC）单独存在于96孔PCR板的2个孔中。该引物对序列优选为SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列。具有SEQ ID NO：98所示的核苷酸序列的RNA经逆转录后能与该引物对配合使用。
其中，用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC）单独存在于96孔PCR板的2个孔中，该引物对序列优选为SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列，该引物对能特异性的扩增人或食蟹猴的非转录基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染。
优选的，所述荧光定量PCR反应的条件为：（1）95℃变性30s；（2）95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环。（3）熔解曲线分析，95℃，15s；60℃，1min；按0.3℃/s的升温速度升到95℃，然后95℃，15s。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明一方面提供了能够用于分析人类和食蟹猴静脉血白细胞中与动脉粥样硬化相关基因的表达情况的引物组，该引物组能够在同一PCR条件下分别高效、特异性的扩增相关基因序列；同时本发明还提供了包含有上述引物组的荧光定量PCR检测芯片，该芯片能够对动脉粥样硬化相关基因表达情况进行准确定量，重复性好，特异性高，且能在仪器中直观地分析基因的扩增效率，对于促进糖尿病的基础研究、预防检测和临床治疗具有重要意义；另外本发明还提供了利用上述荧光定量PCR引物组进行动脉粥样硬化相关基因表达情况进行检测的方法，该方法简单，检测效率高。
附图说明
图1是本发明实施例6中提供的一种人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片上各基因的排布顺序图。
图2是本发明实施例5中提供的人猴通用动脉粥样硬化相关基因APOF引物对的扩增效率图。
图3是本发明实施例5中IL1β引物对扩增正常人样本产物的熔解曲线。
图4是本发明实施例5中IL1β引物对扩增正常食蟹猴样本产物的熔解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
试验用仪器：高速低温离心机（eppendorf）、荧光定量PCR仪（Applied Biosystems StepOne? Software v2.1）、ABI常规PCR仪。
试验用试剂：
（1）红细胞裂解液(TransGen Biotech)；
（2）TRIZOL(TaKaRa，D9108A)；
（3）淋巴细胞提取液——Ficoll-PaqueTM PREMIUM（GE，17-5442-02）；
（4）cDNA反转录试剂盒——EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，AE301)；
（5）2×SYBR? Premix Ex TaqTM (TaKaRa Perfect Real Time，Code：DRR041a)；
（6）50×ROX（TaKaRa Perfect Real Time，Code：DRR041a）。
实施例1.白细胞的提取。
采集静脉血于抗凝管中，分别标号；健康食蟹猴、动脉粥样硬化食蟹猴、健康人、动脉粥样硬化病人各7例。其中样品1-7为健康食蟹猴样品；样品8-14为动脉粥样硬化食蟹猴样品；样品15-21为健康人样品；样品22-28为动脉粥样硬化病人样品。上述动脉粥样硬化食蟹猴是通过高能膳食诱导正常食蟹猴从而获得的动脉粥样硬化模型猴。所得模型猴相关指标检测如下：C-反应蛋白﹥10㎎/L，胆固醇﹥7.97mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇﹥6.57mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇﹤1.03mmol/L，甘油三酯﹥1.58mmol/L，空腹血糖值﹥4.62mmol/L，血压≥140/90mmHg。另外，上述动脉粥样硬化病人相关指标检测结果如下：C-反应蛋白﹥10㎎/L，胆固醇﹥6.0mmol/L，低密度脂蛋白胆固醇﹥3.10mmol/L，高密度脂蛋白胆固醇﹤1.00mmol/L，甘油三酯﹥1.80mmol/L，空腹血糖值﹥6.1mmol/L，血压﹥140/90mmHg。
按下述方法分别处理上述静脉血样品。
将2mL上述静脉血样品与红细胞裂解液（1.6mM EDTA，10mM KHCO3，153mM NH4C1，pH 7.4）按1：5的比例混合，温和颠倒混匀，冰上静置30min（期间每隔5min上下颠倒混匀几次）；然后于450g，4℃离心10min，弃去上清；加入5mL红细胞裂解液，震荡混匀后于450g，4℃离心5min，弃去上清；加入5mLPBS，震荡混匀，将混合液分装到2mL冻存管中，然后于3000g，4℃离心5min，弃去上清，将白细胞置于液氮中保存待用。
实施例2.RNA的提取。
①将实施例1所得白细胞从液氮中取出，室温静置，指弹管壁将白细胞弹散，每个冷冻管中加入1mL TRIZOL,充分混匀。
②分层：样品加入TRIZOL后，室温放置5min，使样品充分裂解。然后加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min。
③RNA沉淀：4℃，10000g离心15min。样品会分成三层：下层的黄色的有机相，中间层和上层的无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μL）转移到新管中。小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃，10000g离心15min，弃上清，RNA沉淀于管底。
④在RNA沉淀中加入1mL 75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃,10000g离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2min晾干沉淀。RNA样品不要过于干燥，否则难以溶解。
⑤沉淀中加入10-20μL RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-80℃或液氮保存。
⑥RNA检测：紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。使用甲醛电泳试剂（Ambion）进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA质量。
注意事项：经常更换手套，RNA在TRIZOL试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和吸头都是RNase-free的。
实施例3.cDNA反转录。
使用Transgene的cDNA反转录试剂盒——EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech，AE301)将实施例2提取的RNA反转录为cDNA，具体方法可参考说明书进行，将制备好的cDNA置于-20℃保存待用。
实施例4.RNA的质量的检测。
常规PCR扩增，检测RNA的质量及反转录结果，取PCR反应管一支，在管壁上做好标记，反应体系如下：
已提取的待测样品cDNA 2μL（含cDNA 50-100ng）；
Taq酶（5U/μL） 0.5μL；
dNTP（各2.5 mM） 1μL；
10×PCR buffer 2.5μL；
GAPDH上游引物（SEQ ID NO：85） 0.5μL（10μM）；
GAPDH下游引物（SEQ ID NO：86） 0.5μL（10μM）；
灭菌去离子水 18μL；
共计25μL。
在ABI常规PCR仪上按下述条件进行PCR扩增，95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸45s，36个循环；72℃延伸10min。用2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，结果显示所提取的RNA质量良好。
实施例5.人猴通用动脉粥样硬化相关基因检测引物组的确定。
以实施例1中正常人和正常食蟹猴样本所得的cDNA为模板，采用SYBR Green Ⅰ染料在ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统上对动脉粥样硬化相关基因进行实时荧光定量PCR检测。然后采用ABI StepOne Software v2.1分析113个动脉粥样硬化相关基因的扩增曲线、熔解曲线，去除无扩增信号、熔解曲线差的基因。结果共有42个动脉粥样硬化相关基因在人和食蟹猴外周血白细胞内有效、特异表达，这些基因分别为ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF、TNFRSF1B。
通过对Genebank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中公布的与人和恒河猴动脉粥样硬化疾病相关的蛋白基因序列，针对共有的特异性序列分别设计引物，并通过相关实验筛选得到能够用于分析人和猴动脉粥样硬化相关基因的扩增引物组。
相关扩增引物对信息如下表所示：
GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因均为管家基因，它们的表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，同时表达变化很小。为了使上述引物组在使用时能够更准确反映人和食蟹猴动脉粥样硬化相关基因的表达情况，本发明进一步针对GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因设计筛选扩增引物对，相关扩增引物对信息如表2-4所示。在使用过程中，可根据实际情况选择上述管家基因引物对中的一对或多对与表2-1、表2-2和表2-3中的引物对配合使用。
另外，为了更为准确分析人和猴动脉粥样硬化相关蛋白基因的表达情况，可在使用上述引物组的同时使用用于检测PCR效率的扩增引物对（PPC）、用于检测反转录效率的扩增引物对（RTC）、用于检测是否有DNA污染的扩增引物对（GDC）。其中PPC优选SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列；RTC优选SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列；GDC优选SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列；上述三个引物对的信息如表2-5所示。
在使用过程中，含有SEQ ID NO：98（R-GAPDH）所示的核苷酸序列的RNA经逆转录成cDNA，该cDNA作为RTC扩增的模板。而PPC扩增的模板则为含有SEQ ID NO：97（Z-SRV-ENV）所述的核苷酸序列的质粒。而GDC扩增的模板则为需检测的样本。
由表2-1、表2-2、表2-3、表2-4、表2-5可知，本发明提供的各引物组PCR所得产物大都在200bp左右，引物组中上下游引物的Tm值均在60℃左右。
（1）动脉粥样硬化相关基因引物对扩增特异性实验。
以实施例3所得正常食蟹猴静脉血白细胞cDNA——样本1、正常人静脉血白细胞cDNA——样本15为模板，利用表2-1、表2-2、表2-3、表2-4中的引物对分别进行扩增，将2种模板，45个基因，共计90个的PCR产物分别送到上海生工生物技术有限公司测序以确定扩增出来的核酸序列是否是我们的目的基因。将测序结果在NCBI数据中分别与人或恒河猴中相应基因进行BLAST，结果表明，除食蟹猴OLR1基因对扩增产物与恒河猴的相似度较低外，其他基因的相似度均较高，其中食蟹猴样本的相似度稍低的原因可能是因为用于比对的序列并不是食蟹猴的基因，因为目前Genebank数据库中并未公布食蟹猴的完整基因组信息，故本实施例中用已公布的恒河猴的基因组进行比对。
部分比对数据见表3，说明了本发明提供的动脉粥样硬化相关基因引物对能用于人和猴动脉粥样硬化相关基因表达状态分析。
另外以实施例3所得正常食蟹猴静脉血白细胞cDNA——样本1、正常人静脉血白细胞cDNA——样本15为模板，利用表2-1、表2-2、表2-3、表2-4中的引物对分别进行荧光定量PCR。PCR反应体系如下：
2×SYBR? Premix Ex TaqTM 10μL；
cDNA模板 1μL；
灭菌去离子水 7.8μL；
50×ROX 0.4μL；
上游引物 0.4μL（10μM）；
下游引物 0.4μL（10μM）；
共计20μL。
荧光定量PCR反应的条件为：（1）95℃变性30s；（2）95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环；（3）熔解曲线分析，95℃，15s；60℃，1min；按0.3℃/s的升温速度升到95℃，然后95℃，15s。
分析所得的各动脉粥样硬化相关基因扩增产物的溶解曲线可知，表2-1、表2-2、表2-3、表2-4中的引物对均能特异性的扩增各自的目的序列。部分基因引物对的扩增产物的熔解曲线如图3、图4所示。
（2）各引物对分别单独扩增对应基因的扩增效率实验。
将实施例3所得食蟹猴静脉血白细胞cDNA——样本1，浓度为5ng/μL，按10倍梯度稀释成5个浓度，以这5个浓度的cDNA为模板，表2-1、2-2、2-3所示的引物对中的任一对为上下游引物，采用SYBR Green染料在ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统（ABI）上采用标准曲线法进行荧光定量PCR。
荧光定量PCR反应体系如下：
2×SYBR? Premix Ex TaqTM 10μL；
cDNA模板 1μL；
灭菌去离子水 7.8μL；
50×ROX 0.4μL；
上游引物 0.4μL（10μM）；
下游引物 0.4μL（10μM）；
共计20μL。
荧光定量PCR反应的条件为：（1）95℃变性30s；（2）95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环。
结果如表4——各动脉粥样硬化相关基因引物对的扩增效率表、图2——APOF引物对的扩增效率图所示。
由表4和图2可知，本发明设计的引物对的引物扩增效率高，并且各引物对的扩增效率相当（且和内参的扩增效率接近，数据未完全显示），保证实验的可靠性，说明可以在同一PCR条件下使用这些引物进行荧光定量PCR实验，从而分析各动脉粥样硬化相关基因的表达情况。
实施例6.人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片的制备。
将表2-1、表2-2、表2-3所示的引物对分别保存在96孔PCR板中，上述引物可以以液体或干粉形式保存在各个孔中。
人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片，还可以包括表2-4所示的引物对，即将表2-4所示的引物对也分别保存在96孔PCR板的孔中。表2-4所示的引物对用于芯片数据的标准化。
人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片，还可以包括表2-5所示的引物对，即将表2-5所示的引物对也分别保存在96孔PCR板的孔中。
其中，优选表2-1、表2-2、表2-3、表2-4、表2-5所示的引物对分别保存在96孔PCR板的2个孔中。同时人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片还包括具有SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列的质粒，该质粒可作为表2-5中的PPC引物对的扩增模板，在利用此芯片进行检测时使用；人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片还包括具有SEQ ID NO：98所示的核苷酸序列的RNA，该RNA可作为反转录效率对照的模板，其逆转录产物与2-5中的RTC引物对配合使用。
这些引物对在96孔PCR板中的排列方式可如图1所示。当利用这块96孔PCR板（即人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片）检测样品时，我们可根据3个管家基因和PPC、RTC、GDC引物对的扩增情况，非常准确地同时得到42个与动脉粥样硬化相关的基因表达情况，从而对该样本来源的人或猴的动脉粥样硬化进展情况做出准确的预测。这块96孔PCR板一次能够同时检测两个样品，或者对一个样品同时检测2次。
每个96孔PCR板孔中的引物对总量优选为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同。优选保存在2-8℃。
实施例7.利用人猴通用动脉粥样硬化相关基因引物组进行检测。
（1）以实施例3所得的cDNA为模板，实施例5中的人猴通用动脉粥样硬化相关基因引物组进行荧光定量PCR反应，反应体系如下：
2×SYBR? Premix Ex TaqTM 10μL；
cDNA模板 1μL；
灭菌去离子水 7.8μL；
50×ROX 0.4μL；
上游引物（10μM） 0.4μL；
下游引物 （10μM） 0.4μL；
共计20μL；不同的动脉粥样硬化疾病相关的基因分别在各自的反应体系中进行单重PCR扩增。动脉粥样硬化疾病相关基因上下游引物的相关信息见表2-1、表2-2、表2-3。还可根据实际情况加入相关的参照，参照所使用的PCR引物对如表2-4和表2-5所示。
（2）使用如图1所示的人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片，若芯片中的引物对均为干粉，引物对总量为1-20×10-12mol，其中上下游引物对的量相同，此时只需在各96孔PCR板中加入2×SYBR? Premix Ex TaqTM 10μL；cDNA模板1μL；灭菌去离子水8.6μL；50×ROX0.4μL。
（1）或（2）在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，反应条件如下：
A.95℃变性30s；
B.95℃变性5s；60℃退火延伸34s，重复40个循环；
C.熔解曲线分析，95℃，15s；60℃，1min；按0.3℃/s的升温速度升到95℃，然后95℃，15s。
（3）结果分析。
利用实施例6中提供的一种人猴通用动脉粥样硬化相关基因荧光定量PCR检测芯片(如图1所示)，检测动脉粥样硬化食蟹猴、动脉粥样硬化病人静脉血白细胞中动脉粥样硬化相关基因的表达情况，分别以健康食蟹猴、正常人样品为对照，其中样品1-7为健康食蟹猴样品；样品8-14为动脉粥样硬化食蟹猴样品；样品15-21为健康人样品；样品22-28为动脉粥样硬化病人样品。
采用ABI StepOne Software v2.1对荧光定量PCR结果进行初步分析，首先调整阈值和基线，将阈值设置在指数期的初期，且同一个基因阈值调成一致。然后去除无表达，溶解曲线较差，且8﹥Ct和Ct﹥35、△C t﹥10的反应。采用2—△△Ct法计算动脉粥样硬化相关基因相对表达量。在计算相对表达量时，分别以正常人和食蟹猴作为参照，即将其值转换成１，动脉粥样硬化样本再与其比较，获得相对表达量。采用EXCEL函数AVERAGE和AEDEV计算所有实验结果的平均值和标准偏差。用SPSS17.0对实验数据进行统计分析。
42个相关基因的相对表达量如表5所示。
注：表5中数值分别为病患相对于正常个体的表达量，数据用±S表示，采用SPSS17.0 One-Way ANOVA分析组间差异，*表示P<0.05。
实验表明，该芯片能灵敏的检测到动脉粥样硬化病人、健康人、动脉粥样硬化食蟹猴、健康食蟹猴之间的基因表达差异，证明该芯片可应用于人类和食蟹猴外周静脉血动脉粥样硬化相关基因的表达差异比较。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东蓝岛生物技术有限公司
<120> 人猴通用动脉粥样硬化检测引物组、PCR检测芯片及检测方法
<130>
<160> 98
<170> PatentIn version 3.3
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gcugugggca aggucauccc ugagcugaac gggaagcuca cuggcauggc cuuccguguc 180
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gacgcugggg cuggcauugc ccucaacgac cacuuuguca agcucauuuc cugguaugac 420
aacgaauuug gcuacagcaa caggguggug ga 452
Claims (6)
1.人猴通用动脉粥样硬化检测引物组，其特征在于：包括分别用于扩增动脉粥样硬化相关基因ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF和TNFRSF1B的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-84所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的人猴通用动脉粥样硬化检测引物组，其特征在于：还包括分别用于扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对中的至少一对，扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：85-90所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人猴通用动脉粥样硬化检测引物组，其特征在于：还包括：
用于检测是否有DNA污染的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列；
用于检测反转录效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列；
以及，用于检测PCR效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列。
4.一种包括权利要求1至3任一所述的人猴通用动脉粥样硬化检测引物组的荧光定量PCR检测芯片。
5.根据权利要求4所述的人猴通用动脉粥样硬化荧光定量PCR检测芯片，其特征在于：所述引物组中的各扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的孔中。
6.根据权利要求4所述的人猴通用动脉粥样硬化荧光定量PCR检测芯片，其特征在于：
所述检测引物组包括分别用于扩增动脉粥样硬化相关基因ACE、APOA1、APOC1、APOF、CCL2、CD40LG、DBP、EDN1、FAS、FASLG、FGG、GLG1、GRN、ICAM1、IL18、IL1β、IL1RN、IL6、IL6ST、IL8、ITGα2β、ITGα4、ITGα6、ITGαM、ITGαV、ITGβ1、ITGβ2、LTA、LTB、MTHFR、NFKβ1、OLR1、PLAUR、PLTP、PON2、SELL、SELP、SELPG、SERPINE1、TIMP1、TNF和TNFRSF1B的扩增引物对，上述基因扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：1-84所示的核苷酸序列；
还包括分别用于扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对中的至少一对，扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对序列分别为SEQ ID NO：85-90所示的核苷酸序列；
还包括：用于检测是否有DNA污染的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：91-92所示的核苷酸序列；
用于检测反转录效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：93-94所示的核苷酸序列；
以及，用于检测PCR效率的扩增引物对，该扩增引物对序列为SEQ ID NO：95-96所示的核苷酸序列；
所述动脉粥样硬化相关基因的扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于扩增GAPDH、RPL13A、YWHAZ基因的扩增引物对分别单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于检测PCR效率的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于检测反转录效率的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的2个孔中；用于检测是否有DNA污染的扩增引物对单独存在于96孔PCR板的2个孔中。
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| .血管紧张素转换酶基因多态性与冠心病关系的研究.《南通医学院学报》.2002,第22卷(第2期),第145－148页. |
| 苏伟等􀀁 |
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