JP2001017185A - 薬物代謝酵素遺伝子多型の簡易検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】薬物代謝酵素の遺伝子多型を簡便に検出する。 【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを含むＰＣ
Ｒ緩衝液、正常フォワードプライマー、変異フォワード
プライマー、リバースプライマー及び蛍光標識プローブ
を含む薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キット；及び薬
物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤＮＡを前記ＰＣＲ緩
衝液、正常フォワードプライマー、リバースプライマー
及び蛍光標識プローブとともにＰＣＲ反応を行うＡ工
程、薬物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤＮＡを前記Ｐ
ＣＲ緩衝液、変異フォワードプライマー、リバースプラ
イマー及び蛍光標識プローブとともにＰＣＲ反応を行う
Ｂ工程、Ａ工程及びＢ工程の結果を比較する比較工程を
含む薬物代謝酵素遺伝子の多型検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光標識プローブ
を用いることにより、ＰＣＲ産物のリアルタイム検出を
可能とする薬物代謝酵素遺伝子多型の簡易検出法、特
に、CYP2C18、CYP2C19、CYP2C9、TPMT、NAT2及びALDH2
遺伝子多型を測定する方法に関わる。

【０００２】

【従来の技術】薬物を服用する際、数種の薬剤を一緒に
服用することが多く、単独で用いることは希になってき
ている。さらに最近は、薬物の効力が以前に比べ向上し
ており、投薬される量も減少している。このような状況
において、投与された薬物の相互間に影響を及ぼす結
果、時には重大な副作用を引き起こすことがある。

【０００３】一般に、投与された薬物は、肝臓の薬物代
謝酵素によって水溶性の高い物質に変換され、体外に排
泄される。この薬物代謝酵素の活性は、年齢、性、病
態、遺伝などの内的要因に加え、外的要因である薬物の
服用によっても大きく変化する。薬物代謝酵素、特にチ
トクロームP450はヒトの肝臓では20種以上の分子種が含
まれており、ほとんどの薬物の代謝に関与してその体内
動態を律速している。このために、薬物の薬効と安全性
を知るためには薬物がどのチトクロームP450の分子種に
よって代謝されるか、どのチトクロームP450の活性を阻
害あるいは誘導するのかを正確に把握することは重要な
ことである。

【０００４】チトクロームP450の阻害が原因と推定され
る多くの相互作用の中で、同じチトクロームP450分子種
により代謝される薬物を併用することによる阻害は最も
頻度が高いものである。P450を介した薬物相互作用は阻
害と誘導によるものが多いが、原因となる機構別に分類
すると、P450の阻害に起因する相互作用が最も多く約70
％を占め、誘導によるものが23％、その他が7％ある。
このような場合は、同じチトクロームP450で代謝される
薬物の併用は避けるか、あるいは注意して併用を行うな
どの対応が必要である。

【０００５】更に、上記のような薬物による副作用の他
に遺伝的にチトクロームP450が欠損していることに起因
する副作用が存在することも明らかになってきている。
これまでに、ヒトにおいて遺伝的な多型の存在が考えら
れているP450分子種は、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2
C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A5、CYP3A7等が知
られている。特にCYP2C19は臨床的に重要な薬物の代謝
に関与していることが数多く報告されている。さらに、
ヒトでは、少なくとも4分子種（CYP2A6、CYP2C9、CYP2C
19、およびCYP2D6)の発現に遺伝的多型が知られてお
り、poor metabolizerと呼ばれる欠損者では、これら分
子種によって選択的に代謝される薬物の血中からの消失
が、extensive metabolizerと呼ばれる健常人に比べ遅
延している。このことから、遺伝的多型との関連の有無
も代謝酵素の同定が必要な理由の一つとなっている。た
とえば、CYP2C19は胃潰瘍治療薬のオメプラゾールなど
を代謝するが、代謝の遅い個体、すなわち、この分子種
のpoor metabolizer(PM)の頻度は、白人が約５％に比し
て、日本人では高く約20％と推定されている。しかも日
本人の場合のCYP2C19のPMは2つの遺伝子変異で殆ど１０
０％説明できるとされており（de Morais et al., 199
4, Mol.Pharmacol., 46, 594-598）、CYP2C19で代謝さ
れる臨床上有用な薬物も、PMであるがために重篤な副作
用を引き起こすことがある。患者がPMであるかどうかを
予め遺伝子診断により予想し、投与量、あるいは併用薬
を変更することは重要なことである。さらに、CYP2C9は
ワーファリン、トルブタミド、ジクロフェナック等の代
謝に関与する。

【０００６】さらに、チトクロームP450以外の薬物代謝
酵素として、チオプリンメチルトランスフェラーゼ(TPM
T)はアザチオプリンなどの代謝に関与し、N-アセチルト
ランスフェラーゼ２(NAT2)はイソニアジドなどの代謝に
関与し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２はアセトアルデ
ヒドなどの代謝に関与する。

【０００７】一方、PCR法の開発により、遺伝子診断が
急激に発展し、感染症の遺伝子診断はもとより、各種病
気を発症する遺伝子欠損症の診断も広く行われるように
なってきた。 又、前述のように、薬剤の選択にあたっ
て、遺伝子診断により薬物代謝酵素活性のPMを決定後、
投与薬物量、併用薬を決定することは、薬物の相互作用
により起こり得る重篤な副作用、又は効果の減退を予防
することからも重要なことと考えられる。しかし、現在
のPCR法では、PMの判定に時間が掛かり1日でも早い投薬
が望まれる患者に遺伝子診断を行ってから、適合する薬
剤を選択することには問題があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、PCR測定法
を用いる遺伝子多型の診断方法に改良を加え、従来法の
早期投薬が望まれる患者検体を簡便でしかも、短時間に
多量のサンプルを処理できる方法を提供することを目的
とする。さらに、従来技術的に困難であった、薬物代謝
に重要な役割を果たしている、CYP2C18およびCYP2C19、
さらにはCYP2C9、TPMT、NAT2及びALDH2の遺伝子多型を
簡便に検出することができるオリゴヌクレオチドプロー
ブを提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは上記事実
に鑑み、鋭意研究を行った結果、短時間に、簡単に薬物
代謝酵素の多型（野生型又は変異型）を決定する方法を
考案し、薬物代謝酵素、特にCYP2C18(ヒトチトクローム
P450 2 C18)および／またはCYP2C19(ヒトチトクロームP
450 2 C19)並びにCYP2C9、TPMT、NAT2及びALDH2の遺伝
子多型を精度よく検出する方法及びキットを完成した。

【００１０】本発明は、以下の項１〜項５４に関する。 項１． ＤＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを含むＰＣＲ緩
衝液、正常フォワードプライマー、変異フォワードプラ
イマー、リバースプライマー及び蛍光標識プローブを含
む薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キット。 項２． ＤＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを含むＰＣＲ緩
衝液、正常プライマープローブセット（正常フォワード
プライマー＋リバースプライマー＋蛍光標識プロー
ブ）、変異プライマープローブセット（変異フォワード
プライマー＋リバースプライマー＋蛍光標識プローブ）
を含む項１記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キッ
ト。 項３． マグネシウムイオン終濃度が１．５〜６．０ｍ
Ｍである項１又は２に記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の
検出用キット。 項４． 薬物代謝酵素遺伝子多型がCYP2C9、CYP2C18、C
YP2C19、TPMT、NAT2及びALDH2からなる群から選ばれる
いずれかの多型である項１又は２に記載の薬物代謝酵素
遺伝子多型の検出用キット。 項５． 薬物代謝酵素遺伝子多型が、ポイントミューテ
ーションによるものである項１〜４のいずれかに記載の
薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キット。 項６． 正常フォワードプライマーおよび変異フォワー
ドプライマーに、少なくとも１つのミスマッチを導入し
てなる項１〜５のいずれかに記載の薬物代謝酵素遺伝子
多型の検出用キット。 項７． ミスマッチをポイントミューテーションの隣に
導入してなる項６に記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の検
出用キット。 項８． 薬物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤＮＡを前
記ＰＣＲ緩衝液、正常フォワードプライマー、リバース
プライマー及び蛍光標識プローブとともにＰＣＲ反応を
行うＡ工程、薬物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤＮＡ
を前記ＰＣＲ緩衝液、変異フォワードプライマー、リバ
ースプライマー及び蛍光標識プローブとともにＰＣＲ反
応を行うＢ工程、Ａ工程及びＢ工程の結果を比較する比
較工程を含む薬物代謝酵素遺伝子の多型検出方法。 項９． 前記比較工程が、Ａ工程とＢ工程の蛍光シグナ
ルが初めて検出されるサイクル数(Ct)をコンピュータソ
フトウェアで比較する工程である項８記載の薬物代謝酵
素遺伝子の多型検出方法。 項１０． Ａ工程とＢ工程を１．５〜６ｍＭのマグネシ
ウムイオン終濃度で行う項７又は８に記載の方法。 項１１． 薬物代謝酵素遺伝子がCYP2C9、CYP2C18、CYP
2C19、TPMT、NAT2及びALDH2からなる群から選ばれるい
ずれかの遺伝子である項８〜１０のいずれかに記載の薬
物代謝酵素遺伝子多型の多型検出方法。 項１２． 薬物代謝酵素遺伝子多型が、ポイントミュー
テーションによるものである項８〜１１のいずれかに記
載の薬物代謝酵素遺伝子多型の多型検出方法。 項１３． 正常フォワードプライマーおよび変異フォワ
ードプライマーに、少なくとも１つのミスマッチを導入
してなる項８〜１２のいずれかに記載の薬物代謝酵素遺
伝子多型の多型検出方法。 項１４． ミスマッチをポイントミューテーションの隣
に導入してなる項１３に記載の薬物代謝酵素遺伝子多型
の多型検出方法。 項１５． 配列番号１で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子のエクソン2中の点突然変異ｍ１の検査
用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項１６． 配列番号２で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子のエクソン2中の点突然変異ｍ１の検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項１７． 配列番号３で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトCYP2C18遺伝子のエクソン2
中の点突然変異ｍ１の検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項１８． 配列番号４で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子のエクソン2中の点突然変異ｍ１の検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項１９． 配列番号5で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子の5'-Flanking region中の点突然変異
ｍ２の検査用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライ
マー。 項２０． 配列番号6で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子の5'-Flanking region中の点突然変異
ｍ２の検査用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライ
マー。 項２１． 配列番号７で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトCYP2C18遺伝子の5'-Flanki
ng region中の点突然変異ｍ２の検査用オリゴヌクレオ
チドプローブ。 項２２． 配列番号８で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C18遺伝子の5'-Flanking region中の点突然変異
ｍ２の検査用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項２３． 配列番号９で示される塩基配列を有する、ヒ
トCYP2C9遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査用
オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項２４． 配列番号１０で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C9遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項２５． 配列番号１１で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトCYP2C9遺伝子のエクソン4
中の点突然変異*3の検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項２６． 配列番号１２で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C9遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項２７． 配列番号１３で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン5中の点突然変異*2の検査
用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項２８． 配列番号１４で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン5中の点突然変異*2の検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項２９． 配列番号１５で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン5
中の点突然変異*2の検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項３０． 配列番号１６で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン5中の点突然変異*2の検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項３１． 配列番号１７で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査
用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項３２． 配列番号１８で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項３３． 配列番号１９で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン4
中の点突然変異*3の検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項３４． 配列番号２０で示される塩基配列を有する、
ヒトCYP2C19遺伝子のエクソン4中の点突然変異*3の検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項３５． 配列番号２１で示される塩基配列を有する、
ヒトTPMT遺伝子のエクソン10中の点突然変異*3Cの検査
用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項３６． 配列番号２２で示される塩基配列を有する、
ヒトTPMT遺伝子のエクソン10中の点突然変異*3Cの検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項３７． 配列番号２３で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトTPMT遺伝子のエクソン10中
の点突然変異*3Cの検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項３８． 配列番号２４で示される塩基配列を有する、
ヒトTPMT遺伝子のエクソン10中の点突然変異*3Cの検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項３５． 配列番号２５で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*5Bの検査用
オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項３６． 配列番号２６で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*5Bの検査用
オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項３７． 配列番号２７で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中
の点突然変異*5Bの検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項３８． 配列番号２８で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*5Bの検査用
オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項３９． 配列番号２９で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*6Aの検査用
オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項４０． 配列番号３０で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*6Aの検査用
オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項４１． 配列番号２７で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中
の点突然変異*6Aの検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項４２． 配列番号２８で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*6Aの検査用
オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項４３． 配列番号３１で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*7Bの検査用
オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項４４． 配列番号３２で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*7Bの検査用
オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項４５． 配列番号３３で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中
の点突然変異*7Bの検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項４６． 配列番号３４で示される塩基配列を有する、
ヒトNAT2遺伝子のエクソン1中の点突然変異*7Bの検査用
オリゴヌクレオチドリバースプライマー。 項４７． 配列番号３５で示される塩基配列を有する、
ヒトALDH2遺伝子のエクソン12中の点突然変異*7Bの検査
用オリゴヌクレオチド正常フォワードプライマー。 項４８． 配列番号３６で示される塩基配列を有する、
ヒトALDH2遺伝子のエクソン12中の点突然変異*7Bの検査
用オリゴヌクレオチド変異フォワードプライマー。 項４９． 配列番号３７で示される塩基配列を有する、
５’端をレポーター蛍光色素で、３’端をクエンチャー
蛍光色素で標識された、ヒトALDH2遺伝子のエクソン12
中の点突然変異*7Bの検査用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 項５０． 配列番号３８で示される塩基配列を有する、
ヒトALDH2遺伝子のエクソン12中の点突然変異*7Bの検査
用オリゴヌクレオチドリバースプライマー。

【００１１】

【発明の実施の形態】従来、薬物代謝酵素の変異型の測
定は、ヒト末梢血約100μｌから常法に従って、ゲノムD
NAを抽出し、約100μｌの水に溶解後、フォワードプラ
イマー及びリバースプライマーを用いてPCR法にて増幅
し、次いで、得られたPCR産物を制限酵素にて消化を行
った後、アガロースゲルにて電気泳動を行い、紫外線照
射により各バンドを確認するものである。この方法によ
り遺伝子多型の検出に8時間から24時間を要し、一度に4
〜8検体のサンプルしか測定できなかった。

【００１２】本発明では、上記PCR反応の過程で蛍光標
識プローブ（例えばTaqManプローブ）を反応系に加える
ことにより、該プローブ由来の蛍光によりPCR産物のリ
アルタイム検出が可能となり、アガロースによる電気泳
動が不要となった。即ち、蛍光標識プローブと対立遺伝
子特異的増幅法を導入することにより、従来の制限酵素
処理及び電気泳動分離の必要性がなく、この改良法によ
り2.5時間で24サンプルの測定が可能となった。

【００１３】さらに、従来法ではPCR反応ミックスを調
製する際に、10XPCR Buffer、ｄNTPMix、フォワードプ
ライマー、リバースプライマー、サンプルDNA、ポリメ
ラーゼの6種を混合していたが、本発明の好ましい具体
例においては、ＰＣＲ緩衝液、正常又は変異プライマー
プローブセット（正常又は変異フォワードプライマー＋
リバースプライマー＋蛍光標識プローブ）、サンプルDN
Aの3種を混合するのみで、混合サンプルの調製も簡便に
なった。

【００１４】本発明のキット及び方法では、ＰＣＲ反応
を促進するため、通常のＰＣＲよりも高濃度のマグネシ
ウムイオンを使用する。ＰＣＲ反応混合物中のマグネシ
ウムイオン終濃度は、好ましくは１．５〜６．０ｍＭ、
より好ましくは４．５〜５．５ｍＭ、特に約５．５ｍＭ
である。

【００１５】本発明において、遺伝子多型を有する薬物
代謝酵素としては、CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9、
CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5, CYP3A7、ジヒドロ
ピリミジンデヒドロゲナーゼ、TPMT、NAT2、ALDH2など
が挙げられるが、遺伝子多型を有する限り他の薬物代謝
酵素も含まれる。薬物代謝酵素の中で、ヒトにおける薬
物代謝酵素は主にCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、C
YP3A4、TPMT、NAT2及びALDH2である。

【００１６】本発明は、少なくとも１カ所のポイントミ
ューテーションにより遺伝子多型を有する薬物代謝酵素
の遺伝子多型を検出するのに有用であり、特にポイント
ミューテーションが１カ所の薬物代謝酵素の遺伝子多型
の検出に有用である。

【００１７】特に、ポイントミューテーションが１カ所
のみである場合、正常フォワードプライマーと多型（変
異）遺伝子の組合せ、変異フォワードプライマーと正常
遺伝子の組合せであってもＰＣＲが起こりやすく、特に
マグネシウムイオン濃度が高くＰＣＲがかかりやすい条
件下では、正常(wt/wt）、ヘテロ(wt/m）、ホモ（m/m)
についての差が少なく、これらを確実に診断することは
困難になる場合がある。このような場合であっても、正
常フォワードプライマー及び変異フォワードプライマー
に少なくとも１箇所のミスマッチを導入することによ
り、正常(wt/wt）、ヘテロ(wt/m）、ホモ（m/m)をより
正確に診断することが可能になる。

【００１８】CYP2C19は、抗潰瘍薬のオメプラゾール（5
‐水酸化）、ランソプラゾール（5‐水酸化）、抗うつ
剤のイミプラミン（脱メチル化）、クロミプラミン（N-
脱メチル化）、シタロプラム（N-脱メチル化）；抗てん
かん剤のS-メフェニトイン（4-水酸化）、R-メホバルビ
タール（4-水酸化）、フェニトイン（4-水酸化）；その
他カリソプロドール（N-脱アルキル化）、ジアゼパム
（N-脱メチル化）、プログアニル、ヘキソバルビタール
（3-水酸化）等の代謝に関与する特に重要な酵素であ
る。

【００１９】CYP2C19*2とCYP2C18m2、及び、CYP2C19*3
とCYP2C18m1はそれぞれ完全にリンクしているので、CYP
2C18m2およびCYP2C18m1を検出することで、CYP2C19*2お
よびCYP2C19*3を検出することが可能であり、CYP2C19の
遺伝子多型を測定することができる(Mamiya et al. Pha
rmacogenetics, 1998, 8: 87-90; Kubota et al. Bioch
em. Pharmacol., 1998, 55: 2039-2042) 。

【００２０】CYP2C9は、ワーファリン、トルブタミド、
ジクロフェナック等の代謝に関与する。

【００２１】TPMTは、アザチオプリンなどの代謝に関与
する。

【００２２】NAT2は、イソニアジドなどの代謝に関与す
る。

【００２３】ALDH2は、アセトアルデヒドなどの代謝に
関与する。

【００２４】サンプルＤＮＡの由来としては、血液、乾
燥ろ紙血、唾液、毛髪、頬粘膜などが挙げられる。

【００２５】リバースプライマーの核酸配列は、遺伝子
多型を有する薬物代謝酵素遺伝子から適当な配列を選択
すればよく、正常フォワードプライマーは遺伝子多型で
変異している箇所を含む限り適当な配列を選択すればよ
く、当業者により容易に決定することができる。 ま
た、各プライマーの製造は、ＤＮＡ自動合成機を用いる
などの常法に従い製造できる。正常フォワードプライマ
ーとしては、配列番号１、５のプライマーが例示され
る。リバースプライマーとしては、配列番号４、８のプ
ライマーが例示される。

【００２６】変異フォワードプライマーは、野生型と少
なくとも１つの核酸（Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）が欠失、置
換又は付加した変異部位を含むものであれば、任意に選
択できる。変異フォワードプライマーとしては、配列番
号２、６のプライマーが例示される。

【００２７】配列番号１〜８で表される核酸配列は、CY
P2C18遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号１：１８１〜２０３； 配列番号２：１８１〜２０３； 配列番号３：２０６〜２２９； 配列番号４：２５１〜２２９； 配列番号５：−４９９〜−４７８； 配列番号６：−４９９〜−４７８； 配列番号７：−４６３〜−４３９； 配列番号８：−３９９〜−４１９。

【００２８】配列番号９〜１２で表される核酸配列は、
CYP2C9遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号９ ：１０４１〜１０６１； 配列番号１０：１０４１〜１０６１； 配列番号１１：１０９２〜１１２１； 配列番号１２：１１８１〜１２０６。

【００２９】配列番号１３〜１６で表される核酸配列
は、CYP2C19遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号１３：６８１〜７０４； 配列番号１４：６８１〜７０４； 配列番号１５：６３５〜６６９； 配列番号１６：５７７〜５９７。

【００３０】配列番号１７〜２０で表される核酸配列
は、CYP2C19遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号１７：６３６〜６５９； 配列番号１８：６３６〜６５９； 配列番号１９：６０７〜６３４； 配列番号２０：４８５〜５１６。

【００３１】配列番号２１〜２４で表される核酸配列
は、TPMT遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号２１：７１９〜７３８； 配列番号２２：７１９〜７３８； 配列番号２３：６７１〜７０４； 配列番号２４：５９９〜６２４。

【００３２】配列番号２５〜２８で表される核酸配列
は、NAT2遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号２５：４８１〜５０２； 配列番号２６：４８１〜５０２； 配列番号２７：４３３〜４６２； 配列番号２８：３８７〜４０８。

【００３３】配列番号２９〜３０で表される核酸配列
は、NAT2遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号２９：５９０〜６２０； 配列番号３０：５９０〜６２０； 配列番号３１〜３４で表される核酸配列は、NAT2遺伝子
の以下の位置に対応する： 配列番号３１：８５７〜８８７； 配列番号３２：８５７〜８８７； 配列番号３３：８２９〜８５４； 配列番号３４：７６８〜７９３。

【００３４】配列番号３５〜３８で表される核酸配列
は、ALDH2遺伝子の以下の位置に対応する： 配列番号３５：４８７〜５０８； 配列番号３６：４８７〜５０８； 配列番号３７：４６１〜４８１； 配列番号３８：３７４〜３９４。

【００３５】上記配列では、フォワードプライマーへの
ミスマッチ導入は、−２の位置を４つの塩基で置き換え
た全てのパターンを作り、最も特異性が高くなる組合せ
を採用したが、−２の位置だけでなく任意の位置に導入
してもよく、またミスマッチの数も１又は複数箇所（例
えば２ないし３カ所）であってもよい。

【００３６】蛍光標識プローブ（例えばTaqManプロー
ブ）としては、５’端をレポーター蛍光色素で、３’端
をクエンチャー蛍光色素で標識されたプローブが例示さ
れ、該プローブは、フォワードプライマーとリバースプ
ライマーに挟まれる核酸配列の一部である限り、任意の
配列が使用できる。蛍光標識プローブとしては、例えば
配列番号３、７の配列の５’端をレポーター蛍光色素
で、３’端をクエンチャー蛍光色素で標識されたプロー
ブが例示される。

【００３７】なお、レポーター蛍光色素としては6-カル
ボキシフルオレセイン(FAM)が例示され、クエンチャー
蛍光色素としては6-カルボキシテトラメチルローダミン
(TAMRA)が例示される。

【００３８】CYP2C19の正常型はCYP2C19*1と呼ばれ、PM
の2つの遺伝子はCYP2C19*2およびCYP2C19*3が報告され
ている。また、CYP2C18にも２つの遺伝子多型CYP2C18m1
およびCYP2C18m2が報告されている。Morais等のCYP2C19
*2検出方法は、ヒト末梢血約100μｌから常法に従って
ゲノムDNAを抽出し、約100μｌの水に溶解後、フォワー
ドプライマー及びリバースプライマーを用いてPCR法に
て増幅する。得られたPCR産物をSmaIにて消化を行った
後、４％アガロースゲルにて電気泳動を行い、紫外線照
射により各バンドを確認するものである。即ち、遺伝子
に変異がある場合（ホモ型）は消化されないので169bp
のバンドのみが検出されるが、野生型は120bp及び49bp
が検出され、ヘテロ型の場合は169bp、120bp及び49bpの
3本のバンドが検出される（de Morais et al.,J.Biol.C
hem., 1994;269;15419-15422)。また、CYP2C19*3の検
出方法は、PCR反応後、PCR産物をBamHIにて消化を行
い、３％アガロースゲルにより電気泳動を行う。紫外線
照射によって、ホモ型（遺伝子に変異がある場合）は消
化されないので329bpのバンドのみが検出される。野生
型は233bp及び96bpが、ヘテロ型は329bp、233bp及び69b
pの3本のバンドが検出される（de Morais et al., Mol.
Pharmacol. 1994; 46; 594-598).上記方法により変異型
の決定に8時間から24時間を要し、一度に4〜8検体のサ
ンプルしか測定できなかった。

【００３９】以下において、薬物代謝酵素多型の検出と
して、CYP2C18m1およびCYP2C18m2の検出を示す。他の薬
物代謝酵素多型の検出も同様に行うことができるCYP2C1
8m1の検出は、チューブAに配列番号１，３，４のオリゴ
ヌクレオチドの正常プライマー・プローブセット、サン
プルＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液としてのTaqMan Universal P
CR Master Mix（パーキンエルマー社製）を用いた反応
系を組み、チューブBに配列番号２，３，４のオリゴヌ
クレオチドの変異プライマー・プローブセット、サンプ
ルＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液としてのTaqMan Universal PCR
Mixを用いた反応系を組む。反応チューブをABI PRISM
7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー社製）に
設置し、95℃で5分間から10分間の変性後、95℃で15秒
間、60℃で1分間の反応を35〜50サイクルを行う。サイ
クル数は特に限定されない。反応終了後、得られたデー
タはすべてABI PRIM 7700TM Sequence Detector付属の
コンピュータソフトで解析される。その中でもソフトウ
ェア上で計算されるPCR産物の指数関数的増幅に相当す
る蛍光シグナルが初めて検出されるサイクル数、Thresh
old Cycle(Ct)を用いる。具体的には、チューブA（Ctw
t)とチューブB(Ctmt)で得られたそれぞれのCt値の差（C
twt-Ctmt)を求め、その大きさが−３以下であれば正常
型（wt／wt）、−３〜３の間（−３＜Ctwt-Ctmt＜３）
であればヘテロ型（wt/m1）、３以上であればホモ型（m
1/m1）であると診断することができる。ただし、解析時
のThresholdは0.009に設定する。

【００４０】CYP2C18m2の検出は、チューブCに配列番号
５、７、８のオリゴヌクレオチドの正常プライマー・プ
ローブセット、サンプルＤＮＡ,TaqMan Universal PCR
Master Mixを用いた反応系を組み、チューブDに配列表
の配列番号６、７、８のオリゴヌクレオチドの変異プラ
イマー・プローブセット、サンプルＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝
液としてのTaqMan Universal PCR Master Mixを用いた
反応系を組む。 反応チューブをABI PRISM 7700TM Sequ
ence Detector(パーキンエルマー社製）に設置し、95℃
で5分間から10分間の変性後、95℃で15秒間、60℃で1分
間の反応を35〜50サイクルを行う。サイクル数は特に限
定されない。反応終了後、得られたデータはすべてABI
PRISM 7700TM Sequence Detector付属のコンピュータソ
フトで解析される。その中でもソフトウェア上で計算さ
れるPCR産物の指数関数的増幅に相当する蛍光シグナル
が初めて検出されるサイクル数、Threshold Cycle(Ct)
を用いる。具体的には、チューブC（Ctwt)とチューブD
(Ctmt)で得られたそれぞれのCt値の差（Ctwt-Ctmt)を求
め、その大きさが−３以下であれば正常型（wt／wt）、
−３〜３の間（−３＜Ctwt-Ctmt＜３）であればヘテロ
型（wt／m2）、３以上であればホモ型（m2／m2）である
と診断することができる。ただし、解析時のThreshold
を0.200に設定する。

【００４１】CYP2C18m1とCYP2C18m2の検出は、同一の反
応条件のために同時に行うことができる。また、それぞ
れで診断された結果を組合わせることにより、CYP2C18
の6種のジェノタイプ（wt／wt、wt／m1、wt／m2、m1／m
1、m2／m2、m1／m2）をタイピングできる。

【００４２】また、CYP2C19の正常型はCYP2C19*1と呼ば
れ、PMの2つの遺伝子はCYP2C19*2およびCYP2C19*3が報
告されている（de Morais et al., 1994, Mol.Pharmaco
l., 46, 594-598；de Morais et al., 1994, J.Biol.Ch
em., 269, 15419-15422）。しかも興味深いことにCYP2C
19*2とCYP2C18m1、CYP2C19*3とCYP2C18m1はそれぞれ完
全にリンクしている。それゆえ、同時に上記結果から、
CYP2C19の6種のタイプ（CYP2C19*1/CYP2C19*1, CYP2C19
*1/CYP2C19*2, CYP2C19*1/CYP2C19*3, CYP2C19*2/CYP2C
19*2, CYP2C19*2/CYP2C19*3、およびCYP2C19*3/CYP2C19
*3)をタイピングすることができる。

【００４３】またCYP2C19は、正常型をCYP2C19*1、日本
人で見つかっているエクソン５中の点突然変異をCYP2C1
9*2、エクソン４中の点突然変異をCYP2C19*3と呼んでい
る。

【００４４】CYP2C19の正常型（CYP2C19*1/CYP2C19*
1)、ヘテロ型（CYP2C19*1/CYP2C19*2あるいはCYP2C19*1
/CYP2C19*3)及びホモ型（CYP2C19*2/CYP2C19*2あるいは
CYP2C19*3/CYP2C19*3)のタイピングは、上記と同様にし
て行うことができる。

【００４５】ワーファリンやトルブタミドの代謝に関与
するCYP2C9は、正常型をCYP2C9*1、日本人で見つかって
いるエクソン４中の点突然変異をCYP2C9*3と呼んでい
る。

【００４６】CYP2C9の正常型（CYP2C9*1/CYP2C9*1)、ヘ
テロ型（CYP2C9*1/CYP2C9*3)及びホモ型（CYP2C9*3/CYP
2C9*3)のタイピングは、上記と同様にして行うことがで
きる。

【００４７】アザチオプリンなどの代謝に関与するTPMT
は、正常型をTPMT*1、日本人で見つかっているエクソン
10中の点突然変異をTPMT*3Cと呼んでいる。

【００４８】TPMTの正常型（TPMT*1/TPMT*1)、ヘテロ型
（TPMT*1/TPMT*3C)及びホモ型（TPMT*3C/TPMT*3C)のタ
イピングは、上記と同様にして行うことができる。

【００４９】イソニアジドなどの代謝に関与するNAT2
は、正常型をNAT2*4、日本人で見つかっているエクソン
１中の点突然変異をNAT2*5B、NAT2*6A、NAT2*7Bと呼ん
でいる。

【００５０】NAT2の正常型（NAT2*4/NAT2*4)、ヘテロ型
（NAT2*4/NAT2*5B，NAT2*4/NAT2*6AあるいはNAT2*4/NAT
2*7B)及びホモ型（NAT2*5B/NAT2*5B，NAT2*6A/NAT2*6A
あるいはNAT2*7B/NAT2*7B)のタイピングは、上記と同様
にして行うことができる。

【００５１】アセトアルデヒドなどの代謝に関与するAL
DH2は、正常型をALDH2*1、日本人で見つかっているエク
ソン12中の点突然変異をALDH2*2と呼んでいる。

【００５２】ALDH2の正常型（ALDH2*1/ALDH2*1)、ヘテ
ロ型（ALDH2*1/ALDH2*2)及びホモ型（ALDH2*2/ALDH2*2)
のタイピングは、上記と同様にして行うことができる。

【００５３】本発明の正常及び変異フォワードプライマ
ーは3’側から-2の位置に人為的なミスマッチを導入し
ているため、非常に特異性が高い。また、本法はPCR産
物で非特異的増殖が起こっても、蛍光標識プローブがア
ニーリングしないと増殖がカウントされないので、末梢
血由来のDNAのほかにも、比較的純度の低い唾液由来のD
NAでも診断可能であり、従来法に比べ特に精度が高い。

【００５４】

【発明の効果】本発明は、PCR測定法を用いる遺伝子多
型の診断方法に改良を加え、煩雑な操作を伴わない、簡
便でしかも、短時間に多量のサンプルを処理できる遺伝
子検査法が提供される。さらに、CYP2C18m1とm2及びCYP
2C19*2とCYP2C19*3の遺伝子多型を簡便に検出すること
ができるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。さら
に、CYP2C19*1（正常型）とCYP2C19*2あるいはCYP2C19*
3（変異型）、CYP2C9*1（正常型）とCYP2C9*3（変異
型）、TPMT*1（正常型）とTPMT*3C（変異型）、NAT2*4
（正常型）とNAT2*5B，NAT2*6AあるいはNAT2*7B（変異
型）、ALDH2*1（正常型）とALDH2*2（変異型）の遺伝子
多型を簡便に検出することができるオリゴヌクレオチド
プローブを提供する。

【００５５】

【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。

【００５６】

【実施例１】（１）ジェノタイピング(CYP2C19) 144人の日本人から静脈血1 mlあるいは唾液１mlずつ採
取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNAを抽
出した。CYP2C18ｍ1検出は、得られたDNAを鋳型とし
て、本発明の配列番号１の正常フォワードプライマー、
配列番号3の蛍光標識プローブおよび配列番号4のリバー
スプライマーを用いPCRを行った。さらに別のチューブ
で、配列番号２の変異フォワードプライマー、配列番号
3の蛍光標識プローブおよび配列番号4のリバースプライ
マーを用いてPCRを行った。終濃度が１ｘ TaqMan Unive
rsal PCR Master Mix（パーキンエルマー社製）、100 n
M の蛍光標識プローブ、400 nM フォワードプライマ
ー、400 nM リバースプライマーを含む反応液中で約20
〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはABI PRISM 7700TM
Sequence Detector(パーキンエルマー社製）を用い
た。95℃で５分間から10分間の変性後、95℃で15秒、60
℃で1分間の反応を35から50サイクル行った。また、CYP
2C18m2検出は、同様の反応条件で、配列番号５の正常フ
ォワードプライマー、配列番号７の蛍光標識プローブお
よび配列番号8のリバースプライマーを用いPCRを行い、
別のチューブで、配列番号6の変異フォワードプライマ
ー、配列番号7の蛍光標識プローブおよび配列番号8のリ
バースプライマーを用いてPCRを行った。反応終了後得
られたデータはABI PRISM 7700TM Sequence Detector付
属のコンピューターソフト「Sequence Detector]で解析
した。正常プライマーで得られたCt値（Ctwt)から変異
プライマーで得られたCt値（Ctmt)を差引いた値によ
り、変異の有無を確認した。すなわち、その大きさが−
3以下であれば正常型（wt/wt)、−3から3の間であれば
ヘテロ型（wt/m1あるいはwt/m2）、3以上であればホモ
型（m1/m1あるいはm2/m2）であると診断した。

【００５７】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号１、５）、変異フォワードプライマー（配列番号２、
６）、リバースプライマー（配列番号４、８）、TaqMan
プローブ（配列番号３、７）は、常法に従い製造した。
各TaqManプローブの５’端は6-カルボキシフルオレセイ
ン(FAM)で、３’端を6-カルボキシテトラメチルローダ
ミン(TAMRA)で各々標識した。

【００５８】典型的な結果を図1〜図４に示す。ただ
し、ここではCYP2C18m1検出時のThresholdを0.009、CYP
2C18m2検出時のThresholdを0.200と設定した。ここでは
示さないが、サンプルＤＮＡとして唾液由来のDNAを用
いた場合も同様の結果が得られ、その特異性の高さが示
された。

【００５９】点変異のCYP2C19*2とCYP2C18m2、CYP2C19*
3とCYP2C18m1はそれぞれ完全にリンクしていることを利
用し、上記方法により得られたCYP2C19ジェノタイピン
グの結果を表１に示す。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【実施例２】（１）ジェノタイピング(CYP2C9) ２１６人の日本人から静脈血１ｍｌあるいは唾液１mlず
つ採取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNA
を抽出した。CYP2C9*3検出は、得られたDNAを鋳型とし
て、本発明の配列番号９の正常フォワードプライマー、
配列番号１１の蛍光標識プローブおよび配列番号１２の
リバースプライマーを用いPCRを行った。さらに別のチ
ューブで、配列番号１０変異フォワードプライマー、配
列番号１１の蛍光標識プローブおよび配列番号１２のリ
バースプライマーを用いてPCRを行った。終濃度が１ｘ
TaqMan Universal PCR Master Mix（パーキンエルマー
社製）、100 nM の蛍光標識プローブ、400 nM フォワー
ドプライマー、400 nM リバースプライマーを含む反応
液中で約20〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはABIPRI
SM 7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー社製）
を用いた。50℃で約２分間、続いて95℃で５分間から10
分間の変性後、95℃で15秒、60℃で1分間の反応を35か
ら50サイクル行った。反応終了後得られたデータはABI
PRISM 7700TMSequence Detector付属のコンピューター
ソフト「Sequence Detector]で解析した。正常プライマ
ーで得られたCt値（Ctwt)から変異プライマーで得られ
たCt値（Ctmt)を差引いた値により、変異の有無を確認
した。すなわち、その大きさが−3以下であれば正常型
（CYP2C9*1/CYP2C9*1)、−3から3の間であればヘテロ型
（CYP2C9*1/CYP2C9*3)、3以上であればホモ型（CYP2C9*
3/CYP2C9*3)であると診断した。

【００６２】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号９）、変異フォワードプライマー（配列番号１０）、
リバースプライマー（配列番号１２）、TaqManプローブ
（配列番号１１）は、常法に従い製造した。各TaqManプ
ローブの５’端は6-カルボキシフルオレセイン(FAM)
で、３’端を6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAM
RA)で各々標識した。

【００６３】典型的な結果を図５(A)〜(B)に示す。ただ
し、検出時のThresholdを0.200と設定した。ここでは示
さないが、サンプルＤＮＡとして唾液由来のDNAを用い
た場合も同様の結果が得られ、その特異性の高さが示さ
れた。

【００６４】上記方法により得られたCYP2C9ジェノタイ
ピングの結果を表２に示す。

【００６５】

【表２】

【００６６】このヒトサンプル中には、ホモ型CYP2C9*3
/CYP2C9*3のジェノタイプが見つからなかったため、こ
の検出系が３つの遺伝子型を分離できるか否かはわから
なかった。そこで、鋳型ＤＮＡとして人工的にそれぞれ
のジェノタイプを示すようなプラスミドＤＮＡを構築し
た。すなわち、pBluescript SK+のEcoRI 及びXhoIサイ
トにCYP2C9*1あるいはCYP2C9*3の周辺配列319bpを含む
領域をサブクローン化した。それぞれ得られたクローン
を、CYP2C9*1及びCYP2C9*3とした。正常型、ヘテロ型及
びホモ型は、それぞれCYP2C9*1、(CYP2C9*1+CYP2C9*3)
およびCYP2C9*3のプラスミドＤＮＡを鋳型として上記と
同様の反応をかけた。その結果を図６(A)〜(D)に示す。
これらの結果は、仮にCYP2C9*3/CYP2C9*3が人ゲノムＤ
ＮＡが鋳型であったとしても、上記の反応系が有用であ
ることを示すものである。

【００６７】

【実施例３】（１）ジェノタイピング(CYP2C19) １４４人の日本人から静脈血１ｍｌあるいは唾液１mlず
つ採取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNA
を抽出した。CYP2C19*2検出は、得られたDNAを鋳型とし
て、本発明の配列番号１３の正常フォワードプライマ
ー、配列番号１５の蛍光標識プローブおよび配列番号１
６のリバースプライマーを用いPCRを行った。終濃度が
１ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix（パーキンエル
マー社製）、100 nM の蛍光標識プローブ、400 nM フォ
ワードプライマー、400 nM リバースプライマーを含む
反応液中で約20〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはAB
I PRISM 7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー
社製）を用いた。50℃で約２分間、続いて95℃で５分間
から10分間の変性後、95℃で15秒、60℃で1分間の反応
を35から50サイクル行った。また、CYP2C19*3の検出
は、同様の反応条件で、配列番号１７の正常フォワード
プライマー、配列番号１９の蛍光標識プローブおよび配
列番号２０のリバースプライマーを用いPCRを行い、別
のチューブで、配列番号１８の変異フォワードプライマ
ー、配列番号１９の蛍光標識プローブおよび配列番号２
０のリバースプライマーを用いてPCRを行った。反応終
了後得られたデータはABI PRISM 7700TM Sequence Dete
ctor付属のコンピューターソフト「Sequence Detector]
で解析した。正常プライマーで得られたCt値（Ctwt)か
ら変異プライマーで得られたCt値（Ctmt)を差引いた値
により、変異の有無を確認した。すなわち、その大きさ
が−3以下であれば正常型（*1/*1)、−3から3の間であ
ればヘテロ型（*1/*2あるいは*1/*3）、3以上であれば
ホモ型（*2/*2あるいは*3/*3）であると診断した。

【００６８】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号１３，１７）、変異フォワードプライマー（配列番号
１４、１８）、リバースプライマー（配列番号１６，２
０）、TaqManプローブ（配列番号１５，１９）は、常法
に従い製造した。各TaqManプローブの５’端は6-カルボ
キシフルオレセイン(FAM)で、３’端を6-カルボキシテ
トラメチルローダミン(TAMRA)で各々標識した。

【００６９】CYP2C19*2の結果を図７(A)〜(C)に示し、C
YP2C19*3の結果を図８(A)〜(C)に示す。ただし、ここで
は検出時のThresholdを0.200と設定した。ここでは示さ
ないが、サンプルＤＮＡとして唾液由来のDNAを用いた
場合も同様の結果が得られ、その特異性の高さが示され
た。

【００７０】上記方法により得られたCYP2C19ジェノタ
イピングの結果を表３に示す。

【００７１】

【表３】

【００７２】

【実施例４】（１）ジェノタイピング(TPMT) １９２人の日本人から静脈血１ｍｌあるいは唾液１mlず
つ採取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNA
を抽出した。TPMT*3C検出は、得られたDNAを鋳型とし
て、本発明の配列番号２１の正常フォワードプライマ
ー、配列番号２３の蛍光標識プローブおよび配列番号２
４のリバースプライマーを用いPCRを行った。さらに別
のチューブで、配列番号２２の変異フォワードプライマ
ー、配列番号２３の蛍光標識プローブおよび配列番号２
４のリバースプライマーを用いてPCRを行った。終濃度
が１ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix（パーキンエ
ルマー社製）、100 nM の蛍光標識プローブ、400 nM フ
ォワードプライマー、400 nMリバースプライマーを含む
反応液中で約20〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはAB
I PRISM 7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー
社製）を用いた。50℃で約２分間、続いて95℃で５分間
から10分間の変性後、95℃で15秒、60℃で1分間の反応
を35から50サイクル行った。反応終了後得られたデータ
はABI PRISM 7700TM Sequence Detector付属のコンピュ
ーターソフト「Sequence Detector]で解析した。正常プ
ライマーで得られたCt値（Ctwt)から変異プライマーで
得られたCt値（Ctmt)を差引いた値により、変異の有無
を確認した。すなわち、その大きさが−3以下であれば
正常型（TPMT*1/TPMT*1)、−3から3の間であればヘテロ
型（TPMT*1/TPMT*3C)、3以上であればホモ型（TPMT*3C/
TPMT*3C）であると診断した。

【００７３】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号２１）、変異フォワードプライマー（配列番号２
２）、リバースプライマー（配列番号２４）、TaqManプ
ローブ（配列番号２３）は、常法に従い製造した。各Ta
qManプローブの５’端は6-カルボキシフルオレセイン(F
AM)で、３’端を6-カルボキシテトラメチルローダミン
(TAMRA)で各々標識した。

【００７４】典型的な結果を図９(A)〜(B)に示す。ただ
し、検出時のThresholdを0.200と設定した。ここでは示
さないが、サンプルＤＮＡとして唾液由来のDNAを用い
た場合も同様の結果が得られ、その特異性の高さが示さ
れた。

【００７５】上記方法により得られたTPMTジェノタイピ
ングの結果を表４に示す。

【００７６】

【表４】

【００７７】

【実施例５】（１）ジェノタイピング(NAT2) １９２人の日本人から静脈血１ｍｌあるいは唾液１mlず
つ採取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNA
を抽出した。NAT2*5B検出は、得られたDNAを鋳型とし
て、本発明の配列番号２５の正常フォワードプライマ
ー、配列番号２７の蛍光標識プローブおよび配列番号２
８のリバースプライマーを用いPCRを行った。さらに別
のチューブで、配列番号２６の変異フォワードプライマ
ー、配列番号２７の蛍光標識プローブおよび配列番号２
８のリバースプライマーを用いてPCRを行った。終濃度
が１ｘ TaqMan Universal PCR Master Mix（パーキンエ
ルマー社製）、100 nM の蛍光標識プローブ、400 nM フ
ォワードプライマー、400 nMリバースプライマーを含む
反応液中で約20〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはAB
I PRISM 7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー
社製）を用いた。50℃で約２分間、続いて95℃で５分間
から10分間の変性後、95℃で15秒、60℃で1分間の反応
を35から50サイクル行った。また、NAT2*6A検出は、同
様の反応条件で、配列番号２９の正常フォワードプライ
マー、配列番号２７の蛍光標識プローブおよび配列番号
２８のリバースプライマーを用いPCRを行った。さらに
別のチューブで、配列番号３０の変異フォワードプライ
マー、配列番号２７の蛍光標識プローブおよび配列番号
２８のリバースプライマーを用いてPCRを行った。ま
た、NAT2*7B検出は、同様の反応条件で、配列番号３１
の正常フォワードプライマー、配列番号３３の蛍光標識
プローブおよび配列番号３４のリバースプライマーを用
いPCRを行い、別のチューブで、配列番号３２の変異フ
ォワードプライマー、配列番号３３の蛍光標識プローブ
および配列番号３４のリバースプライマーを用いてPCR
を行った。反応終了後得られたデータはABI PRISM 7700
TM Sequence Detector付属のコンピューターソフト「Se
quence Detector]で解析した。正常プライマーで得られ
たCt値（Ctwt)から変異プライマーで得られたCt値（Ctm
t)を差引いた値により、変異の有無を確認した。すなわ
ち、その大きさが−3以下であれば正常型（*4/*4)、−3
から3の間であればヘテロ型（*4/*5B、*4/*6Aあるいは*
4/*7B)、3以上であればホモ型（*5B/*5B、*6A/*6Aある
いは*7B/*7B）であると診断した。

【００７８】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号２５，２９，３１）、変異フォワードプライマー（配
列番号２６，３０，３２）、リバースプライマー（配列
番号２８，３４）、TaqManプローブ（配列番号２６，３
０，３２）は、常法に従い製造した。各TaqManプローブ
の５’端は6-カルボキシフルオレセイン(FAM)で、３’
端を6-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)で各
々標識した。

【００７９】NAT2*5Bの結果を図１０(A)〜(B)に、NAT2*
6Aの結果を図１１(A)〜(C)に、NAT2*7Bの結果を図１２
(A)〜(C)に各々示す。ただし、検出時のThresholdを0.2
00と設定した。ここでは示さないが、サンプルＤＮＡと
して唾液由来のDNAを用いた場合も同様の結果が得ら
れ、その特異性の高さが示された。

【００８０】上記方法により得られたNAT2ジェノタイピ
ングの結果を表５に示す。

【００８１】

【表５】

【００８２】

【実施例６】（１）ジェノタイピング(ALDH2) ４８人の日本人から静脈血１ｍｌあるいは唾液１mlずつ
採取し、市販のキット（和光純薬社製）を用いてDNAを
抽出した。ALDH2*2検出は、得られたDNAを鋳型として、
本発明の配列番号３５の正常フォワードプライマー、配
列番号３７の蛍光標識プローブおよび配列番号３８のリ
バースプライマーを用いPCRを行った。さらに別のチュ
ーブで、配列番号３６変異フォワードプライマー、配列
番号３７の蛍光標識プローブおよび配列番号３８のリバ
ースプライマーを用いてPCRを行った。終濃度が１ｘ Ta
qMan Universal PCR Master Mix（パーキンエルマー社
製）、100 nM の蛍光標識プローブ、400 nM フォワード
プライマー、400 nM リバースプライマーを含む反応液
中で約20〜100 ng のDNAを増幅した。増幅にはABIPRISM
7700TM Sequence Detector(パーキンエルマー社製）を
用いた。50℃で約２分間、続いて95℃で５分間から10分
間の変性後、95℃で15秒、60℃で1分間の反応を35から5
0サイクル行った。反応終了後得られたデータはABI PRI
SM 7700TMSequence Detector付属のコンピューターソフ
ト「Sequence Detector]で解析した。正常プライマーで
得られたCt値（Ctwt)から変異プライマーで得られたCt
値（Ctmt)を差引いた値により、変異の有無を確認し
た。すなわち、その大きさが−3以下であれば正常型（A
LDH2*1/ALDH2*1)、−3から3の間であればヘテロ型（ALD
H2*1/ALDH2*2)、3以上であればホモ型（ALDH2*2/ALDH2*
2)であると診断した。

【００８３】なお、正常フォワードプライマー（配列番
号３５）、変異フォワードプライマー（配列番号３
６）、リバースプライマー（配列番号３８）、TaqManプ
ローブ（配列番号３７）は、常法に従い製造した。各Ta
qManプローブの５’端は6-カルボキシフルオレセイン(F
AM)で、３’端を6-カルボキシテトラメチルローダミン
(TAMRA)で各々標識した。

【００８４】典型的な結果を図１３(A)〜(C)に示す。た
だし、検出時のThresholdを0.200と設定した。ここでは
示さないが、サンプルＤＮＡとして唾液由来のDNAを用
いた場合も同様の結果が得られ、その特異性の高さが示
された。

【００８５】上記方法により得られたALDH2ジェノタイ
ピングの結果を表６に示す。

【００８６】

【表６】

【００８７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ostuka Pharmaceutical Co., ltd. <120> Simple detection method for gene polymorphism of drug-metabolizing enzymes <130> 3549JP <160> 38 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 1 ATGGCCCTGT GTTCACTGTG TGT 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 2 ATGGCCCTGT GTTCACTGTG TGA 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 3 TTGGCCTGAA GCCCATTGTG GTGT 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 4 CCTTCACTGC TTCATATCCA TGC 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 5 TCATGCCTGT AATCCCAGCA TT 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 6 TCATGCCTGT AATCCCAGCA AC 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 7 TGGCCAACAT GGTGAAACCC TGTCT 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 8 AATGCACAAC TACGCCCAGG T 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 9 TGCACGAGGT CCAGAGATAT A 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 10 TGCACGAGGT CCAGAGATAT C 21 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 11 CTGCCCCATG CAGTGACCTG TGACATTAAA 30 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 12 TGATACTATG AATTTGGGAC TTAGAA 26 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 13 TTAAGTAATT TGTTATGGGT TCGC 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 14 TTAAGTAATT TGTTATGGGT TCGT 24 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 15 AATGATAGTG GGAAAATTAT TGCATATCTA AGAGA 35 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 16 ACAACCAGAG CTTGGCATAT T 21 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 17 AAAAAACTTG GCCTTACCTG GAAC 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 18 AAAAAACTTG GCCTTACCTG GAAT 24 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 19 AGGGGGTGCT TACAATCCTG ATGTTTTC 28 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> primer <400> 20 GTTTACTCAT ATTTTAAAAT TGTTTCCAAT CA 32 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 21 TATGTCTCAT TTACTTTTCT GTAAGTAGTT 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 22 TATGTCTCAT TTACTTTTCT GTAAGTAGTC 30 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> primer <400> 23 AGACAGTCAA TTCCCCAACT TTTATGTCGT TCTT 34 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 24 TTAACATGTT ACTCTTTCTT GTTTCA 26 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 25 GCTCTCTCCT GATTTGGTCC TG 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 26 GCTCTCTCCT GATTTGGTCC GA 22 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> primer <400> 27 TTCTGTCAAG CAGAAAATGC AAGGCACCTG 30 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 28 CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AA 22 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 29 GTATTCATAG ACTCAAAATC TTCAATTGTA C 31 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 30 GTATTCATAG ACTCAAAATC TTCAATTGTA T 31 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 31 TTTTGTTCCT TATTCTAAAT AGTAAGGGAA C 31 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 32 TTTTGTTCCT TATTCTAAAT AGTAAGGGAA T 31 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 33 TCACCAGGTT TGGGCACGAG ATTTCT 26 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 34 AACTCTCACT GAGGAAGAGG TTGAAG 26 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 35 CCACACTCAC AGTTTTCACT GC 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 36 CCACACTCAC AGTTTTCACT AT 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 37 ATGCCTGCAG CCCGTACTCG C 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 38 CAAATTACAG GGTCAACTGC T 21

【図面の簡単な説明】

【図１】CYP2C18m1のジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図２】CYP2C18m1のジェノタイピングの結果を示す図
である。

【図３】CYP2C18m2のジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図４】CYP2C18m2のジェノタイピングの結果を示す図
である。

【図５】CYP2C9*3のジェノタイピングを行った結果を示
すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図６】プラスミドＤＮＡを用いて行ったCYP2C9のジェ
ノタイピングの結果を示す図である。

【図７】CYP2C19*2のジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図８】CYP2C19*3のジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図９】TPMT*3Cのジェノタイピングを行った結果を示
すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図１０】NAT2*5Bのジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図１１】NAT2*6Aのジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図１２】NAT2*7Bのジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

【図１３】ALDH2*2のジェノタイピングを行った結果を
示すリアルタイムＰＣＲのプロファイルである。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＤＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを含むＰＣ
   Ｒ緩衝液、正常フォワードプライマー、変異フォワード
   プライマー、リバースプライマー及び蛍光標識プローブ
   を含む薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キット。
2. 【請求項２】ＤＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰを含むＰＣ
   Ｒ緩衝液、正常プライマープローブセット（正常フォワ
   ードプライマー＋リバースプライマー＋蛍光標識プロー
   ブ）、変異プライマープローブセット（変異フォワード
   プライマー＋リバースプライマー＋蛍光標識プローブ）
   を含む請求項１記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用
   キット。
3. 【請求項３】マグネシウムイオン終濃度が１．５〜６．
   ０ｍＭである請求項１又は２に記載の薬物代謝酵素遺伝
   子多型の検出用キット。
4. 【請求項４】薬物代謝酵素遺伝子多型がCYP2C9、CYP2C1
   8、CYP2C19、TPMT、NAT2及びALDH2からなる群から選ば
   れるいずれかの多型である請求項１又は２に記載の薬物
   代謝酵素遺伝子多型の検出用キット。
5. 【請求項５】薬物代謝酵素遺伝子多型が、ポイントミュ
   ーテーションによるものである請求項１〜４のいずれか
   に記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の検出用キット。
6. 【請求項６】正常フォワードプライマーおよび変異フォ
   ワードプライマーに、少なくとも１つのミスマッチを導
   入してなる請求項１〜５のいずれかに記載の薬物代謝酵
   素遺伝子多型の検出用キット。
7. 【請求項７】ミスマッチをポイントミューテーションの
   隣に導入してなる請求項６に記載の薬物代謝酵素遺伝子
   多型の検出用キット。
8. 【請求項８】薬物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤＮＡ
   を前記ＰＣＲ緩衝液、正常フォワードプライマー、リバ
   ースプライマー及び蛍光標識プローブとともにＰＣＲ反
   応を行うＡ工程、薬物代謝酵素遺伝子を含むサンプルＤ
   ＮＡを前記ＰＣＲ緩衝液、変異フォワードプライマー、
   リバースプライマー及び蛍光標識プローブとともにＰＣ
   Ｒ反応を行うＢ工程、Ａ工程及びＢ工程の結果を比較す
   る比較工程を含む薬物代謝酵素遺伝子の多型検出方法。
9. 【請求項９】前記比較工程が、Ａ工程とＢ工程の蛍光シ
   グナルが初めて検出されるサイクル数(Ct)をコンピュー
   タソフトウェアで比較する工程である請求項８記載の薬
   物代謝酵素遺伝子の多型検出方法。
10. 【請求項１０】Ａ工程とＢ工程を１．５〜６ｍＭのマグ
    ネシウムイオン終濃度で行う請求項７又は８に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】薬物代謝酵素遺伝子がCYP2C9、CYP2C1
    8、CYP2C19、TPMT、NAT2及びALDH2からなる群から選ば
    れるいずれかの遺伝子である請求項８〜１０のいずれか
    に記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の多型検出方法。
12. 【請求項１２】薬物代謝酵素遺伝子多型が、ポイントミ
    ューテーションによるものである請求項８〜１１のいず
    れかに記載の薬物代謝酵素遺伝子多型の多型検出方法。
13. 【請求項１３】正常フォワードプライマーおよび変異フ
    ォワードプライマーに、少なくとも１つのミスマッチを
    導入してなる請求項８〜１２のいずれかに記載の薬物代
    謝酵素遺伝子多型の多型検出方法。
14. 【請求項１４】ミスマッチをポイントミューテーション
    の隣に導入してなる請求項１３に記載の薬物代謝酵素遺
    伝子多型の多型検出方法。