JP5687721B2 - シトクロムP2D6遺伝子の遺伝型分析のためのhtSNPs、及びそれを用いた遺伝子多重分析法 - Google Patents
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Description
また、本発明の他の目的は、前記htSNPを用いてヒトCYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2(=PXR)及びUGT1A遺伝子の遺伝型を決定する方法を提供することにある。
本発明で用語“aN>M”または“NaM”(この時、aは整数、N及びMはそれぞれ独立的にA、C、TまたはGである。)は、遺伝子塩基配列でa番目N塩基がM塩基に置換されたことを意味し、“ainsN”または“adelN”(この時、aは整数、NはA、C、TまたはGである。)は、遺伝子塩基配列でa番目にN塩基がもう一つ挿入され、または欠失されたことを意味する。
本発明は、韓国人CYP1A2遺伝子の変異分析を通じて韓国人において発見されるCYP1A2遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるhtSNPを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。また、本発明は、ヒトCYP1A2遺伝子の新規なハプロタイプを糾明したという点に特徴がある。
(a)被験者から生物学的試料を採取する工程;
(b)前記(a)工程で採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記(b)工程の核酸を鋳型とし、ヒトCYP1A2遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;
(d)前記(c)工程で得られたPCR産物の塩基配列を分析して変異の存在有無を確認する工程;及び
(e)前記(d)工程で変異が存在すると確認されたPCR産物の塩基配列をSNPタガー(SNPtagger)ソフトウェアを用いて分析する工程。
(b)前記(a)工程の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記(b)工程の核酸を鋳型とし、ヒトCYP1A2遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;及び
(d)前記(c)工程で得られたPCR産物の塩基配列において、−3860G>A、−3598G>T、−3594T>G、−3113G>A、−2847T>C、−2808A>C、−2603insA、−2467delT、−1708T>C、−739T>G、−163C>A、1514G>A、2159G>A、2321G>C、3613T>C、5347C>T及び5521A>Gからなる群より選択されるCYP1A2遺伝子の変異の存在有無を調査する工程。
前記ヒトCYP1A2遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトCYP1A2遺伝子の公知となった単一塩基多型を含む断片をいう。前記(c)工程で使用され得るプライマーは、これに制限されないが、配列番号2乃至配列番号31からなる群より選択される。
(b)前記(a)工程の採取された試料からゲノムDNAを抽出する工程;
(c)前記(b)工程のゲノムDNAを鋳型とし、ヒトCYP1A2遺伝子のプロモーター領域を増幅できるプライマーを用いてPCRを遂行する工程;及び
(d)前記(c)工程で得られたPCR産物の塩基配列において、−3860G>A、−3598G>T、−3594T>G、−3113G>A、−2847T>C、−2808A>C、−2603insA、−2467delT、−1708T>C、−739T>G及び163C>AからなるCYP1A2遺伝子の変異の存在有無を調査する工程。
前記(c)工程でヒトCYP1A2遺伝子のプロモーター領域を増幅できるプライマーは、配列番号1の−3860G>Aから−163C>Aまでの単一塩基多型を増幅できるプライマーであれば、制限なしに使用することができ、好ましくは配列番号62及び配列番号63のプライマーを使用することができる。
本発明は韓国人CYP2A6遺伝子の変異分析を通じて韓国人で主に発見されるCYP2A6遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるhtSNPを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。
本発明によるヒトCYP2A6遺伝子のhtSNPを選別する方法は次の工程を含む:
(b)前記工程(a)の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)の核酸を鋳型とし、ヒトCYP2A6遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;
(d)前記工程(c)で得られたPCR産物の塩基配列で変異の存在有無を確認する工程;
(e)前記工程(d)で変異が存在すると確認されたPCR産物の塩基配列でハプロタイプを分析する工程;及び
(f)前記工程(e)で分析されたハプロタイプの塩基配列をSNPタガーソフトウェア(http://www.well.ox.ac.uk/〜xiayi/haplotype/)を用いて分析してhtSNPを選別する工程。
(b)前記工程(a)の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)の核酸を鋳型とし、ヒトCYP2A6遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;及び
(d)前記工程(c)で得られたPCR産物の塩基配列において、−48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>T、及び6091C>Tからなる群より選択されるCYP2A6遺伝子変異の存在有無を調査する工程。
前記ヒトCYP2A6遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトCYP2A6遺伝子の公知となった変異、例えばSNPを含んでいる断片をいう。前記工程(c)で用いられるプライマーは、これに制限されないが、配列番号90、91、120及び103のプライマーであっても良い。
本発明は韓国人CYP2D6遺伝子の変異分析を通じて韓国人で主に発見されるCYP2D6遺伝子の遺伝型を糾明し、これに基づいてそれぞれのハプロタイプの最適の標識セットであるhtSNPを選別し、その有用性を確認したという点に特徴がある。
(a)ヒトから生物学的試料を採取する工程;
(b)前記(a)工程の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記(b)工程の核酸を鋳型とし、ヒトCYP2D6遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;
(d)前記(c)工程で得られたPCR産物の塩基配列で変異の存在有無を確認する工程;
(e)前記(d)工程で変異が存在すると確認されたPCR産物の塩基配列でハプロタイプ(haplotype)を分析する工程;及び
(f)前記(e)工程で分析されたハプロタイプの塩基配列をSNPタガーソフトウェアを用いて分析してhtSNPを選別する工程。
(b)前記(a)工程の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記(b)工程の核酸を鋳型とし、ヒトCYP2D6遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;及び
(d)前記(c)工程で得られたPCR産物の塩基配列において、−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;1887insTA;2573insC;2988G>A;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失;及び2D6重複からなる群より選択される一つを含む少なくとも11個のCYP2D6遺伝子変異の存在有無を調査する工程。
前記ヒトCYP2D6遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトCYP2D6遺伝子の公知となった変異、例えば単一塩基多型を含んでいる断片をいう。前記(c)工程で使用され得るプライマーは、これに制限されないが、配列番号106、配列番号107、配列番号121乃至配列番号127、配列番号129乃至配列番号136、配列番号138、配列番号139、配列番号149及び配列番号150からなる群より選択される塩基配列を有するものであっても良い。
(b)各対立遺伝子(allele)の特異的な塩基を同定できるASPE(allele specific primer extension)プライマーを用いてASPE反応を遂行する工程;
(c)前記反応産物を遺伝子チップに混成化させる工程;及び
(d)前記チップを分析する工程。
また、本発明はSNP検査用ジップ・コード(ZiP Code)オリゴ塩基チップを含む遺伝型分析用キットを提供する(図42参照)。
本発明の方法は韓国人のPXR遺伝子の変異に基づいて選別された、htSNPを用いてPXR遺伝子の機能的変異型を分析することを特徴とする。
本発明によるヒトPXR遺伝子のhtSNPを選別する方法は次の工程を含む:
(b)前記工程(a)の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)の核酸を鋳型とし、ヒトPXR遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;
(d)前記工程(c)で得られたPCR産物の塩基配列を分析して変異の存在有無を確認する工程;
(e)前記工程(d)で変異が存在することが確認されたPCR産物の塩基配列中のハプロタイプを分析する工程;及び
(f)前記工程(e)で分析されたハプロタイプの塩基配列をSNPタガーソフトウェアを用いて分析してhtSNPを選別する工程。
本発明の方法は前記工程(a)乃至(e)を反復する工程を追加的に含むことができる。種族や患者などのようなある特定集団におけるPXR遺伝子の変異様相及びこれに対するハプロタイプを分析しようとする場合には、各PXR遺伝型の頻度を調査して前記集団で多く発見されるPXR遺伝型を選定した後、これを対象として工程(f)を遂行できる。
本発明の他の実施例では、前記で選別された22個のSNPの中で6個の機能的変異によるハプロタイプをDYNACOM社のSNPAlyzeプログラムを用いて分析し、総14個のハプロタイプを確認した(表49参照)。
(b)前記工程(a)の採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)の核酸を鋳型とし、ヒトPXR遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;及び
(d)前記工程(c)で得られたPCR産物の塩基配列において、−25385C>T、−24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C及び11193T>Cからなる群より選択されたPXR遺伝子の機能的変異の存在有無を調査する工程。
前記ヒトPXR遺伝子の断片は、前記の通り、ヒトPXR遺伝子の公知となった変異、例えばSNPを含む断片をいう。前記工程(c)で使用されるプライマーは、これに制限されないが、配列番号242乃至247のプライマーからなる群より選択され得る。
本発明の方法により分析され得るPXR遺伝子の機能的変異型は−25385C>T、−24113G>A、7635A>G、8055C>T、11156A>C及び11193T>Cを含む。
本発明によるヒトUGT1A族遺伝子群の機能的変異型を決定する方法は次の工程を含む:
(a)ヒトから生物学的試料を採取する工程;
(b)前記工程(a)で採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)で抽出された核酸を用いてヒトUGT1A族個別遺伝子を増幅する工程;及び
(d)前記工程(c)で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、UGT1A1での−39(TA)6>(TA)7、211G>A、233C>T及び686C>A;UGT1A3での31T>C、133C>T及び140T>C;UGT1A4での31C>T、142T>G及び292C>T;UGT1A6での19T>G、541A>G及び552A>C;UGT1A7での387T>G、391C>A、392G<A、622T>C及び701T>C;及びUGT1A9での−118T9>T10、726T>G及び766G>Aからなる群より選択されたUGT1A族遺伝子群の機能的変異型の存在有無を確認する工程。
(a)ヒトから生物学的試料を採取する工程;
(b)前記工程(a)で採取された試料から核酸を抽出する工程;
(c)前記工程(b)で抽出された核酸を用いてヒトUGT1A族遺伝子を増幅する工程;及び
(d)前記工程(c)で増幅された遺伝子の塩基配列を分析し、UGT1A1での211G>A、233C>T及び686C>A;UGT1A6での19T>G、541A>G及び552A>C;及びUGT1A9での−118T9>T10、726T>G及び766G>Aからなる群より選択されたUGT1A族遺伝子変異型の存在有無を確認する工程。
実施例1:韓国人におけるCYP1A2遺伝子の遺伝型分析
<1−1>CYP1A2遺伝子の増幅
48名の健康な被験者から血液を分離した後、Qiagen社のゲノムDNA分離キットを使用してDNAをそれぞれ分離した。CYP1A2遺伝子は7個のエクソンを含み総遺伝子の長さが約11kbである。従って、CYP1A2遺伝子を15個の断片に分けてPCRを遂行した。各PCRに使用したプライマーは下記の表1の通りである。本明細書に記載された塩基配列でA、T、G及びCはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
前記実施例<1−1>で得られた各PCR産物の塩基配列を自動配列分析器を用いて分析した。この時に使用したプライマーは下記の表4の通りである。
その結果、前記1個の単一塩基多型は全てプロモーター部位−2603insAに位置した。この変異型の単一塩基多型は二本のDNAのうち、一本は変異型、他の一本は野生型を有していることが示された(図1)。
前記実施例1で糾明された17個のCYP1A2遺伝子の変異は、その組み合わせによりCYP1A2の酵素活性に影響を与える可能性があり、幾つかのハプロタイプに対する酵素活性変異は既に報告されている。従って、本発明者等は実施例1で確認した変異によるハプロタイプをDYNACOM社のSNPAlyzeプログラムを使用して分析した。その結果、下記の表6に示した通り、他種族で発見されない韓国型の新たなハプロタイプが確認された。
CYP1A2遺伝子の単一塩基多型の組み合わせであるハプロタイプがCYP1A2の酵素活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このように作られた詳細なハプロタイプの情報は最小マーカで確認することができる。これら最小マーカをhtSNPといい、前記htSNPはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるhtSNP組み合わせをSNPタガーソフトウェア(http://www.well.ox.ac.uk/〜xiayi/haplotype)を用いて選別した。選別されたhtSNP組み合わせの例を図2乃至図6に示し、各選別されたhtSNP組み合わせは最適の標識セットのうちの一つとして、「1」は野生型を、「2」は変異型、そして「V」表示は選択されたそれぞれのhtSNPを示す。htSNPの選別は図2乃至6の組み合わせ以外にも他の組み合わせが可能である。
その後、探し出した組み合わせの中でディプロタイプを考慮して互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できるかをMatlabソフトウェア(version 7.1,The Math Works Inc., 米国)を使用して分析し、これを用いてチェックした後に組み合わせを決定した。
前記実施例1で確認された韓国人で発見されたCYP1A2遺伝子の17個の単一塩基多型の中で、CYP1A2酵素活性に影響を与えるプロモーター部分の単一塩基多型11個を高速に検索するためにスナップショット分析を実施した。被験者のDNAを鋳型としてPCRを遂行し、増幅された産物をスナップショット分析した。CYP1A2遺伝子のプロモーターは約4,000baseであり、PCRに使用したプライマーは下記の表7の通りである。
実施例5:韓国人における2A6遺伝子の遺伝型分析
<5−1>2A6遺伝子の増幅
50名の健康な被験者から血液を分離した後、Qiagen社のゲノムDNA分離キットを使用してDNAをそれぞれ分離した。CYP2A6遺伝子は9個のエクソンを含む総遺伝子の長さが約6.9kbである。従って、CYP2A6遺伝子を7個の断片に分けてPCRを遂行した。各PCRに使用したプライマーは下記の表12の通りである。本明細書に記載された塩基配列でA、T、G及びCはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
前記実施例<5−1>で得られた各PCR産物の塩基配列を自動配列分析器及び配列番号:76乃至89のプライマーを用いて分析した。
また、前記の表で「♯」は新規変異を意味する。
前記実施例5で糾明された27個のCYP2A6遺伝子の変異と3個のCYP2A6欠失標識変異は、その組み合わせに応じてCYP2A6の酵素活性に影響を与える可能性がある。従って、本発明者等は実施例5で確認した変異によるハプロタイプをDYNACOM社のSNPAlyzeプログラムを使用して分析した。通常的にハプロタイプの分析で頻度が低い変異の場合、統計的有意性を確保し難いため、主に5%または10%以上の頻度を有する変異を選別してハプロタイプの分布を予測する。しかしながら、アミノ酸の置換を招く場合には、頻度が低いにもかかわらず、明確な機能性を有しているため、本発明では頻度が高い変異である−48T>G、22C>T、51G>A、1620T>C、1836G>T、及び6354T>Cの6個の変異とアミノ酸の変化を招く13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>Tの8個の変異を用いてハプロタイプ分析を遂行し、遺伝子の欠失がある場合、これを標識できる変異である5971G>A、5983T>G、6091C>T変異を検査変異対象に追加した。総17個の変異を用いてハプロタイプを分析した結果、図15のように総20個の韓国人におけるハプロタイプ分布を得ることができた。
CYP2A6遺伝子のSNPの組み合わせであるハプロタイプがCYP2A6の酵素活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このような詳細なハプロタイプの情報は最小マーカで確認することができる。これら最小マーカをhtSNPといい、前記htSNPはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるhtSNP組み合わせを選別するために、前記実施例6で選別された総20個のハプロタイプの塩基配列をSNPタガーソフトウェア(http://www.well.ox.ac.uk/〜xiayi/haplotype/)を用いて分析した。
前記実施例5で確認された韓国人で発見されたCYP2A6遺伝子の27個の変異とCYP2A6遺伝子欠失を標識する3個の変異のうち、機能性を変化させるCYP2A6の遺伝型が遺伝子診断に有用に使用され得る。従って、図16にある変異の中でアミノ酸の変化を起こしているか、または既に機能性が立証されている変異である−48T>G、13G>A、567C>T、2134A>G、3391T>C、6458A>T、6558T>C、6582G>T、6600G>Tの9個の変異と遺伝子欠失を標識する6091C>T変異とを含む総10個の機能的変異を高速に検索するために、CYP2A6遺伝子の高速遺伝型分析技術の一つであるスナップショット分析を実施した。選別されたhtSNPは図16のhtSNP組み合わせの中で機能性を反映する10個の変異が選択されたものであり、変異の位置は下記の表17の通りである。
従って、前記方法は韓国人で主に発見される10種のCYP2A6ハプロタイプを決定することによって、これら組み合わせによるCYP2A6遺伝型を同時に高速に分析できる方法であり、韓国人で発見される遺伝的変異を含むので、遺伝型決定の正確度が高い。また、韓国人と遺伝的特性が非常に類似する日本人の場合にもほとんど全ての遺伝型分析が可能であり、既に知られた結果から中国人でも90%以上の範囲でCYP2A6遺伝型を判別できる技術であると思料される。
実施例9:韓国人のCYP2D6遺伝子の遺伝型分析
<9−1>ゲノムDNAの分離
174名の韓国人から採取した血液試料からゲノムDNA分離キット(Qiagen社)を用いてゲノムDNAをそれぞれ分離した。
前記実施例<9−1>で分離された総174個のゲノムDNAサンプルの中で任意に選んだ51個のサンプルを鋳型とし、下記のプライマー対でPCRを遂行してヒトCYP2D6遺伝子を構成する9個のエクソンと1.8kbのプロモーター部位が増幅されるようにした。
前記実施例<9−1>から分離した残りの123個のゲノムDNAサンプルについては、下記の方法により東洋人で主に発見される*2A、*5、*2N、*10B、*14B、*18、*21B、*41A、*49、*52、*60変異に対する遺伝型分析を個別的に遂行した。
CYP2D6*5遺伝型を分析するために、下記の表27に記載されたプライマーを使用してPCRを遂行した。PCR反応条件としては、94℃で1分間反応させた後に98℃で10秒、64℃で30秒及び72℃で5分間30サイクルを反復して72℃で10分間反応させた。その結果、野生型の場合、9個のエクソンを含む5.1kbのPCR産物が増幅され、CYP2D6*5変異型の場合、3.5kbのPCR産物が増幅された。
CYP2D6*2N遺伝型を分析するために、下記の表28に記載されたプライマーを使用してPCRを遂行した。PCRは94℃で1分間反応させた後に98℃で10秒、64℃で30秒及び72℃で8分間30サイクルを反復して72℃で10分間反応させた。その結果、CYP2D6*2N変異型の場合、7.8kbのPCR産物を収得した。
CYP2D6*2遺伝型とCYP2D6*41遺伝型の場合、−1584C>G変異を除いて同一の変異(1235A>G;−740C>T;−678G>A;イントロン1でのCYP2D7への遺伝子転換(gene conversion);1661G>C;2850C>T;4180G>C)を有する。従って、先ずイントロン1でのCYP2D7への遺伝子転換の変異配列を下記の表29に記載されたプライマーを用いてAS−PCR方法(Johanson,Molecular Pharmacology,46:452-459,1994)で分析した。
PCRは94℃で5分間反応させた後に94℃で30秒、64℃で30秒及び72℃で30秒間35サイクルを反復して72℃で10分間反応させた。その後、−1584C>G変異を下記の表29に記載されたシーケンシングプライマーを用いてパイロシーケンシングで分析して−1584Gである場合をCYP2D6*2遺伝型に、−1584Cである場合をCYP2D6*41遺伝型に決定した。
CYP2D6*10B、*14、*18及び*49遺伝型はPCR−RFLP方法で分析した(Johanson,Molecular Pharmacology,46:452-459,1994; Wang,Drug Metabolism and Dispososition,27:385-388,1998; 及び Geadigk,Pharmacogenetics,9:669-682,1999)。この時に使用したプライマーは下記の表30の通りであり、実験条件は下記の表31に示す通りである。
CYP2D6*21、*52及び*60遺伝型の分析はPCR−パイロシーケンシング法で分析した。分析に使用したプライマーの配列は下記の表32に示す通りである。
前記実施例9で確認した韓国人で発見される12種のCYP2D6遺伝型を決定するために、表34に示す33個の変異を全て分析することは、時間と費用的な面で効率性が非常に落ちる。従って、詳細なハプロタイプの情報を用いて標識遺伝子変異であるhtSNPを選定して遺伝型を決定すれば経済的な遺伝型判別が可能である。前記htSNPはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、色々な組み合わせを構成するようになる。この最適化された標識セットであるhtSNP組み合わせをSNPタガーソフトウェア(http://www.well.ox.ac.uk/〜xiayi/haplotype/)を用いて選別した。選別されたhtSNP組み合わせの例を図34乃至図39に示し、各選別されたhtSNP組み合わせは最適の標識セットとして、「1」は野生型を、「2」は変異型を示し、「V」表示はhtSNPを示す。
検証の結果、互いに重ならずにディプロタイプ遺伝型を決定できることを確認した。これは本発明で選択したhtSNP組み合わせが互いに同一なものがなく、遺伝型を決定するに当たって不正確な分析が全くないことを示す。
前記実施例10で選別されたhtSNP組み合わせを用いてCYP2D6遺伝子の高速遺伝型分析技術の一つであるスナップショット分析を遂行した。このために図34のhtSNP組み合わせを選択した。各htSNPで選別される変異の位置は下記の表35の通りである。下記の表35でhtSNP1乃至htSNP3の場合には該当する複数個の変異の中で一つのSNPだけを分析しても遺伝型判別が可能である。また、htSNP9の場合には9個の塩基(GTGCCCACT)が挿入されて反復される様相を示すようになるので、4125番目塩基から4133番目塩基位置のうちのいずれか一つの塩基位置だけを分析し、野生型遺伝子の塩基配列と比較することによって遺伝型判別が可能である。
<12−1>ZiP Codeチップの製作
1)プローブ製作
ASPE PCR反応に使用するZiPCodeと相補的な塩基配列でデザインし、プローブは3’方向に10bpのヌクレオチド配列(5’−CAG GCC AAGT−3’)をスペーサで挿入してターゲットと交雑反応がよく生じるように誘導した。
チップ製作のための基板はアミンがコーティングされているコーニン(Corning)社のGAPSIIガラススライドを使用した。SMP4XBピンを使用してOmniGgid100スポッターでスポッティングし、スポッティング条件は温度−22℃、湿度−54%とし、27種のプローブはそれぞれ2回反復でスポッティングした。スポッティング後、7,500μJ/cm2のUVを照査してガラススライドにプローブを固定させた。
CYP2D6遺伝子の9個の遺伝型標識(SNP;前記の表で下線にて表示)を用いて11個の遺伝型(CYP2D6*1、*2、*5、*10B、*14A、*14B、*18、*21、*41、*49、*2N)を検証した。
1)ロング(Long)PCR
CYP 2D6ゲノムDNAサンプル2μl、1X LA緩衝液、2.5mM MgCl2、0.4mM dNTP、下記の表16の各0.2pmol/μlプライマー、LAタクDNAポリメラーゼ(taq DNA polymerase,TAKARA:cat. No. RR002A)2.5ユニット、3次蒸溜水を入れて50μlに合わせた後、94℃で1分間1回変成させた後、98℃10秒、64℃30秒、72℃6分間30サイクル反応後、72℃で1分間延長反応して増幅させた(図44)。(CYP2D6遺伝子は、*5、*2N対立遺伝子(allele)、及びその他対立遺伝子用として各3種類の1STPCR産物を得た。各条件は前記と同一である。)
前記で得られた多重PCR産物の各6μl、1X amplitaq緩衝液、Cy5dUTP(ジーンケム)10μM、各ASPEプライマー125nM、 Amplitaq gold(Applied Biosystems:cat. No. N8080242)1ユニット、1X Band doctor(ソルジェント)及び3次蒸溜水を入れて20μlに合わせた後、94℃で5分間1回変成させた後、94℃で30秒、60℃で1分、72℃で1分間30回のサイクルで反応して増幅させた(図45参照)。ASPE反応セット及びプライマー配列は下記の表42及び43に記載した通りである。
ASPE反応で得られた1乃至4セットの産物をpoolingしてQiagen精製キット(Qiagen:ca. no. 28106)を用いて製造会社のマニュアルにより精製し、最終溶出体積を50μlとした。
前混成化(prehybridization)緩衝液(25%ホルムアミド、5X SSC、0.1%SDS、10mg/ml BSA)を42℃で温めた後、チップを前記緩衝液に漬けて42℃で30分以上培養した。前記チップを蒸溜水で1分ずつ3回洗浄した後、チップをコニカル(conical)チューブに入れて800rpmで5分間遠心分離して乾燥させた。
前記のように準備されたチップをAxonのGenePix 4100Bスキャナーを使用して出力波長は650nm付近でスキャニングし、スキャニングされたイメージはGenePix Pro 6.0 softwareを使用して蛍光信号の強さを分析し、その結果を図46及び下記の表44に示した。
実施例13:韓国人のPXR遺伝子の遺伝型分析
<13−1>PXR遺伝子の増幅
54名の健康な被験者から血液を分離した後、Qiagen社のゲノムDNA分離キットを使用してDNAをそれぞれ分離した。PXR遺伝子の全体塩基配列を自動塩基配列分析器(ABI Genetic Analyzer 3130XL)を用いて分析した結果、現在まで報告された総18個の機能的変異の中で6個を確認した。PXR遺伝子は9個のエクソンを含んで総遺伝子の長さが約38kbである。従って、PXR遺伝子を機能的変異があるエクソンを中心に10個の断片に分けてPCRを遂行した。各PCRに使用したプライマーは下記の表45の通りである。本明細書に記載された塩基配列でA、T、G及びCはそれぞれアデニン、チミン、グアニン及びシトシンを意味する。
前記実施例<13−1>で得られた各PCR産物の塩基配列を自動配列分析器及び配列番号:131乃至150のプライマーを用いて分析した。
前記実施例13で機能性が研究されたことがある6個のPXR遺伝子の機能的変異はその組み合わせによりPXRの機能性に影響を与える可能性がある。
PXR遺伝子のSNPの組み合わせであるハプロタイプがPXRの活性に影響を与える可能性が多くのハプロタイプで報告されたことがある。このように作られたハプロタイプの詳細な情報は最小マーカで確認できる。これら最小マーカをhtSNPといい、前記htSNPはそれぞれのハプロタイプの正確な表示のために必要なマーカであり、種々の組み合わせを含む。この最適化された標識セットであるhtSNP組み合わせを選別するために、前記実施例14で選別された14個のハプロタイプの塩基配列をSNPタガーソフトウェア(http://www.well.ox.ac.uk/〜xiayi/haplotype)を用いて分析した。
前記実施例13で確認された韓国人で発見されたPXR遺伝子の6個の機能的変異の中で、PXR機能に影響を与える機能的変異を高速に検索するためにスナップショット分析を実施した。被験者のDNAを鋳型としてPCRを遂行し、増幅された産物をスナップショット分析した。PCRに使用したプライマーは下記の表50の通りである。
実施例17:韓国人由来のUGT1A族遺伝子群の変異遺伝子選別
工程1)遺伝体DNAの分離
50名の韓国人を対象として血液をそれぞれ採取した後、遺伝体DNA分離キット(Qiagen社)を用いて採取された各血液試料から遺伝体DNAを分離した。
工程2)UGT1A族遺伝子群の増幅及び全長塩基配列分析
前記工程2で増幅させた各UGT1A族遺伝子の全長配列を対象として公知の3100遺伝子分析器(3130x Genetic Analyzer,Applied Biosystems)を用いて配列を分析し、その結果をそれぞれ野生型UGT1A族遺伝子の塩基配列(GenBank accession No.:NT_005120)と比較した。結果を下記の表56及び57に示した。
前記工程3で得られた韓国人50名で発見されたUGT1A族遺伝子の多型性に基づき、酵素活性の増加または減少のように機能的に関連したと報告された変異型を選別して下記の表58に示した。この時、UGT1A9でのG766A変異型は工程3では確認されなかったが、日本人で報告された機能的変異型であるので下記の表58に追加した。「truncated protein」は蛋白質が翻訳過程中間に突然変異により非正常的に翻訳終結されることを意味する。
前記工程3で得られた韓国人50名で発見されたUGT1A族遺伝子の多型性に基づき、大腸癌治療用抗癌剤であるイリノテカン(Irinotecan)の代謝に関与すると知られたUGT1A1、UGT1A6及びUGT1A9の多型性を選別して下記の表59に示した。この時、UGT1A9でのG766A変異型は工程3では確認されなかったが、日本人で報告された機能的変異型であるので下記の表59に追加した。
18−1)UGT1A族遺伝子の機能的変異型分析
前記実施例17の被験者の中で各UGT1A族遺伝子の野生型、異型の対立形質を有する変異型、同型の対立形質を有する変異型を有するヒトからの血液を対象として、次の通り本発明によるヒトUGT1A族遺伝子の機能的変異型を確認した。
前記の表60に提示されたプライマーの代わりに、下記の表62に提示されたプライマーを同時に使用したことを除いて、前記18−1でのスナップショット分析と同一な工程を遂行してイリノテカン感受性と関連したUGT1A族多型性を分析し、その結果を図55に示した。この時、表62に提示されたプライマーを5'末端に互いに異なる長さのT反復配列を付けてそれぞれの長さを異なるようにした。
Claims (12)
- (a)ヒトから採取された生物学的試料から核酸を抽出する工程;
(b)前記(a)工程の核酸を鋳型とし、韓国人またはこれと類似の遺伝学的特性を有するアジア人CYP2D6遺伝子またはその断片を増幅できるプライマーでPCRを遂行する工程;及び
(c)前記(b)工程で得られたPCR産物の塩基配列において、−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;1887insTA;2573insC;2988G>A;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失(deletion);及び2D6重複(duplication)からなる群より選択される少なくとも11個のCYP2D6遺伝子変異の存在有無を調査する工程を含む、ヒトCYP2D6遺伝子の遺伝型を決定する方法。 - 前記(a)工程の生物学的試料が、血液、皮膚細胞、粘膜細胞及び毛髪からなる群より選択されるものである請求項1に記載の方法。
- 前記(b)工程のプライマーが、配列番号106、配列番号107、配列番号121乃至配列番号127、配列番号129乃至配列番号136、配列番号138、配列番号139、配列番号149及び配列番号150からなる群より選択される塩基配列を有するものである請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;1887insTA;2573insC;2988G>A;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1584C>G;−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;2573insC;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;−1245insGA、−1028T>C、−377A>C、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;−1584C>G;−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;1887insTA;2573insC;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1584C>G;−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;2573insC;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;−1245insGA、−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;4125〜4133insGTGCCCACT;−1235A>G;1887insTA;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1661G>C及び4180G>Cからなる群より一つ;1758G>A;1887insTA;2573insC;2988G>A;4125〜4133insGTGCCCACT;−1235A>G;1887insTA;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程において、−1584C>G;−1426C>T、100C>T及び1039C>Tからなる群より一つ;1611T>A;1758G>A;2573insC;−740C>T、−678G>A、214G>C、221C>A、223C>G、227T>C、232G>C、233A>C、245A>G及び2850C>Tからなる群より一つ;−1245insGA、−1028T>C、−377A>G、3877G>A、4388C>T及び4401C>Tからなる群より一つ;1887insTA;2988G>A;4125〜4133insGTGCCCACT;2D6欠失;及び2D6重複を含む変異の存在有無を調査する請求項1に記載の方法。
- 前記(c)工程の変異の存在有無の調査を、スナップショット(SNaPshot)分析を用いて遂行する請求項1に記載の方法。
- 前記スナップショット分析を、単一塩基多型位置の直ぐそばの塩基が3'末端となり、前記単一塩基多型位置の隣接部位にアニーリングされる配列を含み、5'末端にはT塩基が付加されたプライマーを用いて遂行する請求項10に記載の方法。
- 前記プライマーが、配列番号141乃至配列番号148、配列番号152及び配列番号153からなる群より選択される塩基配列を有する請求項11に記載の方法。
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