CN111100929A

CN111100929A - 一种检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒

Info

Publication number: CN111100929A
Application number: CN202010053115.2A
Authority: CN
Inventors: 王双双; 王义聪; 薛方方; 王玮; 李振红; 付光宇; 杨增利; 苗拥军
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2020-05-05

Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒。该试剂盒用于检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)多态性位点。本发明的引物和探针灵敏度高、特异性强，可准确检出低至0.1ng/μL的基因组DNA。且试剂盒操作简便，可配合自动化仪器检测。

Description

一种检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒。

背景技术

高血压药物的个体差异在临床上也十分普遍，据报道约有20％-50％的高血压患者在接受药物治疗后血压未能达到良好控制。造成这种现象的主要原因也是与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异，目前对高血压药物代谢酶和受体遗传变异的研究主要集中在CYP2C9*3，ADRBI(1165G＞C)、AGTRI(166A＞C)、CYP2D6*10、ACE(I/D)等基因上，这些基因的突变是造成高血压患者药物反应个体差异的根本原因。

CYP2C9(CytochromeP4502C9)是细胞色素P450超家族(Cytochrome P450proteins，CYP)第二亚家族中的一个重要成员，临床上约有16％的药物由CYP2C9代谢。CYP2C9有多种突变等位基因，其中CYP2C9*2、CYP2C9*3突变会引起酶活性的减弱，导致CYP2C9的催化功能受到损害。CYP2C9*3突变最常出现在亚洲人群中，是CYP2C9 cDNA 7号外显子的A1075变为C，导致多肽链第359位氨基酸Ile(I)变为Leu(L)。虽然其突变率低，但是导致的不良反应严重，因此需要高度重视。CYP2C9*3突变会显著降低常用降压药洛沙坦的代谢，所以CYP2C9*3突变基因型的高血压患者应适当调整用药剂量，避免药物中毒。除此之外，经CYP2C9代谢的药物还有华法林、氟西汀、非甾体类有布洛芬、抗癫痫药物苯妥英钠和卡马西平、降血糖药物甲苯磺丁脲和格列吡嗪等其他药物。

细胞色素(CYP)2D6是一种参与众多内源性物质和不同药物消除的P450系氧化代谢酶。临床上25％的药物由CYP2D6代谢。CYP2D6基因突变通过改变体内酶数量及活性来影响药物代谢。CYP2D6*10是东方人最常见的突变，有4个点突变，其中C188T是最主要的改变因素。常用降压药美托洛尔为选择性β1受体阻滞剂，其α-羟基化代谢途径完全由CYP2D6介导。不同人口服美托洛尔血药浓度个体差异高达20倍。此外，经由CYP2D6代谢的药物还包括抗心律失常药，抗抑郁药，抗精神病药等。

肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统：肾素作用于血管紧张素原，使其转变成血管紧张素I(ANGI)，血管紧张素在正常血浆浓度下无生理活性，但在血管紧张素转换酶的作用下，形成血管紧张素II(ANGII)。血管紧张素II可经酶作用，脱去一个天门冬氨酸，转化为血管紧张素III(ANGIII)。ANGII和ANGIII与血管紧张素(ANG或AT)受体结合，产生各种生理效应，其中以ANGII活性最大，其生理作用是由AT1和AT2受体介导的，有强烈的收缩血管作用，其加压作用约为肾上腺素的10～40倍，而且可通过刺激肾上腺皮质球状带，促使醛固酮分泌，潴留水钠，刺激交感神经节增加去甲肾上腺素分泌，增加交感神经递质和提高特异性受体的活性等，使血压升高。它还可反馈性地抑制肾脏分泌肾素和刺激肾脏分泌前列腺素，使血压保持在正常水平。这个从肾素开始到生成醛固酮为止的调节机制，称为RAAS系统，具有调节血压的作用。

血管紧张素转换酶(ACE)是使血管紧张素I转换成血管紧张素II的重要限速酶。ACEI类药物可通过阻断ACE酶抑制RAAS过度激活从而发挥降压疗效，具有良好的靶器官保护作用。而ACE基因第16内含子中Alu序列的插入(I)/缺失(D)，使ACE有I/I、I/D和D/D三种基因型。血浆和细胞内的ACE水平受到ACE基因多态性的显著影响。ACE基因DD型人群ACE水平明显高于II型，因此对ACEI的降压疗效产生显著影响。因此，明确患者的ACE基因型的基础上选择合适的药物进行治疗是精准用药最根本的保证。而且，《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)概要》推荐DD基因型的高血压患者建议选用福辛普利进行降压治疗；DD基因型的高血压合并左心室肥大和舒张期充盈障碍的患者建议使用依那普利和赖诺普；II基因型患者应用赖诺普利或卡托普利治疗时应注意监测肾功能。

AGTR1是人类编码AT1受体的基因。AGTR1 3′UTR区的1166A＞C出现AA型、AC型和CC型3种基因型。AGTR1不同基因型的患者对高血压药物产生不同的药理反应，显著影响高血压患者的用药选择。随着血管紧张素II受体拮抗剂的广泛使用，AGTR1的基因多态性也受到广泛关注。其中AGTR1的CC和AC基因型的血压反应更大，尤其是有代谢综合征的患者。随着RAS系统抑制剂不断开发利用，不少肽类及非肽类抑制剂已广泛应用于治疗高血压等疾病，AGTR1多态性的研究将为指导此类药物个体化治疗打下坚实的基础。因此临床医师用药前可先对病人的基因型进行检测以了解患者对哪种特定抗高血压药物有效，从而制定出最佳的治疗方案使患者得到最有效治疗。

β1受体阻滞剂是临床上常用的降压药，β肾上腺素受体是该类药物的作用靶点。ADRB1是β肾上腺素受体基因，该基因位于人10号染色体。ADRB1基因c.1165G＞C位点突变能提高受体敏感度。研究表明ADRB1和CYP2D6基因多态性是造成美托洛尔降压疗效存在个体差异的主要原因。其中CYP2D6*10影响的是美托洛尔的药代动力学，而ADRB1突变型通过提高受体敏感性影响美托洛尔的降压疗效。除此之外，ADRB1基因多态性还显著影响阿替洛尔、比索洛尔的疗效。因此，临床药师可以通过患者ADRB1的基因型判断病人是否适合洛尔类药物及确定其给药剂量，从而提高药物疗效和用药准确性。

2013年卫生部发布的《医疗机构临床检验项目目录(2013年版)》也增加了针对用药指导的分子生物学检验项目，包括用于指导高血压个体化用药的基因检测项目：CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)检测。目前，基因多态性检测的分子生物学方法有多种，主要包括高分辨率溶解曲线、基因芯片技术和DNA测序技术，其中DNA一代测序技术作为该检测的金标准，程序繁杂，耗时长严重制约了其在临床中的应用。高分辨率溶解曲线和基因芯片对仪器和操作人员要求较高，临床不易推广，因此需要一种操作渐变快速，特异性好，且灵敏的检测方法。

目前，有多篇公开专利要求保护多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒。但这些专利中的检测试剂盒存在着检测限高、灵敏度差、检测时间长等缺陷。如CN201610732578专利整体使用taqman探针，公用上下游引物，两条探针中间有单位点突变，不属于arms PCR。且在实际操作中发现分型效果极差；该专利中能够做到的检测限是5ng/μL。又如CN201710201070专利使用的酶为Taq酶及UNG酶；使用锁核酸探针，价位大约是TaqMan探针的5-10倍；灵敏度仅达到1ng。该试剂-20℃保存。每次冻融，使用不方便。另外冻融对试剂的稳定保存有一定影响。又如CN201810245896、CN201910614761专利使用溶解曲线法，溶解曲线法灵敏度不高；扩增时间长达3小时，无法实现快速扩增。又如CN201811032803专利使用的是在ARMS PCR基础上，对TaqMan探针进行了改造的分型方法。该专利使用的MGB探针价位较TaqMan探针高；锁核酸探针，价位大约是TaqMan探针的5-10倍；成本极高。灵敏度仅达到0.1ng/μL。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒。该试剂盒灵敏度高、特异性强，可准确检出低至0.1ng/μL的基因组DNA。且试剂盒操作简便，可配合自动化仪器检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒，试剂盒包括PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2、PCR反应液E；

PCR反应液W1包括CYP2D6野生型引物、ADRB1野生型引物、CYP2C9野生型引物、CYP2D6探针、ADRB1探针、CYP2C9探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

PCR反应液M1包括CYP2D6突变型引物、ADRB1突变型引物、CYP2C9突变型引物、CYP2D6探针、ADRB1探针、CYP2C9探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

PCR反应液W2包括ACE(DD)引物、AGTR1野生型引物、ACE(DD)探针、AGTR1探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

PCR反应液M2包括ACE(II)引物、AGTR1突变型引物、ACE(II)探针、AGTR1探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

其中，

CYP2D6野生型引物：SEQ ID NO：1所示上游引物、SEQ ID NO：2所示下游引物；

CYP2D6突变型引物：SEQ ID NO：3所示上游引物、SEQ ID NO：4所示下游引物；

CYP2D6探针：SEQ ID NO：23所示；

ADRB1野生型引物：SEQ ID NO：5所示上游引物、SEQ ID NO：6所示下游引物；

ADRB1突变型引物：SEQ ID NO：7所示上游引物、SEQ ID NO：8所示下游引物；

ADRB1探针：SEQ ID NO：24所示；

CYP2C9野生型引物：SEQ ID NO：9所示上游引物、SEQ ID NO：10所示下游引物；

CYP2C9突变型引物：SEQ ID NO：11所示上游引物、SEQ ID NO：12所示下游引物；

CYP2C9探针：SEQ ID NO：25所示；

ACE(DD)引物：SEQ ID NO：13所示上游引物、SEQ ID NO：14所示下游引物；

ACE(DD)探针：SEQ ID NO：26所示；

ACE(II)引物：SEQ ID NO：15所示上游引物、SEQ ID NO：16所示下游引物；

ACE(II)探针：SEQ ID NO：27所示；

AGTR1野生型引物：SEQ ID NO：17所示上游引物、SEQ ID NO：18所示下游引物；

AGTR1突变型引物：SEQ ID NO：19所示上游引物、SEQ ID NO：20所示下游引物；

AGTR1探针：SEQ ID NO：28所示。

作为优选，PCR反应液E为浓度为10～30mM的醋酸锰水溶液。

优选地，PCR反应液E为浓度为20mM的醋酸锰水溶液。

作为优选，试剂盒还包括内参引物及探针。

作为优选，内参引物为：SEQ ID NO：21所示上游引物、SEQ ID NO：22所示下游引物；内参探针：SEQ ID NO：29所示。

作为优选，试剂盒还包括阳性质控和阴性质控。

作为优选，阳性质控为包含野生型基因、突变型基因、杂合型基因和内控基因的质粒；

作为优选，阴性质控为仅含有内控基因的质粒。

作为优选，CYP2D6探针、ACE(DD)探针或ACE(II)探针的发光基团标记为FAM；

作为优选，ADRB1探针或AGTR1探针的发光基团标记为ROX；

作为优选，CYP2C9探针的发光基团标记为CY5。

作为优选，PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2中各组分的浓度为：

优选地，PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2中各组分的浓度为：

作为优选，试剂盒的反应体系为：

模板DNA： 50μL；

PCR反应液W1、M1、W2、M2中一种 20μL；

PCR反应液E： 10μL。

作为优选，试剂盒的扩增程序为：

50℃2mm；

95℃2min；

95℃10s，60℃22s，45个循环。

本发明提供了一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒。该试剂盒包括PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2、PCR反应液E。本发明的试剂盒具有以下优点：

1、一次检测可以准确检测单个样本5个位点的基因型，费用较低；

2、操作简单，2管PCR即可对单个样本的5个位点进行准确分型；

3、可以准确检测0.1ng/μL基因组浓度的DNA的基因型；

4、针对CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE的5个位点分别设计对应的ARMS引物和Taqman探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；

5、使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程引入UNG酶防污染体系，且全程闭管，因此可以大大降低污染风险，保证检测的准确型；

6、快速检测，整个检测过程在50分钟内完成，判读方法简单可行7.PCR试剂实现4℃保存，避免传统-20℃保存的苛刻条件。

附图说明

图1-图15分别是CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)五个位点五种基因型的扩增检测图；

图1 CYP2D6*10野生型；

图2 CYP2D6*10突变型；

图3 CYP2D6*10杂合型；

图4 ADRB1(1165G＞C)野生型；

图5 ADRB1(1165G＞C)突变型；

图6 ADRB1(1165G＞C)杂合型；

图7 CYP2C9*3野生型；

图8 CYP2C9*3突变型；

图9 CYP2C9*3杂合型；

图10 ACE DD型；

图11 ACE II型；

图12 ACE ID型；

图13 AGTR1(1166A＞C)野生型；

图14 AGTR1(1166A＞C)突变型；

图15 AGTR1(1166A＞C)杂合型。

具体实施方式

本发明公开了一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明在于克服现有技术中的不足，在Taqman探针的基础上，提供一种操作简便、高灵敏度、特异性强的人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)多态性位点检测引物和探针，本发明的另一目的是提供包括检测以上多态性位点的试剂盒，以及检测方法。

所述探针均为Taqman探针，探针的核苷酸序列5’端标记发光基团，3’端标记荧光淬灭基团，且CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)和内标靶片段所用Taqman探针的荧光标记基团各不相同。

优选的W1和M1体系中CYP2D6*10位点和W2和M2体系中ACE(I/D)位点的发光基团标记为FAM，W1和M1体系中内标的发光基团标记为HEX，W1和M1体系中ADRB1(1165G＞C)位点和W2和M2体系中AGTR1(1166A＞C)位点的发光基团标记为ROX，W1和M1体系中CYP2C9*3位点和W2和M2体系中内标的发光基团标记为CY5。

优选的，所述人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因检测试剂盒，还包括PCR反应液，PCR反应液包括dNTPs，PCR缓冲液、甘油、超纯水、酶、金属离子等。

优选的，所述人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因检测试剂盒，还包括阴性质控和阳性质控。

本发明还提供了上述人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)样本制备，包括分离纯化样品中的基因组DNA；

2)用权利要求1中所述的人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因检测引物探针及PCR试剂配置的PCR反应液(W1)、PCR反应液(M1)、PCR反应液(W2)、PCR反应液(M2)和PCR反应液(E)构建PCR反应体系，分别构建PCR反应液(W1)、PCR反应液(M1)、PCR反应液(W2)四种反应体系，每个反应体系均用DNA作为模板，进行荧光定量PCR，同时设置阴性质控和阳性质控。

3)检测结果分析：

阳性质控FAM、HEX、ROX、CY5信号CT≤30，阴性质控四种信号CT≥30或无信号值；待检测样本在应反应体系W1和M1产生的HEX信号CT≤30情况下，表示扩增正常；在反应体系W2和反应体系M2产生的CY5信号CT≤30情况下，表示扩增正常，按照下面标准进行基因型判断：

表1基因型判断标准

待测样本检测结果判读：

CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)

W1和M1体系中FAM通道结果：Ct_W1-Ct_M1＞2.5为CYP2D6*10 CC型，Ct_W1-Ct_M1＞2.5为CYP2D6*10TT型，|Ct_W1-Ct_M1|≤2.5为CYP2D6*10CT型；

W1和M1体系中ROX通道结果：Ct_W1-Ct_M1＞2.5为ADRB1(1165G＞C)GG野生型，Ct_W1-Ct_M1＞2.5为ADRB1(1165G＞C)CC突变型，|Ct_W1-Ct_M1|≤2.5为ADRB1(1165G＞C)GC杂合型；

W1和M1体系中CY5通道结果：Ct_W1-Ct_M1＞2.5为CYP2C9*3AA型，Ct_W1-Ct_M1＞2.5为CYP2C9*3CC型，|Ct_W1-Ct_M1|≤2.5为CYP2C9*3AC型；

W2和M2体系中FAM通道结果：Ct_W2-Ct_M2＞2.5为ACE(I/D)DD型，Ct_W2-Ct_M2＞2.5为ACE(I/D)II型，|Ct_W2-Ct_M2|≤2.5为ACE(I/D)ID型；

W2和M2体系中ROX通道结果：Ct_W2-Ct_M2＞2.5为AGTR1(1166A＞C)AA型，Ct_W2-Ct_M2＞2.5为AGTR1(1166A＞C)CC型，|Ct_W2-Ct_M2|≤2.5为AGTR1(1166A＞C)AC型；

本发明的人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了四管反应检测5个多态性位点基因型的多重荧光定量PCR方法，本发明CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的片段，同时采用普通Taqman探针以降低成本，同时引入内标体系和UNG酶防污染系统，更加准确、稳定的对样本进行分型检测。

本发明提供的多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：试剂盒的组成

本发明所述试剂盒的组成如下表：

表2试剂盒的组成

表3引物和探针

实施例2：样本基因组DNA的提取

本实施例中收集人全血/外周血样本，从中提取基因组DNA。

从EDTA抗凝血浆中提取基因组DNA，用其作为PCR检测的模板。采用郑州安图生物工程股份有限公司的前处理试剂和核酸提取纯化试剂(磁珠法)，按照说明进行，具体详述如下：

1.样本前处理：

1)冻融全血用红细胞裂解液进行前处理：

①取200μL临床冻融或发生溶血全血样本，加入600μL红细胞裂解液，轻轻颠倒混匀10次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。12000rpm/min，离心3min，弃上清；

②加入600μL 0.2mg/ml蛋白酶K，常温20-25℃孵育5min后，12000rpm/min离心3min，弃上清，取沉淀；

③加入600μL裂解液涡旋充分重悬沉淀，备用。

2)非冻融全血用淋巴细胞分离液处理：

①取200μL EDTA抗凝血缓慢加入含有600μL淋巴细胞分离液EP管中(不可晃动，直接离心)3000rpm/min，离心5min，此时离心管中由上至下细胞分四层(第一层：为血浆层。第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。第三层：为透明分离液层。第四层：为红细胞层)。

②取前三层上清液备用。

2.样本提取：

①将10μL蛋白酶K、20μL磁珠混悬液(吸前振荡混匀磁珠)、1.3mL裂解液、600μL血清/血浆样本或处理后其他样本类型样本液依次加入5mL离心管，混匀，于37℃培养箱中孵育2min；

②将孵育后的上述混合液转移至2mL离心管中，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清；

③去除磁力架，添加2mL洗液A，混匀，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清；

④去除磁力架，添加2mL洗液B，混匀，放置在磁力架上，磁吸2min，弃上清(尽量减少残留)；

⑤加100-300μL(按照后续实验要求添加)洗脱液，振荡混匀，于80℃干式恒温器中解离5min；

⑥放置在磁力架上，磁吸2min后，取上清液用于后续实验。

实施例3：样本基因组DNA的检测

本实施例采用实施例1中所列举的引物、探针组合来扩增实施例2中所提取的基因组DNA样品。检测步骤如下：

①构建反应体系

计算所需要的样本数，按照下表中的量等比例增加试剂量，阴阳性质控只做一份。

表4野生型反应体系W1

表5突变型反应体系M1

表6野生型反应体系W2

表7突变型反应体系M2

PCR反应液(M2)	PCR反应液(E)	样本DNA	阳性质控	阴性质控
					20μL	10μL	50μL	-	-
20μL	10μL	-	50μL	-
					20μL	10μL	-	-	50μL

②上机检测

直接上荧光定量PCR仪进行检测，扩增程序设置为50℃2min，95℃2min，(95℃10s，60℃22s，45Cycle)；每个循环后收集FAM、HEX、ROX、CY5荧光。

③检测结果分析

表8检测结果

实施例4对比试验

依据现有专利(CN201610732578、CN201710201070、CN201810245896、CN201811032803、CN201910614761)中的方案，配制成PCR反应液(方案1、方案2、方案3、方案4、方案5)，与本研究实施例1进行对比：

实验一：

对每个多态位点50例样本进行分型准确性验证。结果如下：

表9分型准确性验证-CYP2D6

表10分型准确性验证-AGTR1

表11分型准确性验证-CYP2C9

表12分型准确性验证-ADRB1

表13分型准确性验证-ACE

实验二：

将临床样本核酸提取物稀释至0.05ng/μL，采用郑州安图生物工程股份有限公司的核酸提取或纯化试剂进行核酸的提取纯化，并使用不同PCR加速试剂方案配制的PCR反应液进行检测，各方案均重复检测21次，结果如下：

表14 CYP2D6杂合检出率

组别	1ng/μL	0.5ng/μL	0.1ng/μL	0.05ng/μL
					实施例1	21/21	21/21	21/21	21/21
方案1	5/21	0/21	0/21	0/21
					方案2	19/21	10/21	1/21	0/21
方案3	21/21	20/21	0/21	0/21
					方案4	21/21	21/21	20/21	0/21
方案5	16/21	0/21	0/21	0/21

表15 AGTR1杂合检出率

表16 CYP2C9杂合检出率

组别	1ng/μL	0.5ng/μL	0.1ng/μL	0.05ng/μL
					实施例1	21/21	21/21	21/21	21/21
方案1	5/21	1/21	0/21	0/21
					方案2	20/21	12/21	1/21	0/21
方案3	21/21	18/21	5/21	0/21
					方案4	21/21	21/21	20/21	11/21
方案5	18/21	4/21	0/21	0/21

表17 ACE杂合检出率

组别	1ng/μL	0.5ng/μL	0.1ng/μL	0.05ng/μL
					实施例1	21/21	21/21	21/21	21/21
方案1	3/21	2/21	0/21	0/21
					方案2	19/21	10/21	3/21	0/21
方案3	21/21	20/21	1/21	0/21
					方案4	21/21	21/21	19/21	7/21
方案5	10/21	3/21	0/21	0/21

表18 ADRB1杂合检出率

组别	1ng/μL	0.5ng/μL	0.1ng/μL	0.05ng/μL
					实施例1	21/21	21/21	21/21	21/21
方案1	6/21	1/21	0/21	0/21
					方案2	18/21	6/21	0/21	0/21
方案3	21/21	19/21	0/21	0/21
					方案4	21/21	20/21	20/21	2/21
方案5	14/21	3/21	0/21	0/21

对比结果表明，检测YP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)临床样本进行分型验证时，本专利与测序法的符合率达到100％，符合率明显优于现有专利方案(方案1、方案2、方案3、方案4、方案5)。

检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165G＞C)、AGTR1(1166A＞C)、ACE(I/D)的最低检出限浓度样本(0.05ng/μL)时，本研究方案均能够全部检出，检出率100％，且在Ct值的重复性上均优于现有专利方案(方案1、方案2、方案3、方案4、方案5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 一种检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒

<130> MP1927513

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgcaagag tcacca 16

<210> 2

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgggctgca cgctacc 17

<210> 3

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcactcagg actaa 15

<210> 4

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgggctgca cgctact 17

<210> 5

<211> 14

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtttcctcg gcgg 14

<210> 6

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgacttccgc aaggccttcc agg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcatggcct tcgtgtacct 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgacttccgc aaggccttcc agg 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttattttca gcctatgtgt 20

<210> 10

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggtccagag ataca 15

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgaagtgtg tttcttttag 20

<210> 12

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggtccagag atacc 15

<210> 13

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtaagccac tgctggagag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgcttgtaag gggagctcag 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagagccact cccatcct 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcgacagagc gagactcc 18

<210> 17

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatcattctt acaagttata ctct 24

<210> 18

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcacttcac taccaaatga gca 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttttctggat gtattgattc aac 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agcacttcac taccaaatga gcc 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaaggctcat ggcaagaaag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctcactcagt gtggcaaagg 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caggccctta cccagggtag gc 22

<210> 24

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccgcgcccg cgccgccgcc cggacc 26

<210> 25

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cttctttcat ttcttcctgt cttcc 25

<210> 26

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctgctgcct atacagtcac ttttatgtgg 30

<210> 27

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctctagacct gctgcctata cagtcac 27

<210> 28

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgcctatca ccatttgtat 20

<210> 29

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cttgaggttg tccaggtgag ccag 24

Claims

1.一种多重荧光PCR法检测人CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2、PCR反应液E；

所述PCR反应液W1包括CYP2D6野生型引物、ADRB1野生型引物、CYP2C9野生型引物、CYP2D6探针、ADRB1探针、CYP2C9探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

所述PCR反应液M1包括CYP2D6突变型引物、ADRB1突变型引物、CYP2C9突变型引物、CYP2D6探针、ADRB1探针、CYP2C9探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

所述PCR反应液W2包括ACE(DD)引物、AGTR1野生型引物、ACE(DD)探针、AGTR1探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

所述PCR反应液M2包括ACE(II)引物、AGTR1突变型引物、ACE(II)探针、AGTR1探针、dNTPs、rTth酶、UNG酶、PCR缓冲液、水；

其中，

CYP2D6野生型引物为：SEQ ID NO：1所示上游引物、SEQ ID NO：2所示下游引物；

CYP2D6突变型引物为：SEQ ID NO：3所示上游引物、SEQ ID NO：4所示下游引物；

CYP2D6探针如SEQ ID NO：23所示；

ADRB1野生型引物为：SEQ ID NO：5所示上游引物、SEQ ID NO：6所示下游引物；

ADRB1突变型引物为：SEQ ID NO：7所示上游引物、SEQ ID NO：8所示下游引物；

ADRB1探针如SEQ ID NO：24所示；

CYP2C9野生型引物为：SEQ ID NO：9所示上游引物、SEQ ID NO：10所示下游引物；

CYP2C9突变型引物为：SEQ ID NO：11所示上游引物、SEQ ID NO：12所示下游引物；

CYP2C9探针如SEQ ID NO：25所示；

ACE(DD)引物为：SEQ ID NO：13所示上游引物、SEQ ID NO：14所示下游引物；

ACE(DD)探针如SEQ ID NO：26所示；

ACE(II)引物为为：SEQ ID NO：15所示上游引物、SEQ ID NO：16所示下游引物；

ACE(II)探针如SEQ ID NO：27所示；

AGTR1野生型引物为：SEQ ID NO：17所示上游引物、SEQ ID NO：18所示下游引物；

AGTR1突变型引物为：SEQ ID NO：19所示上游引物、SEQ ID NO：20所示下游引物；

AGTR1探针如SEQ ID NO：28所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液E为浓度为10～30mM的醋酸锰水溶液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参引物及探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物为：SEQ ID NO：21所示上游引物、SEQ ID NO：22所示下游引物；内参探针：SEQ ID NO：29所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控为包含野生型基因、突变型基因、杂合型基因和内控基因的质粒；

所述阴性质控为仅含有内控基因的质粒。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，CYP2D6探针、ACE(DD)探针或ACE(II)探针的发光基团标记为FAM；

ADRB1探针或AGTR1探针的发光基团标记为ROX；

CYP2C9探针的发光基团标记为CY5。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应液W1、PCR反应液M1、PCR反应液W2、PCR反应液M2中各组分的浓度为：

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：

模板DNA： 50μL；

PCR反应液W1、M1、W2、M2中一种 20μL；

PCR反应液E： 10μL。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：

50℃2min；

95℃2min；

95℃10s，60℃22s，45个循环。