CN103122376A

CN103122376A - 一种rs6311的检测试剂盒

Info

Publication number: CN103122376A
Application number: CN201210523154XA
Authority: CN
Inventors: 孔庆梅; 张晓静; 邵宏; 赵振国; 刘叔平; 鄂文; 田新霞
Original assignee: 鄂文
Current assignee: Beijing Able Ankang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2012-12-09
Filing date: 2012-12-09
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2032-12-09
Also published as: US20140162261A1; US20160369341A1; CN103122376B

Abstract

本发明涉及一种rs6311的检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液，其中所述探针，序列如下：rs6311T-fam：CTGTGAGTGTCTGGC；rs6311C-vic ：CTGTGAGTGTCCGGC。其中所述引物，序列如下：rs6311-F：AGAGAGAACATAAATAAGGCTAGAAAACAGTA；rs6311-R：CACTGTTGGCTTTGGATGGA。

Description

一种rs6311的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因表型的测定，特别涉及一种rs6311的检测试剂盒，检测方法及其应用。

背景技术

同一种药物对一些人非常有效，对另一些人效果却不明显，是因为他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为人类基因组上单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性（SNP）。单核苷酸的多态性，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。因此，SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

抑郁症目前为世界第四大疾患，到2020年可能成为仅次于心脏病的第二大疾病，正成为一个严重的全球性问题。研究认为抑郁与中枢去甲肾上腺素(NA)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、单氨氧化酶(MAO)等的含量过低及其受体功能低下有关。抗抑郁药自从20世纪50年代问世以来，发展很快，临床治疗效果也取得了很大的进展。Stahl等将抗抑郁药分为7类。其中，羟色胺重摄取抑制药(SSRI)是欧美国家最广泛的用于治疗抑郁症的一线抗抑郁药物。（Stahl,1998)

1988年，美国礼莱公司推出了第一个选择性SSRI--氟西汀(fluoxetine)，SSRIs的作用机制主要是通过选择性抑制神经元突触前膜五羟色胺（5-HT）泵对5-HT的再摄取，从而增加突触间隙5-HT的浓度，增强5-HT系统功能，起到抗抑郁作用。SSRIs几乎不影响其他神经受体 (如组胺受体、乙酰胆碱受体、肾上腺素受体、快速钠通道、NE再摄取泵等) ，因此SSRIs的作用位点相对其他传统的抗抑郁药物单纯，使得其显效快、用药剂量小，副作用明显较低（2-4)。目前，SSRI药物已达30多种，主要包括氟西汀、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、齐美定(zimeldine)、西酞普兰(citalopram)和曲唑酮(trazodone)。其化学结构虽无相同之处，但却有共同的药理学特性：抑制神经元再摄取5-HT，而对其他神经递质几乎无明显的影响。

临床常用SSRIs给药剂量

盐酸舍曲林治疗抑郁症：一日1次，50mg/次，治疗剂量范围为一日50mg～100mg。

盐酸氟西汀每天服用20mg；

帕罗西汀每日20 mg，早晨一次服用，2～3周后根据病情调整剂量，可以10 mg递增，每日最高剂量为50 mg。老年患者每日最大量不宜超过40 mg。长期应用需逐渐减量，不宜骤停。

氟伏沙明每日100～200mg，分1～2次服，饭时或饭后服下。剂量可视病情调整，每日不应超过300mg；

西酞普兰，成人：超始剂量20mg,qd，可增至40mg,qd,必要时可增至60mg,qd。65岁以下患者减半；

艾司西酞普兰，起始剂量一日一次10mg，一周后可以增至一日一次20mg,早晨或晚上口服。一般情况下应持续几个月甚至更长时间的治疗。老年患者或肝功能不全者建议一日一次10mg·，轻度或中度肾功能不全者无需调节剂量。严重肾功能不全者慎用。

虽然SSRIs在抑郁症的临床治疗中取得了极大的进展，但长期对大量患者的疗效观察结果显示，单独使用SSRIs在临床治疗中的效果根据人群的不同出现了很大的差别。对于SSRIs治疗效果不明显的抑郁症患者，临床上采取了低剂量（0.5–1.5 mg/day）利培酮联用SSRIs的治疗手段，短期内（1-2天），在受试人群中大多数患者中获得了非常理想的治疗效果(O’Connor and Silver, 1998; Ostroff and Nelson,1999)。利培酮的加入，可快速高效的提高SSRIs的抗抑郁能力。但这一显著的疗效在所有受试者中并非普遍存在。（Gerard J Marek， 2003）对于这一现象的解释，学者进行了基因组学的研究，推测这种现象与患者的相关因子基因的多态性存在着紧密的联系，如细胞色素酶P450多态性（靳士立等，2007；侯静等，2001)， 5羟色胺受体基因多态性（5,6,7)等等。

5-HT_2A受体基因定位于染色体13q14．21，有3个外显子和2个内含子。Turechi等研究提出，脑内5-HT_2A受体密度与5-HT_2A受体基因多态性相关（9)。目前发现的该基因多种多态性中， 1438G/A(rs6311C/T)多态性是唯一位于5-HT_2A受体基因启动子区域的结构多态性变异，其修饰启动子活性（15)，而启动子是启动转录的关键位点，其序列的不同可能有区别的改变转录，影响受体数目，构象和结合功能，进而导致中枢神经系统神经递质和受体的变化包括突触前变化，如神经递质的合成、释放、代谢和(或)再摄取，以及突触后变化，如受体、转换剂(G一蛋白)、第二信使(环化酶和磷脂酰肌醇系统)的变化和离子运输的异常，都会影响疗效。

近年来，关于rs6311多态性与情感性疾病的关联性研究较多，但结果缺乏一致性。亚洲对此此项关联的研究中，发现5-HT_2A受体基因 1438G/A多态性与帕罗西汀和氟西汀的治疗反应有关，1438G/G基因型患者疗效较好（10)。针对韩国人研究发现，1438G/G基因型患者对西肽普兰疗效较好（11)。而且，在中国汉族人群中有对此结论进一步的验证。2009年，报道了5-HT_2A rs6311在汉族神经障碍患者存在C等位基因频率增高,T位基因频率降低现象,且C等位基因频率增高在抑郁患者中普遍存在（12)。且有大量数据提示5-HT_2A受体基因rs6311位点多态性与SSRIs疗效的相关性,且推测T等位基因、TT基因型可能为疗效差的预测因子。对北京汉族人群的调查显示，T等位基因出现频率wie48.8%，人群中TT以及TC基因型的比率为69.8%。（详见rs6311多态性人群分布）

研究发现，SSRIs下调5-HT_2A受体的表达（Yatham et al, 1999; Maj J et al. 1996)。同时，有研究指出长期使用阻断突出前膜对5-HT再摄取作用的SSRIs类药物可导致皮层5-HT_2A受体的密度下降（13,14)。Glennon和Dukat研究报道SSRIs与5-HT_2A受体的反应率下降有关（Glermon et al, 1995)。据此，我们推测，在rs6311位点存在T等位基因、TT基因型时，可能会下调5-HT_2A受体的表达或者其对SSRIs的反应性，配合使用特异性5-HT_2A受体阻断剂，很可能会提高抑郁症的治疗效果。

在SSRIs治疗的患者中联用低剂量利培酮(0.5–1 mg/day)可在1-2天内明显改善大部分患者的症状。(O’Connor and Silver, 1998; Ostroff and Nelson,1999). 利培酮经口服后可被完全吸收，并在1-2小时内达到血药浓度峰值，其吸收不受食物影响。利培酮是一种具有独特性质的选择性单胺能拮抗剂，它与5—羟色胺能的5-HT2受体有很高的亲和力。利培酮与5-HT_2A受体结合能力远远大于 5-HT_1A和5-HT_2c受体，约为5-HT_1A受体结合能力的1000倍。在也能与肾上腺素能受体结合且以较低的亲和力与 H1—组胺能受体和α2-肾上腺素受体结合。利培酮不与胆碱能受体结合。治疗抑郁症利培酮的有效剂量为(0.5–1 mg/day)，治疗精神分裂症的剂量则为6mg/day。这与不同浓度下利培酮选择性阻碍的受体种类有关，4 mg剂量时刻封闭70–80%的纹状体多巴胺D2 受体。(Nyberg et al, 1999)血药浓度的继续增高会引起锥体外系副作用的增加。0.5-1 mg剂量的利培酮可饱和封闭5-HT_2A受体,并可将锥体外系副作用降到最低。

5-HT_2A受体是SSRIs类药物以及利培酮作用的主要靶点，属于G蛋白偶联的受体族，主要分布在额叶皮质（Arora RC et al. 1989; Yates M et al. 1990) 。5-HT_2A受体拮抗抑郁症等神经精神性疾病的治疗中对非5-HT_2A受体的激活作用（Gerard J Marek， 2003）。研究者在抑郁症动物模型的试验中发现5-HT_2A可能调节机体对药物的反应（8)。Black和Goodwin的研究中发现抗抑郁药的治疗可减少动物脑中5-HT_2A受体的密度（Goodwin GM et al.1984)。Biegon等报道抑郁症患者血小板膜上5-HT_2A受体的结合能力与患者的临床状态变化有关，当患者显示临床改善，则5-HT_2A受体的结合能力显著降低：而临床症状没有改善的患者，5-HT_2A受体的结合能力也没有变化（Biegon A Essar N et al.1990)。以上这些研究结果均提示5-HT_2A受体与抗抑郁药物反应存在密切的相关性。利培酮的低剂量摄取，可选择性的封闭5-HT_2A受体。鉴于在抑郁症的治疗中5-HT系统发挥的极复杂的功能，多种5-HT受体在治疗中的激活都会影响SSRIs的治疗。5-HT_2A受体特异性封闭取得疗效上的进展可能可以很大程度上为抑郁症的治疗带来新的途径。(Ostroff and Nelson, 1999; Ansoms et al, 1977).

为准确使用SSRIs类药物，本发明根据rs6311的多态性位点特点（rs6311位点多态性基因组序列见附件2），设计并合成了特异性探针和引物，检测人基因组中rs6311位点多态性，将人群分为正常代谢组（CC型）和缓慢代谢组（CT型和TT型）。正常代谢组常规给药SSRI。缓慢代谢组在SSRI药物基础上，同时给药低剂量利培酮（0.5-1mg/d），取得了良好的治疗效果，同时极大的减轻了药物副作用。

发明内容

为此，本发明进行了以下实验：

以上本发明的检测方法，在临床应用中得到了良好的评价，如进行的以下实验：

根据评价标准选取入组患者，按照研究方法线路图进行（图3），按照技术路线（图4），取患者外周血2毫升（EDTA抗凝），全血提取基因组DNA，分别采用双向测序方法和实时荧光Teqman探针技术确定每例样本的基因型，然后随机分成2组，一组按照常规给药方式，进行效果评价。另外一组进行A组实验：分型组的CC基因型组按照临床常规给药方案给药；分型组的CT/TT基因型组按照临床常规给药剂量给予SSRIs，并联合用药低剂量利培酮。根据临床效果评价，这一组还可以进一步进行（B组）研究实验：CC基因型按照常规给药方案给药。CT/TT基因型按照常规给药减低 SSRIs的剂量。按照抑郁症症状标准，严重程度标准评价，记录患者给药后情况。根据以上实验结论，可以得出初步给药方案。

实验后重新评价，确定剔除或者继续研究。进一步确定酮色林与SSRIs联用的对轻度，中度，重度抑郁症患者治疗中的剂量比例关系。

根据以上实验，本发明可以达到以下目的：

1、提供可以对抑郁病人进行分类的检测试剂盒

2、针对不同时期抑郁症患者调整SSRIs药物和利培酮剂量的配比

3、两种目标不同靶点的药物联用，以提高疗效。

为检测人群的正常代谢组（CC型）和缓慢代谢组（CT型和TT型）本发明设计了一种检测方法，在此基础上设计了一种检测试剂盒，以便更加方便的使用试剂盒中的试剂对上述人群进行检测。

本发明的检测方法，包括以下步骤：

1、患者全血基因组DNA提取，提取方法如下：

在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉非也，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm理性30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA。

2、PCR扩增：方法如下：

从以下序列中自主设计探针和引物

gagccagctc ccgcactgct aggatcctgt tggcttcctc tggcacggct cggctgggtt cctccctccc tgtgcggctc gcctcagcag gcacacattt agaaatcatt cacgagcccc tcaaagtcgc acaaaagaac tgcatgggaa agtaggaaga gctgtctgca ccaagggact cctggtttcc acgggaatgg agtagctctc tgactgtctc gttcatttca tcagacctcc ctctatgtgt atgtcataag ctgcaaggta gcaacagcca ggagggcgga ccaaacaggc tttttcttct ccctcttttt gctacatatt aatattggga agttttcctt tgcttttgag agaaactgga gaaatggcct tttgtgcaga ttcccattaa ggtaggtaag tggcactgtg gtaatttttt aggctgaagg gtgaagagag aacataaata aggctagaaa acagtatgtc ctcggagtgc tgtgagtgtc（序列1）

Y(T或者C)

ggcacttcca tccaaagcca acagtgtttg tgtccagagt ggaattactg acattggcca cataggctca gggtggctag gcacgtctgt ggtgataact ctgataaact attagcacta tttttattta atagatacac cattgaactg gcttattttc ttcagcagaa atatgccacc cagatattat tcaaaacctc acatgtggta ggaaataagt tggtttcgca gtaccaattt ttttccccca ccagtaatga caacttgcct tacttgtaaa gaaagccctt tcccaagtag gtttctaaag gaggcagttc gatctctctc tttttgcagg catgaaaata ttttcctcaa tagttgggtt ttgctacagt tctatcacct tctgttcttc acattctccc tggacaaatt caaccactct catgccttca atatgtttgt ggccaagtct gtaccttcat agctgattat ttctctcagt tccagaccta（序列2）

使用GeneCopoeia公司所提供的2*Probe AllinOne Q-PCR Mix按照合适的比例加入MIX，探针，引物以及上一步提取出来的基因组DNA，最后加入石蜡油，在荧光PCR仪上按照以下程序进行扩增：95℃10分钟---40次循环（95℃10秒-60℃30秒），

3、按照扩增曲线进行单链多态性分析待检样品的基因型，方法如下：

使用单链多态性分析仪器，如使用BIO-RAD iQ5仪，通过Taq-man荧光PCR检测候检位点待检样品的基因型，不同的基因型显示的结果是不相同的，如正常代谢组（CC型）显示的结果为：VIC标记探针扩增，

缓慢代谢组（CT型和TT型）显示的结果为：FAM标记探针和VIC标记探针同时扩增，或者FAM标记探针扩增。

根据以上所得到的待检样品的基因型的结果，就可以按照相对应的给药方式有针对性的调节药物剂量，给予合适的临床用药，如针对正常代谢组（CC型）给药方式为：常规给药SSRI。

缓慢代谢组（CT型和TT型）给药方式为：在SSRI药物基础上，同时给药低剂量利培酮（0.5-1mg/d），观察疗效，及时调整用药剂量。以上检测方法中，全血基因组DNA提取，可以使用庄盟血液基因组DNA小量提取试剂盒（Blood Genomic DNA Kit），试剂盒中内容为：红细胞裂解液，缓冲液A,B,C，漂洗液W2，洗脱缓冲液TE，蛋白酶K,吸附柱，收集管，说明书等，该试剂盒可以从市场上购买得到。全血基因组DNA提取属于现有技术，因此可以根据现有技术的方法进行提取，不局限于上述提及的方法。

评价标准

本发明根据以上检测方法，设计了一种检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液（为常规的PCR反应液，可以从市场上购买得到，如广州复能基因有限公司）。

其中所述探针，序列如下：

rs6311T-fam	CTGTGAGTGTCTGGC（序列3）
		rs6311C-vic	CTGTGAGTGTCCGGC（序列4）

其中所述引物，序列如下：

rs6311-F	AGAGAGAACATAAATAAGGCTAGAAAACAGTA（序列5）
		rs6311-R	CACTGTTGGCTTTGGATGGA（序列6）

以上所述的探针，引物，可以根据现有技术进行合成，如使用合成仪器，或通过化学合成方法，将核苷酸依次序进行连接。探针合成可选用MGB标记方法，产品的纯度以99%以上为宜。

以上试剂按照比例盛装，其中探针，引物的用量为：根据仪器的敏感程度，选择检测1-3次的用量，各试剂可分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，低温保存，使用时根据说明书中描述的方法进行操作即可。有关试剂的用量以一人1-3次的用量为宜，以上试剂根据需要可以和全血基因组DNA提取用的试剂盒共同组合包装，这样便于测定时一同使用。

本发明的优点在于：

1.尝试建立通过单核苷酸多态性判断人体药物代谢率，并据此调整用药方案的治疗患者的平台，为单核苷酸多态性在临床治疗中的应用提供理论及实践依据

2.提供治疗抑郁症的新理念以及新的治疗方案，提高患者生活质量

3.提供抑郁症患者SSRIs药物耐受时新的治疗手段

4.在保证疗效的基础上减低SSRIs药物的用量，并且将对患者的不良影响降到最低。

附图说明：

图1：rs6311多态性人群分布

图2：rs6311位点多态性基因组序列

图3：研究方法

图4：技术路线

具体实施方式：

实施例1

荧光扩增试剂盒及其应用

试剂盒中装有：荧光反应管，去离子三蒸水，MIX反应液

其中荧光反应管中装有以下探针和引物

其中所述探针，序列如下：

其中所述引物，序列如下：

和石蜡油

混合盛装，以上试剂盒最好在-20℃低温保存。

各试剂配制方法如下：

探针配制成：25μM，去离子三蒸水为溶剂。

引物配制成：20μM，去离子三蒸水为溶剂。

各试剂的比例如下：

每条探针0.1微升

每条引物0.8微升

去离子三蒸水，用1.5毫升小瓶盛装

MIX反应液用1.5毫升小瓶盛装。

石蜡油，适量，可以直接加入到荧光反应管中，也可单独盛装，反应时加入。

PCR扩增时在混合物上面铺一层石蜡油，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加5倍，

试剂盒的使用方法如下：

一．DNA提取过程按照以下步骤完成：

1. 全血基因组DNA提取，使用庄盟血液基因组DNA小量提取试剂盒（Blood Genomic DNA Kit），试剂盒中内容为：红细胞裂解液，缓冲液A,B,C，漂洗液W2，洗脱缓冲液TE，蛋白酶K,吸附柱，收集管，说明书等。

2. 仪器：低温高速离心机，电热恒温干浴锅，可调式移液器，荧光定量PCR仪等

3. 在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA。

二．从低温冰箱中取出按照一个人份分装好的荧光反应管，其中已经按照比例配置合适的探针，引物，石蜡油等反应液，操作者只需依次加入3.7微升去离子三蒸水，10微升MIX反应液，4.5微升上一步提取出来的DNA就可以上机扩增，扩增程序为：95℃10分钟---40次循环（95℃10秒-60℃30秒）。

三．最后根据扩增曲线，得出待检样品的基因型，按照相对应的给药方式予以临床应用。

序列表

<110>北京大学

<120>一种rs6311的检测试剂盒

<160>6

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gagccagctc ccgcactgct aggatcctgt tggcttcctc tggcacggct cggctgggtt cctccctccc tgtgcggctc gcctcagcag gcacacattt agaaatcatt cacgagcccc tcaaagtcgc acaaaagaac tgcatgggaa agtaggaaga gctgtctgca ccaagggact cctggtttcc acgggaatgg agtagctctc tgactgtctc gttcatttca tcagacctcc ctctatgtgt atgtcataag ctgcaaggta gcaacagcca ggagggcgga ccaaacaggc tttttcttct ccctcttttt gctacatatt aatattggga agttttcctt tgcttttgag agaaactgga gaaatggcct tttgtgcaga ttcccattaa ggtaggtaag tggcactgtg gtaatttttt aggctgaagg gtgaagagag aacataaata aggctagaaa acagtatgtc ctcggagtgc tgtgagtgtc

<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

ggcacttcca tccaaagcca acagtgtttg tgtccagagt ggaattactg acattggcca cataggctca gggtggctag gcacgtctgt ggtgataact ctgataaact attagcacta tttttattta atagatacac cattgaactg gcttattttc ttcagcagaa atatgccacc cagatattat tcaaaacctc acatgtggta ggaaataagt tggtttcgca gtaccaattt ttttccccca ccagtaatga caacttgcct tacttgtaaa gaaagccctt tcccaagtag gtttctaaag gaggcagttc gatctctctc tttttgcagg catgaaaata ttttcctcaa tagttgggtt ttgctacagt tctatcacct tctgttcttc acattctccc tggacaaatt caaccactct catgccttca atatgtttgt ggccaagtct gtaccttcat agctgattat ttctctcagt tccagaccta

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

ctgtgagtgt ctggc

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

ctgtgagtgt ccggc

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>5

agagagaaca taaataaggc tagaaaacag ta

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>6

cactgttggc tttggatgga

Claims

1.一种rs6311的检测试剂盒，该试剂盒包括探针，引物，MIX反应液，

其中所述探针，序列如下：rs6311T-fam ：CTGTGAGTGTCTGGC

rs6311C-vic： CTGTGAGTGTCCGGC

其中所述引物，序列如下：

rs6311-F ：AGAGAGAACATAAATAAGGCTAGAAAACAGTA

rs6311-R ：CACTGTTGGCTTTGGATGGA。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，试剂盒中装有：荧光反应管，去离子三蒸水，MIX反应液；

其中荧光反应管中装有以下探针和引物：

其中所述探针，序列如下：rs6311T-fam ：CTGTGAGTGTCTGGC

rs6311C-vic： CTGTGAGTGTCCGGC

其中所述引物，序列如下：

rs6311-F ：AGAGAGAACATAAATAAGGCTAGAAAACAGTA

rs6311-R ：CACTGTTGGCTTTGGATGGA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，探针配制成：25μM，引物配制成：20μM。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，各试剂的比例如下：

每条探针0.1微升，每条引物0.8微升，去离子三蒸水，用1.5毫升小瓶盛装，MIX用1.5毫升小瓶盛装。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中还包括石蜡油。

6.权利要求1所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

患者全血基因组DNA提取，提取方法如下：

在1.5毫升离心管中加入10微升蛋白酶K和100微升待检样品(EDTA抗凝全血)，并混匀，2000rpm离心10秒，加入200微升缓冲液B，颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀2-3次，加入200微升无水乙醇，颠倒混匀，并加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉非也，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升缓冲液C，12000rpm理性30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入700微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入500微升漂洗液W2，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管，然后12000rpm离心2分钟，将吸附柱置于一个新的1.5毫升离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，向吸附膜中间部位悬空滴加100微升洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集管中即为基因组DNA，

PCR扩增：方法如下：

按照扩增曲线进行单链多态性分析待检样品的基因型，方法如下：