WO2004016814A1 - グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 - Google Patents

グルクロン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方法 Download PDF

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Hiroshi Sato
Yoshihide Fujiyama
Kazuo Yamamoto
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for genetic testing of an enzyme involved in glucuronidation and a probe and a kit therefor, which are used in the field of clinical testing. Background technology
  • UGT Resin-diphospho-gluc mouth nosinole transferase
  • UGT1 has at least nine isoforms of UGT1A1 and UGT1A3 to UGT1A10.
  • UGT1A1 conjugates bilirubin, amine, phenol, etc.
  • UGT1A6 conjugates phenol having a planar molecular structure.
  • the human UGT1 gene (UGT1) is present on chromosome 2q37, and is common to exon 1 with substrate specificity for each isoform (1A1-1A10) and to each isoform. Exons 2 to 5, and a promoter region containing TATA bo X exists upstream of each exon 1.
  • Each isoform has a unique amino-terminal region encoded by at least one of the first exons and a common carboxy-terminal region encoded by four exons.
  • UGT2 is divided into a subfamily of UGT2A, which conjugates odorants, and UGT2, which conjugates bile acids and steroids.
  • cytochrome P450 is well known as a substance involved in drug metabolism in the body. It is also well known that differences in this enzyme polymorphism cause abnormal metabolism of drugs, in which certain drugs are not metabolized.
  • the metabolic abnormality of drugs is not limited to the polymorphism of cytochrome P450, but it is known that UGT polymorphism is involved in drug metabolism. I was able to.
  • UGT polymorphism is involved in drug metabolism.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining, predicting or testing drug metabolism by efficiently detecting mutations in a gene encoding UGT. (Means to solve the problem)
  • the present inventors have conducted intensive studies and as a result, the gene encoding UGT is composed of five exons, and the exon 2 to 5 regions are common to each UGT 1 isoform.
  • UGT1 mutations could be effectively detected without detecting each UGT1 isoform, and in particular, mutations in the exon 5 region of one UGT molecule were detected.
  • a method for testing UGT drug metabolizing ability which comprises a step of detecting a mutation in the exon 5 region of a gene encoding UDP-glucuronosyltransferase (UGT);
  • test method described in 1 above which combines a step of detecting a mutation of an increase or decrease in the repeat sequence of TA present in TATA box of the promoter region,
  • Amino acid sequence of one molecule of UGT 1 A Detects mutations in the exon 5 region of each isoform of UGT 1 A molecule corresponding to nucleotides 144 and 6 of the UGT gene sequence encoding amino acid 486
  • the inspection method described in the preceding item 3 including the step of performing 5. Any one of the above items 1 to 4 including a step of detecting a mutation in at least one of exon 1, 2, 3, and 4 regions of the gene sequence encoding the UGT molecule, in addition to the step of detecting the above mutation. Inspection method described in the
  • a UGT gene having a mutation comprising the base substitution according to the above 3 or 4, or a fragment of a gene containing the mutation,
  • a method for detecting a DNA fragment having a functionally effective length as a test DNA to be subjected to the method for detecting a base substitution according to any one of the preceding items 1 to 6 or the method for detecting a base substitution according to the above 1 to 6 A DNA fragment having a functionally effective length as a probe for use,
  • DNA fragment according to the above item 7 or 8 which is an oligonucleotide probe specific to UG having the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • a detection device in which the oligonucleotide probe according to any one of the above items 7 to 9 or the oligonucleotide probe used in the method according to claim 10 is installed in the same device.
  • Kit consists of BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing an arrangement of nucleic acid probes on a DNA chip.
  • FIG. 2 is a diagram showing a test result of a sample 1 (normal sample).
  • FIG. 3 is a diagram showing an inspection result of Sample 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing an inspection result of Sample 3.
  • FIG. 5 is a diagram showing an inspection result of Sample 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing an inspection result of Sample 5.
  • FIG. 7 is a diagram showing an inspection result of Sample 6.
  • FIG. 8 is a diagram showing an inspection result of Sample 7. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • 2-Amino-5-nitro-41-Trifluoromethy / Refeno a formic acid conjugate is a major metabolite of flutaamide, a non-steroidal antiandrogen used in the treatment of prostate cancer with strong hepatotoxicity It is.
  • Trinole ole methinolephenol is conjugated to DARC by a UGT.
  • the mutant UGT 1A1 showed a maximum speed of about 12% as compared to the maximum speed of the natural type, and the Km value was 2-amino-1-5-nitro-4. It was about half for one trypnoleolomethylphenol and was equivalent to the native form for UDP-gluconic acid.
  • the mutant showed only 1% or less of the activity of the natural type, and the maximum reaction rate and Km could not be measured.
  • the UGT1 gene has a common exon 2 to 5 region for each isoform and a different exon 1 region for each isoform, if a mutation occurs in the common exon region, the UGT1 It can be said that the enzyme activity decreases.
  • the present invention provides a method for efficiently testing gene mutations in all isoforms that may be present in UGT1 by examining mutations in the common exon region. Specifically, for example, by detecting mutations (Y486D) in the exon 5 region of UGT1A1 and UGT1A6, drug metabolism by these enzymes can be predicted.
  • the present invention detects mutations specific to each isoform by adding mutation detection in the exon 1 region of UGT1, and by combining them, the overall frequency of missed detection of UGT gene mutations
  • the present invention provides a method for detecting a mutation in the UGT gene, which can reduce the amount of glutamine. This provides a method for efficiently predicting and testing drug metabolism.
  • the present invention discloses a method for testing a mutation in the exon 5 region of UGT1A1, specifically, a Y486D mutation, and detects a mutation in another isoform occurring at the same time by the testing method. I can do it.
  • U487A3, UGT1A4 and Y487D which is a mutation of UGT1A5, Y485D which is a mutation of UGT1A6, and UGT1A7, UGT1A8, UGT1A 9 and Y4833D, which is a mutation of UGT1A10, can be examined using the same probe and Z or the same apparatus. Therefore, according to the method of the present invention, UGT plays an important role in drug metabolism. By using a single nucleic acid probe, mutations in all exon 5 regions of these isoforms can be detected without individually testing for mutations in each isoform of 1A. Metabolism can be determined, predicted or tested.
  • the detection of the drug metabolizing ability of UGT can be more accurately tested.
  • the TATAboX region there are six repeats of TA.
  • an increase or decrease in the number of this TA repeat sequence affects the drug metabolizing ability of UGT. Therefore, by detecting a change relating to an increase or decrease in the number of repeated sequences of TA, the drug metabolizing ability of UGT can be examined.
  • mutations in which the number of repeated sequences is any of 4 to 8 and any combination of 4 to 8 for heterozygotes, or 4, 5, 7, or 8 for homozygotes
  • the drug metabolizing ability of UGT can be tested.
  • a method for detecting a mutation relating to an increase or decrease in the number of TAT AboX can be performed by a known method.
  • the gene mutation to be detected has been clarified and identified.
  • detection of a specific mutation (Y486D mutation) of the present invention in a subject's UGT gene can be performed by various methods for analyzing a nucleotide sequence containing the mutation position. This includes various detection methods that combine, for example, Southern hybridization, dot hybridization (see Mol. Biol., 98: 503-517, 1975, etc.), dideoxy sequencing, and DNA amplification.
  • PCR Restriction fragment length polymorphism (RFLP), PCR— Chain conformation polymorphism analysis (see Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 2766-2770, 1989, etc.), PCR—Specific sequence oligonucleotide method (SSO: Specinc sequence oligonucleotide; PCR— Allele-specific oligonucleotide method using SSO and dot-noise hybridization (see Nature, 324: 163-166, 1986, etc.)], and the like. It is also possible to easily detect by a nucleic acid chip or a nucleic acid array.
  • SSO Specific sequence oligonucleotide method
  • PCR Allele-specific oligonucleotide method using SSO and dot-noise hybridization
  • Mutation of the nucleic acid base at position 6 and 6 in exon 1 (G71R), mutation of the nucleic acid base at position 6 and 6 of exon 1 (P2229Q), and ⁇ xon of the gene encoding one UGT molecule
  • the mutation of the nucleobase at the 1456th position (Y486D) in 5 can be detected using a nucleic acid probe.
  • the number of nucleotides of the DNA fragment for these nucleic acid probes is at least 8, usually 10 to 50, and preferably 15 to 35. If the number of nucleotides in the probe is too large, it will be difficult to hybridize to single-stranded DNA, while if too small, the specificity of hybridization will be reduced.
  • an oligonucleotide having a nucleotide sequence of (SEQ ID NO: 2) TC A GAG AC NG AG CAT TTT, and a probe for detecting a P2 3)
  • An oligonucleotide having a base sequence of TAATTCC CNGTATGAAA, and an oligonucleotide having a base sequence of TGGTACCAGNA CCATTCCT (SEQ ID NO: 1) can be used as the Y486D mutation detection probe.
  • N is any of A, T, C or G or a universal base such as inosine.
  • a necessary chemical substance for example, a substance for facilitating spotting at the time of preparing a nucleic acid array, various labeling substances, or the like can be added to the ends of these oligonucleotides.
  • the base sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 3 may include a sequence in which, for example, substitution or deletion of 2 or less nucleotides and modification by Z or addition are included. it can.
  • Each oligonucleotide of the probe used in the present invention can be easily synthesized according to a conventional method using an automatic synthesizer, for example, a DNA synthesizer (PerkinElmer), and the obtained oligonucleotide is further required. Purification can also be performed using a commercially available purification cartridge or the like. When the synthetic oligonucleotide is applied to a nucleic acid array immobilized on a slide glass surface, it is preferable that the 5 'end is amino-labeled.
  • nucleic acid array can be immobilized on a surface of a slide glass or the like and used as a nucleic acid array (generally, also referred to as a “microarray”).
  • Method for nucleic acid array can be applied to known methods, especially the method is not limited (e.g., genetic engineering experiment notebook under YODOSHA, 175-187 (2002)) 0 example, commercially available Areiya, A an if Can be prepared by spotting on an aminosilane-coated slide glass using yme trix 417 Arrayer '' (Preparation of target sample and test sample)
  • the sample to be measured may be a biological sample, and is not particularly limited, and examples include liver, kidney, leukocytes, hair and other organs and tissues. If the UGT gene expression level is low in the measurement sample, measure the target nucleic acid amplified by an appropriate amplification method such as the PCR method, LAMP method, LCR method, NASBA method, etc. Is also possible.
  • a test sample can be prepared by extracting DNA from a test sample and amplifying the DNA by, for example, a PCR method using a primer pair specific to a region where mutation is to be detected. Specifically, by preparing a fluorescently labeled sample using a primer (for example, 5'-Cy3-labeled oligo DNA) fluorescently labeled at the 5 'end, the prepared sample is hybridized with the probe on the nucleic acid array. And directly detects the result of the hybridization.
  • a primer for example, 5'-Cy3-labeled oligo DNA
  • primers for sample preparation for example, the following can be used. Thereby, DNA can be amplified to prepare a fluorescently labeled sample.
  • a commercially available detection device is used for the detection of the nucleic acid array fluorescent label.
  • a ff yme trix 4 28A rray the S Canner Te use Rere, it is possible to detect the fluorescent signal of each spot scans Jung c
  • a drug that can be tested by the method of the present invention is useful for testing its metabolism if it is conjugated to DARC by UGT.
  • these drugs include diuretics such as spironolatatatone, analgesics such as acetaminophen, aspirin, floctafen, indomethacin, etc., psychotropic drugs such as haloperidol, carpipramine, lorazepam, amoxane, morphine, propofol, and aachen.
  • a 5 'amino-modified oligonucleotide having each sequence of SEQ ID NOs: 1 to 12 was synthesized, and spotted on the surface of an aminosilane-coated slide glass (manufactured by Sigma) using Affymetrix 417 A rrayer. To prepare a DNA chip. Five oligonucleotides were spotted. Figure 1 shows the spot tray out of the prepared array.
  • test samples were subjected to PCR amplification using the following 5'-Cy3-labeled oligonucleotide and an unlabeled oligonucleotide primer to prepare fluorescently labeled samples.
  • Mutation detection site PCR amplification product of 195 base pairs using P 229 G primer pair, P 229 Q-F and Cy 3-P 229 G-R Using a primer pair for site Y 486D, Y486D-F and Cy3-Y486D-R, a PCR amplification product of 187 base pairs was obtained.
  • the conditions of the PCR are as follows.
  • the reaction product was purified by the ethanol precipitation method.
  • Example 2 Each sample prepared in Example 2 was mixed with 12 ⁇ l of a hybridization buffer [4 x SSC (0.15 mo1 / L NaC1 and 15 mmo1 ZL sodium tenate). 4X represents 4 times its concentration as a basic solution), 0.2% SDS, 50% formamide], and 10pL thereof is hybridized to the nucleic acid array prepared in Example 1 at 42 ° C for 2 hours. Let it soy. After hybridization, wash with buffer (2xSSC, 0.2% SDS) at 37 ° C for 5 minutes, wash with buffer (0.2XSSC) at room temperature for 5 minutes, dry, and dry. The fluorescent signal was detected using a me trix 428 Air Ray Scanner. The results are shown in Figs.
  • Sample 6 showed a normal hybridization pattern for the G71R and P229Q mutation detection chips, but showed a normal hybridization pattern for the Y486D mutation detection chip. Hybridization was observed in both the hybridizing T row and the mutation G row. This confirmed the heterozygous variation (Fig. 7).
  • Table 1 shows the results of a comparison of the above results with the UGT activity measured using bilirubin as a substrate, and the results are as shown in Table 1.
  • Table 1 shows the results of a comparison of the above results with the UGT activity measured using bilirubin as a substrate, and the results are as shown in Table 1.
  • a mutation in the exon 5 region encoding the UGT molecule It was confirmed that the enzyme activity of the UGT molecule can be predicted by detecting the mutation. This indicates that it is possible to examine abnormalities in drug metabolism. Furthermore, it was shown that abnormalities in drug metabolism can be more effectively tested by detecting mutations in exon 1-4 regions other than exon 5 region.
  • the method for detecting a mutation in the common exon region encoding UGT1 of the present invention allows efficient mutation of the UGT1 gene without individually detecting a large number of isoforms. Once detected, the metabolic judgment and prediction of many drugs can be performed efficiently.

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Abstract

本発明の課題はＵＧＴをコードする遺伝子の変異を有効的に検出することにより、薬剤代謝の判定、予測又は検査方法を提供することである。ＵＧＴをコードする遺伝子が５個のエキソンから成り、エキソン２～５領域はＵＧＴ１のアイソフォーム毎に共通の領域であることから、共通領域の変異、とりわけエキソン５領域の変異を検査し、さらに複数のエキソン領域の変異検出を加えることにより、効果的なＵＧＴ１遺伝子の変異を検査する。変異検査の手段としては、核酸プローブを用いた核酸チップが用いられる。

Description

明 細 書 ダルク口ン酸転移酵素遺伝子の変異解析による薬剤代謝活性の予測方 法 技術分野
本発明は臨床検査の分野で用いられ、 とりわけグルクロン酸抱合に関 与する酵素の遺伝子検査の方法およびそのためのプローブおよびキット に関する。 . 背景技術
ゥ リ ジン-ジホス フエー トグルク 口 ノシノレ トランスフェラーゼ (UDP-glucuronosyltransferase, U G T) は種々の薬剤のグルクロン 酸抱合を触媒する酵素である。 UGTはそのアミノ酸配列の相同性によ り UGT 1 と UGT 2の 2つのファミリ一に分類される。
UGT 1には、 UGT 1 A 1および U GT 1 A 3〜UGT 1 A 1 0の 少なくとも 9個のアイソフォームが存在する事が知られている。例えば、 UGT 1 A 1はビリルビン、 ァミン、 フエノールなどを抱合し、 UGT 1 A 6は平面状の分子構造をもつフエノールを抱合する。 ヒ ト UGT 1 遺伝子 （UGT 1 ) は染色体 2 q 3 7に存在しており、 ァイソフォーム ( 1 A 1〜 1 A 1 0) ごとに基質特異性のあるェキソン 1 と、 各ァイソ フォームで共通のェキソン 2〜 5からなり、 各ェキソン 1の上流に T A T A b o Xを含むプロモーター領域が存在する。 それぞれのアイソフォ 一ムは第 1ェキソン群の少なく とも 9のうちの 1つによりコードされる ユニークなアミノ末端領域と 4つのェキソンによってコードされる共通 のカルボキシ末端領域を持っている。 一方 U G T 2は臭気物質を抱合する U G T 2 Aと胆汁酸、 ステロイ ド を抱合する U G T 2のサブファミリ一に分けられる。
血清ビリルビンが高値となる以外に一般肝機能検査に異常がなく、 明 らかな黄疽の原因（溶血所見など）を認めないものを体質性黄疸と称し、 間接 （非抱合型） ビリルビンが上昇する Crigler-Najjar症候群 I型， 同 II 型および Gilbert 症候群と、 直接 （抱合型） ビリルビンが上昇する Dubin -Johnson症候群， ； Rotor症候群とに大別される。 Crigler-Najjar 症候群 I型， 同 II型および Gilbert症候群では U G T 1 A 1遺伝子のェ キソン 5での変異が報告されている。 具体的にはァミノ酸配列番号 4 8 6番目のチロシンがァスパラギン酸に置換した変異 （Y 4 8 6 D ) によ り、 その酵素活性が正常のものに比べて 1 3分の 1に低下する。
一方、 体内での薬剤代謝に関与する物質として、 チトクローム P 4 5 0が良く知られている。 そしてこの酵素の多型の違いにより、 ある特定 の薬剤が代謝されない、 薬剤代謝異常が引き起こされることもよく知ら れている。 薬剤の代謝異常はチトクローム P 4 5 0の多型によるのみな らず、上述のごとく薬剤がダルク口ン酸抱合されて代謝されること力ゝら、 薬剤代謝に U G Tの多型の関与が知られるようになった。しかしながら、 種々の薬剤代謝と U G Tの多型との関係において、 数多くの薬剤に対す る代謝を反映しうる有効な遺伝子の変異は明らかでない。 とりわけ U G T 1遺伝子のェキソン 5領域の変異と薬剤代謝の関連は明らかでない。 発明の開示
(解決しようとする課題）
本発明の課題は、 U G Tをコードする遺伝子の変異を効率的に検出す ることにより、 薬剤代謝の判定、 予測または検査方法を提供することで める。 (課題を解決する手段）
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、 UGTをコードする遺伝子が 5 個のェキソンから成り、 ェキソン 2 ~ 5領域は UGT 1のァイソフォー ム毎に共通の領域であることから、 これらの領域の変異を調べると、 U GT 1のアイソフォーム毎の検查をすることなく、 UGT 1の変異を有 効的に検出しうることに着目し、 とりわけ UGT 1分子のェキソン 5領 域の変異を検出することで、 薬物代謝の予測が有効になされることを見 出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
1. UD P—グルクロノシルトランスフェラーゼ (UGT) をコードす る遺伝子のェキソン 5領域の変異を検出する工程を含むことを特徴とす る U G Tの薬剤代謝能に対する検査方法、
2. プロモーター領域の TATA b o xに存在する T Aの繰り返し配列 の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなる前項 1に記 載の検査方法、
3. UGT 1をコードする遺伝子を含む試料を、 UGT 1 A 1、 UGT 1 A 3、 UG T 1 A 4 s UGT 1 A 5、 UGT 1 A 6、 UGT 1 A 7 , UGT 1 A 8 N UGT 1 A 9および UGT 1 A 1 0の各アイソフォーム 毎の検查をすることなく、 該各ァイソフォームに共通の核酸配列を有す るェキソン 5領域の変異を検出する工程を含む前項 1または 2に記載の 検査方法、
4. UGT 1 A 1分子のアミノ酸配列 4 8 6番目のアミノ酸をコードす る UGT遺伝子配列の 1 4 5 6番目の塩基に対応する UGT 1 A分子の 各アイソフォームのェキソン 5領域の変異を検出する工程を含む前項 3 に記載の検査方法、 5. 上記変異の検出工程ともに、 UGT分子をコードする遺伝子配列の ェキソン 1、 2、 3および 4の領域の少なく とも 1つの領域の変異を検 出する工程を含む前項 1〜 4のいずれか 1に記載の検查方法、
6. UGT 1 A 1分子のアミノ酸配列 7 1番目のアミノ酸をコードする UGT遺伝子配列の 2 2 6番目の変異おょぴアミノ酸配列 2 29番目の アミノ酸をコードする遺伝子配列の 4 8 6番目の変異のうち少なく とも 1つの遺伝子配列の変異を検出する工程を含む前項 5に記載の検査方法、
7. 前項 3または 4に記載の塩基置換からなる変異を有する U G T遺伝 子または該変異を含む遺伝子の断片、
8. 前項 1〜 6のいずれか 1に記載の塩基置換の検出方法に供される被 検 DNAとしての機能的有効長を有する DN A断片または前項 1〜 6に 記載の塩基置換を検出方法に使用するためのプローブとしての機能的有 効長を有する DNA断片、
9. 配列番号 1〜 3のいずれか 1で表される塩基配列を有する UG丁に 特異的なオリゴヌクレオチドプロープである前項 7または 8記載の DN A断片。
1 0. 配列番号 1で表される塩基配列を有するプローブと配列番号 2お よび/または 3で表される塩基配列を有するプローブを組み合わせて使 用する前項 5または 6に記載の検査方法、
1 1. 前項 7〜 9のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドプローブま たは請求項 1 0に記載の方法に用いるオリゴヌクレオチドプロープを同 一の装置内に設置した検出装置。
1 2. 前項 7〜 9のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドプローブの 塩基配列の末端が、 官能基を介して不溶性支持体に結合して固定化され ている核酸チップまたは核酸アレイである前項 1 1記載の検出装置
1 3. 前項 1 1または 1 2に記載の装置を用いて薬剤代謝を判定、 予測 または検査する方法。
1 4 . 前項 1〜6、 1 0、 1 3のいずれか 1に記載の方法に用い、 また は前項 7〜 9に記載の核酸断片或いは前項 1 1または 1 2に記載の装置 を組み込んだ検查キッ ト、 からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は D N Aチップの核酸プローブの配置を示した図である 第 2図は試料 1 (正常検体） の検査結果を表した図である。
第 3図は試料 2の検査結果を表した図である。
第 4図は試料 3の検査結果を表した図である。
第 5図は試料 4の検査結果を表した図である。
第 6図は試料 5の検査結果を表した図である。
第 7図は試料 6の検査結果を表した図である。
第 8図は試料 7の検査結果を表した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明を詳細に説明するため、 実施態様を例示して説明する。
2—アミノー 5—ニトロ一 4一トリフルォロメチ /レフエノー, 口ン酸抱合物は強い肝毒性を有する前立腺癌の治療に使われる非ステロ ィド系の抗男性ホルモン剤であるフルタアミ ドの主な代謝物である。
2—アミノー 5—二トロー 4 _ トリフノレオ口メチノレフェノールは U G Tによってダルク口ン酸抱合される。 U G T 1 A 1および U G T 1 A 6 の各アイソフォームの酵素によりダルク口ン酸抱合されるときの酵素反 応学的な反応を、 それぞれ正常な分子と Y 4 8 6 Dの変異をもつ分子で 比較した。 その結果、 U G T 1 A 1の変異型では天然型の最大速度に比 ベて約 1 2 %の最大速度を示し、 K m値は 2—ァミノ一 5—二トロ— 4 一トリプノレオロメチルフエノールに対しては約半分であり、 UDP—グ ルク口ン酸に対しては天然型と同等であった。 一方 UGT 1 A 6につい ては変異型は天然型の 1 %以下の活性しか示さず、 最大反応速度、 Km の測定はともに不可能なレベルであった。
前述のように UGT 1遺伝子がアイソフォーム毎に共通のェキソン 2 〜 5領域とアイソフォーム毎に異なるェキソン 1領域を有することから、 共通ェキソン領域に変異が起きるとすべてのアイソフォームにおいて U GT 1の酵素活性が低下するといえる。
本発明は、 共通ェキソン領域の変異を調べることで、 UGT 1に存在 しうるァイソフォームの全てを対象に、 遺伝子の変異を効率的に検査す る方法を提供するものである。 具体的には、 例えば UGT 1 A 1および UGT 1 A6のェキソン 5領域の変異 （Y48 6 D) を検查することに より、 これらの酵素による薬物代謝を予測することができる。
さらに本発明は、 UGT 1のェキソン 1領域の変異検出を加えること により、 各ァイソフォームに固有の変異を検出し、 それらを組み合わせ ることで、 総合的に UGT遺伝子の変異の検出漏れの頻度を低減可能と する UGT遺伝子の変異検査方法が提供される。 このことにより、 薬剤 代謝の予測、 検査を効率的に行う方法が提供できる。
本発明は、 UGT 1 A 1のェキソン 5領域の変異、 具体的には Y 48 6 D変異の検査方法を開示するもので、 該検査方法により、 同時に起き ている他のアイソフォームの変異も検出し得る。例えば、 UGT 1 A 3、 UGT 1 A 4並びに UGT 1 A 5の変異である Y 48 7D、 UGT 1 A 6の変異である Y48 5 D、 および UGT 1 A 7、 UGT 1 A8、 UG T 1 A 9並びに UGT 1 A 1 0の変異である Y 48 3 D等を同一のプロ ーブおよび Zまたは同一の装置を使用して検査することができる。 した がって、 本発明の方法により、 薬剤代謝に重要な働きをしている UGT 1 Aの各ァイソフォームの変異を個々に検査することなく、 1種の核酸 プローブを用いることによって、 これらアイソフォームの全てのェキソ ン 5領域の変異を検出でき、その酵素活性の低下による薬剤代謝の判定、 予測または検査を行うことが可能になる。
さらに UGT遺伝子のプロモーター領域に存在する TATA b o xに 存在する T A配列の繰返配列の増加又は減少を検出することによって U GTの薬剤代謝能の検出をより正確に検査することができる。 通常、 該 TATAb o Xの領域には、 T Aの繰返配列は 6箇所存在する。しかし、 この T Aの繰返配列の数が増加又は減少すると、 U G Tの薬剤代謝能に 影響が及ぶ。 そこで、 この T Aの繰返配列数の増加又は減少に関する変 異を検出することで、 UGTの薬剤代謝能を検査することができる。 具 体的には、 繰返配列数がヘテロ接合体の場合で 4〜 8のいずれか及び 4 〜 8のいずれかの組合せとなる変異、 又はホモ接合体の場合で 4、 5、 7又は 8となる変異を検出することで UGTの薬剤代謝能を検査するこ とができる。 T AT A b o Xの数の増加又は減少に関する変異の検出方 法は、 公知の方法により行うことができる。
本発明において、 検出すべき遺伝子変異が明らかにされ、 これが特定 されているので、 本発明の開示に従えば、 その検出のための方法を適宜 採用しもしくは該方法を適宜修飾して採用することは当業者であれば容 易である。 例えば、 被験者の UGT遺伝子を対象として、 本発明の特定 の変異 （Y 4 8 6D変異） の検出は、 当該変異位置を含む塩基配列を解 析する各種の方法に従うことができる。 これには、 例えばサザンハイブ リダイゼーション法、 ドットハイブリダイゼーション法 （ Mol. Biol., 98： 503-517, 1975等参照）、 ジデォキシ塩基配列決定法、 DNAの増幅 手法を組合せた各種の検出法 [例えば P CR—制限酵素断片長多型分析 法 (RFLP: Restriction iragment length polymorphism)， P C R—卓 鎖高次構造多型分析法 (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86: 2766-2770, 1989 等参照）、 P C R—特異的配列オリゴヌク レオチド法 （SSO: Specinc sequence oligonucleotide;、 P CR— S S Oと ドットノヽづブリ ダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的ォリ ゴヌクレオチド法 (Nature, 324： 163-166, 1986等参照）]等を例示することができる。 さ らにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップまたは核酸ァレイ によって簡便に検出することも可能である。
(プローブ）
UGT 1分子をコードする遺伝子のェキソン 1内 22 6番目の核酸塩 基の変異 （G 7 1 R)、 ェキソン 1内 6 8 6番目の核酸塩基の変異 （P 2 2 9 Q) の変異およびヱキソン 5内 1 4 5 6番目の核酸塩基の変異 （Y 4 8 6 D) は、 核酸プローブを用いて検出することができる。
これらの核酸プローブ用の DN A断片のヌクレオチド数は、 少なくと も 8個、 通常 1 0〜50個、 好ましくは 1 5〜3 5個の範囲にあるのが よい。プローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、 1本鎖 DNAにハイブリダイズしにくくなり、 逆にあまりに小さすぎる と、 ハイプリダイゼーションの特異性が低下する。
具体的には、 G 7 1 R変異検出用プローブとして、 （配列番号 2) TC A GAG AC NG AG CAT TTTの塩基配列を有するオリゴヌクレオ チド、 P 2 2 9 Q変異検出用プローブは （配列番号 3) TAATTCC CNGTATGAAAの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、 そして Y 48 6 D変異検出プローブは （配列番号 1) TGGTACCAGNA CCATTCCTの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用するこ とができる。 この場合において、 Nは A， T， Cまたは Gの何れかもし くはィノシン等のユエバーサル塩基である。 また、 これらのオリゴヌクレオチドの末端には、 必要な化学物質、 例 えば核酸アレイ調製時のスポッティングを容易にするための物質や、 各 種標識物質などを付加することができる。
さらに本発明においては、 UGT遺伝子検出用プローブとして機能し 得るものであれば、 上記配列番号 1〜 3に表される塩基配列を有する D NA断片に限定されず、 铸型鎖との間に少数のミスマッチがあっても良 い。 例えば、 上記機能を有するものであれば、 配列番号 1〜3に表され る塩基配列に例えば 2個以下のヌクレオチドの置換、 欠失および Zまた は付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
上記本発明で用いるプローブの各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、 自動合成機、 例えば DN Aシンセサイザー （パーキンエルマ一社） 等を 用いて容易に合成することができ、 得られるオリゴヌクレオチドは更に 必要に応じて、 市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもで きる。 合成オリゴヌクレオチドはスライ ドグラス表面に固定化した核酸 アレイへ応用する場合には 5 '末端をアミノ標識しておくことも好適で ある。
(核酸アレイ）
上記の各プローブはスライドグラス等の表面に固定化して核酸ァレイ (一般には、 「マイクロアレイ」ともいう。）として用いることができる。 核酸アレイの手法は、 公知の方法を適用することができ、 特にその方法 は限定されない （例えば遺伝子工学実験ノート下， 羊土社， 175-187 (2002)) 0 例えば、 市販のァレイヤー、 A i f yme t r i x 4 1 7A r r a y e rを用いてァミノシランコートしたスライドグラス上にスポッ トして調製することができる ' (対象試料と検査試料の調製）
本発明の方法により、 医薬品開発における動態試験において重要な位 置を占めるグルクロン酸抱合による薬物代謝を容易に判定することがで きる。 これにより、 投与される医薬品の代謝の適否を判定することがで きる。 測定の対象となる試料は生体試料であれば良く、 特に限定されな いが、例えば肝臓、 腎臓、 白血球、 毛髪等の臓器、組織等が挙げられる。 測定試料において、 UGT遺伝子の発現量が少ない場合には、 対象とす る核酸を P CR法、 LAMP法、 LCR法、 NAS BA法等の適当な増 幅方法により增幅させた試料を測定することも可能である。
検査対象試料から DNAを抽出し、 変異を検出しょうとする領域に特 異的なプライマー対を用いて例えば P CR法により DNAを増幅させて 検査試料を調製することができる。 具体的には、 5'末端を蛍光標識した プライマー （例えば、 5'— C y 3標識オリゴ DNA) を用いて蛍光標識 試料を調製することにより、 調製した試料を核酸ァレイ上のプローブと ハイブリザィズさせて直接そのハイプリザィズした結果を検出すること ができる。
試料調製のためのプライマーとして、 例えば以下のものを使用するこ とができる。 これにより、 DN Aを増幅させて蛍光標識試料を調製でき る。
1) 変異検出部位 G 7 1 R用のプライマー対：
G 7 1 R- F
(CTGCAGCAGAGGGGACATGA) (配列番号 4 ) C y 3— G 7 1 R— R
(C y 3 -AACATTATGCCCGAGACTAAC) (配列番号 5 )
2) 変異検出部位 P 2 29 G用プライマー対： P 2 2 9 Q- F
(CAAC C CATTCTCCTACGTG) (配列番号 6)
C y 3 -P 2 2 9 G-R
(C y 3 -AGATGCAGAGCTCAATAGGTC) (配列番号 7)
3) 変異検出部位 Y4 8 6 D用プライマー対
a) Y 4 8 6 D— F
(GCTGGAC CTGGCAGTGTTC) (配列番号 8)
C y 3一 Y 48 6 D-R
(C y 3 -TTT CCGGTAGCCATATGCACA)
(配列番号 9)
b) Y 48 6 D- F 2
(CCGCAGC CCACGAC CTCACCTGGT)
(配列番号 1 0) C y 3 - Y 4 8 6 D-R 2
(C y 3 -AGAGGAAACCAATCACGTCCAAGG)
(配列番号 1 1 )
(検出）
上記の核酸ァレイ蛍光標識の検出には市販の検出装置が用いられる。 例えば、 A f f yme t r i x 4 28A r r a y S c a n n e rを用レヽて、 スキャンユングして各スポットの蛍光シグナルを検出することができる c
(対象薬剤）
本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤は、 UGTにより ダルク口ン酸抱合されるものであれば、 その代謝の検査に有用である。 これらの薬剤の例として、 スピロノラタ トン等の利尿剤、 ァセトァミノ フェン、 アスピリ ン、 フロクタフエェン、 インドメタシン等の鎮痛剤、 ハロペリ ドール、 カルピプラミン、 ロラゼパム、 ァモキサン等の向精神 薬、 モルヒネ、 プロボフォール、 ァヘン等の麻酔鎮痛剤、 抗癌剤の塩酸 ドキソルビジン、 鎮咳剤のリン酸コディン、 喘息治療薬の硫酸オルシプ レナリン、 抗てんかん剤のフエニトイン、 抗ヒスタミン剤のフマル酸ケ トチフェン、 降圧おょぴ狭心症治療薬のカルベジロール、 塩酸プロプラ ノロール等、 脂質代謝改善剤のクロフイブラートアルミエゥム、 ァルツ ハイマー治療薬の塩酸ドネぺジル等が挙げられる。
(実施例）
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこ れらに限定されるものではない。
(実施例 1 核酸アレイの調製）
配列番号 1から 1 2の各配列を持つ 5 'ァミノ修飾オリゴヌクレオチ ドを合成し、 A f f yme t r i x 4 1 7A r r a y e rを用いて、 ァ ミノシランコートしたスライ ドグラス (シグマ社製) の表面にスポッテ ィングし DNAチップを調製した。 各オリゴヌクレオチドを 5個ずっス ポッ トした。 調製したアレイのスポッ トレイアウ トを図 1に示した。
(実施例 2 試料の調製）
7種類の検查試料を以下の 5 '— C y 3標識オリ ゴヌクレオチドと未 標識オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて P CR増幅させ、 蛍光標識 試料を調製した。 変異検出部位 G 7 1 R用のプライマー対として、 G 7 1 R— Fと C y 3— G 7 1 R— Rを用いて 1 5 0塩基対の P C R増幅産 物を、 変異検出部位 P 2 2 9 G用プライマー対、 P 2 2 9 Q—Fと C y 3—P 22 9 G— Rを用いて 1 9 5塩基対の P C R増幅産物を、 さらに 変異検出部位 Y 486 D用プライマー対、 Y486D— Fと C y 3— Y 48 6 D— Rを用いて 1 8 7塩基対の P CR増幅産物を得た。 P CRの 条件は以下のとおりである。
反応容量 ： 1 0 OpL
テンプレート ：検査試料 Ιμί
プライマー ：各 20 p m o 1
使用酵素 ： E X T a q
反応条件 ： 94°C一 3 0秒
5 5 °C— 3◦秒
7 2 °C— 30秒
3 5サイクル
反応物はェタノール沈殿法により精製した。
(実施例 3 ハイブリダィゼーションおよび検出）
実施例 2で調製した各試料を 1 2μίのハイブリダィゼーション緩衝 液 〔4 xS S C (0. 1 5 m o 1 /Lの N a C 1 と 1 5 mm o 1 ZLの タエン酸ナトリ ゥムを基本溶液として 4 Xはその 4倍濃度を表す）、 0. 2 % S D S , 5 0%ホルムアミ ド〕 に溶解し、 その 1 0pLを実施例 1 で作成した核酸ァレイに 42 °Cで 2時間ハイブリダイズさせた。 ハイブ ダイズ後、 緩衝液 （2xS S C、 0. 2 % S D S ) で 3 7°C、 5分間洗 浄後さらに、 緩衝液 （0. 2XS S C) で室温、 5分間洗浄後、 乾燥し、 A f f i me t r i x 42 8 A r r a y S c a n n e rを用レヽて蛍 光シグナルを検出した。 その結果を図 2〜 8に示した。
試料 1では、 G 7 1 Rの変異検出チップの G列のみに、 P 2 2 9 Q変 異検出チップの C列のみに、 さらに Y 4 8 6 Dの変異検出チップの T列 のみにそれぞれハイブリダィズが観察された。 これは、 何れも正常な配 列を有していることを示していた （図 2 )。
試料 2および 3では、 P 2 2 9 Qの変異検出チップの C列おょぴ Y 4 8 6 Dの変異検出チップの T列にハイブリダィズが認められ、 それぞれ 正常な配列が認められたが、 G 7 1 Rの変異検出チップの A列および G 列の両方にハイプリダイズが観察された。 これにより、 G列にハイプリ ダイズする正常な配列と、 A列にハイプリダィズする変異配列を共に有 するヘテロ接合性の変異が確認された （図 3、 図 4 )。
試料 4においては、 P 2 2 9 Qおよび Y 4 8 6 Dの変異検出チップで は何れも正常なハイプリダイズパターンを示したが、 G 7 1 Rの変異検 出チップの A列のみにハイブリダィズが観察された。 これにより、 ホモ 接合性の変異が確認された （図 5 )。
試料 5では、 G 7 1 Rおよび Y 4 8 6 Dの変異検出チップのハイプリ ダイズパターンは何れも正常であつたが、 P 2 2 9 Qにおいては正常な ハイプリダイズである C列とさらに A列にもハイブリダィズが観察され た。 これにより、 ヘテロ接合性の変異が確認された （図 6 )。
試料 6では G 7 1 Rおよび P 2 2 9 Qの変異検出チップに対しては何 れも正常なハイプリダイズパターンを示したが、 Y 4 8 6 Dの変異検出 チップに対しては、 正常なハイブリダィズである T列と変異を示す G列 の両方にハイブリダィズが観察された。 これにより、 ヘテロ接合性の変 異が確認された （図 7 )。
試料 7では試料 6と異なり、 Y 4 8 6 D変異検出チップにおいて G列 のみにハイブリダィズが観察された。 これにより、 ホモ接合性の変異が 確認された （図 8 )。
以上 7種の試料と同じ遺伝子配列を持つ U G T分子を遺伝子組換えに より調製し、 ビリルビンを基質として測定したときの UGT活性と上記 の結果を比較検討した結果、 表 1のようになり、 UGT分子をコードす るェキソン 5領域の変異、 とりわけ Y 4 8 6 Dの変異を検出することに より、 UGT分子の酵素活性を予測することが可能なことが確認された。 これより薬剤代謝の異常を検査することが可能であることが示された。 さらに、 ェキソン 5領域以外のェキソン 1 ~4の領域の変異を合わせて 検出することにより、 より効果的に薬剤代謝の異常を検査できることが 示された。
(表 1 ) DN Aチップでの解析結果と対応する遺伝子組換え UGT 1 A 1分子の UGT活性
Figure imgf000016_0001
(実施例 4 ) ,
実施例 1と同様に操作してェキソン 5領域の変異を検出した UGT 1 A 6分子について、 ェキソン 5領域の変異の解析結果と、 対応するその 遺伝子組換え UGT 1 A 6分子の UGT活性を 2—アミノー 5— -トロ 一 4一トリフルォロメチルフエノールを基質として測定した。 その結果 を表 2に示した。 (表 2) DN Aチップでの解析結果と対応する遺伝子組換え UGT 1 A 6分子の UG T活性
Figure imgf000017_0001
この結果、 UGT 1 A 1のみならず、 他のアイソフォームの変異も本 発明の方法で検出可能であることが判り、本発明の効果が確かめられた。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明の UGT 1をコードする共通ェキソン領 域の変異を検出方法により、 多数の存在するァイソフォームを個別に検 查することなく、 効率的に UGT 1遺伝子の変異を検出して、 数多い薬 剤に対してその代謝の判定、 予測おょぴ検査を効率的に行うことができ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1. U D P—ダルク口ノシルトランスフェラーゼ (UGT) をコードす る遺伝子のェキソン 5領域の変異を検出する工程を含むことを特徴とす る U G Tの薬剤代謝能に対する検査方法。
2. プロモーター領域の TATA b o xに存在する T Aの繰り返し配列 の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなる請求の範囲 第 1項に記載の検査方法。
3. UGT 1をコードする遺伝子を含む試料を、 UGT 1 A 1、 UGT 1 A 3、 UGT 1 A4、 UGT 1 A 5 UGT 1 A 6 , UGT 1 A 7 UGT 1 A 8、 UGT 1 A 9および UGT 1 A 1 0の各アイソフォーム 毎の検査をすることなく、 該各アイソフォームに共通の核酸配列を有す るェキソン 5領域の変異を検出する工程を含む請求の範囲第 1項または 第 2項に記載の検査方法。
4. UGT 1 A 1分子のァミノ酸配列 4 8 6番目のアミノ酸をコードす る UGT遺伝子配列の 14 5 6番目の塩基に対応する UGT 1 A分子の 各アイソフォームのェキソン 5領域の変異を検出する工程を含む請求の 範囲第 3項に記載の検査方法。
5. 上記変異の検出工程ともに、 UGT分子をコードする遺伝子配列の ェキソン 1、 2、 3および 4の領域の少なくとも 1つの領域の変異を検 出する工程を含む請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1に記載の検査 方法。
6 . U G T 1 A 1分子のアミノ酸配列 7 1番目のァミノ酸をコードする U G T遺伝子配列の 2 2 6番目の変異およびァミノ酸配列 2 2 9番目の アミノ酸をコードする遺伝子配列の 4 8 6番目の変異のうち少なくとも 1つの遺伝子配列の変異を検出する工程を含む請求の範囲第 5項に記載 の検査方法。
7 . 請求の範囲第 3項または第 4項に記載の塩基置換からなる変異を有 する U G T遺伝子または該変異を含む遺伝子の断片。
8 . 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1に記載の塩基置換の検出方 法に供される被検 D N Aとしての機能的有効長を有する D N A断片また は請求の範囲第 1項〜第 6項に記載の塩基置換を検出方法に使用するた めのプローブとしての機能的有効長を有する D N A断片。
9 . 配列番号 1〜 3のいずれか 1で表される塩基配列を有する U G丁に 特異的なオリゴヌクレオチドプローブである請求の範囲第 7項または第 8項記載の D N A断片。
1 0 . 配列番号 1で表される塩基配列を有するプローブと配列番号 2お よび または 3で表される塩基配列を有するプローブを組み合わせて使 用する請求の範囲第 5項または第 6項に記載の検査方法。
1 1 . 請求の範囲第 7項〜第 9項のいずれか 1に記載のォリゴヌクレオ チドプローブまたは請求の範囲第 1 0項に記載の方法に用いるオリゴヌ クレオチドプローブを同一の装置内に設置した検出装置。
1 2 . 請求の範囲第 7項〜第 9項のいずれか 1に記載のオリ ゴヌクレオ チドプローブの塩基配列の末端が、 官能基を介して不溶性支持体に結合 して固定化されている核酸チップまたは核酸ァレイである請求の範囲第 1 1項記載の検出装置
1 3 . 請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載の装置を用いて薬剤代 謝を判定、 予測または検査する方法。
1 4 . 請求の範囲第 1項〜第 6項、 第 1 0項、 第 1 3項、 のいずれか 1 に記載の方法に用い、 または請求の範囲第 7項〜第 9項に記載の核酸断 片或いは請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載の装置を組み込んだ 検查キット。
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