CN105950766B - 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测HLA‑B*5801等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针,包含两对根据HLA‑B*5801特异性序列设计的引物及相应两条探针，还包含一对用于筛除HLA‑B*5801假阳性的引物及相应一条探针，还包含一对内对照引物及相应一条探针。本发明具有如下技术效果：通过两个反应管确定实验样本HLA‑B*5801基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA‑B*5801基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA‑B*5801基因的假阴性结果。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测HLA-B*5801等位基因的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
药物基因组学(pharmacogenomics)又称为基因组药物学或基因组药理学，是药理 学的一个分支，定义为在基因组学的基础上，通过将基因表达或单核苷酸的多态性与药物的疗效或毒性联系起来，研究药物如何由于遗传变异而产生不同的作用。简而言之，药物基因组学致力于研究个体基因结构对药物反应的影响，发现关联基因及其作用机制和功能，并应用于临床疾病诊断和确定给药剂量。基因研究资料与临床实践结合可有助于更精确的掌握病人概况，选择最优化治疗方案，进一步帮助对易发生药品不良反应(Adverse DrugReactions,ADRs)病人的鉴别。大量基因学研究数据现已运用于药物反应和疾病易感性的预测，美国食品药品监督管理局(FDA)已公布百余种药物与特异性基因的相关性资料，其中一些基因检测已在世界范围内应用于常规临床诊治。例如，美国FDA批准对拟采用易瑞沙(Gefitinib)、特罗凯(Erlotinib)等表面生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类肿瘤靶向治疗药物的患者，进行EGFR酪氨酸激酶基因突变检测；细胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因突变检测也被包含在多种抗精神病药物的标签上。
ADR是指在按规定剂量正常应用药品的过程中产生的与治疗无关的作用，而这种作用一般是有害的，且与药品应用有因果关系，可表现出多种临床症状和体征，并可由多种结构不同的化合物引发。过敏反应由于其症状严重性、高入院率和高死亡率已成为国家医药卫生系统的负担，并成为ADR中受主要关注的一种。药物过敏反应可表现为轻型斑丘疹爆发(Maculopapular Eruption，MPE)，也可表现为更加危险甚至致命的重症皮肤不良反应(Severe Cutaneous Adverse Reactions,SCAR)，包括史蒂芬琼森症候群(StevensJohnson Syndrome，SJS)、毒性表皮坏死松懈症(Toxic Epidermal Necrolysis，TEN)和过敏反应综合征(Hypersensitivity Syndrome,HSS)。MPE主要表现为细小的粉色斑丘疹，并可在停止用药后1-2周消退。HSS表现为多器官综合征，除发生皮疹外，伴有多系统损害，如发热、关节痛、嗜酸性粒细胞增多和淋巴结病变；SJS以发热、乏力、迅速进展的泡状斑疹和粘膜病变为特征；TEN的症状与SJS相似，但更为严重，死亡率更高。虽然SJS/TEN的发病率极低，每年大约有1,000,000分之0.4至6个个案，但其死亡率高达5-50％，并且存活的SJS/TEN患者约有30-70％患有严重后遗症。SJS/TEN可由病毒感染、肺炎霉浆菌感染、遗传等多种因素引起，但最常见的起因为药物治疗，约占80％。SCAR的发病机制尚不清楚，普遍认为是多因素的，包括遗传因素。同时，以往的研究证明免疫机制在多种ADR的进展中发挥着重要作用。因此，基因变异在高度多态性的人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)系统中的作用引起了研究者的高度关注。
HLA位于人类6号染色体短臂的21.31区，约含360万个碱基对，是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最丰富的区域，分为HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因。经典的HLA-Ⅰ类基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三类，经典的Ⅱ类基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ类基因与前两类不同，除包含肿瘤坏死因子(Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、热休克蛋白基因等具有免疫相关功能的基因外，还包括许多非免疫相关基因。其中，HLA-B是人类基因组中最具多态性的区域，包含超过1600个等位基因。研究报道，HLA与多种疾病密切相关，如强直性脊柱炎、贝赛特氏症、乳糜泻等。近年来，HLA在药物基因组学研究中的重要作用引起广泛关注，国内外多个课题组通过对临床病例的基因检测，发现特定的HLA等位基因与多种药物过敏反应高度相关。其中，最典型的应用为美国FDA明确建议亚裔病人在服用卡马西平(carbamazepine)前进行HLA*B5801基因检测。此外，阿巴卡韦(abacavir)、别嘌呤醇(allopurinol)等引起的SCAR与特异性HLA等位基因的密切关系也得到明确报道。
别嘌呤醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，自1963年以来，被广泛应用于痛风、高尿酸血症及其并发症的治疗，其价格便宜，方便给药，既可治疗尿酸盐产生过剩，又可治疗尿酸盐排泄下降，成为临床治疗的首选药物。然而，别嘌呤醇也是引起cADRs的最常见因素之一，占SCAR病例的5％。别嘌呤醇所致cADRs范围广泛，严重程度从MPE到SCAR不一，SCAR虽然罕见，但死亡率高达26％。在台湾、香港和上海进行的研究发现，HLA*B5801基因阳性的汉族人群服用别嘌呤醇可导致SJS/TEN，对HLA*B5801的基因学检测将具有重要前瞻性意义，可能降低别嘌呤醇所致SCAR的发病率。此外，在泰国、日本、马来西亚等亚洲人群中均确认了HLA*B5801与别嘌呤醇所致SJS/TEN间的高度相关性。
由此可见，快速而准确地检测HLA*B5801等位基因对临床个体化治疗、医学研究及新药开发和评价具有重要意义。目前国内市场上常用的上述基因检测方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specificprimer)即序列特异引物引导的PCR反应，是目前被广泛采用的检测方法，其基本方法是设计一系列等位基因型特异性引物，通过特定PCR反应体系扩增各等位基因型特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，此方法成本低，但操作复杂，无法自动获取结果，准确度也有待提高。PCR-SSOP即多聚酶链反应寡聚核苷酸探针杂交，先采用位点特异性引物对HLA-B位点进行扩增，扩增产物包括HLA-B位点的所有等位基因序列，再根据碱基互补原则，将PCR产物经化学变性解链后，单链与固化在2条尼龙膜上的序列特异寡核苷酸探针在特定条件下杂交，经洗膜，加入标记有碱性磷酸盐的抗生物蛋白链菌素与生物素及底物反应，对扩增片段进行分析鉴定。SSOP反向杂交法操作繁琐，耗时长，需严格控制实验条件，否则会导致错配，影响结果准确性。荧光定量PCR的基本原理是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，从而对PCR产物进行实时检测。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。Taqman荧光定量PCR法克服了以上不足，操作简便、快速，特异性高，并可实现高通量检测。一般来讲，Taqman荧光定量PCR法通过设计一对或多对HLA-B*5801特异性引物及相应探针，进行PCR扩增，考虑到HLA多态性非常高，结果易出现假阳性，从而影响其准确性。因此，本领域急需一种操作简便、快速，且准确度高的检测方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测HLA-B*5801等位基因的方法和试剂盒。
本发明的用于检测HLA-B*5801等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，包含两对根据HLA-B*5801特异性序列设计的引物及相应两条探针，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物1 | 5’-GCGCCAGGTCTCACATC-3’ |
| 引物2 | 5’-GTCGTAGGCGTACTGC-3’ |
| 探针1 | 5’-GATGTATGCCTGCGAC-3’ |
| 引物3 | 5’-CGCGAGTCCGAGGA-3’ |
| 引物4 | 5’-CATGTTCGGTGTCTCC-3’ |
| 探针2 | 5’-CGCGGGCGCCATGGATAG-3’ |
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA-B*5801假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物5 | 5’-CTGTACGAGGACCTGA-3’ |
| 引物6 | 5’-CACGGGTCGACTCC-3’ |
| 探针3 | 5'-CTGGACCGCGGCGGAC-3' |
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果，序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物7 | 5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’ |
| 引物8 | 5’-ACACATGGAAGACCACA-3’ |
| 探针4 | 5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3' |
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。
本发明提供了上述PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-B*5801等位基因的试剂盒中的应用。
本发明提供了含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。
所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
本发明具有如下技术效果：通过两个反应管确定实验样本HLA-B*5801基因阳性与否，通过一个反应管排除HLA-B*5801基因的假阳性结果，通过每个反应孔添加的内对照引物及探针排除样本HLA-B*5801基因的假阴性结果。
附图说明
图1为样本检测示意图。
图2-1a为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 1VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-1b为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 1FAM(检测5801的报告荧光)的扩增曲线。
图2-2a为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 2VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-2b为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 2FAM(检测5801的报告荧光)的扩增曲线。
图2-3a为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 3VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-3b为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 3FAM(检测5801的报告荧光)的扩增曲线。
图2-4a为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 4VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-4b为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 4FAM(检测5801的报告荧光)的扩增曲线。
图2-5a为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 5VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线。
图2-5b为HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 5FAM(检测5801的报告荧光)的扩增曲线。
图3-1为Sample 1测序图。
图3-2为Sample 2测序图。
图3-3为Sample 3测序图。
图3-4为Sample 4测序图。
图3-5为Sample 5测序图。
具体实施方式
实施例1
1.原料和设备：
1.1试剂盒内含物：
1)荧光定量PCR反应8连管，每条8连管可进行2个样本检测，每个检测需3管(MIX1、MIX2和MIX3)：
8连管上标记红色依次为MIX1,MIX2,MIX3，同排空一管后依次为MIX1,MIX2,MIX3，如图3所示。
2)3对特异性上下游扩增引物及相应探针，按特定排列冻干在PCR反应8连管底部，每个PCR反应8连管底部还添加有一对内对照引物及相应探针；所有引物和探针均冻干在PCR反应管底部。
3对特异性扩增引物及相应探针在PCR反应8连管中的分布如下：
每个反应管中还添加一对内对照引物及相应探针，内对照引物序列如下：
| 名称 | 序列 |
| 引物7 | 5’-CATCTGGACATGCTTGCT-3’ |
| 引物8 | 5’-ACACATGGAAGACCACA-3’ |
| 探针4 | 5'-TGTTAAAGCTCTGAATAA-3' |
3)PCR反应试剂
DNA聚合酶：为热启动Taq聚合酶；
PCR反应混合液，成分如下：包括0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
1.2样本的来源
1)血液样本采集
血液样本可以用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。
2)核酸样本萃取
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
3)核酸样本定量
萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于15-30ng/μl，不可将核酸样本溶解于含有超过0.5mM螯化物如乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液。
4)核酸样本质量规范
核酸样本的A260/A280比值应介于1.65到1.8之间。
1.3所需实验设备
荧光定量PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8连管水平头)。
2.基因分型过程
2.1反应体系的配置：以一次进行4个样本的检测为例，反应体系如表1所示：
表1：PCR反应体系
| 组分名称 | 加量μl/管 | 4人份(13孔) |
| PCR反应混合液 | 3 | 39 |
| 灭菌水 | 13 | 169 |
| Taq核酸聚合酶 | 0.2 | 2.6 |
| 核酸样本 | 2 | - |
| 总体积 | 18.2 | 210.6 |
每个PCR反应8连管中预先冻存有0.6μl 10μM内对照引物和0.4μl 10μM内对照探针，3对特异性引物及相应探针在PCR反应8连管中的分布和用量如下：
取16μl的上述混合液至各反应管中；每个反应管加入2μl核酸样本，确认样本与上述混合液充分混合均匀；将反应管盖上盖子，短暂离心后，放入荧光定量PCR仪中。
2.2 PCR反应程序：如表2所示：
表2：PCR反应程序
请依各型号的自动循环控温仪操作手册进行程序设定，荧光信号采集点设定在65℃；荧光信号采集波长设定FAM(520nm)和VIC(560nm)，其中VIC为内对照基因报告荧光。
2.3实验结果分析：在上述PCR反应体系中，观察样本中FAM(检测5801的报告荧光)和VIC(内对照基因的报告荧光)的扩增曲线及Ct值。三管反应的内对照(VIC)Ct值均≤35，提示聚合酶链式反应正常进行；样本具备如下条件，且扩增曲线呈典型S型曲线，判为阳性：
即待测样本中，MIX1和MIX2的特异性荧光信号FAM都形成对数扩增S型曲线Ct值均≤32，MIX3无扩增Ct值>35，则该样本判为HLA-B*5801等位基因阳性。
图2-1a—图2-5b为5个HLA-B*5801等位基因阳性样本——Sample 1、Sample2、Sample 3、Sample 4和Sample 5使用本方法和试剂盒检测图。图中，各样本三管反应的内对照(VIC)Ct值均≤35，提示聚合酶链式反应正常进行；MIX1和MIX2的FAM扩增曲线呈典型S型曲线，Ct值≤32；MIX3的FAM无扩增，Ct值>35。样本判为HLA-B*5801等位基因阳性。
图3-1—图3-5为这5个HLA-B*5801等位基因阳性样本测序图。测序结果显示样本均为HLA-B*5801等位基因阳性。本发明的试剂盒检测结果与测序结果一致。
结论：整个实验流程仅需约1个小时，实验结果准确，通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的HLA-B*5801等位基因阴阳性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于检测HLA-B*5801等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针包含两对根据HLA-B*5801特异性序列设计的引物及相应两条探针，序列如下：
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对用于筛除HLA-B*5801假阳性的引物及相应一条探针，序列如下：
所述的PCR扩增引物组和Taqman探针还包含一对内对照引物及相应一条探针，用于监控仪器故障、试剂因素或样本中的抑制物的因素造成的假阴性结果，序列如下：
2.根据权利要求1所述的用于检测HLA-B*5801等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针，其特征在于，所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX或VIC，3’端的淬灭基团为BHQ-1。
3.如权利要求1或2所述的PCR扩增引物组和Taqman探针在制备检测HLA-B*5801等位基因的试剂盒中的应用。
4.含有如权利要求1或2所述的用于检测HLA-B*5801等位基因的PCR扩增引物组和Taqman探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应混合液和Taq酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应混合液包括：0.18mMdNTP、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM Tris-HCl、甘油(glycerol)0.6％v/v，二甲基亚砜(DMSO)5％v/v和甲酰胺2.5％v/v，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A primer set and kit for detecting HLA-B * 5801 allele Effective date of registration: 20230131 Granted publication date: 20191206 Pledgee: Bank of Communications Co.,Ltd. Taizhou Branch Pledgor: JIANGSU WEIHE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023320000042 |