CN104946735A - 试剂盒及确定待测dna样本预定snp位点的基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法，其中该试剂盒包括：第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针、第二探针、第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针、第四探针、第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针、第六探针、第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针、第八探针、第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针、第十探针、第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针、第十二探针、第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针、第十四探针、第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。该试剂盒能够用于Rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的检测和基因型分型。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法。
背景技术
据WHO统计，全球抑郁症发病率为11％。在我国抑郁症发病率约为3％～5％，目前已经有超过2600万人患有抑郁症。药物是治疗抑郁症的最有效方法。在中国约10％的患者接受了相关的药物治疗。美国人口中的10％在服用抗抑郁症药物，而其中45～55岁妇女中服用抗抑郁症药物高达25％。然而，抗抑郁症药物在过去十年中为医药公司带来可观利益同时，相关问题不容忽视：首先，抗抑郁症药物副作用大且存在显著的个体化差异，服用第二代抗抑郁症药物的患者平均有61％经历至少一种副作用。最常见的有头痛、失眠症和性功能障碍等；其次，用药剂量存在个体化的问题，用药量不当会导致死亡；再次，疗效个体化差异大，仅30％～45％的患者获得临床症状的完全缓解。研究表明，人群对抗抑郁症药物的个体差异与单核苷酸多态性(SNP)密切相关。国内外学者正在纷纷开展此类研究，并证实了rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点与个体的抗抑郁症药物用药相关。因而，在抗抑郁症药物用药之前，需药个体的上述SNP位点的基因型检测和分型，意义重大。
然而，现阶段rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的检测和基因型分型的方法仍有待改进。
发明内容
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前检测SNP位点的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针杂交法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。 该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。Taqman探针杂交法的原理为：在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针，探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，探针的5’端标记有报告基因，如FAM、VIC，3’端标记有荧光淬灭基团，如MGB TAMRA；当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。由此，应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能够扩增出各自的基因型；用两种荧光信号能够被显著区分的荧光染料分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。因而，利用该方法进行SNP基因型分型时，引物和探针的设计至关重要，引物长度、探针长度、引物特异性和探针特异性均会显著影响检测结果的特异性和敏感性。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效用于rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点检测的试剂盒，以及确定待测DNA样本的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型的方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；第二核酸分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；第一探针，所述第一探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；第二探针，所述第二探针具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；第三核酸分子，所述第三核酸分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；第四核酸分子，所述第四核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；第三探针，所述第三探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；第四探针，所述第四探针具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；第五核酸分子，所述第五核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；第六核酸分子，所述第六核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；第五探针，所述第五探针具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；第六探针，所述第六探针具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；第八核酸分子，所述第八核酸分子具有SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；第七探针，所述第七探针具有SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；第八探针，所述第八探针具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；第九核酸分子，所述第九核酸分子具有SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；第十核酸分子，所述第十核酸分子具有SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；第九探针，所述第九探针具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；第十探针，所述第十探针具有SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；第十一核酸分子，所述第十一核酸分子具有SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；第十二核酸分子，所述第十二核酸分子具有SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；第十一探针，所述第十一探针具有SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列；第十二探针，所述第十二探针具有SEQ ID NO：24所示的核苷 酸序列；第十三核酸分子，所述第十三核酸分子具有SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列；第十四核酸分子，所述第十四核酸分子具有SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列；第十三探针，所述第十三探针具有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列；第十四探针，所述第十四探针具有SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列；第十五核酸分子，所述第十五核酸分子具有SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列；第十六核酸分子，所述第十六核酸分子具有SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列；第十五探针，所述第十五探针具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列；第十六探针，所述第十六探针具有SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列，其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同，所述第三探针与所述第四探针的荧光报告基团不同，所述第五探针与所述第六探针的荧光报告基团不同，所述第七探针与所述第八探针的荧光报告基团不同，所述第九探针与所述第十探针的荧光报告基团不同，所述第十一探针与所述第十二探针的荧光报告基团不同，所述第十三探针与所述第十四探针的荧光报告基团不同，所述第十五探针与所述第十六探针的荧光报告基团不同。
根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够用于rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的检测。具体地，根据Taqman探针杂交法，利用该试剂盒中的试剂，将待测DNA样本进行荧光定量PCR后，基于荧光定量PCR结果即可容易地确定rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型。进而，可以将rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型信息，与其他临床信息结合分析，用于指导待测DNA样本来源的个体的抗抑郁症药物用药。
根据本发明的实施例，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述淬灭基团为MGB。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法，所述预定SNP位点为选自rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的至少一种。根据本发明的实施例，该方法包括：根据Taqman探针杂交法，利用前面所述的试剂盒，将所述待测DNA样本进行荧光定量PCR；以及对荧光定量PCR结果进行分析，以便确定待测样本预定SNP位点的基因型，其中，针对rs2032583位点，采用所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针；针对rs1800532位点，采用所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针；针对rs6265位点，采用所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针；针对rs6311位点，采用所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针；针对rs1065852位点，采用所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针；针对rs4244285位点，采用所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针；针对rs4986893位点，采用所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针；针对rs4680位点，采用所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。。
根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够有效地确定待测DNA样本rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型。此 外，发明人惊奇地发现，该方法成本低、特异性强、灵敏度高、准确度高、可重复性好，且在一次PCR反应中即可完成对单个SNP位点的基因型判定，操作方便、快速。
另外，根据本发明上述实施例的确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，利用ABI Stepone荧光定量PCR仪进行所述荧光定量PCR。由此，荧光定量PCR结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR的反应体系为：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix；3.5重量份的超纯水；0.5重量份的组合物；以及1重量份的待测DNA样本，其中，针对rs2032583位点，所述组合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针组成；针对rs1800532位点，所述组合物由所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针组成；针对rs6265位点，所述组合物由所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针组成；针对rs6311位点，所述组合物由所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针组成；针对rs1065852位点，所述组合物由所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针组成；针对rs4244285位点，所述组合物由所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针组成；针对rs4986893位点，所述组合物由所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针组成；针对rs4680位点，所述组合物由所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针组成。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述待测DNA样本的浓度为20ng/μl。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述待测DNA样本来源于人唾液或外周血。
根据本发明的实施例，所述组合物中每种核酸分子的浓度均为18μmol/L，每种探针的浓度均为5μmol/L。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR的反应程序为：第一步：60℃下保持30秒；第二步：95℃下保持10分钟；第三步：92℃下保持15秒；第四步：60℃下保持90秒；第五步：循环第三步第四步50次；以及第六步：60℃下保持30秒。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，利用Stepone software V2.1对所述荧光定量PCR结果进行分析。由此，对荧光定量PCR结果的分析更准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：
图1-图22分别显示了根据本发明一个实施例的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的与抗抑郁症药物用药相关的22种基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
其中，
图1为rs2032583位点AA基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图2为rs2032583位点AG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图3为rs1800532位点CC基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图4为rs1800532位点AC基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图5为rs1800532位点AA基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图6为rs6265位点AA基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图7为rs6265位点AG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图8为rs6265位点GG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图9为rs6311位点TT基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图10为rs6311位点CT基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图11为rs6311位点CC基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图12为rs1065852位点TT基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图13为rs1065852位点CT基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图14为rs1065852位点CC基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图15为rs4244285位点AA基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图16为rs4244285位点AG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图17为rs4244285位点GG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图18为rs4986893位点AG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图19为rs4986893位点GG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图20为rs4680位点AA基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图21为rs4680位点AG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图，
图22为rs4680位点GG基因型的代表性Stepone software V2.1分析图；
图23-图24显示了根据本发明一个实施例的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的与抗抑郁症药物用药相关的22种基因型的代表性测序峰图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
试剂盒
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包 括：第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针、第二探针、第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针、第四探针、第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针、第六探针、第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针、第八探针、第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针、第十探针、第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针、第十二探针、第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针、第十四探针、第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：5’-ACTAGAAGGTTCTGGGAA-3’；所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：5’-TGAAAAAGATTGCTTTGA-3’；所述第一探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列：5’-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTGGAATACTTTACTCTACTTAATTA-3’；所述第二探针具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：5’-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTAGAATACTTTACTCTACTTAATTA-3’；所述第三核酸分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列：5’-GGTACCTGGCATGAAATA-3’；所述第四核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列：5’-AGCTTTATGCAGGCAGAA-3’；所述第三探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列：5’-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTATCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-3’；所述第四探针具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列：5’-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTAGCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-3’；所述第五核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列：5’-GAAAGAGAAGAGGAGGCT-3’；所述第六核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列：5’-TTGGCTGACACTTTCGAA-3’；所述第五探针具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列：5’-CATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-3’；所述第六探针具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列：5’-CATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-3’；所述第七核酸分子具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列：5’-AAGTGGCACTGTGGTAAT-3’；所述第八核酸分子具有S EQ ID NO：14所示的核苷酸序列：5’-CCAATGTCAGTAATTCCA-3’；所述第七探针具有S EQ ID NO：15所示的核苷酸序列：5’-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCAGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-3’；所述第八探针具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列：5’-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCGGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-3’；所述第九核酸分子具有SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列：5’-TGGCCGTGATAGTGGCCA-3’；所述第十核酸分子具有SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTG-3’；所述第九探针具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列：5’-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGAGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-3’；所述第十探针具有SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列：5’-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGGGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-3’；所述第十一核酸分子具有SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列：5’-TTTATTAAATGCTTTTAA-3’；所述第十二核酸分子具有SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列：5’-TCTTTTACTTTCTCCAAA-3’；所述第十一探针具有SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列：5’-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCTGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-3’；所述第十二探针具有SE Q ID NO：24所示的核苷酸序列：5’-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCCGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-3’；所述第十三核酸分子具有SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列：5’-AAAGATCAGCAATTTCTT-3’；所述第十四核酸分子具有SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列：5’-GTCAATATAGAATTTTGG-3’；所述第十三探针具有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列：5’-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATTCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-3’；所述第十四探针具有SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列：5’-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATCCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-3’；所述第十五核酸分子具有SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列：5’-ATCACCATCGAGATCAAC-3’；所述第十六核酸分子具有SEQ ID N O：30所示的核苷酸序列：5’-AGGACAAAGTGCGCATGC-3’；所述第十五探针具有SEQ I D NO：31所示的核苷酸序列：5’-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCACGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-3’；所述第十六探针具有SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列：5’-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCATGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-3’。
其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同，所述第三探针与所述第四探针的荧光报告基团不同，所述第五探针与所述第六探针的荧光报告基团不同，所述第七探针与所述第八探针的荧光报告基团不同，所述第九探针与所述第十探针的荧光报告基团不同，所述第十一探针与所述第十二探针的荧光报告基团不同，所述第十三探针与所述第十四探针的荧光报告基团不同，所述第十五探针与所述第十六探针的荧光报告基团不同。需要说明的是，在本文中所使用的类似“所述第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同”的表达方式是指，所述两种探针的荧光报告基团的荧光信号能够被荧光定量PCR仪区分。例如，当第一探针与第二探针的荧光报告基团分别为VIC和FAM时，因VIC的最大激发波长是538nm，最大发射波长是552nm；FAM的最大激发波长495nm，最大发射波长是521nm，从而荧光定量PCR仪能够区分两种探针的荧光信号。
根据本发明的实施例，所述荧光报告基团为FAM(6-羧基荧光素)或VIC，所述淬灭基团为MGB(Minor Groove Binder，小沟结合物)。
优选地，根据本发明的一些实施例，所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针、第七探针、第八探针、第九探针、第十探针、第十一探针、第十二探针、第十三探针、第十四探针、第十五探针和第十六探针的淬灭基团均为MGB，所述第一探针、第三探针、第五探针、第七探针、第九探针、第十一探针、第十三探针、第十五探针的荧光报告基团为FAM，所述第二探针、第四探针、第六探针、第八探针、第十探针、第十二探针、第十四探针、第十六探针的荧光报告基团为VIC。即所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针、第七探针、第八探针、第九探针、第十探针、第十一探针、第十二探针、第十三探针、第十四探针、第十五探针和第十六探针分别为：
第一探针：FAM-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTGGAATACTTTACTCTACTTAATTA-MGB；
第二探针：VIC-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTAGAATACTTTACTCTACTTAA TTA-MGB；
第三探针：FAM-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTATCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB；
第四探针：VIC-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTAGCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB；
第五探针：FAM-CATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB；
第六探针：VIC-CATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB；
第七探针：FAM-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCAGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-MGB；
第八探针：VIC-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCGGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-MGB；
第九探针：FAM-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGAGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB；
第十探针：VIC-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGGGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB；
第十一探针：FAM-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCTGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB；
第十二探针：VIC-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCCGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB；
第十三探针：FAM-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATTCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB；
第十四探针：VIC–GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATCCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB；
第十五探针：FAM-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCACGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB；
第十六探针：VIC-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCATGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB。
根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够用于rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的检测。具体地，根据Taqman探针杂交法，利用该试剂盒中的试剂，将待测DNA样本进行荧光定量PCR后，基于荧光定量PCR结果即可容易地确定rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型。进而，可以将rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型信息，与其他临床信息结合分析，用于指导待测DNA样本来源的个体的抗抑郁症药物用药。
其中，需要说明的是，目前已知SNP rs2032583(ABCB1)具有AA、AG和GG三种基因型，其中AA型个体服用文拉法辛、帕罗西汀、西酞普兰缓解率(其中，缓解率是指给予某种治疗后，进入疾病临床消失期的病例数占总治疗例数的百分比)一般，AG型个体服用文拉法辛、帕罗西汀、西酞普兰缓解率较高，GG型个体服用文拉法辛、帕罗西汀、西酞普兰缓解率高；SNP rs1800532(TPH1)具有CC、CA和AA三种基因型，其中CC型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类(Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，选择性血清素再吸收抑制剂)缓解率高，CA型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类缓解率较高，而AA型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类缓解率一般；rs6265(BDNF)具有AA、AG和GG三种基因型，其中AA型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类缓解率高，AG型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类缓解率较高，而GG型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类缓解率一般；rs6311(5HT2AR)具有CC、CT和TT三种基因型，其中CC型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类出现性功能障碍和胃肠道等副作用的风险高，CT型个体服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类出现性功能障碍和胃肠道等副作用的风险较高，而TT型服用帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明和舍曲林等SSRIs类出现性功能障碍和胃肠道等副作用的风险一般；SNP rs1065852(CYP2D6*10)具有TT、TC和CC三种基因型，其中TT和TC型个体对氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、文拉法辛和米安色林的代谢能力较差，为中间代谢型，可适当降低用药量，而CC型个体对氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、文拉法辛和米安色林的代谢能力正常，为快代谢型，可适当提高用药量；SNP rs4244285(CYP2C19*2)和rs4986893(CYP2C19*3)均具有AA、AG和GG三种基因型，当上述两个SNP位点为GA+GA型或AA+GG型或GG+AA型时，个体对西酞普兰、艾司西酞普兰和舍曲林的代谢能力差，为慢代谢型，可一定程度地降低用药量或是改用其他药物，当两个SNP位点为GA+GG型或GG+GA型时，个体对西酞普兰、艾司西酞普兰和舍曲林的代谢能力较差，为中间代谢型，可适当降低用药量，当两个SNP位点为GG+GG型时，个体对西酞普兰、艾司西酞普兰和舍曲林的代谢能力正常，为快代谢型，可适当提高用药量；rs4680(COMT)具有AA、AG和GG三种基因型，其中GG型个体服用米氮平缓解率高，AG型个体服用米氮平缓解率较高，而AA型个体服用米氮平缓解率一般。
确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法，所述预定SNP位点为选自rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的至少一种。
根据本发明的实施例，该方法包括：
首先，根据Taqman探针杂交法，利用前面所述的试剂盒，将所述待测DNA样本进行 荧光定量PCR。其中，针对rs2032583位点，采用所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针；针对rs1800532位点，采用所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针；针对rs6265位点，采用所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针；针对rs6311位点，采用所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针；针对rs1065852位点，采用所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针；针对rs4244285位点，采用所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针；针对rs4986893位点，采用所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针；针对rs4680位点，采用所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。
需要说明的是，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子为用于扩增rs2032583位点的一对引物，其中所述第一核酸分子为上游引物，所述第二核酸分子为下游引物，所述第一探针和第二探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第三核酸分子和所述第四核酸分子为用于扩增rs1800532位点的一对引物，其中所述第三核酸分子为上游引物，所述第四核酸分子为下游引物，所述第三探针和第四探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第五核酸分子和所述第六核酸分子为用于扩增rs6265位点的一对引物，其中所述第五核酸分子为上游引物，所述第六核酸分子为下游引物，所述第五探针和第六探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第七核酸分子和所述第八核酸分子为用于扩增rs6311位点的一对引物，其中所述第七核酸分子为上游引物，所述第八核酸分子为下游引物，所述第七探针和第八探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第九核酸分子和所述第十核酸分子为用于扩增rs1065852位点的一对引物，其中所述第九核酸分子为上游引物，所述第十核酸分子为下游引物，所述第九探针和第十探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第十一核酸分子和所述第十二核酸分子为用于扩增rs4244285位点的一对引物，其中所述第十一核酸分子为上游引物，所述第十二核酸分子为下游引物，所述第十一探针和第十二探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第十三核酸分子和所述第十四核酸分子为用于扩增rs4986893位点的一对引物，其中所述第十三核酸分子为上游引物，所述第十四核酸分子为下游引物，所述第十三探针和第十四探针均为针对该位点的Taqman探针；所述第十五核酸分子和所述第十六核酸分子为用于扩增rs4680位点的一对引物，其中所述第十五核酸分子为上游引物，所述第十六核酸分子为下游引物，所述第十五探针和第十六探针均为针对该位点的Taqman探针。
根据本发明的实施例，进行荧光定量PCR的仪器不受特别限制。根据本发明一些具体示例，利用ABI Stepone荧光定量PCR仪进行所述荧光定量PCR。由此，荧光定量PCR结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，荧光定量PCR的反应体系不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述荧光定量PCR的反应体系为：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix(ABI公司，货号：4371355)；3.5重量份的超纯水；0.5重量份的组合物；以及1重量份的待测DNA样本，其中，针对rs2032583位点，所述组合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针组成；针对rs1800532位点，所述组合物由所述第三核酸分子、第四核 酸分子、第三探针和第四探针组成；针对rs6265位点，所述组合物由所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针组成；针对rs6311位点，所述组合物由所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针组成；针对rs1065852位点，所述组合物由所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针组成；针对rs4244285位点，所述组合物由所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针组成；针对rs4986893位点，所述组合物由所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针组成；针对rs4680位点，所述组合物由所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针组成。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
其中，待测DNA样本的浓度不受特别限制，只要能够有效完成荧光定量PCR即可。根据本发明的一些具体示例，所述待测DNA样本的浓度为20ng/μl。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述待测DNA样本的来源不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例，所述待测DNA样本来源于人唾液或外周血。
根据本发明的实施例，所述组合物中每种核酸分子的浓度均为18μmol/L，每种探针的浓度均为5μmol/L。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR的反应程序为：第一步：60℃下保持30秒；第二步：95℃下保持10分钟；第三步：92℃下保持15秒；第四步：60℃下保持90秒；第五步：循环第三步第四步50次；以及第六步：60℃下保持30秒。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
然后，对荧光定量PCR结果进行分析，以便确定待测样本预定SNP位点的基因型。其中，对所述荧光定量PCR结果进行分析的方法不受特别限制。根据本发明的实施例，利用Stepone software V2.1对所述荧光定量PCR结果进行分析。由此，对荧光定量PCR结果的分析更准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
根据本发明的一些具体示例，发明人首先对多个测试样本进行测序得到其基因型，然后采用本发明的引物及探针对上述多个测试样本进行taqman荧光定量PCR基因分型，经验证，证明利用本发明的方法进行基因分型的结果准确可靠。然后，通过统计将测序确定的特定的基因型与taqman荧光定量曲线图相关联。从而，在之后利用本发明的方法对待测样本进行taqman基因分型时，基于待测样本的taqman荧光定量曲线图，根据特定的基因型与taqman荧光定量曲线图的关联结果，确定待测样本的基因型。例如，参照图1-图22，针对某一种基因型，其荧光信号曲线位于基线(即背景荧光的信号)以上，一般表明存在对应的基因型。
发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效地确定待测DNA样本rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型，并且该方法成本低、特异性强、灵敏度高、准确度高、可重复性好，且在一次PCR反应中即可完成对单个SNP位点的基因型判定，操作方便、快速。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
根据本发明的确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法，确定48例待测DNA样本(人外周血DNA样本)的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型，具体步骤如下：
1、设计并合成以下引物和探针：
(1)针对rs2032583位点：
F引物：5’-ACTAGAAGGTTCTGGGAA-3’(SEQ ID NO：1)；
R引物：5’-TGAAAAAGATTGCTTTGA-3’(SEQ ID NO：2)；
FAM探针：FAM-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTGGAATACTTTACTCTACTTAATTA-MGB；
VIC探针：VIC-AGGGAGTAACAAAATAACACTGATTAGAATACTTTACTCTACTTAATTA-MGB。
(2)针对rs1800532位点：
F引物：5’-GGTACCTGGCATGAAATA-3’(SEQ ID NO：5)；
R引物：5’-AGCTTTATGCAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO：6)；
FAM探针：FAM-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTATCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB；和
VIC探针：VIC-CCCTATGCTCAGAATAGCAGCTAGCACCTAATAGGTTGTCAATTAATAA-MGB。
(3)针对rs6265位点：
F引物：5’-GAAAGAGAAGAGGAGGCT-3’(SEQ ID NO：9)；
R引物：5’-TTGGCTGACACTTTCGAA-3’(SEQ ID NO：10)；
FAM探针：FAM-CATTGGCTGACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB；
VIC探针：VIC-CATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGA-MGB。
(4)针对rs6311位点：
F引物：5’-AAGTGGCACTGTGGTAAT-3’(SEQ ID NO：13)；
R引物：5’-CCAATGTCAGTAATTCCA-3’(SEQ ID NO：14)；
FAM探针：FAM-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCAGACACTCACAGCACTCCG AGGAC-MGB；
VIC探针：VIC-ACTGTTGGCTTTGGATGGAAGTGCCGGACACTCACAGCACTCCGAGGAC-MGB。
(5)针对rs1065852位点：
F引物：5’-TGGCCGTGATAGTGGCCA-3’(SEQ ID NO：17)；
R引物：5’-TCGAAGCAGTATGGTGTG-3’(SEQ ID NO：18)；
FAM探针：FAM-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGAGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB；
VIC探针：VIC-CCGGGCATGGCAGGGGCCTGGTGGGTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGCGC-MGB。
(6)针对rs4244285位点：
F引物：5’-TTTATTAAATGCTTTTAA-3’(SEQ ID NO：21)；
R引物：5’-TCTTTTACTTTCTCCAAA-3’(SEQ ID NO：22)；
FAM探针：FAM-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCTGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB；
VIC探针：VIC-TTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCCGGGAAATAATCAATGATAGTGGG-MGB。
(7)针对rs4986893位点：
F引物：5’-AAAGATCAGCAATTTCTT-3’(SEQ ID NO：25)；
R引物：5’-GTCAATATAGAATTTTGG-3’(SEQ ID NO：26)；
FAM探针：FAM-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATTCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB；
VIC探针：VIC-GCAAAAAACTTGGCCTTACCTGGATCCAGGGGGTGCTTACAATCCTGAT-MGB。
(8)针对rs4680位点：
F引物：5’-ATCACCATCGAGATCAAC-3’(SEQ ID NO：29)；
R引物：5’-AGGACAAAGTGCGCATGC-3’(SEQ ID NO：30)；
FAM探针：FAM-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCACGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB；
VIC探针：VIC-TCAGGCATGCACACCTTGTCCTTCATGCCAGCGAAATCCACCATCCGCT-MGB。
2、荧光定量PCR：
利用ABI Stepone荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)，分别对各DNA样本进行荧光定量PCR，其中每个DNA样本的每个位点的检测都分别进行。
其中，荧光定量PCR的反应体系的总体积为10μl：Taqman Genotyping Master Mix(ABI公司，货号：4371355)5μl、ddH2O 3.5μl、针对特定位点的探针和引物的混合液0.5μl(上 下游引物的浓度均为18μmol/L，VIC探针和FAM探针的浓度均为5μmol/L)，浓度为20ng/μl的待测DNA样本1μl。
荧光定量PCR的扩增程序为：第一步：60℃下保持30秒；第二步：95℃下保持10分钟；第三步：92℃下保持15秒；第四步：60℃下保持90秒；第五步：循环第三步第四步50次；以及第六步：60℃下保持30秒。
4、实验结果：
PCR反应结束后，应用Stepone software V2.1(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司)进行分析，结果在48例样本中共分辨出22种基因型：SNP rs2032583两种基因型：A/A基因型有45例，A/G基因型有3例；SNP rs1800532三种基因型：C/C基因型为30例，A/C基因型有16例，A/A基因型有2例；SNP rs6265三种基因型：A/A基因型8例，A/G基因型24例，G/G基因型16例；SNP rs6311三种基因型：C/C基因型为12例，T/C基因型有20例，T/T基因型有16例；SNP rs1065852三种基因型：T/T基因型有18例，T/C基因型有18例，C/C基因型12例；SNP rs4244285三种基因型：A/A基因型8例，A/G基因型24例，G/G基因型16例；SNP rs4986893两种基因型：G/G基因型45例，A/G基因型3例；SNP rs6265三种基因型：A/A基因型4例，A/G基因型2例，G/G基因型28例。其中，图1-图22分别显示了8个SNP位点的抗抑郁症药物用药相关的22种基因型的代表性Stepone software V2.1分析图。
5、结果验证
利用Illumina HiSeq2000测序仪，根据其建库和测序方法，将上述48例待测DNA样本进行建库并测序，然后，基于测序结果，确定48例待测DNA样本的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型。结果显示，通过测序确定的该48例待测DNA样本的rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型与步骤4中根据本发明的方法确定的基因型结果完全一致。
其中，图23-图24显示了8个SNP位点的与抗抑郁症药物用药相关的22种基因型的代表性测序峰图。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
第二核酸分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
第一探针，所述第一探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
第二探针，所述第二探针具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；
第三核酸分子，所述第三核酸分子具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；
第四核酸分子，所述第四核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
第三探针，所述第三探针具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
第四探针，所述第四探针具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
第五核酸分子，所述第五核酸分子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；
第六核酸分子，所述第六核酸分子具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
第五探针，所述第五探针具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；
第六探针，所述第六探针具有SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
第七核酸分子，所述第七核酸分子具有SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；
第八核酸分子，所述第八核酸分子具有SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；
第七探针，所述第七探针具有SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；
第八探针，所述第八探针具有SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；
第九核酸分子，所述第九核酸分子具有SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；
第十核酸分子，所述第十核酸分子具有SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；
第九探针，所述第九探针具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；
第十探针，所述第十探针具有SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；
第十一核酸分子，所述第十一核酸分子具有SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；
第十二核酸分子，所述第十二核酸分子具有SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；
第十一探针，所述第十一探针具有SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列；
第十二探针，所述第十二探针具有SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列；
第十三核酸分子，所述第十三核酸分子具有SEQ ID NO：25所示的核苷酸序列；
第十四核酸分子，所述第十四核酸分子具有SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列；
第十三探针，所述第十三探针具有SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列；
第十四探针，所述第十四探针具有SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列；
第十五核酸分子，所述第十五核酸分子具有SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列；
第十六核酸分子，所述第十六核酸分子具有SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列；
第十五探针，所述第十五探针具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列；
第十六探针，所述第十六探针具有SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列，
其中，
所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，
所述第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同，
所述第三探针与所述第四探针的荧光报告基团不同，
所述第五探针与所述第六探针的荧光报告基团不同，
所述第七探针与所述第八探针的荧光报告基团不同，
所述第九探针与所述第十探针的荧光报告基团不同，
所述第十一探针与所述第十二探针的荧光报告基团不同，
所述第十三探针与所述第十四探针的荧光报告基团不同，
所述第十五探针与所述第十六探针的荧光报告基团不同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述淬灭基团为MGB。
3.一种确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法，所述预定SNP位点为选自rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680Rs2032583、rs1800532、rs6265、rs6311、rs1065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的至少一种，其特征在于，包括：
根据Taqman探针杂交法，利用权利要求1或2所述的试剂盒，将所述待测DNA样本进行荧光定量PCR；以及
对荧光定量PCR结果进行分析，以便确定待测样本预定SNP位点的基因型，
其中，
针对rs2032583位点，采用所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针；针对rs1800532位点，采用所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针；针对rs6265位点，采用所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针；针对rs6311位点，采用所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针；针对rs1065852位点，采用所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针；针对rs4244285位点，采用所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针；针对rs4986893位点，采用所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针；针对rs4680位点，采用所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用荧光定量PCR仪，优选ABI Stepone荧光定量PCR仪进行所述荧光定量PCR。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：
5重量份的Taqman Genotyping Master Mix；
3.5重量份的超纯水；
0.5重量份的组合物；以及
1重量份的待测DNA样本，
其中，针对rs2032583位点，所述组合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针组成；针对rs1800532位点，所述组合物由所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针组成；针对rs6265位点，所述组合物由所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针组成；针对rs6311位点，所述组合物由所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针组成；针对rs1065852位点，所述组合物由所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针组成；针对rs4244285位点，所述组合物由所述第十一核酸分子、第十二核酸分子、第十一探针和第十二探针组成；针对rs4986893位点，所述组合物由所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针组成；针对rs4680位点，所述组合物由所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测DNA样本的浓度为20ng/μl。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待测DNA样本来源于人唾液或外周血。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组合物中每种核酸分子的浓度均为18μmol/L，每种探针的浓度均为5μmol/L。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：
第一步：60℃下保持30秒；
第二步：95℃下保持10分钟；
第三步：92℃下保持15秒；
第四步：60℃下保持90秒；
第五步：循环第三步第四步50次；以及
第六步：60℃下保持30秒。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，利用Stepone software V2.1对所述荧光定量PCR结果进行分析。
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|---|---|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104946735A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108823299A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-16 | 苏州艾达康医疗科技有限公司 | 一种抑郁症用药相关基因的检测方法及试剂盒 |
| CN110819701A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-21 | 吉林和合医学检验有限公司 | 用于荧光定量pcr检测cyp2d6基因多态性的方法 |
| CN113270140A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-17 | 温州医科大学 | 以cyp2d6基因型为依据的氟伏沙明临床精准应用虚拟仿真实验系统 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN2153052Y (zh) * | 1993-05-11 | 1994-01-12 | 大庆石化总厂塑料厂 | 超高压多功能试验台 |
| WO2008076434A2 (en) * | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Theragenetics | Predicting a response to risperidone |
| CN102071254A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-05-25 | 东南大学 | 一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用 |
| CN103122376A (zh) * | 2012-12-09 | 2013-05-29 | 鄂文 | 一种rs6311的检测试剂盒 |
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
-
2014
- 2014-07-22 CN CN201410350086.0A patent/CN104946735A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN2153052Y (zh) * | 1993-05-11 | 1994-01-12 | 大庆石化总厂塑料厂 | 超高压多功能试验台 |
| WO2008076434A2 (en) * | 2006-12-18 | 2008-06-26 | Theragenetics | Predicting a response to risperidone |
| CN102071254A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-05-25 | 东南大学 | 一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用 |
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
| CN103122376A (zh) * | 2012-12-09 | 2013-05-29 | 鄂文 | 一种rs6311的检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SEFI KRONENBERG ET AL: "Pharmacogenetics of selective serotonin reuptake inhibitors in pediatric depressin and anxiety", 《PHARMACOGENOMICS》 * |
| 王欣晨等: "汉族人群帕罗西汀血药浓度和BDNF、GDNF基因多态性与抗抑郁疗效的相关分析", 《中国药理学会第三届全国治疗药物监测学术年会》 * |
| 解魏卫: "ABCB1基因多态性与抑郁症及抗抑郁药疗效的相关性研究", 《万方数据知识服务平台》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108823299A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-16 | 苏州艾达康医疗科技有限公司 | 一种抑郁症用药相关基因的检测方法及试剂盒 |
| CN110819701A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-21 | 吉林和合医学检验有限公司 | 用于荧光定量pcr检测cyp2d6基因多态性的方法 |
| CN113270140A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-17 | 温州医科大学 | 以cyp2d6基因型为依据的氟伏沙明临床精准应用虚拟仿真实验系统 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150930 |