CN104017898A - 快速检测hla-b*5801等位基因的引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种快速检测HLA-B*5801基因的引物、含有该引物的试剂盒以及采用该引物和试剂盒快速检测HLA-B*5801基因的方法。本发明使用了HLA-B*5801基因的特异性引物，且采用多重引物的组合设计，完全覆盖了HLA-B*5801基因的SNP位点，增强了特异性的结合，更加有效地防止了假阳性的产生。此外，本发明将特异性引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，大大节省了操作时间和工作量，具有快速、简便、准确、直观的特点，在3小时内即可完成整个基因的筛查和分型实验，解决了HLA-B*5801基因用于痛风类等药物安全性用药指导的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及快速检测HLA-B*5801等位基因的引物、试剂盒及方法。
背景技术
痛风是嘌呤代谢异常致使尿酸合成增加而导致的代谢性疾病。痛风与人体的代谢失衡有关，与血尿酸水平升高关系密切。在我国，该病的患病率逐年上升，某些地区高尿酸血症的发病率已达13.3％，且常与高血压、糖尿病、高脂血症、肥胖等共同存在。在我国，别嘌醇作为首选治疗痛风的药物。但是别嘌醇的使用会出现一定的药物不良反应。近年来，许多研究显示，别嘌醇相关的严重药疹与HLA-B*5801密切相关已经得到肯定。早在2008年，中国台湾地方行政部门就已经发布指令，在服用别嘌醇前必须进行HLA-B*5801检测。2012年美国风湿病学会痛风治疗指南中也强调，对于特定的人群，如韩国裔，同时有3级以上慢性肾脏病(CKD)，及所有中国汉族人、泰国裔，因为人类白细胞抗原HLA-B*5801阳性率高，发生别嘌醇相关的严重过敏性药疹危险性增高，在使用别嘌醇前，应该进行HLA-B*5801基因检测。因此，在服用抗痛风药物之前，进行HLA-B*5801基因检测，实现了个体化用药并体现了药物经济学等因素。
目前检测HLA-B*5801的主要方法为PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链反应)、PCR-SSP(序列特异引物引导的聚合酶链反应)、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应)和RT-PCR(荧光定量PCR反应)等检测方法。其中PCR-SBT方法是对HLA基因的B位点进行测序，进而确定HLA-B*5801高分辨率的方法，但其检测的步骤繁琐，费用昂贵并且周转时间较长(大于1天)，不适合对于用药安全性的快速指导。RT-PCR的检测方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵，而且需要制备标准品，对实验环境要求高。PCR-SSP方法是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩增，具有成本低，时间短的特性。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测HLA-B*5801的试剂盒，但目前市面上的试剂盒涵盖的基因型别不全，容易出现漏检情况，远远不能满足对用药安全性的快速、简便、高特异性检测HLA-B*5801基因的需求。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的HLA数据库，考虑不同引物设计的位置、序列、涵盖的等位基因数量等因素，并应用单管多重PCR反应体系，通过一个反应即实现了基因型别的检测，从而提供了一种快速，简便、高特异性、易标准化地定性检测HLA-B*5801基因的PCR-SSP方法。
为此，本发明一方面提供了一种快速检测HLA-B*5801基因的引物，其包含SEQ ID NO.1-6所示的检测引物58PF01、58PR01、58PF02、58PR02、58PF03和58PR03。
在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示的内对照引物NCXF和NCXR。
本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*5801基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液中包含如上所述的快速检测HLA-B*5801基因的引物，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中快速检测HLA-B*5801基因的引物58PF01、58PR01、58PF02、58PR02、58PF03和58PR03的浓度均为0.5μM。
在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上所述的内对照引物。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。
在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。
本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*5801基因的方法，其包含以下步骤：
1、提取待检测样品的DNA溶液；
2、采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒，以步骤1中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增；
3、PCR扩增产物经凝胶电泳后，进行结果判读，当HLA-B*5801基因的三条谱带同时出现时，表明该基因为HLA-B*5801基因阳性，否则均为HLA-B*5801基因阴性。
本发明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的试剂盒在快速检测HLA-B*5801基因中的应用。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明基于PCR-SSP技术开发的HLA-B*5801基因筛查试剂盒，由于使用了特异性引物，且采用多重引物的组合设计，完全覆盖了HLA-B*5801基因的SNP位点，增强了特异性的结合，更加有效地防止了假阳性的产生，具有快速、简便、准确、直观的特点，并且实验成本低，仅需微量检材即可完成实验检测所需。同时，本发明的检测试剂盒可以很直观地根据PCR扩增后电泳条带的有无情况，即可判断HLA-B*5801的等位基因型，从而完成HLA-B*5801的快速筛查。
此外，本发明将引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，可大大节省实验者的操作时间和工作量。并且，本发明将等位基因的多对引物混合，完成同时扩增，实现了一个PCR反应即可完成等位基因的分型，满足了高通量的实验需求，直接得出分型和筛查结果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合格DNA样品的情况下，本发明在3小时内即可完成整个基因筛查和分型实验，解决了HLA-B*5801基因用于痛风类药物安全性用药指导的问题。
附图说明
图1：检测样品的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：快速检测HLA-B*5801基因的引物设计
PCR引物设计所需要的所有HLA等位基因的数据来源于IMGT/HLADatabase(Release3.15.0,2014-01-17)，具体网址为：http：//www.ebi.nc.uk/ipd/imgt/hla/。引物设计采用人工方法，设计的引物在IMGT数据库中进行比对，确认该引物能特异性结合HLA-B*5801等位基因。在引物设计过程中，关键是使设计的引物在特定的PCR缓冲体系环境下，能够特异地扩增HLA-B*5801基因，即该引物为一种“具有序列特异性的SSP”。
为了采用特异性的PCR-SSP对HLA-B*5801基因进行筛查，在HLA-B*5801基因的SNP位点区域分别设计了特异性引物58PF01(SEQ IDNO.1)、引物58PR01(SEQ ID NO.2)、引物58PF02(SEQ ID NO.3)、引物58PR02(SEQ ID NO.4)、引物58PF03(SEQ ID NO.5)和58PR03(SEQ ID NO.6)，6个引物进行多重组合，合并为一个特异性反应。
同时，对下游引物的3’端引入了错配碱基的特异性设计，以增强引物扩增的特异性。
为了保证反应体系的正常进行，还设计了一对上下游引物NCXF(SEQID NO.7)和NCXR(SEQ ID NO.8)，作为内对照引物。
具体设计的引物情况如表1所示。
表1.快速检测HLA-B*5801基因的引物
| 引物编号 | 序列号 | 引物序列 |
| 58PF01 | SEQ ID NO.1 | AAC ATG AAG GCC TCC GCC |
| 58PR01 | SEQ ID NO.2 | CCG CGC GCT GCA GCG TCG |
| 58PF02 | SEQ ID NO.3 | CGC GAGTCC GAG GAC GGA |
| 58PR02 | SEQ ID NO.4 | TTC ATG TTC CGT GTC TCC CC |
| 58PF03 | SEQ ID NO.5 | ACG TGA CCC ACC ACC CCG |
| 58PR03 | SEQ ID NO.6 | GAA GGT TCT ATC TCC TGC TGG |
| NCXF | SEQ ID NO.7 | AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT |
| NCXR | SEQ ID NO.8 | GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT |
采用上述引物对HLA-B*5801等位基因进行检测，PCR目标片段大小分别为597bp、84bp和161bp。同时，采用内对照引物进行PCR扩增的产物大小为285bp。
实施例2：制备快速检测HLA-B*5801基因的试剂盒
1、引物的合成
引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列分别为SEQ ID NO.1-8所示，具体序列如表1所示。
2、PCR反应混合液的制备
将SEQ ID NO.1-8所示的引物，dNTPs，染料甲酚红，Taq酶缓冲液混合。检测引物SEQ ID NO.1-6的浓度均为0.5μM，内参引物SEQ ID NO.6-7的浓度分别为0.2μM，染料甲酚红浓度为0.01％，dNTPs浓度为0.2mM。PCR缓冲液为：Tris-HCL浓度为10mM，氯化钾浓度为50mM，氯化镁浓度为1.5mM，明胶浓度为0.001％。将上述PCR反应混合液和Taq酶分装后包装，组成试剂盒。
实施例3：样本中HLA-B*5801基因的定型检测
选取23份已知HLA-B位点结果的DNA样品。分别加入PCR管中，同时在每管中加入Taq酶。加样完成后将反应混合液混匀，短暂离心，进行PCR反应。
PCR反应的条件为：96℃2min；再依次按照以下程序运行35个循环，95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec；最后72℃10min，降温至15℃，可进行凝胶电泳检测。
使用0.5×TBE缓冲液，配置1.5％琼脂糖凝胶。取3ul PCR产物直接点样到凝胶孔上，电泳20分钟，然后在紫外光下拍照记录，具体凝胶电泳图参见附图1。
结果判读：在内对照条带正常出现的情况下，检测HLA-B*5801基因的结果有两种可能。一种是HLA-B*5801基因3个条带同时出现，表明该基因为HLA-B*5801基因阳性。另一种只出现0个、1个或者2个条带，均说明该基因为HLA-B*5801基因阴性。
Claims (10)
1.一种快速检测HLA-B*5801基因的引物，其包含SEQ ID NO.1-6所示的检测引物58PF01、58PR01、58PF02、58PR02、58PF03和58PR03。
2.根据权利要求1所述的引物，其进一步包含SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的内对照引物NCXF和NCXR。
3.一种快速检测HLA-B*5801基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液包含权利要求1所述的快速检测HLA-B*5801基因的引物，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中快速检测HLA-B*5801基因的引物58PF01、58PR01、58PF02、58PR02、58PF03和58PR03的浓度均为0.5μM。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中PCR反应混合液中进一步包含权利要求2所述的内对照引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。
7.根据权利要求3至6任一项所述的试剂盒，其中PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料优选为甲酚红。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。
9.一种快速检测HLA-B*5801基因的方法，其包含以下步骤：
(1)提取待检测样品的DNA溶液，
(2)采用权利要求1或2所述的引物，或采用权利要求3至8中任一项所述的试剂盒，以步骤(1)中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，当HLA-B*5801基因的三条谱带同时出现时，表明该基因为HLA-B*5801基因阳性，否则均为HLA-B*5801基因阴性。
10.权利要求1或2所述的引物，或者权利要求3至8中任一项所述的试剂盒在快速检测HLA-B*5801基因中的应用。
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