JP4096037B2 - グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 - Google Patents
グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4096037B2 JP4096037B2 JP2002235029A JP2002235029A JP4096037B2 JP 4096037 B2 JP4096037 B2 JP 4096037B2 JP 2002235029 A JP2002235029 A JP 2002235029A JP 2002235029 A JP2002235029 A JP 2002235029A JP 4096037 B2 JP4096037 B2 JP 4096037B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mutation
- ugt
- gene
- region
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子検査の方法およびそのためのプローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウリジンジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ（UDP-glucuronosyltransferase，ＵＧＴ）は種々の薬剤のグルクロン酸抱合を触媒する酵素である。ＵＧＴはそのアミノ酸配列の相同性によりＵＧＴ１とＵＧＴ２の２つのファミリーに分類される。
ＵＧＴ１には、ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ３〜ＵＧＴ１Ａ１０の少なくとも９個のアイソフォームが存在する事が知られている。例えば、ＵＧＴ１Ａ１はビリルビン、アミン、フェノールなどを抱合し、ＵＧＴ１Ａ６は平面状の分子構造をもつフェノールを抱合する。ヒトＵＧＴｌ遺伝子（ＵＧＴ１）は染色体２ｑ３７に存在しており、アイソフォーム（１Ａ１〜ｌＡ１０）ごとに基質特異性のあるエキソンｌと、各アイソフォームで共通のエキソン２〜５からなり、各エキソン１の上流にＴＡＴＡｂｏｘを含むプロモーター領域が存在する。それぞれのアイソフォームは第１エキソン群の少なくとも９のうちの１つによりコードされるユニークなアミノ末端領域と４つのエキソンによってコードされる共通のカルボキシ末端領域を持っている。したがって、
一方ＵＧＴ２は臭気物質を抱合するＵＧＴ２Ａと胆汁酸、ステロイドを抱合するＵＧＴ２のサブファミリーに分けられる。
【０００３】
血清ビリルビンが高値となる以外に一般肝機能検査に異常がなく、明らかな黄疽の原因（溶血所見など）を認めないものを体質性黄疸と称し、間接（非抱合型）ビリルビンが上昇するCrigler-Najjar症候群I型，同II型およびGilbert症候群と、直接（抱合型）ビリルビンが上昇するDubin-Johnson症候群，Rotor症候群とに大別される。Crigler-Najjar症候群I型，同II型およぴGilbert症候群ではＵＧＴ１Ａ１遺伝子のエキソン５での変異が報告されている。具体的にはアミノ酸配列番号４８６番目のチロシンがアスパラギン酸に置換した変異（Ｙ４８６Ｄ）により、その酵素活性が正常のものに比べて１３分の１に低下する。
【０００４】
一方、体内での薬剤代謝に関与する物質として、チトクロームＰ４５０が良く知られている。そしてこの酵素の多型の違いにより、ある特定の薬剤が代謝されない、薬剤代謝異常が引き起こされることもよく知られている。薬剤の代謝異常はチトクロームＰ４５０の多型によるのみならず、上述のごとく薬剤がグルクロン酸抱合されて代謝されることから、薬剤代謝にＵＧＴの多型の関与が知られるようになった。しかしながら、種々の薬剤代謝とＵＧＴの多型との関係において、数多くの薬剤に対する代謝を反映しうる有効な遺伝子の変異は明らかでない。とりわけＵＧＴ１遺伝子のエキソン５領域の変異と薬剤代謝の関連は明らかでない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＵＧＴをコードする遺伝子の変異を効率的に検出することにより、薬剤代謝の判定、予測または検査方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決する手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＵＧＴをコードする遺伝子が５個のエキソンから成り、エキソン２〜５領域はＵＧＴ１のアイソフォーム毎に共通の領域であることから、これらの領域の変異を調べると、ＵＧＴ１のアイソフォーム毎の検査をすることなく、ＵＧＴ１の変異を有効的に検出しうることに着目し、とりわけＵＧＴ１分子のエキソン５領域の変異を検出することで、薬物代謝の予測が有効になされることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
１．ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする遺伝子のエキソン５領域の変異を検出する工程を含むことを特徴とするＵＧＴの薬剤代謝能に対する検査方法、
２．プロモーター領域の変異を検出する工程を含む前項１に記載の検査方法、
３．ＵＧＴ１をコードする遺伝子を含む試料を、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０の各アイソフォーム毎の検査をすることなく、該各アイソフォームに共通の核酸配列を有するエキソン５領域の変異を検出する工程を含む前項１または２に記載の検査方法、
４．ＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列４８６番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の１４５６番目の塩基に対応するＵＧＴ１Ａ分子の各アイソフォームのエキソン５領域の変異を検出する工程を含む前項３に記載の検査方法、
５．上記変異の検出工程ともに、ＵＧＴ分子をコードする遺伝子配列のエキソン１、２、３および４の領域の少なくとも１つの領域の変異を検出する工程を含む前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法、
６．ＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列７１番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の２２６番目の変異およびアミノ酸配列２２９番目のアミノ酸をコードする遺伝子配列の４８６番目の変異のうち少なくとも１つの遺伝子配列の変異を検出する工程を含む前項５に記載の検査方法、
７．前項３または４に記載の塩基置換からなる変異を有するＵＧＴ遺伝子または該変異を含む遺伝子の断片、
８．前項１〜６のいずれか１に記載の塩基置換の検出方法に供される被検ＤＮＡとしての機能的有効長を有するＤＮＡ断片または前項１〜６に記載の塩基置換を検出方法に使用するためのプローブとしての機能的有効長を有するＤＮＡ断片、
９．配列番号１〜３のいずれか１で表される塩基配列を有するＵＧＴに特異的なオリゴヌクレオチドプローブである前項７または８記載のＤＮＡ断片。
１０．配列番号１で表される塩基配列を有するプローブと配列番号２および／または３で表される塩基配列を有するプローブを組み合わせて使用する前項５または６に記載の検査方法、
１１．前項７〜９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたは請求項１０に記載の方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブを同一の装置内に設置した検出装置。
１２．前項７〜９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列の末端が、官能基を介して不溶性支持体に結合して固定化されている核酸チップまたは核酸アレイである前項１１記載の検出装置
１３．前項１１または１２に記載の装置を用いて薬剤代謝を判定、予測または検査する方法。
１４．前項１〜６、１０、１３のいずれか１に記載の方法に用い、または前項７〜９に記載の核酸断片或いは前項１１または１２に記載の装置を組み込んだ検査キット、からなる。
【０００８】
【本発明の実施態様】
本発明を詳細に説明するため、実施態様を例示して説明する。
２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールグルクロン酸抱合物は強い肝毒性を有する前立腺癌の治療に使われる非ステロイド系の抗男性ホルモン剤であるフルタアミドの主な代謝物である。
２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールはＵＧＴによってグルクロン酸抱合される。ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ６の各アイソフォームの酵素によりグルクロン酸抱合されるときの酵素反応学的な反応を、それぞれ正常な分子とＹ４８６Ｄの変異をもつ分子で比較した。その結果、ＵＧＴ１Ａ１の変異型では天然型の最大速度に比べて約１２％の最大速度を示し、Ｋｍ値は２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールに対しては約半分であり、ＵＤＰ−グルクロン酸に対しては天然型と同等であった。一方ＵＧＴ１Ａ６については変異型は天然型の１％以下の活性しか示さず、最大反応速度、Ｋｍの測定はともに不可能なレベルであった。
前述のようにＵＧＴ１遺伝子がアイソフォーム毎に共通のエキソン２〜５領域とアイソフォーム毎に異なるエキソン１領域を有することから、共通エキソン領域に変異が起きるとすべてのアイソフォームにおいてＵＧＴ１の酵素活性が低下するといえる。
【０００９】
本発明は、共通エキソン領域の変異を調べることで、ＵＧＴ１に存在しうるアイソフォームの全てを対象に、遺伝子の変異を効率的に検査する方法を提供するものである。具体的には、例えばＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ６のエキソン５領域の変異（Ｙ４８６Ｄ）を検査することにより、これらの酵素による薬物代謝を予測することができる。
さらに本発明は、ＵＧＴ１のエキソン１領域の変異検出を加えることにより、各アイソフォームに固有の変異を検出し、それらを組み合わせることで、総合的にＵＧＴ遺伝子の変異の検出漏れの頻度を低減可能とするＵＧＴ遺伝子の変異検査方法が提供される。このことにより、薬剤代謝の予測、検査を効率的に行う方法が提供できる。
【００１０】
本発明は、ＵＧＴ１Ａ１のエキソン５領域の変異、具体的にはＹ４８６Ｄ変異の検査方法を開示するもので、該検査方法により、同時に起きている他のアイソフォームの変異も検出し得る。例えば、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４並びにＵＧＴ１Ａ５の変異であるＹ４８７Ｄ、ＵＧＴ１Ａ６の変異であるＹ４８５Ｄ、およびＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９並びにＵＧＴ１Ａ１０の変異であるＹ４８３Ｄ等を同一のプローブおよび／または同一の装置を使用して検査することができる。したがって、本発明の方法により、薬剤代謝に重要な働きをしているＵＧＴ１Ａの各アイソフォームの変異を個々に検査することなく、１種の核酸プローブを用いることによって、これらアイソフォームの全てのエキソン５領域の変異を検出でき、その酵素活性の低下による薬剤代謝の判定、予測または検査を行うことが可能になる。
【００１１】
本発明において、検出すべき遺伝子変異が明らかにされ、これが特定されているので、本発明の開示に従えば、その検出のための方法を適宜採用しもしくは該方法を適宜修飾して採用することは当業者であれば容易である。例えば、被験者のＵＧＴ遺伝子を対象として、本発明の特定の変異（Ｙ４８６Ｄ変異）の検出は、当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法に従うことができる。これには、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップまたは核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。
【００１２】
（プローブ）
ＵＧＴ１分子をコードする遺伝子のエキソン１内２２６番目の核酸塩基の変異（Ｇ７１Ｒ）、エキソン１内６８６番目の核酸塩基の変異（Ｐ２２９Ｑ）の変異およびエキソン５内１４５６番目の核酸塩基の変異（Ｙ４８６Ｄ）は、核酸プローブを用いて検出することができる。
これらの核酸プローブ用のＤＮＡ断片のヌクレオチド数は、少なくとも８個、通常１０〜５０個、好ましくは１５〜３５個の範囲にあるのがよい。プローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００１３】
具体的には、Ｇ７１Ｒ変異検出用プローブとして、（配列番号２）ＴＣＡＧＡＧＡＣＮＧＡＧＣＡＴＴＴＴの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、Ｐ２２９Ｑ変異検出用プローブは（配列番号３）ＴＡＡＴＴＣＣＣＮＧＴＡＴＧＡＡＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、そしてＹ４８６Ｄ変異検出プローブは（配列番号１）ＴＧＧＴＡＣＣＡＧＮＡＣＣＡＴＴＣＣＴの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。この場合において、ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧの何れかもしくはイノシン等のユニバーサル塩基である。
また、これらのオリゴヌクレオチドの末端には、必要な化学物質、例えば核酸アレイ調製時のスポッティングを容易にするための物質や、各種標識物質などを付加することができる。
【００１４】
さらに本発明においては、ＵＧＴ遺伝子検出用プローブとして機能し得るものであれば、上記配列番号１〜３に表される塩基配列を有するＤＮＡ断片に限定されず、鋳型鎖との間に少数のミスマッチがあっても良い。例えば、上記機能を有するものであれば、配列番号１〜３に表される塩基配列に例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
【００１５】
上記本発明で用いるプローブの各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。合成オリゴヌクレオチドはスライドグラス表面に固定化した核酸アレイへ応用する場合には５´末端をアミノ標識しておくことも好適である。
【００１６】
（核酸アレイ）
上記の各プローブはスライドグラス等の表面に固定化して核酸アレイ（一般には、「マイクロアレイ」ともいう。）として用いることができる。核酸アレイの手法は、公知の方法を適用することができ、特にその方法は限定されない（例えば遺伝子工学実験ノート下，羊土社，175-187 (2002)）。例えば、市販のアレイヤー、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒを用いてアミノシランコートしたスライドグラス上にスポットして調製することができる
【００１７】
（対象試料と検査試料の調製）
本発明の方法により、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占めるグルクロン酸抱合による薬物代謝を容易に判定することができる。これにより、投与される医薬品の代謝の適否を判定することができる。測定の対象となる試料は生体試料であれば良く、特に限定されないが、例えば肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等が挙げられる。測定試料において、ＵＧＴ遺伝子の発現量が少ない場合には、対象とする核酸をＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等の適当な増幅方法により増幅させた試料を測定することも可能である。
【００１８】
検査対象試料からＤＮＡを抽出し、変異を検出しようとする領域に特異的なプライマー対を用いて例えばＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅させて検査試料を調製することができる。具体的には、５´末端を蛍光標識したプライマー（例えば、５´−Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡ）を用いて蛍光標識試料を調製することにより、調製した試料を核酸アレイ上のプローブとハイブリザイズさせて直接そのハイブリザイズした結果を検出することができる。
【００１９】
試料調製のためのプライマーとして、例えば以下のものを使用することができる。これにより、ＤＮＡを増幅させて蛍光標識試料を調製できる。
１）変異検出部位Ｇ７１Ｒ用のプライマー対：
Ｇ７１Ｒ−Ｆ
（ＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡ）（配列番号４）
Ｃｙ３−Ｇ７１Ｒ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＡＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＣＴＡＡＣ）（配列番号５）
２）変異検出部位Ｐ２２９Ｇ用プライマー対：
Ｐ２２９Ｑ−Ｆ
（ＣＡＡＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ）（配列番号６）
Ｃｙ３−Ｐ２２９Ｇ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＧＧＴＣ）（配列番号７）
３）変異検出部位Ｙ４８６Ｄ用プライマー対
a)Ｙ４８６Ｄ−Ｆ
（ＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣ）（配列番号８）
Ｃｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＴＴＴＣＣＧＧＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡ）（配列番号９）
b)Ｙ４８６Ｄ−Ｆ２
（ＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴ）（配列番号１０）
Ｃｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒ２
（Ｃｙ３−ＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＧ）（配列番号１１）
【００２０】
（検出）
上記の核酸アレイ蛍光標識の検出には市販の検出装置が用いられる。例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒを用いて、スキャンニングして各スポットの蛍光シグナルを検出することができる。
【００２１】
（対象薬剤）
本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤は、ＵＧＴによりグルクロン酸抱合されるものであれば、その代謝の検査に有用である。これらの薬剤の例として、スピロノラクトン等の利尿剤、アセトアミノフェン、アスピリン、フロクタフェニン、インドメタシン等の鎮痛剤、ハロペリドール、カルピプラミン、ロラゼパム、アモキサン等の向精神薬、モルヒネ、プロポフォール、アヘン等の麻酔鎮痛剤、抗癌剤の塩酸ドキソルピジン、鎮咳剤のリン酸コデイン、喘息治療薬の硫酸オルシプレナリン、抗てんかん剤のフェニトイン、抗ヒスタミン剤のフマル酸ケトチフェン、降圧および狭心症治療薬のカルベジロール、塩酸プロプラノロール等、脂質代謝改善剤のクロフィブラートアルミニウム、アルツハイマー治療薬の塩酸ドネペジル等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
（核酸アレイの調製）
配列番号１から１２の各配列を持つ５´アミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒを用いて、アミノシランコートしたスライドグラス（シグマ社製）の表面にスポッティングしＤＮＡチップを調製した。各オリゴヌクレオチドを５個ずつスポットした。調製したアレイのスポットレイアウトを図１に示した。
【００２４】
【実施例２】
（試料の調製）
７種類の検査試料を以下の５´−Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドと未標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅させ、蛍光標識試料を調製した。変異検出部位Ｇ７１Ｒ用のプライマー対として、Ｇ７１Ｒ−ＦとＣｙ３−Ｇ７１Ｒ−Ｒを用いて１５０塩基対のＰＣＲ増幅産物を、変異検出部位Ｐ２２９Ｇ用プライマー対、Ｐ２２９Ｑ−ＦとＣｙ３−Ｐ２２９Ｇ−Ｒを用いて１９５塩基対のＰＣＲ増幅産物を、さらに変異検出部位Ｙ４８６Ｄ用プライマー対、Ｙ４８６Ｄ−ＦとＣｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒを用いて１８７塩基対のＰＣＲ増幅産物を得た。ＰＣＲの条件は以下のとおりである。
【００２５】
反応物はエタノール沈殿法により精製した。
【００２６】
【実施例３】
（ハイブリダイゼーションおよび検出）
実施例２で調製した各試料を１２μＬのハイブリダイゼーション緩衝液〔４×ＳＳＣ（０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌと１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを基本溶液として４×はその４倍濃度を表す）、０．２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド〕に溶解し、その１０μＬを実施例１で作成した核酸アレイに４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。ハイブダイズ後、緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で３７℃、５分間洗浄後さらに、緩衝液（０．２×ＳＳＣ）で室温、５分間洗浄後、乾燥し、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ４２８ ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒを用いて蛍光シグナルを検出した。その結果を図２〜８に示した。
【００２７】
試料１では、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＧ列のみに、Ｐ２２９Ｑ変異検出チップのＣ列のみに、さらにＹ４８６Ｄの変異検出チップのＴ列のみにそれぞれハイブリダイズが観察された。これは、何れも正常な配列を有していることを示していた（図２）。
【００２８】
試料２および３では、Ｐ２２９Ｑの変異検出チップのＣ列およびＹ４８６Ｄの変異検出チップのＴ列にハイブリダイズが認められ、それぞれ正常な配列が認められたが、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＡ列およびＧ列の両方にハイブリダイズが観察された。これにより、Ｇ列にハイブリダイズする正常な配列と、Ａ列にハイブリダイズする変異配列を共に有するヘテロ接合性の変異が確認された（図３、図４）。
【００２９】
試料４においては、Ｐ２２９ＱおよびＹ４８６Ｄの変異検出チップでは何れも正常なハイブリダイズパターンを示したが、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＡ列のみにハイブリダイズが観察された。これにより、ホモ接合性の変異が確認された（図５）。
【００３０】
試料５では、Ｇ７１ＲおよびＹ４８６Ｄの変異検出チップのハイブリダイズパターンは何れも正常であったが、Ｐ２２９Ｑにおいては正常なハイブリダイズであるＣ列とさらにＡ列にもハイブリダイズが観察された。これにより、ヘテロ接合性の変異が確認された（図６）。
【００３１】
試料６ではＧ７１ＲおよびＰ２２９Ｑの変異検出チップに対しては何れも正常なハイブリダイズパターンを示したが、Ｙ４８６Ｄの変異検出チップに対しては、正常なハイブリダイズであるＴ列と変異を示すＧ列の両方にハイブリダイズが観察された。これにより、ヘテロ接合性の変異が確認された（図７）。
【００３２】
試料７では試料６と異なり、Ｙ４８６Ｄ変異検出チップにおいてＧ列のみにハイブリダイズが観察された。これにより、ホモ接合性の変異が確認された（図８）。
【００３３】
以上７種の試料と同じ遺伝子配列を持つＵＧＴ分子を遺伝子組換えにより調製し、ビリルビンを基質として測定したときのＵＧＴ活性と上記の結果を比較検討した結果、表１のようになり、ＵＧＴ分子をコードするエキソン５領域の変異、とりわけＹ４８６Ｄの変異を検出することにより、ＵＧＴ分子の酵素活性を予測することが可能なことが確認された。これより薬剤代謝の異常を検査することが可能であることが示された。さらに、エキソン５領域以外のエキソン１〜４の領域の変異を合わせて検出することにより、より効果的に薬剤代謝の異常を検査できることが示された。
【００３４】
（表１）ＤＮＡチップでの解析結果と対応する遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ１分子のＵＧＴ活性
【００３５】
【表１】
【００３６】
【実施例４】
実施例１と同様に操作してエキソン５領域の変異を検出したＵＧＴ１Ａ６分子について、エキソン５領域の変異の解析結果と、対応するその遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ６分子のＵＧＴ活性を２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールを基質として測定した。その結果を表２に示した。
【００３７】
（表２）ＤＮＡチップでの解析結果と対応する遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ６分子のＵＧＴ活性
【００３８】
【表２】
【００３９】
この結果、ＵＧＴ１Ａ１のみならず、他のアイソフォームの変異も本発明の方法で検出可能であることが判り、本発明の効果が確かめられた。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のＵＧＴ１をコードする共通エキソン領域の変異を検出方法により、多数の存在するアイソフォームを個別に検査することなく、効率的にＵＧＴ１遺伝子の変異を検出して、数多い薬剤に対してその代謝の判定、予測および検査を効率的に行うことができる。
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡチップの核酸プローブの配置を示した図である。
【図２】試料１（正常検体）の検査結果を表した図である。
【図３】試料２の検査結果を表した図である。
【図４】試料３の検査結果を表した図である。
【図５】試料４の検査結果を表した図である。
【図６】試料５の検査結果を表した図である。
【図７】試料６の検査結果を表した図である。
【図８】試料７の検査結果を表した図である。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の遺伝子検査の方法およびそのためのプローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウリジンジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ（UDP-glucuronosyltransferase，ＵＧＴ）は種々の薬剤のグルクロン酸抱合を触媒する酵素である。ＵＧＴはそのアミノ酸配列の相同性によりＵＧＴ１とＵＧＴ２の２つのファミリーに分類される。
ＵＧＴ１には、ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ３〜ＵＧＴ１Ａ１０の少なくとも９個のアイソフォームが存在する事が知られている。例えば、ＵＧＴ１Ａ１はビリルビン、アミン、フェノールなどを抱合し、ＵＧＴ１Ａ６は平面状の分子構造をもつフェノールを抱合する。ヒトＵＧＴｌ遺伝子（ＵＧＴ１）は染色体２ｑ３７に存在しており、アイソフォーム（１Ａ１〜ｌＡ１０）ごとに基質特異性のあるエキソンｌと、各アイソフォームで共通のエキソン２〜５からなり、各エキソン１の上流にＴＡＴＡｂｏｘを含むプロモーター領域が存在する。それぞれのアイソフォームは第１エキソン群の少なくとも９のうちの１つによりコードされるユニークなアミノ末端領域と４つのエキソンによってコードされる共通のカルボキシ末端領域を持っている。したがって、
一方ＵＧＴ２は臭気物質を抱合するＵＧＴ２Ａと胆汁酸、ステロイドを抱合するＵＧＴ２のサブファミリーに分けられる。
【０００３】
血清ビリルビンが高値となる以外に一般肝機能検査に異常がなく、明らかな黄疽の原因（溶血所見など）を認めないものを体質性黄疸と称し、間接（非抱合型）ビリルビンが上昇するCrigler-Najjar症候群I型，同II型およびGilbert症候群と、直接（抱合型）ビリルビンが上昇するDubin-Johnson症候群，Rotor症候群とに大別される。Crigler-Najjar症候群I型，同II型およぴGilbert症候群ではＵＧＴ１Ａ１遺伝子のエキソン５での変異が報告されている。具体的にはアミノ酸配列番号４８６番目のチロシンがアスパラギン酸に置換した変異（Ｙ４８６Ｄ）により、その酵素活性が正常のものに比べて１３分の１に低下する。
【０００４】
一方、体内での薬剤代謝に関与する物質として、チトクロームＰ４５０が良く知られている。そしてこの酵素の多型の違いにより、ある特定の薬剤が代謝されない、薬剤代謝異常が引き起こされることもよく知られている。薬剤の代謝異常はチトクロームＰ４５０の多型によるのみならず、上述のごとく薬剤がグルクロン酸抱合されて代謝されることから、薬剤代謝にＵＧＴの多型の関与が知られるようになった。しかしながら、種々の薬剤代謝とＵＧＴの多型との関係において、数多くの薬剤に対する代謝を反映しうる有効な遺伝子の変異は明らかでない。とりわけＵＧＴ１遺伝子のエキソン５領域の変異と薬剤代謝の関連は明らかでない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＵＧＴをコードする遺伝子の変異を効率的に検出することにより、薬剤代謝の判定、予測または検査方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決する手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＵＧＴをコードする遺伝子が５個のエキソンから成り、エキソン２〜５領域はＵＧＴ１のアイソフォーム毎に共通の領域であることから、これらの領域の変異を調べると、ＵＧＴ１のアイソフォーム毎の検査をすることなく、ＵＧＴ１の変異を有効的に検出しうることに着目し、とりわけＵＧＴ１分子のエキソン５領域の変異を検出することで、薬物代謝の予測が有効になされることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
１．ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする遺伝子のエキソン５領域の変異を検出する工程を含むことを特徴とするＵＧＴの薬剤代謝能に対する検査方法、
２．プロモーター領域の変異を検出する工程を含む前項１に記載の検査方法、
３．ＵＧＴ１をコードする遺伝子を含む試料を、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０の各アイソフォーム毎の検査をすることなく、該各アイソフォームに共通の核酸配列を有するエキソン５領域の変異を検出する工程を含む前項１または２に記載の検査方法、
４．ＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列４８６番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の１４５６番目の塩基に対応するＵＧＴ１Ａ分子の各アイソフォームのエキソン５領域の変異を検出する工程を含む前項３に記載の検査方法、
５．上記変異の検出工程ともに、ＵＧＴ分子をコードする遺伝子配列のエキソン１、２、３および４の領域の少なくとも１つの領域の変異を検出する工程を含む前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法、
６．ＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列７１番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の２２６番目の変異およびアミノ酸配列２２９番目のアミノ酸をコードする遺伝子配列の４８６番目の変異のうち少なくとも１つの遺伝子配列の変異を検出する工程を含む前項５に記載の検査方法、
７．前項３または４に記載の塩基置換からなる変異を有するＵＧＴ遺伝子または該変異を含む遺伝子の断片、
８．前項１〜６のいずれか１に記載の塩基置換の検出方法に供される被検ＤＮＡとしての機能的有効長を有するＤＮＡ断片または前項１〜６に記載の塩基置換を検出方法に使用するためのプローブとしての機能的有効長を有するＤＮＡ断片、
９．配列番号１〜３のいずれか１で表される塩基配列を有するＵＧＴに特異的なオリゴヌクレオチドプローブである前項７または８記載のＤＮＡ断片。
１０．配列番号１で表される塩基配列を有するプローブと配列番号２および／または３で表される塩基配列を有するプローブを組み合わせて使用する前項５または６に記載の検査方法、
１１．前項７〜９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたは請求項１０に記載の方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブを同一の装置内に設置した検出装置。
１２．前項７〜９のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列の末端が、官能基を介して不溶性支持体に結合して固定化されている核酸チップまたは核酸アレイである前項１１記載の検出装置
１３．前項１１または１２に記載の装置を用いて薬剤代謝を判定、予測または検査する方法。
１４．前項１〜６、１０、１３のいずれか１に記載の方法に用い、または前項７〜９に記載の核酸断片或いは前項１１または１２に記載の装置を組み込んだ検査キット、からなる。
【０００８】
【本発明の実施態様】
本発明を詳細に説明するため、実施態様を例示して説明する。
２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールグルクロン酸抱合物は強い肝毒性を有する前立腺癌の治療に使われる非ステロイド系の抗男性ホルモン剤であるフルタアミドの主な代謝物である。
２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールはＵＧＴによってグルクロン酸抱合される。ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ６の各アイソフォームの酵素によりグルクロン酸抱合されるときの酵素反応学的な反応を、それぞれ正常な分子とＹ４８６Ｄの変異をもつ分子で比較した。その結果、ＵＧＴ１Ａ１の変異型では天然型の最大速度に比べて約１２％の最大速度を示し、Ｋｍ値は２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールに対しては約半分であり、ＵＤＰ−グルクロン酸に対しては天然型と同等であった。一方ＵＧＴ１Ａ６については変異型は天然型の１％以下の活性しか示さず、最大反応速度、Ｋｍの測定はともに不可能なレベルであった。
前述のようにＵＧＴ１遺伝子がアイソフォーム毎に共通のエキソン２〜５領域とアイソフォーム毎に異なるエキソン１領域を有することから、共通エキソン領域に変異が起きるとすべてのアイソフォームにおいてＵＧＴ１の酵素活性が低下するといえる。
【０００９】
本発明は、共通エキソン領域の変異を調べることで、ＵＧＴ１に存在しうるアイソフォームの全てを対象に、遺伝子の変異を効率的に検査する方法を提供するものである。具体的には、例えばＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ６のエキソン５領域の変異（Ｙ４８６Ｄ）を検査することにより、これらの酵素による薬物代謝を予測することができる。
さらに本発明は、ＵＧＴ１のエキソン１領域の変異検出を加えることにより、各アイソフォームに固有の変異を検出し、それらを組み合わせることで、総合的にＵＧＴ遺伝子の変異の検出漏れの頻度を低減可能とするＵＧＴ遺伝子の変異検査方法が提供される。このことにより、薬剤代謝の予測、検査を効率的に行う方法が提供できる。
【００１０】
本発明は、ＵＧＴ１Ａ１のエキソン５領域の変異、具体的にはＹ４８６Ｄ変異の検査方法を開示するもので、該検査方法により、同時に起きている他のアイソフォームの変異も検出し得る。例えば、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４並びにＵＧＴ１Ａ５の変異であるＹ４８７Ｄ、ＵＧＴ１Ａ６の変異であるＹ４８５Ｄ、およびＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９並びにＵＧＴ１Ａ１０の変異であるＹ４８３Ｄ等を同一のプローブおよび／または同一の装置を使用して検査することができる。したがって、本発明の方法により、薬剤代謝に重要な働きをしているＵＧＴ１Ａの各アイソフォームの変異を個々に検査することなく、１種の核酸プローブを用いることによって、これらアイソフォームの全てのエキソン５領域の変異を検出でき、その酵素活性の低下による薬剤代謝の判定、予測または検査を行うことが可能になる。
【００１１】
本発明において、検出すべき遺伝子変異が明らかにされ、これが特定されているので、本発明の開示に従えば、その検出のための方法を適宜採用しもしくは該方法を適宜修飾して採用することは当業者であれば容易である。例えば、被験者のＵＧＴ遺伝子を対象として、本発明の特定の変異（Ｙ４８６Ｄ変異）の検出は、当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法に従うことができる。これには、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップまたは核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。
【００１２】
（プローブ）
ＵＧＴ１分子をコードする遺伝子のエキソン１内２２６番目の核酸塩基の変異（Ｇ７１Ｒ）、エキソン１内６８６番目の核酸塩基の変異（Ｐ２２９Ｑ）の変異およびエキソン５内１４５６番目の核酸塩基の変異（Ｙ４８６Ｄ）は、核酸プローブを用いて検出することができる。
これらの核酸プローブ用のＤＮＡ断片のヌクレオチド数は、少なくとも８個、通常１０〜５０個、好ましくは１５〜３５個の範囲にあるのがよい。プローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００１３】
具体的には、Ｇ７１Ｒ変異検出用プローブとして、（配列番号２）ＴＣＡＧＡＧＡＣＮＧＡＧＣＡＴＴＴＴの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、Ｐ２２９Ｑ変異検出用プローブは（配列番号３）ＴＡＡＴＴＣＣＣＮＧＴＡＴＧＡＡＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、そしてＹ４８６Ｄ変異検出プローブは（配列番号１）ＴＧＧＴＡＣＣＡＧＮＡＣＣＡＴＴＣＣＴの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。この場合において、ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧの何れかもしくはイノシン等のユニバーサル塩基である。
また、これらのオリゴヌクレオチドの末端には、必要な化学物質、例えば核酸アレイ調製時のスポッティングを容易にするための物質や、各種標識物質などを付加することができる。
【００１４】
さらに本発明においては、ＵＧＴ遺伝子検出用プローブとして機能し得るものであれば、上記配列番号１〜３に表される塩基配列を有するＤＮＡ断片に限定されず、鋳型鎖との間に少数のミスマッチがあっても良い。例えば、上記機能を有するものであれば、配列番号１〜３に表される塩基配列に例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
【００１５】
上記本発明で用いるプローブの各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。合成オリゴヌクレオチドはスライドグラス表面に固定化した核酸アレイへ応用する場合には５´末端をアミノ標識しておくことも好適である。
【００１６】
（核酸アレイ）
上記の各プローブはスライドグラス等の表面に固定化して核酸アレイ（一般には、「マイクロアレイ」ともいう。）として用いることができる。核酸アレイの手法は、公知の方法を適用することができ、特にその方法は限定されない（例えば遺伝子工学実験ノート下，羊土社，175-187 (2002)）。例えば、市販のアレイヤー、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒを用いてアミノシランコートしたスライドグラス上にスポットして調製することができる
【００１７】
（対象試料と検査試料の調製）
本発明の方法により、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占めるグルクロン酸抱合による薬物代謝を容易に判定することができる。これにより、投与される医薬品の代謝の適否を判定することができる。測定の対象となる試料は生体試料であれば良く、特に限定されないが、例えば肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等が挙げられる。測定試料において、ＵＧＴ遺伝子の発現量が少ない場合には、対象とする核酸をＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等の適当な増幅方法により増幅させた試料を測定することも可能である。
【００１８】
検査対象試料からＤＮＡを抽出し、変異を検出しようとする領域に特異的なプライマー対を用いて例えばＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅させて検査試料を調製することができる。具体的には、５´末端を蛍光標識したプライマー（例えば、５´−Ｃｙ３標識オリゴＤＮＡ）を用いて蛍光標識試料を調製することにより、調製した試料を核酸アレイ上のプローブとハイブリザイズさせて直接そのハイブリザイズした結果を検出することができる。
【００１９】
試料調製のためのプライマーとして、例えば以下のものを使用することができる。これにより、ＤＮＡを増幅させて蛍光標識試料を調製できる。
１）変異検出部位Ｇ７１Ｒ用のプライマー対：
Ｇ７１Ｒ−Ｆ
（ＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡ）（配列番号４）
Ｃｙ３−Ｇ７１Ｒ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＡＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＣＴＡＡＣ）（配列番号５）
２）変異検出部位Ｐ２２９Ｇ用プライマー対：
Ｐ２２９Ｑ−Ｆ
（ＣＡＡＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＣＧＴＧ）（配列番号６）
Ｃｙ３−Ｐ２２９Ｇ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＧＧＴＣ）（配列番号７）
３）変異検出部位Ｙ４８６Ｄ用プライマー対
a)Ｙ４８６Ｄ−Ｆ
（ＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣ）（配列番号８）
Ｃｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒ
（Ｃｙ３−ＴＴＴＣＣＧＧＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡ）（配列番号９）
b)Ｙ４８６Ｄ−Ｆ２
（ＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴ）（配列番号１０）
Ｃｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒ２
（Ｃｙ３−ＡＧＡＧＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＧ）（配列番号１１）
【００２０】
（検出）
上記の核酸アレイ蛍光標識の検出には市販の検出装置が用いられる。例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒを用いて、スキャンニングして各スポットの蛍光シグナルを検出することができる。
【００２１】
（対象薬剤）
本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤は、ＵＧＴによりグルクロン酸抱合されるものであれば、その代謝の検査に有用である。これらの薬剤の例として、スピロノラクトン等の利尿剤、アセトアミノフェン、アスピリン、フロクタフェニン、インドメタシン等の鎮痛剤、ハロペリドール、カルピプラミン、ロラゼパム、アモキサン等の向精神薬、モルヒネ、プロポフォール、アヘン等の麻酔鎮痛剤、抗癌剤の塩酸ドキソルピジン、鎮咳剤のリン酸コデイン、喘息治療薬の硫酸オルシプレナリン、抗てんかん剤のフェニトイン、抗ヒスタミン剤のフマル酸ケトチフェン、降圧および狭心症治療薬のカルベジロール、塩酸プロプラノロール等、脂質代謝改善剤のクロフィブラートアルミニウム、アルツハイマー治療薬の塩酸ドネペジル等が挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】
（核酸アレイの調製）
配列番号１から１２の各配列を持つ５´アミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７Ａｒｒａｙｅｒを用いて、アミノシランコートしたスライドグラス（シグマ社製）の表面にスポッティングしＤＮＡチップを調製した。各オリゴヌクレオチドを５個ずつスポットした。調製したアレイのスポットレイアウトを図１に示した。
【００２４】
【実施例２】
（試料の調製）
７種類の検査試料を以下の５´−Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドと未標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅させ、蛍光標識試料を調製した。変異検出部位Ｇ７１Ｒ用のプライマー対として、Ｇ７１Ｒ−ＦとＣｙ３−Ｇ７１Ｒ−Ｒを用いて１５０塩基対のＰＣＲ増幅産物を、変異検出部位Ｐ２２９Ｇ用プライマー対、Ｐ２２９Ｑ−ＦとＣｙ３−Ｐ２２９Ｇ−Ｒを用いて１９５塩基対のＰＣＲ増幅産物を、さらに変異検出部位Ｙ４８６Ｄ用プライマー対、Ｙ４８６Ｄ−ＦとＣｙ３−Ｙ４８６Ｄ−Ｒを用いて１８７塩基対のＰＣＲ増幅産物を得た。ＰＣＲの条件は以下のとおりである。
【００２５】
【００２６】
【実施例３】
（ハイブリダイゼーションおよび検出）
実施例２で調製した各試料を１２μＬのハイブリダイゼーション緩衝液〔４×ＳＳＣ（０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌと１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを基本溶液として４×はその４倍濃度を表す）、０．２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド〕に溶解し、その１０μＬを実施例１で作成した核酸アレイに４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。ハイブダイズ後、緩衝液（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で３７℃、５分間洗浄後さらに、緩衝液（０．２×ＳＳＣ）で室温、５分間洗浄後、乾燥し、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ ４２８ ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒを用いて蛍光シグナルを検出した。その結果を図２〜８に示した。
【００２７】
試料１では、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＧ列のみに、Ｐ２２９Ｑ変異検出チップのＣ列のみに、さらにＹ４８６Ｄの変異検出チップのＴ列のみにそれぞれハイブリダイズが観察された。これは、何れも正常な配列を有していることを示していた（図２）。
【００２８】
試料２および３では、Ｐ２２９Ｑの変異検出チップのＣ列およびＹ４８６Ｄの変異検出チップのＴ列にハイブリダイズが認められ、それぞれ正常な配列が認められたが、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＡ列およびＧ列の両方にハイブリダイズが観察された。これにより、Ｇ列にハイブリダイズする正常な配列と、Ａ列にハイブリダイズする変異配列を共に有するヘテロ接合性の変異が確認された（図３、図４）。
【００２９】
試料４においては、Ｐ２２９ＱおよびＹ４８６Ｄの変異検出チップでは何れも正常なハイブリダイズパターンを示したが、Ｇ７１Ｒの変異検出チップのＡ列のみにハイブリダイズが観察された。これにより、ホモ接合性の変異が確認された（図５）。
【００３０】
試料５では、Ｇ７１ＲおよびＹ４８６Ｄの変異検出チップのハイブリダイズパターンは何れも正常であったが、Ｐ２２９Ｑにおいては正常なハイブリダイズであるＣ列とさらにＡ列にもハイブリダイズが観察された。これにより、ヘテロ接合性の変異が確認された（図６）。
【００３１】
試料６ではＧ７１ＲおよびＰ２２９Ｑの変異検出チップに対しては何れも正常なハイブリダイズパターンを示したが、Ｙ４８６Ｄの変異検出チップに対しては、正常なハイブリダイズであるＴ列と変異を示すＧ列の両方にハイブリダイズが観察された。これにより、ヘテロ接合性の変異が確認された（図７）。
【００３２】
試料７では試料６と異なり、Ｙ４８６Ｄ変異検出チップにおいてＧ列のみにハイブリダイズが観察された。これにより、ホモ接合性の変異が確認された（図８）。
【００３３】
以上７種の試料と同じ遺伝子配列を持つＵＧＴ分子を遺伝子組換えにより調製し、ビリルビンを基質として測定したときのＵＧＴ活性と上記の結果を比較検討した結果、表１のようになり、ＵＧＴ分子をコードするエキソン５領域の変異、とりわけＹ４８６Ｄの変異を検出することにより、ＵＧＴ分子の酵素活性を予測することが可能なことが確認された。これより薬剤代謝の異常を検査することが可能であることが示された。さらに、エキソン５領域以外のエキソン１〜４の領域の変異を合わせて検出することにより、より効果的に薬剤代謝の異常を検査できることが示された。
【００３４】
（表１）ＤＮＡチップでの解析結果と対応する遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ１分子のＵＧＴ活性
【００３５】
【表１】
【実施例４】
実施例１と同様に操作してエキソン５領域の変異を検出したＵＧＴ１Ａ６分子について、エキソン５領域の変異の解析結果と、対応するその遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ６分子のＵＧＴ活性を２−アミノ−５−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールを基質として測定した。その結果を表２に示した。
【００３７】
（表２）ＤＮＡチップでの解析結果と対応する遺伝子組換えＵＧＴ１Ａ６分子のＵＧＴ活性
【００３８】
【表２】
この結果、ＵＧＴ１Ａ１のみならず、他のアイソフォームの変異も本発明の方法で検出可能であることが判り、本発明の効果が確かめられた。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のＵＧＴ１をコードする共通エキソン領域の変異を検出方法により、多数の存在するアイソフォームを個別に検査することなく、効率的にＵＧＴ１遺伝子の変異を検出して、数多い薬剤に対してその代謝の判定、予測および検査を効率的に行うことができる。
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡチップの核酸プローブの配置を示した図である。
【図２】試料１（正常検体）の検査結果を表した図である。
【図３】試料２の検査結果を表した図である。
【図４】試料３の検査結果を表した図である。
【図５】試料４の検査結果を表した図である。
【図６】試料５の検査結果を表した図である。
【図７】試料６の検査結果を表した図である。
【図８】試料７の検査結果を表した図である。
【配列表】
Claims (6)
- ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする遺伝子のエキソン５領域の変異を検出する工程を含み、前記変異がＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列４８６番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の１４５６番目の塩基に対応する、ＵＧＴ１Ａ分子の各アイソフォームのエキソン５領域の変異であり、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０の各アイソフォーム毎の検査をすることなく前記変異を検出する、ＵＧＴの薬剤代謝能に対する検査方法。
- プロモーター領域の変異を検出する工程を含む請求項１に記載の検査方法。
- 上記変異の検出工程ともに、ＵＧＴ分子をコードする遺伝子配列のエキソン１、２、３および４の領域の少なくとも１つの領域の変異を検出する工程を含む請求項１または２に記載の検査方法。
- ＵＧＴ１Ａ１分子のアミノ酸配列７１番目のアミノ酸をコードするＵＧＴ遺伝子配列の２２６番目の変異およびアミノ酸配列２２９番目のアミノ酸をコードする遺伝子配列の６８６番目の変異のうち少なくとも１つの遺伝子配列の変異を検出する工程を含む請求項３に記載の検査方法。
- 配列番号１で表される塩基配列を有するプローブと配列番号２および／または３で表される塩基配列を有するプローブを組み合わせて使用する請求項１〜４のいずれか１に記載の検査方法。
- 請求項１〜５のいずれか１に記載の方法に用いる検査キット。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002235029A JP4096037B2 (ja) | 2002-08-12 | 2002-08-12 | グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 |
| US10/524,278 US7582427B2 (en) | 2002-08-12 | 2003-02-13 | Method of estimating drug metabolic activity by analyzing mutations in glucuronosyl transferase gene |
| CA2499707A CA2499707C (en) | 2002-08-12 | 2003-02-13 | Method for predicting drug metabolizing activity by analysis of glucuronosyltransferase gene mutation |
| AU2003211948A AU2003211948A1 (en) | 2002-08-12 | 2003-02-13 | Method of estimating drug metabolic activity by analyzing mutations in glucuronosyl transferase gene |
| KR1020057001663A KR100705733B1 (ko) | 2002-08-12 | 2003-02-13 | 글루쿠로노실 트랜스퍼라아제 유전자의 변이해석에 따른약제대사활성의 예측방법 |
| PCT/JP2003/001475 WO2004016814A1 (ja) | 2002-08-12 | 2003-02-13 | グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002235029A JP4096037B2 (ja) | 2002-08-12 | 2002-08-12 | グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004073035A JP2004073035A (ja) | 2004-03-11 |
| JP4096037B2 true JP4096037B2 (ja) | 2008-06-04 |
Family
ID=31884370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002235029A Expired - Lifetime JP4096037B2 (ja) | 2002-08-12 | 2002-08-12 | グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7582427B2 (ja) |
| JP (1) | JP4096037B2 (ja) |
| KR (1) | KR100705733B1 (ja) |
| AU (1) | AU2003211948A1 (ja) |
| CA (1) | CA2499707C (ja) |
| WO (1) | WO2004016814A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1629111B1 (en) | 2003-05-30 | 2008-05-28 | University Of Chicago | Methods and compositions for predicting irinotecan toxicity |
| KR100849166B1 (ko) | 2005-02-07 | 2008-07-30 | 인제대학교 산학협력단 | 유디피-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1에이4 유전자의단일염기 다형성 및 그 용도 |
| CN102304572B (zh) * | 2006-09-11 | 2014-10-22 | Inje大学校产学协力团 | 用于确定CYP2D6基因的基因型的htSNP及其用于多重基因分型的方法 |
| JP4884899B2 (ja) * | 2006-09-19 | 2012-02-29 | 東洋鋼鈑株式会社 | イリノテカンの副作用の発生危険度を判定する方法およびそのためのキット |
| US8357516B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-01-22 | Arkray, Inc. | Primer set for amplification of UGT1A1 gene, reagent for amplification of UGT1A1 gene containing the same, and the uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3888807B2 (ja) | 1999-08-06 | 2007-03-07 | 凸版印刷株式会社 | 遺伝子を検出する方法、並びに検出装置及び検出用チップ |
| US6987014B2 (en) | 2000-08-30 | 2006-01-17 | Applera Corporation | Isolated nucleic acid molecules encoding human drug metabolizing proteins |
| US20030092019A1 (en) * | 2001-01-09 | 2003-05-15 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and treating neuropsychiatric disorders such as schizophrenia |
| JP2005505526A (ja) * | 2001-07-23 | 2005-02-24 | エピダウロス・バイオテクノロジー・アクチェンゲゼルシャフト | Ｕｇｔ１ａ１に基づいたがんの改善治療の手段及び方法 |
-
2002
- 2002-08-12 JP JP2002235029A patent/JP4096037B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-02-13 KR KR1020057001663A patent/KR100705733B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-02-13 CA CA2499707A patent/CA2499707C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-13 US US10/524,278 patent/US7582427B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-13 WO PCT/JP2003/001475 patent/WO2004016814A1/ja active Application Filing
- 2003-02-13 AU AU2003211948A patent/AU2003211948A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2499707A1 (en) | 2004-02-26 |
| WO2004016814A1 (ja) | 2004-02-26 |
| US20060257960A1 (en) | 2006-11-16 |
| AU2003211948A1 (en) | 2004-03-03 |
| US7582427B2 (en) | 2009-09-01 |
| JP2004073035A (ja) | 2004-03-11 |
| CA2499707C (en) | 2010-11-02 |
| KR100705733B1 (ko) | 2007-04-09 |
| KR20050042778A (ko) | 2005-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100575381B1 (ko) | 질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 척수소뇌성 운동실조 타입 6의 진단방법 | |
| US6605433B1 (en) | Mitochondrial dosimeter | |
| US20090130660A1 (en) | Single Nucelotide Polymorphism (SNP) | |
| JP2009511026A (ja) | 血栓塞栓性及び冠状動脈性心疾患の診断方法 | |
| WO2014178432A1 (ja) | Ｔ細胞リンパ腫の検出方法 | |
| JP4096037B2 (ja) | グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 | |
| WO2006063703A2 (en) | Single nucleotide polymorphism (snp) associated to type ii diabetes | |
| US20230193388A1 (en) | Compositions and methods for assessing the efficacy of inhibitors of neurotranmitter transporters | |
| JP2010515467A (ja) | 心筋梗塞及び心不全における診断マーカー及び薬剤設計のためのプラットホーム | |
| JP5002746B2 (ja) | 抗うつ薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型 | |
| JP4998874B2 (ja) | 炎症性疾患の判定方法 | |
| JP2005245362A (ja) | 肺癌および頭頸部癌の発症危険率を予測する方法 | |
| Ter Linde et al. | Potential of genetic translational research in gastroenterology | |
| WO2009046118A1 (en) | Cancer susceptibility loci located at chromosome 6p22 and chromosome 20 for use in diagnostic and therapeutic methods | |
| JP5422805B2 (ja) | 新規糖尿病性腎症感受性遺伝子 | |
| KR100849166B1 (ko) | 유디피-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1에이4 유전자의단일염기 다형성 및 그 용도 | |
| JP2006034209A (ja) | Ｕｇｔ１ａ３核酸配列の変異検査方法 | |
| KR20100100529A (ko) | 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법 | |
| JP2002223760A (ja) | オリゴヌクレオチドアレイ及びスプライシングの検出方法 | |
| JP2008543327A (ja) | 心筋梗塞に関与する遺伝子多型、及びその用途 | |
| JP2006101808A (ja) | Ｕｇｔ１ａ４核酸配列の変異検査方法 | |
| JP2006034155A (ja) | Ｕｇｔ１核酸配列の変異検査方法 | |
| WO2000034515A1 (en) | Use of factor x polymorphism in the diagnosis and treatment of factor x and/or factor xa mediated diseases | |
| EP2251438A1 (en) | Genetic markers associated with sporadic pancreatic cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20040407 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040707 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040928 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20041111 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041126 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050512 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050614 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050615 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070725 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070921 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071115 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080107 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080130 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080226 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4096037 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |