CN105969842A - 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法 - Google Patents

基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法 Download PDF

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Abstract

基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法，涉及单核苷酸多态性。试剂盒包括实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照；所述Glu504lys为NCBI所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP位点；分型方法：1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA；2)采用所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。

Description

基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法
技术领域
本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)，尤其是涉及一种基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的靶点定位于某个基因，甚至是单个核苷酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础,通过SNP与疾病和药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术(RFLP)、Tagman荧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨熔解曲线分析法(HRM)等。其中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测；限制性片段长度多态性技术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪以及电泳仪器即可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测；Tagman荧光探针法准确度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难以实现高通量、自动化；高分辨熔解曲线分析法(HRM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不足，仪器选择少。
AllGlo探针作为新一代的荧光探针，在具备TaqMan-MGB探针优点的基础上，大大提高信噪比，减少背景荧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变(Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of thehepatitis B virus YMDD mutant using AllGloTM probes[J].Clin Chim Acta,2011，412(11-12)：1018-1021)、侵袭性曲霉菌病(Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.Theestablishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques forinvasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)。
硝酸甘油是临床上广泛用于治疗及预防冠心病心绞痛的常用药，在治疗心绞痛方面已有100多年的历史。虽然硝酸甘油是治疗心绞痛的一线药物，但其临床的治疗效果在不同个体间却有很大的差异，尤其在中国汉族人群中含服硝酸甘油无效的比例可高达25％以上。乙醛脱氢酶(ALDH2)是体内催化硝酸甘油生物转化的关键酶，其酯酶活性可以通过将硝酸甘油脱硝形成一氧化氮，进而发挥作用。ALDH2第12外显子存在一个SNP位点—Glu504lys，该SNP位点会导致ALDH2活性发生改变，进而造成硝酸甘油无法产生一氧化氮，丧失药效。Glu504lys在白种人中少见，但是在东亚黄种人中却高达30％-50％(Goedde HW,et al.Population genetic studies of aldehyde dehydrogenase isozyme deficiency and alcohol sensitivity.Am.J.Hum.Genet.1983；35:769–772)，因此在用药前对患者进行Glu504lys的检测分型，能够为患者选择更为合适的治疗药物，避免无效用药，为临床治疗用药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下,Glu504lys与硝酸甘油的紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方法来满足精准医学的发展。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒。
本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法。
所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，包括实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照；
所述Glu504lys为美国国家生物技术信息中心(NCBI)所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP位点；
所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、5u/μL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50×Low ROX、100mL无核酶水、10μmol/L Glu504lys的特异正向引物、10μmol/L Glu504lys的特异反向引物和AllGlo探针；所述10×Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl。
所述Glu504lys的特异正向引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5＇-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3＇；
所述Glu504lys的特异反向引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.2：5＇-GCCACCAGCAGACCCTCA-3＇。
所述AllGlo探针为Glu504lys的特异探针，其核苷酸序列为：
SEQ ID NO.3：Glu504lys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR；
SEQ ID NO.4：Glu504lys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP；
所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述阳性纯合对照品1为Glu504lys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分型为GG的DNA样品，所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。
所述阴性对照为1mL的无核酶水。
所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法，包括以下步骤：
1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA；
2)采用所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；
3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。
所述AllGlo探针可采用美国A1leLogic Biosciences Corporation公司的荧光定量探针，它拥有普通Taqman，Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克服了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国A1leLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
所述AllGlo探针具有以下优势：①提高Tm值(可达10℃以上)，探针更短可以达到15～16个碱基，可以适用A,T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
本发明采用了AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP),并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探针SNP检测分型方法，应用前景广阔。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种基于AllGlo探针的SNP检测分型试剂盒和检测方法，其特异性和敏感性高，可快速准确进行SNP分型，与现有的常见技术相比具有以下优势：
1.与直接测序法相比，AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。
2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于Taqman-MGB的一半。
3.与限制性片段长度多态性技术(RFLP)相比，基于AllGlo探针的SNP分型方法将反应时间大大缩短，通量更大，并且敏感性与特异性要明显高于基于限制性酶切位点的SNP分型方法。
4.与扩增阻滞突变系统(ARMS)相比，基于AllGlo探针SNP分型方法检测灵敏度更强，可以实现“闭管操作”，有效防止外界污染，具有良好的特异性和准确性。
5.与高分辨熔解曲线分析法(HRM)相比，基于AllGlo探针SNP分型方法特异性更高，并且多种仪器可应用AllGlo探针进行SNP检测分型，可用仪器选择多，不需要特定技术人员操作，应用范围更广阔。
6.本发明建立了基于AllGlo探针进行Glu504lys的检测分型方法，适合人群进行个体化的SNP检测分型，推动了SNP在临床药物研究及个体化用药的发展。
具体实施方式
实施例1
本发明基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒包括以下组份：
实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照。
①实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100m molTris-HCl和500m mol KCl)、10m mol的MgCl2、5u/μL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m moldNTPs混合液、50×Low ROX、100mL无核酶水、10μmol/L Glu504lys的特异正向引物、10μmol/L Glu504lys的特异反向引物和AllGlo探针。
②阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述阳性纯合对照品1为Glu504lys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分型为GG的DNA样品，所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。
③阴性对照为1mL的无核酶水。
实施例2
外周血Glu504lys的检测分型，包括以下步骤：
1.收集EDTA抗凝外周血：
抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管并分装多管，每管分装400～500μL，取200μL用于DNA提取，其余全血标本置于-80℃冻存。
2.提取DNA：
采用天根生物科技有限公司的生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，按照操作说明书进行样本(全血)DNA提取，200μLEDTA抗凝全血按照说明书操作进行，最后用50μL的洗脱缓冲液TB溶解DNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取纯度A260/A280比值在1.7～1.9之间，取浓度10～50ng/μL的已提取的DNA用于SNP分型检测，其余的DNA均于-80℃冻存。
3.实时荧光定量PCR扩增：
3.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。
3.2配制PCR反应混合液如表1。
表1
3.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入1μL的DNA，充分混匀，整个过程在冰上进行，避免气泡的产生。每次实验设置一个阴性对照，设置一个阳性纯合对照品1，一个阳性纯合对照品2和一个阳性杂合对照品。
3.4检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300，7500(美国AppliedBiosystems公司)等多种仪器。
3.5设置荧光定量PCR反应条件如表2。
表2
4.结果分析与处理：应用ABI仪器自带软件进行结果分析。根据对照扩增结果，分型产生三种基因型：
第一种基因型：AA，与阳性纯合对照品1在同一轴上；
第二种基因型：AG，与阳性杂合对照品在同一轴上；
第三种基因型：GG，与阳性纯合对照品2在同一轴上。
实施例3.组织样本SNP检测分型
1.组织样本处理：
组织(脾组织用量应少10mg)应打碎处理为细胞悬液，然后10000rpm(～11200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(天根DNA提取试剂盒DP304)，震荡至彻底悬浮；
2.组织样本DNA提取和富集：
采用天根生物科技有限公司的生产的DNA提取试剂盒(DP304),按照操作说明书进行组织样本的DNA提取，最后用50μL的洗脱缓冲液TE溶解DNA，于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度；
3.组织样本的SNP检测分型。
后续步骤参照实施例2的步骤3～4。
可应用范围：
基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其检测方法可应用于人类组织样本和血细胞Glu504lys的检测分型，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。

Claims (7)

1.基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，其特征在于包括实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照；
所述Glu504lys为美国国家生物技术信息中心所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP位点。
2.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、5u/μL的Taq HotstartDNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50×Low ROX、100mL无核酶水、10μmol/L Glu504lys的特异正向引物、10μmol/L Glu504lys的特异反向引物和AllGlo探针；所述10×Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl。
3.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，其特征在于所述Glu504lys的特异正向引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.1：5＇-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3＇；
所述Glu504lys的特异反向引物的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.2：5＇-GCCACCAGCAGACCCTCA-3＇；
所述AllGlo探针为Glu504lys的特异探针，其核苷酸序列为：
SEQ ID NO.3：Glu504lys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR；
SEQ ID NO.4：Glu504lys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP。
4.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，其特征在于所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品，所述阳性纯合对照品1为Glu504lys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu504lys分型为GG的DNA样品，所述阳性杂合对照品为Glu504lys分型为AG的DNA样品。
5.如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒，其特征在于所述阴性对照为1mL的无核酶水。
6.基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法，其特征在于包括以下步骤：
1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA；
2)采用如权利要求1～5中任一所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；
3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。
7.如权利要求6所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型方法，其特征在于所述AllGlo探针采用美国A1leLogic Biosciences Corporation公司的荧光定量探针。
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